WO2016152672A1 - 有核赤血球候補細胞の単離方法 - Google Patents

有核赤血球候補細胞の単離方法 Download PDF

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WO2016152672A1
WO2016152672A1 PCT/JP2016/058290 JP2016058290W WO2016152672A1 WO 2016152672 A1 WO2016152672 A1 WO 2016152672A1 JP 2016058290 W JP2016058290 W JP 2016058290W WO 2016152672 A1 WO2016152672 A1 WO 2016152672A1
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WO
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red blood
cell
nucleated red
cells
treatment agent
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Application number
PCT/JP2016/058290
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English (en)
French (fr)
Inventor
中津　雅治
靖幸 石井
達也 石坂
Original Assignee
富士フイルム株式会社
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Publication date
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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a method for isolating nucleated red blood cell candidate cells, and more particularly to a method for isolating nucleated red blood cell candidate cells for examining nucleated red blood cells in pregnant maternal blood.
  • amniotic fluid testing has been performed. However, it has been pointed out that this method has the possibility of miscarriage.
  • fetal cells migrate into the blood of a pregnant mother (hereinafter also simply referred to as “maternal”), and these fetal cells circulate in the mother with blood. Therefore, if fetal cell chromosomal DNA (deoxyribonucleic acid: deoxyribonucleic acid) in maternal blood can be analyzed with high reproducibility and reliability, a prenatal diagnosis with a low possibility of miscarriage will be realized. Will be able to.
  • nucleated red blood cells that are fetal cells from maternal blood there is a method of concentrating nucleated red blood cells, for example, a technique of removing plasma components and maternal red blood cell components using density gradient centrifugation.
  • a technology that isolates maternal leukocytes by magnetism using antibodies that specifically immunoreact with proteins on the surface of leukocytes (MACS: Magnetic activated cell sorting), specifically immunoreacts with the ⁇ chain of fetal hemoglobin
  • FACS method Fluorescence activated cell sorting
  • Patent Document 1 uses a contrast image of cytoplasm and nucleus after staining the cell nucleus and cytoplasm to generate an absorption image of transmitted visible light, irradiating excitation light to form a fluorescence image of the nucleus. Discrimination of nucleated red blood cells is described.
  • Patent Document 2 describes a device that identifies blood cell types by measuring blood cell transmitted light and scattered light using light having a wavelength of 415 nm near the maximum absorption wavelength of hemoglobin.
  • Patent Document 3 describes that albumin, trehalose, or the like may be added for the purpose of cell protection or the like in a nucleated cell separation and recovery method in which nucleated cells such as hematopoietic stem cells can be recovered at a high rate.
  • Patent Document 4 may add EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), albumin, trehalose, polyvinylpyrrolidone, etc., as necessary for the purpose of cell protection in the method of concentrating SP cells (Side® Population). Is described.
  • Patent Document 5 describes that in a method for recovering cells suitable for cytodiagnosis, EDTA, albumin, trehalose, polyvinylpyrrolidone, or the like may be added as necessary for the purpose of cell protection or the like.
  • Patent Document 6 discloses a method for concentrating and isolating nucleated cells such as maternal and fetal nucleated red blood cells in a maternal whole blood sample with a substance such as bovine serum albumin in order to reduce adhesion to the surface. Processing is described. It also describes the use of trehalose or maltose to improve the stability of the cell membrane.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and provides a method for isolating nucleated red blood cell candidate cells that can prevent the destruction of cells at the time of specimen preparation and can reliably analyze the target cells.
  • the purpose is to provide.
  • the present invention provides a concentration step for concentrating nucleated red blood cells in pregnant maternal blood, a washing step for washing a fraction of maternal blood in which nucleated red blood cells are concentrated by the concentration step, and a washing step A smearing process that smears the subsequent fraction on the substrate, a staining process that stains blood cells in the fraction on the substrate, and an identification process that analyzes the blood cells after the staining process and identifies candidate cells for nucleated red blood cells And acquiring the nucleated red blood cell candidate cells identified in the identification step from the substrate, and the washing step is washed with a washing liquid containing the first cell treatment agent, and the washing step and the smearing step At least one of the steps includes a step of treating the fraction with a second cell treatment agent, and the staining step comprises nucleation using a staining solution containing a staining dye and the second cell treatment agent.
  • a method for isolating erythrocyte candidate cells is provided.
  • the washing step washing with the washing liquid containing the first cell treatment agent prevents the cytoplasm from being destroyed in the smearing step.
  • the target nucleated erythrocyte candidate cell can be smeared stably.
  • drying is performed at the end of each step.
  • the blood cell contains the second cell treatment agent at the time of drying, physical damage to the blood cell at the time of drying can be reduced. it can.
  • the treatment with the second cell treatment agent reduces the damage of blood cells, and in the analysis after cell isolation, the DNA amplification property Inhibition can be reduced, and gene analysis can be performed reliably.
  • the fixing step is preferably treated with a fixing solution containing a second cell treatment agent.
  • the fixing step is performed with the fixing solution containing the second cell processing agent, so that the second cell processing agent is included in the blood cells at the time of drying. Can do. Therefore, physical damage to blood cells at the time of drying can be reduced, and inhibition of DNA amplification can be reduced in analysis after cell isolation, and gene analysis can be performed reliably.
  • the concentration of the second cell treatment agent in the fixing solution is 1.2% by mass or more and 9.0% by mass or less.
  • the concentration of the second cell treatment agent in the fixing solution is in a saturated state.
  • the concentration of the second cell treatment agent in the fixing solution is defined.
  • the concentration within the above range the second cell treatment agent is excessive while ensuring DNA amplification. Can be prevented.
  • the first cell treatment agent preferably contains at least one selected from polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, albumin, and polyvinylpyrrolidone.
  • the components of the first cell treatment agent are limited. By containing the above components as the first cell treatment agent, it is possible to prevent destruction of the cytoplasm in the smearing process.
  • the second cell treatment agent contains at least one selected from sucrose, melezitose, trehalose, and arginine.
  • the components of the second cell treatment agent are limited.
  • blood cells are dried in the smearing step, the staining step, and the fixing step. Physical damage can be reduced, and gene analysis can be performed reliably.
  • the concentration of the first cell treatment agent in the cleaning liquid is 1.5% by mass or more and 9.0% by mass or less.
  • the concentration of the first cell treatment agent in the cleaning liquid is 2.0% by mass or more and 5.0% by mass or less.
  • the content concentration of the first cell treatment agent in the washing solution is defined, and by making it within the above range, destruction of the cytoplasm during the smearing process is prevented and the expression of the nuclear shadow is eliminated. And the excessive amount of the first cell treatment agent can be prevented.
  • the content concentration of the second cell treatment agent in the treatment liquid containing the second cell treatment agent is 1.2 mass. % Or more and 9.0% by mass or less is preferable.
  • the concentration of the second cell treatment agent in the staining solution is preferably 1.2% by mass or more and 9.0% by mass or less.
  • the concentration of the second cell treatment agent in the staining solution is preferably 2.0% by mass or more and 5.0% by mass or less.
  • the concentration of the second cell treatment agent in the treatment liquid used in the washing step and the smearing step and the washing liquid is defined. While ensuring, it can prevent that a 2nd cell processing agent becomes excess.
  • the “treatment liquid” means a washing liquid in the washing process, and in the smearing process, a dispersion liquid in which a smear is dispersed or a liquid to be brought into contact with the smear sample when being treated.
  • the dye is preferably a basic dye.
  • nucleated red blood cells and no nuclei can be obtained by using light having a wavelength that is not in the absorption wavelength region of hemoglobin. Identification from red blood cells can be performed.
  • the staining dye is any one selected from hematoxylin, toluidine blue, methylene blue, azure blue, cresyl violet, propidium iodide, methyl green, and nuclea fast red. Is preferred.
  • the dye used is limited, and the above dye does not absorb in the wavelength region that overlaps the absorption band of hemoglobin, so that hemoglobin can be detected with high accuracy and hemoglobin can be detected. A decrease in ability can be prevented.
  • the recovery liquid in the acquisition step, is used when the laser microdissection system irradiates a laser pulse and isolates the nucleated red blood cell candidate cells identified in the identification step. It is preferable.
  • the recovery solution when performing isolation of nucleated red blood cell candidate cells with the laser microdissection system, in addition to the second cell treatment agent used in the previous steps, the recovery solution is used.
  • the physical damage of the isolated cells can be reduced, and the genetic analysis can be performed reliably.
  • the cell membrane in the washing step, is prevented from being destroyed by washing with a washing solution containing the first cell treatment agent.
  • Nuclear red blood cell candidate cells can be smeared stably.
  • inhibition of DNA amplification can be reduced in analysis after cell isolation, Gene analysis can be performed reliably.
  • FIG. 1 is a flowchart showing the procedure of a method for isolating a nucleated tangent ball candidate cell.
  • FIG. 2 is a graph showing absorption coefficients with respect to wavelengths of reduced hemoglobin (Hb) and oxidized hemoglobin (HbO 2 ).
  • FIG. 1 is a flowchart showing the procedure of a method for isolating nucleated red blood cell candidate cells.
  • the method for isolating nucleated red blood cell candidate cells includes a collection step (step S12) for collecting maternal blood from a pregnant mother, a concentration step (step S14) for concentrating nucleated red blood cells in the pregnant mother blood, and a concentration step.
  • the collecting step is a step of collecting maternal blood that is a blood sample.
  • the maternal blood is preferably peripheral blood of a pregnant mother who is not likely to invade.
  • Maternal peripheral blood includes maternal eosinophils, neutrophils, basophils, mononuclear cells, lymphocytes and other white blood cells, and mature erythrocytes without nuclei, as well as maternal nucleated red blood cells, And fetal nucleated red blood cells are included. Fetal nucleated red blood cells are said to be present in maternal blood from about 6 weeks after pregnancy. In this embodiment in which prenatal diagnosis is performed, the peripheral blood of the mother is examined after about 6 weeks after pregnancy. As cells having a nucleus in the peripheral blood, there are leukocytes and rare maternal and fetal nucleated red blood cells.
  • Fetal nucleated red blood cells are red blood cell precursors that pass through the placenta and are present in the maternal blood.
  • fetal red blood cells can be nucleated. Since the erythrocytes have chromosomes, fetal chromosomes and fetal genes can be obtained by means of low invasiveness.
  • the fetal nucleated red blood cells are said to be present in a ratio of 1 in 10 6 cells in maternal blood, and the existence probability is very low in the maternal peripheral blood.
  • the nucleated red blood cells in the maternal blood collected in the collection step are concentrated by the concentration step. Since there are very few nucleated red blood cells contained in maternal blood, it is necessary to concentrate the maternal blood to increase the abundance ratio of nucleated red blood cells. In the present invention, it is preferable to obtain a fraction containing more nucleated red blood cells by concentrating maternal blood.
  • concentration step a known method such as density gradient centrifugation, MACS method, FACS method, lectin method, or filter filtration method can be used as a method used for concentrating maternal blood.
  • concentration by density gradient centrifugation as a simple concentration method utilizing the characteristics of blood cells.
  • a density gradient centrifugation method will be described below.
  • the density gradient centrifugation method is a method of separating using the difference in density of components in blood. Density gradient centrifugation is a method that does not use a separation medium, a method that uses one type of separation medium to separate the top and bottom of the separation medium, or uses two types of separation media.
  • the target component (nucleated erythrocytes including fetal origin in this embodiment) can be collected using a method of separating the density region of the target component so as to be sandwiched between the separation media. Then, nucleated red blood cells can be concentrated from the maternal blood by collecting a fraction containing the target component.
  • the centrifuge tube As a method that does not use a separation medium, fill the centrifuge tube with maternal peripheral blood (which may be diluted with a diluent), which is a blood sample, and collect the target component after centrifugation.
  • maternal peripheral blood which may be diluted with a diluent
  • the nucleated red blood cells can be concentrated with
  • the separation medium is injected into the bottom of the centrifuge tube, and the mother's peripheral blood, which is a blood sample, may be diluted on the separation medium (may be diluted with a diluent). Centrifugation is carried out after laminating the nucleated cells, and nucleated red blood cells can be concentrated by collecting the upper part of the separation medium after centrifugation (which may include a part of the separation medium).
  • the first separation medium is injected into the bottom of the centrifuge tube, the second separation medium is laminated on the first separation medium, and the second separation medium is then separated.
  • the mother's peripheral blood (which may be diluted with a diluent), which is a blood sample, is layered on the medium, and then centrifuged, and the first separation medium and the second separation medium after centrifugation are separated.
  • the nucleated red blood cells can be concentrated by collecting an intermediate layer (which may contain a part of the first separation medium and / or the second separation medium).
  • the centrifuge tube in which the first separation medium is stacked is cooled before the second separation medium is stacked, mixing in the boundary region between the first and second separation media can be suppressed.
  • the density of maternal blood including fetal nucleated red blood cells is about 1.065 to 1.095 g / mL
  • the density of maternal blood cells is about 1.070 to 1.120 g / mL for red blood cells.
  • Acidocytes are about 1.090 to 1.110 g / mL
  • neutrophils are about 1.075 to 1.100 g / mL
  • basophils are about 1.070 to 1.080 g / mL
  • lymphocytes are about 1.060.
  • About 1.080 g / mL and mononuclear cells are about 1.060-1.070 g / mL.
  • the density of the separation medium to be stacked is set to separate fetal nucleated red blood cells having a density of about 1.065 to 1.095 g / mL from other blood cell components in the mother body.
  • the density of the center of fetal nucleated red blood cells is about 1.080 g / mL, so two separation media having different densities sandwiching this density are prepared.
  • by layering adjacently it becomes possible to collect nucleated red blood cells derived from a desired fetus at the interface.
  • the density of the first separation medium is set to 1.08 g / mL or more and 1.10 g / mL or less
  • the density of the second separation medium is set to 1.06 g / mL or more and 1.08 g / mL or less.
  • the density of the first separation medium is 1.08 g / mL or more and 1.09 g / mL or less
  • the density of the second separation medium is 1.065 g / mL or more and 1.08 g / mL or less.
  • the density of the first separation medium to 1.085 g / mL and the density of the second separation medium to 1.075 g / mL
  • plasma components, eosinophils and Nucleocytes can be separated from the desired fraction to be collected. It is also possible to separate some of red blood cells, neutrophils, and lymphocytes.
  • the first separation medium and the second separation medium may be the same type or different types, as long as the effects of the present invention can be realized, but the same type of medium may be used. This is a preferred embodiment.
  • Separation media for density gradient centrifugation used in the concentration step include Histopaque (registered trademark), which is a solution containing polysucrose and sodium diatrizoate, and a silica sol with a diameter of 15 to 30 nm coated with non-dialyzable polyvinylpyrrolidone.
  • Separation media such as Percoll®, a solution, Ficoll®-Paque, a neutral hydrophilic polymer solution rich in side chains made from sucrose, can be used. In this embodiment, it is a preferable aspect to use Histopaque and Percoll.
  • the separation medium for density gradient centrifugation can be prepared to have a desired density by mixing diluents or separation media having different densities (specific gravity).
  • Histopaque can adjust the first separation medium and the second separation medium to a desired density using a commercially available medium having a density of 1.077 and a medium having a density of 1.119. It is.
  • These density gradient centrifugation media can be adjusted in osmotic pressure by adding sodium chloride (NaCl) or the like.
  • a fraction of maternal blood enriched with nucleated red blood cells is prepared as a smear after the following washing step.
  • ⁇ Washing process (step S16)> Next, the fraction of maternal blood in which the nucleated red blood cells are concentrated in the concentration step is washed by the washing step.
  • the maternal blood fraction can be washed by using phosphate buffered saline (PBS) as a washing solution, adding the washing solution to the maternal blood fraction, and performing shaking (centrifugation). it can.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the first cell treatment agent is contained in the washing solution, and the maternal blood fraction is washed with the washing solution containing the first cell treatment agent.
  • the occurrence of nuclear shadow can be reduced by washing with a washing liquid containing the first cell treatment agent.
  • Nucleus is a number of traces in the blood cell smear that the contents of the collapsed cells seem to have spread to the ground, and the nucleated blood cells are broken in the smear process and the nucleus adheres to the ground. it is conceivable that.
  • the nuclear shadow causes contamination in cell isolation, and causes variation in the results of genetic analysis after isolation.
  • At least one selected from albumin, polyethylene glycol (PEG), polyvinyl alcohol (PVA), and polyvinylpyrrolidone (PVP) can be used. It is preferable to use albumin, and bovine serum albumin (BSA: Bovine serum albumin) is more preferable.
  • the concentration of the first cell treatment agent in the washing liquid is preferably 1.5% by mass or more and 9.0% by mass or less, and more preferably 2.0% by mass or more and 5.0% by mass or less.
  • concentration is 1.5% by mass or more, the nuclear shadow can be almost eliminated.
  • concentration of a component is preferably 1.5% by mass or more and 9.0% by mass or less, and more preferably 2.0% by mass or more and 5.0% by mass or less.
  • a second cell treatment agent can be contained in the washing solution, and the fraction of maternal blood in which nucleated red blood cells are concentrated can be treated with the second cell treatment agent in the washing step.
  • the second cell treatment agent it is preferable to use at least one selected from sucrose, melezitose, trehalose and arginine, and trehalose is particularly preferable.
  • the concentration of the second cell treatment agent in the washing solution is preferably 1.2% by mass or more and 9.0% by mass or less, and more preferably 2.0% by mass or more and 5.0% by mass or less.
  • the concentration of the second cell treatment agent in the washing solution is preferably 1.2% by mass or more and 9.0% by mass or less, and more preferably 2.0% by mass or more and 5.0% by mass or less.
  • ⁇ Smearing step (step S18)> the fraction after the cleaning step is smeared on the substrate to produce a smear.
  • a smearing method a known technique can be used.
  • the treatment can be performed by bringing the solution containing the second cell treatment agent into contact with the blood cells of the maternal blood in the smearing step. .
  • the treatment of the second cell treatment agent in the smearing step can be used in addition to the maternal blood fraction immediately after smearing the concentrated maternal blood fraction on the substrate after the concentration step and the washing step. . Moreover, it can carry out by making the solution containing a 2nd cell processing agent contact the smear sample by which the fraction of the concentrated maternal blood was smeared on the board
  • the concentration of the second cell treatment agent in the maternal blood fraction is 1.2. It is preferable to add so that it may become mass% or more and 9.0 mass% or less, More preferably, it is 2.0 mass% or more and 5.0 mass% or less.
  • the concentration of the second cell treatment agent is 1.2 mass% or more and 9.0 mass% or less. It can be processed by contacting with a method of loading a buffer such as a certain phosphate buffer or a method of immersing in a buffer.
  • the smear After the smearing of the maternal blood fraction on the substrate, the smear is dried.
  • the smear can be dried by air drying or the like.
  • the second cell treatment agent is present in the blood cells, so that damage to the cells due to drying can be reduced. Since the second cell treatment agent only needs to be present during air-drying in the smearing process, it is brought into contact with blood cells either before or after smearing the fraction on the substrate in the washing process and smearing process. I can do it.
  • ⁇ Fixing step (Step S20)> Next, it is a preferable embodiment to fix the cells smeared on the substrate.
  • Cell immobilization is performed mainly to stabilize cell morphology and tissue structure, strengthen cell samples, improve staining, inactivate proteolytic enzymes, contaminate microorganisms, and suppress corrosion. .
  • By coagulating and dehydrating proteins in the cytoplasm and nucleus it is possible to prevent alteration of cells and to minimize changes in morphological characteristics.
  • immobilization methods include chemical immobilization for molecular cross-linking and protein insolubilization, and physical immobilization for drying and freezing. After perfusion with saline solution, perfusion method to quickly fix in deep tissue by perfusing fixative, soaked in cryogenic freezing embedding agent (OCT (OptimalCutting Temperature) compound etc.) and then frozen to liquid A freezing method in which the sample is stored in nitrogen, a drying method in which a sample is air-dried and then heated and fixed on a substrate with a flame or the like can be used.
  • OCT OptimalCutting Temperature
  • the second cell treatment agent can be used by mixing water and the second cell treatment agent in a fixing solution. By mixing the second cell treatment agent in the fixing solution, DNA damage is small, and DNA can be reliably recovered.
  • the second cell treatment agent contained in the fixing solution the same as the second cell treatment agent used in the washing step and / or the smearing step can be used, and trehalose is particularly preferable.
  • the concentration of the second cell treatment agent in the fixing solution is preferably such that the second cell treatment agent is contained in a saturated state in the fixing solution. More preferably, it is 1.2 mass% or more and 9.0 mass% or less, and it is more preferable that they are 2.0 mass% or more and 5.0 mass% or less.
  • the content of the second cell treatment agent in the fixing solution By setting the content of the second cell treatment agent in the fixing solution to 1.2% by mass or more, DNA amplification can be ensured. Moreover, it is preferable to set it to 9.0 mass% or less because the content of the second cell treatment agent does not become excessive while having the effect of ensuring the DNA amplification property.
  • any fixing method can be used, but it is preferable to perform chemical fixing in terms of simplicity.
  • the ethanol aqueous solution can be used with an ethanol content of 50 to 99.8%, preferably 70 to 95%. More preferably, it is 75 to 85%.
  • the level of fixation affects the strength with which blood cells adhere to the substrate surface. If the fixation level is too low, cells may fall off the substrate during subsequent smear handling. When the blood cells of the smear are fixed, it is necessary to satisfy a fixing level at which the blood cells are not detached.
  • the fixation level is low at a level where detachment of blood cells does not occur.
  • the fixing level can be controlled by the time of contact with the fixing solution.
  • the fixing time is preferably 0 to 60 minutes, and more preferably 3 to 30 minutes.
  • the smear is then dried.
  • the smear can be dried by air drying or the like. At the time of this drying, the presence of the second cell treatment agent in the blood cells makes it possible to reduce damage to the cells due to drying and loss of water.
  • the time which performs a fixing process may be implemented between a concentration process and a dyeing process. it can. Specifically, before the smear is smeared on the slide, the blood cells in the smear can be fixed. In addition, after the smearing process, the smear can be fixed. Among these, from the viewpoint of preventing aggregation of blood cells, it is preferable to perform a fixing process on the maternal blood smear.
  • ⁇ Dyeing process (step S22)> Next, blood cells on the smear are stained.
  • this blood cell staining is preferably carried out by staining cell nuclei.
  • This staining of cell nuclei is a step of staining with a staining solution intended for staining and drying.
  • the staining includes staining cells with dyes or pigments so that cells in maternal blood, particularly cells having cell nuclei, can be identified by light information.
  • staining is performed using a staining solution containing a staining dye that stains cell nuclei and a second cell treatment agent, so that DNA is less damaged and DNA can be reliably recovered. it can.
  • the second cell treatment agent contained in the staining solution the same as the second cell treatment agent used in the washing step and / or the smearing step and the fixing step can be used.
  • trehalose is used. It is preferable to use it.
  • the concentration of the second cell treatment agent in the staining solution is preferably 1.2% by mass or more and 9.0% by mass or less, and more preferably 2.0% by mass or more and 5.0% by mass or less. More preferred.
  • the content of the second cell treatment agent does not become excessive while having the effect of ensuring the DNA amplification property.
  • red blood cells and other blood cells are differentiated using light absorption in a wavelength region of 380 nm to 470 nm possessed by hemoglobin present in red blood cells.
  • a dye component having absorption in a wavelength region overlapping with the hemoglobin absorption band is included as a staining dye component, there may be a negative effect that the ability to detect hemoglobin decreases, and it becomes difficult to identify the nucleated red blood cells to be obtained. Therefore, it is preferable to use a staining dye that does not overlap the absorption wavelength region of hemoglobin as the staining dye component.
  • hematoxylin, toluidine blue, methylene blue, azure blue, cresyl violet, propidium iodide, methyl green, nuclea fast red, and the like can be used as the staining dye.
  • These staining dyes are substantially free from the detrimental effect on the ability to detect hemoglobin.
  • Hematoxylin is a staining dye that is also used in hematoxylin and eosin staining, which is a representative staining method. Hematoxylin itself is a negatively charged dye and does not have staining properties, but hematein produced by oxidation of hematoxylin forms a complex with the metal part of the mordant and becomes positively charged. Or bind to the phosphate group of ribosome and stain.
  • Meyer's hematoxylin solution hematoxylin 1.0 g, potassium alum 50 g, sodium iodate 0.2 g, chloral hydrate 50 g, crystalline citric acid (monohydrate) 1.0 g, distilled water to 1000 mL Up mixture.
  • Toluidine blue is a staining dye classified as a basic dye, like hematoxylin. Many things in the cell are stained, but especially those where there are many nucleic acids and their binding proteins are strongly stained.
  • Methylene blue is a thiazine-based basic dye that is positively charged and dyes intracellular acidic substances (nuclear DNA, RNA (ribonucleic acid), protein components) in a blue color tone. It also dyes basophil granules but turns metachromatically into a blue-purple color.
  • Azure blue matured from methylene blue is charged with (+) in aqueous solution and (-) with a basophil component (for example, a protein rich in nucleic acid having a phosphate group or glutamic acid having a carboxyl group) Join. That is, a basic dye, Azure Blue, is bonded to a nucleus having a DNA phosphate group to become purple.
  • a basophil component for example, a protein rich in nucleic acid having a phosphate group or glutamic acid having a carboxyl group
  • Cresyl violet is a kind of basic dye.
  • Propidium iodide is a nuclear dye that enhances red fluorescence by intercalating into a double helix structure of DNA. There are also many applications to flow cytometry.
  • methyl green Since methyl green reacts with phosphate groups contained in nucleic acids, it is used in pathological examinations and biological research especially for DNA staining.
  • the staining step is preferably performed on a smear prepared by smearing a maternal blood fraction from the viewpoint of dyeability. However, it can be carried out at any stage after the concentration step. Before the smear solution is smeared onto the substrate from the maternal blood concentration step, the blood cells in the solution can be stained. In addition, after smearing on the substrate, the smear can be stained.
  • the smear After completion of the staining process, the smear is dried.
  • the smear can be dried by air drying or the like. At the time of this drying, the presence of the second cell treatment agent in the blood cells makes it possible to reduce damage to the cells due to drying and loss of water.
  • the smearing process, the staining process, and the fixing process have a process of drying the cells on the substrate after each process.
  • the smearing process and the process of drying the smeared specimen of the staining process respectively.
  • damage to the cells can be reduced.
  • damage to cells inhibition of DNA amplification can be reduced in analysis after isolation of cells, and gene analysis can be performed reliably.
  • washing with a washing solution containing the first cell treatment agent can prevent the cytoplasm from being destroyed during smearing, and the desired cells can be smeared stably.
  • the present invention has an identification step of identifying nucleated red blood cells in maternal blood by analyzing blood cells having stained cell nuclei.
  • the identification step preferably includes a red blood cell identification step for identifying red blood cells based on spectral information of hemoglobin, and a nucleated red blood cell identification step for detecting stained cell nuclei and identifying nucleated red blood cells.
  • red blood cells and other blood cells are identified by utilizing light absorption in a wavelength region of 380 nm to 470 nm possessed by hemoglobin present in the red blood cells.
  • a staining pigment for identifying the presence or absence of nuclei the above-described hematoxylin, toluidine blue, methylene blue, azure blue, cresyl violet, propidium iodide, methyl green, which has substantially no light absorption in the light absorption wavelength region of hemoglobin
  • Red blood cells can be identified by using Nuclea Fast Red or the like.
  • staining methods such as Giemsa staining, May Grünwald Giemsa staining, Wright Giemsa staining, and hematoxylin / eosin staining, which are representative staining methods of blood cells.
  • the smear sample of maternal blood is irradiated with light having a maximum peak wavelength of 380 nm to 470 nm to obtain a transmission image, thereby obtaining red blood cells and red blood cells having no cytosolic hemoglobin absorption. Can be distinguished from blood cells.
  • the wavelength of light used for image acquisition preferably has a maximum peak wavelength of 390 nm to 430 nm, and more preferably 400 nm to 415 nm.
  • red blood cells which are blood cells having hemoglobin, are identified. Among these red blood cells, nucleated red blood cells having a nucleus are also included. In order to discriminate nucleated red blood cells from red blood cells including nucleated red blood cells, nucleated red blood cells and other red blood cells having no nuclei are discriminated using light absorption of the staining dye used for staining.
  • the nucleated red blood cells to be isolated are determined, and the cell position information acquired simultaneously with the image information is transferred to the cell isolation device.
  • nucleated red blood cell identification step it is possible to select maternally-derived nucleated red blood cells and fetal-derived nucleated red blood cells using spectral characteristics resulting from the difference in oxygen affinity of hemoglobin contained in red blood cells. it can.
  • the selection of nucleated red blood cells for example, by using a blood component coated on a glass substrate, utilizing the difference in spectral characteristics between nucleated red blood cells and red blood cells present in the vicinity of the nucleated red blood cells. It is possible to sort into nucleated red blood cells derived from fetuses and nucleated red blood cells derived from fetuses.
  • the probability that the cells isolated in the acquisition step are nucleated red blood cells derived from the fetus can be increased, and the number of cells subjected to DNA analysis can be reduced. it can.
  • FIG. 2 is a graph showing absorption coefficients with respect to the wavelengths of reduced hemoglobin (Hb) and oxidized hemoglobin (HbO 2 ) (described in JP-A No. 2014-014485).
  • the absorption coefficient is a constant indicating how much light the medium absorbs when the light enters the medium.
  • the absorption coefficient of hemoglobin changes due to the interaction with oxygen. That is, oxyhemoglobin has a red color tone, and becomes bluish as it becomes reduced hemoglobin.
  • Spectral characteristics used for selection of maternally-derived nucleated red blood cells and fetal-derived nucleated red blood cells are to detect a difference in a wavelength region where there is a difference in absorption coefficient between reduced hemoglobin and oxidized hemoglobin.
  • Hemoglobin in adult erythrocytes is tetramer ⁇ 2 ⁇ 2 (HbA).
  • hemoglobin in fetal erythrocytes is a tetramer ⁇ 2 ⁇ 2 (HbF) made up of two ⁇ chains and two ⁇ chains, and is converted into HbA2 consisting of HbA, which occupies most and a small number of HbF after birth. It is known to replace it.
  • the fetal hemoglobin obtains oxygen by receiving oxygen from the maternal hemoglobin (HbA) in the blood.
  • hemoglobin (HbA) contained in red blood cells in adult blood is tetramer ⁇ 2 ⁇ 2, but fetal hemoglobin (HbF) is ⁇ 2 ⁇ 2, and has a characteristic of higher oxygen affinity than HbA.
  • HbA maternal hemoglobin
  • HbF fetal hemoglobin
  • the oxygen saturation of central venous blood is said to be 60-80% normal, and this value fluctuates depending on systemic oxygen demand. Since HbA and HbF have different oxygen affinity, the amount of oxygen binding between HbA and HbF is different even in venous blood, and the amount of oxygen binding between HbF is higher than that of HbA. .
  • the maternal hemoglobin (HbA) and the fetal hemoglobin (HbF) also have a difference in oxygen affinity in the vein. As shown in FIG. 2, there is a difference in absorption coefficient between the reduced hemoglobin and the oxidized hemoglobin. Sorting is performed using the difference in absorbance between nucleated red blood cells derived from fetuses and nucleated red blood cells derived from fetuses. A light wavelength range of 400 to 650 nm is applied for measuring the absorbance. The absorbance is measured using at least one monochromatic light having a wavelength selected from this light wavelength range.
  • Absorbance can be measured more reliably by measuring the absorbance of each wavelength using multiple monochromatic lights of different wavelengths and detecting the ratio of the measured values of each wavelength.
  • it is an embodiment using monochromatic light having a wavelength selected from a light wavelength range of 400 to 500 nm, more preferably monochromatic light having a wavelength selected from a light wavelength range of more than 450 nm and less than 480 nm, and more than 550 nm
  • the light wavelength range is a monochromatic light having a wavelength selected from a light wavelength range exceeding 550 nm and less than 575 nm, and a monochromatic light having a wavelength selected from an optical wavelength range exceeding 575 nm and less than 585 nm. It is preferable to select according to the ratio of the absorbance. By deriving the ratio of absorbance measured by two or more different monochromatic lights, it is possible to eliminate absorbance errors caused by cells such as cell thickness and area between individual cells. As shown in FIG. 2, these light wavelength regions have a large difference in absorption coefficient between oxygenated hemoglobin (HbO 2 ) and reduced hemoglobin (Hb). Sorting between nuclear red blood cells and fetal nucleated red blood cells can be performed reliably.
  • HbO 2 oxygenated hemoglobin
  • Hb reduced hemoglobin
  • the optical wavelength range selected according to the optical characteristics is the wavelength of each optical wavelength region with the absorption coefficient of the graph shown in FIG. 2 sandwiching the wavelength where the absorption coefficient of reduced hemoglobin and the absorption coefficient of oxyhemoglobin are reversed. It is preferable to measure.
  • the wavelength of the first light wavelength region in which the absorption coefficient of fetal nucleated red blood cells (the ratio of oxygenated hemoglobin is high) is higher than the absorption coefficient of maternally derived nucleated red blood cells (the ratio of oxygenated hemoglobin is low);
  • the absorbance is measured at a wavelength in the second light wavelength region where the absorption coefficient of the nucleated red blood cells derived from the mother is higher than the absorption coefficient of the nucleated red blood cells derived from the fetus.
  • the ratio of the nucleated erythrocyte derived from a fetus and the maternal origin Since the difference in the proportion of nucleated red blood cells can be increased, fetal nucleated red blood cells can be reliably selected.
  • Examples of the first light wavelength region include a light wavelength region exceeding 400 nm and less than 500 nm, exceeding 525 nm and less than 550 nm, and exceeding 575 nm and less than 585 nm.
  • examples of the second light wavelength region include a light wavelength region of more than 550 nm and less than 575 nm.
  • red blood cells that do not have nuclei around nucleated red blood cells to be selected are used as reference red blood cells. By comparing, it is selected whether the nucleated red blood cells to be selected are fetal-derived nucleated red blood cells or maternally-derived nucleated red blood cells.
  • Fetal nucleated red blood cells can be more reliably selected from nucleated red blood cells to be sorted.
  • the acquisition step is a step of isolating and acquiring the target cell from the smear sample with the cell isolation device to which the cell position information of the target cell has been sent in the identification step.
  • isolation method a known method can be used, and it is particularly preferable to use a micromanipulation (MM) method or a laser microdissection (LMD) method.
  • MM micromanipulation
  • LMD laser microdissection
  • the micromanipulation system can be combined with various micromanipulators of Narishige Co., Ltd., for example.
  • the laser microdissection system for example, a commercially available system such as PALM MicroBeam, which is a laser microdissection system manufactured by ZEISS, can be used.
  • the recovered solution When using the micromanipulation method as the cell isolation method, use the recovered solution. It is preferable to use pure water as the recovered liquid. This is because, when a solution such as a phosphate buffer (PBS) is used, salt evaporation occurs due to evaporation of the solution, which may break cells.
  • PBS phosphate buffer
  • the supply of the recovered liquid is performed by pulling a borosilicate glass tube with a puller into two parts, and using one glass tube, which has been tip-treated with a microforge, for supplying ultrapure water (recovered liquid).
  • Cell isolation is achieved by dripping a few microliters of ultrapure water into the target cell region to be isolated, picking up the target cell using the other sharp tip glass tube, and collecting it in a microtube. I do.
  • PEN polyethylene naphthalate
  • PET polyethylene terephthalate
  • a membrane slide coated with polyethylene terephthalate) or other film can be used, but it is preferable to use a specimen in which a concentrate of maternal blood is smeared directly on a slide glass substrate.
  • the laser microdissection method When using the laser microdissection method to directly isolate a target cell by irradiating the target cell with a laser pulse using a smear sample with a maternal blood concentrate smeared on the substrate, As a physical effect to be given, deterioration of gene analysis of isolated cells has been a problem so far.
  • the presence of the second cell treatment agent used in the washing step to the staining step, and the use of the collected liquid reduce physical damage of the isolated cells and improve gene analysis. Can be good.
  • the reduction of the physical damage of the isolated cell requires the presence of the second cell treatment agent and is not expressed only by the first cell treatment agent.
  • pure water it is preferable to use pure water as the recovery liquid used in the laser microdissection method. This is because, when a solution such as a phosphate buffer (PBS) is used, salt evaporation occurs due to evaporation of the solution, which may break cells.
  • the recovered solution is used by dropping 1 to 100 ⁇ L of ultrapure water onto the target cell region to be isolated, and then the cells are isolated by irradiating with a laser pulse of a laser microdissection.
  • PBS phosphate buffer
  • the amplification step is a step of amplifying a nucleic acid contained in at least a fetal nucleated red blood cell chromosome identified in the identification step.
  • DNA is extracted from cells isolated from the smear, and genome amplification is performed. Genomic amplification can be performed using a commercially available kit.
  • the obtained cells are eluted from the cells through a general method of cell lysis using a surfactant, proteolysis step using protease K, etc.
  • the genomic DNA obtained by the above is used.
  • a reagent PicoPLEX WGAnkit based on polymerase chain reaction (PCR: Polymerase Chain Reaction) (New England Biolabs, PicoPLEX is a registered trademark), GenomePlex Single PigleGlenmePiGGlenmePiG (Registered Trademark), a reagent relating to the MALBAC method (Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles) disclosed in International Publication WO2012 / 166425A2 can be used.
  • GenomiPhi GE Healthcare, GenomiPhi is a registered trademark
  • REPLI-g Qiagen, REPLI-g is a registered trademark
  • PicoPLEXEWGA kit New England Biolabs
  • the presence or absence of amplification of DNA amplification products obtained by whole genome amplification can be confirmed by agarose gel electrophoresis or the like. Furthermore, it is preferable to purify the whole genome amplification product using QIAquick® PCR Purification® Kit (QIAGEN, QIAquick is a registered trademark).
  • NanoDrop Thermo-Fisher-Scientific, NanoDrop is a registered trademark
  • Quantus Fluorometer Promega, Quantus is a registered trademark
  • BioAnalyzer Agilent
  • DNA which is a nucleic acid present in the chromosome of fetal nucleated red blood cells
  • the number of fetal nucleated red blood cells that are the target of the amplification step may be at least one, but it is preferable to amplify nucleic acids obtained from a plurality of fetal nucleated red blood cells.
  • the chromosome of the nucleated red blood cell derived from the mother without the numerical abnormality may be selected as a reference for comparing the amount of the amplified product. This is a preferred embodiment.
  • nucleated red blood cells derived from a mother body When comparing nucleated red blood cells derived from a mother body as a reference, it is also one of preferred embodiments to amplify the nucleic acid of the chromosome of the nucleated red blood cell derived from the mother body identified in the nucleated red blood cell identification step.
  • the determination step the amount of at least fetal nucleated red blood cells amplified in the amplification step is determined, and the fetal nucleated red blood cells identified in the nucleated red blood cell identification step are analyzed by genetic analysis. This is a process of confirming that
  • DNA microarray for gene analysis, DNA microarray, digital PCR, next-generation sequencer, and nCounter System (NanoString, nCounter (registered trademark)) can be used.
  • the accuracy and speed of analysis are 1 degree. It is preferable to use a next-generation sequencer in view of the large number of samples that can be processed.
  • next-generation sequencer means a sequencer classified in comparison with a capillary sequencer (referred to as a first generation sequencer) using the Sanger method.
  • Next generation sequencers include second generation, third generation, fourth generation, and sequencers that will be developed in the future.
  • the most popular next-generation sequencer at present is a sequencer based on the principle of determining a base sequence by capturing fluorescence or light emission linked to complementary strand synthesis by DNA polymerase or complementary strand binding by DNA ligase. Specific examples include MiSeq (Illumina), HiSeq2000 (Illumina, HiSeq is a registered trademark), Roche 454 (Roche).
  • Burrows-Wheeler Aligner As a means for aligning sequence data obtained by the next-generation sequencer, Burrows-Wheeler Aligner (BWA) can be mentioned, and it is preferable to map the sequence data to a known human genome sequence by BWA.
  • Examples of means for analyzing genes include SAMtools and BEDtools, and it is preferable to analyze gene polymorphisms, gene mutations, and chromosome numbers by these analysis means.
  • nucleated red blood cells are fetal nucleated red blood cells by determining the allele sequence.
  • DNA that has been identified as fetal nucleated red blood cells and amplified by the polymerase chain reaction (amplification process) is determined in advance for the chromosome to be examined for numerical abnormalities.
  • the amount of the amplified product of DNA having the sequence of the 100-150 bp (base pair) base region is determined by a sequencer.
  • the chromosomes to be examined are preferably chromosome 13, chromosome 18, chromosome 21, and chromosome X.
  • Fetal nucleated red blood cells usually inherit one pair of chromosomes from their father and mother, and have two chromosomes except for sex chromosomes.
  • nucleated erythrocyte is a fetal nucleated erythrocyte or a maternal nucleated erythrocyte.
  • the nucleated red blood cell can be selected as a fetus-derived nucleated red blood cell.
  • the maternal cell to be subjected to genetic analysis is not particularly limited, but it is preferable to perform DNA analysis from white blood cells present on a maternal blood smear.
  • the alleles to be analyzed are single nucleotide polymorphisms (SNPs): SingletiNucleotide Polymorphism), copy number polymorphisms (CNP (CNPs) Copy Number Polymorphism) or tandem repeats (STR: Short TM TandemRep). It is preferable to do.
  • SNPs Single nucleotide polymorphisms
  • CNP copy number polymorphisms
  • STR Short TM TandemRep
  • Fetal genes inherit a pair of genes from their parents, and genetic information is recorded as a sequence of four types of chemical substances. In the case of humans, there are about 3 billion bases, but there is a sequence portion that varies depending on individuals at a ratio of 1 to 1000-2000, and this is called a single nucleotide polymorphism. If this single nucleotide polymorphism is analyzed and compared with leukocytes, which are maternally derived cells, if the single nucleotide polymorphism sequence can be confirmed in nucleated red blood cells, it will be confirmed that the nucleated red blood cells are of fetal origin. be able to.
  • the copy number polymorphism and the tandem repeat sequence are regions in which a DNA sequence is one unit in the DNA and the DNA sequence is repeatedly arranged in series, and this repeat region. Since fetuses inherit copy number variation and tandem repeats from fathers and mothers, nucleated red blood cells that have copy number variation and tandem repeats that differ from maternal white blood cells are fetal nucleated red blood cells. Can be confirmed.
  • the Y chromosome exists only in males, it does not exist in nucleated red blood cells derived from the mother. Therefore, when the fetus is a boy, if the presence of the Y chromosome can be confirmed, the nucleated red blood cells can be confirmed to be fetal nucleated red blood cells.
  • the determination step is a step of determining the presence or absence of a numerical abnormality of the fetal chromosome by comparing the amount of the amplified DNA product of fetal nucleated red blood cells determined in the determination step.
  • a chromosome other than the target chromosome to be examined for the numerical abnormality is selected and has a predetermined sequence of 100 to 150 bp region The amount of amplification of the DNA amplification product is determined with a sequencer.
  • the reference chromosome is an embodiment in which at least one of the chromosomes other than the target chromosome to be examined for the numerical abnormality of the chromosome of fetal nucleated red blood cells, or a maternally derived nucleated red blood cell. Is selected from the embodiments in which the chromosomes present in the identified cells are selected. In the present embodiment, it is preferable to select a chromosome present in a cell identified as a maternally derived nucleated red blood cell.
  • the fetus determines whether there is a numerical abnormality in the chromosome derived from the fetus based on the ratio between the amount of amplification product of the DNA of the target chromosome to be examined for the numerical abnormality and the amount of amplification product of the DNA of the reference chromosome. If the fetus is in a normal state, the amount of amplification product of the target chromosome DNA derived from the fetus to be examined for numerical abnormality and the amount of amplification product of the reference chromosome DNA are approximately 1: 1. It is expected to be. If there is a numerical abnormality that is a trisomy in which three chromosomes are normal, a ratio of 1.0: 1.5 (or 2: 3) is expected.
  • the amount of the amplification product of the chromosomal DNA derived from the fetus relative to the amount of the chromosomal DNA amplification product derived from the maternal when the normal fetus is pregnant, collected from a plurality of pregnancy mothers in advance.
  • Example 1 Collecting maternal blood After giving informed consent from a pregnant woman, 14 mL of peripheral blood was obtained in two 7 mL vacuum blood collection tubes containing EDTA-2Na (disodium ethylenediaminetetraacetate) as an anticoagulant. The obtained maternal blood was stored at 4 ° C. until processed in the concentration step.
  • EDTA-2Na sodium ethylenediaminetetraacetate
  • the concentrated maternal blood fraction was diluted with D-PBS ( ⁇ ) + 0.06 mass% EDTA + 3.0 mass% BSA (bovine serum albumin; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) + 3.0 mass% trehalose ( Wako Pure Chemical Industries, Ltd.); hereinafter referred to as PEBT) was dispersed as 15 mL and centrifuged at 22 ° C., 2000 rpm for 5 minutes. After completion of the centrifugation, the supernatant was removed with an aspirator.
  • D-PBS ⁇
  • EDTA 3.0 mass% BSA (bovine serum albumin; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) + 3.0 mass% trehalose ( Wako Pure Chemical Industries, Ltd.); hereinafter referred to as PEBT) was dispersed as 15 mL and centrifuged at 22 ° C., 2000 rpm for 5 minutes. After completion of the centrifugation, the supernatant was removed with an aspirator.
  • the maternal blood fraction was dispersed in 15 mL with a diluent (PEBT), centrifuged at 22 ° C., 1130 rpm, 5 minutes, and then the supernatant was removed with an aspirator. Further, the maternal blood fraction was dispersed as 15 mL with a diluent (PEBT), 10 ⁇ L of the dispersion was collected, and the number of cells was measured with a cell counter. Then, after centrifugation at 22 ° C., 1130 rpm, for 5 minutes, the supernatant was removed with an aspirator from the measurement results of the number of cells, and a smear was obtained.
  • PEBT diluent
  • the smear was collected with a micropipette, spotted on a slide glass, and uniformly smeared by a drag glass method to prepare a maternal blood smear and air-dried.
  • the dried smear was immersed in an 80% aqueous ethanol solution saturated with trehalose for 20 minutes and then air-dried.
  • the trehalose concentration was 3.0% by mass.
  • Examples 2 to 11, Comparative Examples 1 and 2> After performing informed consent from pregnant women of a plurality of different volunteers by the same method as in Example 1, maternal blood was collected, and the first cell treatment in the washing solution, fixing solution, and staining solution shown in Table 4 was performed. The concentrations of the agent and the second cell treatment agent were changed, and smears were prepared to give Examples 2 to 11 and Comparative Examples 1 and 2. Only in Example 11, the second cell treatment agent was added to the smear so as to have the amount shown in Table 4 to prepare a smear.
  • the smear sample of maternal blood was exposed to light containing light having a peak wavelength of 405 nm, and the smear sample was scanned to obtain a cell image and position information thereof.
  • the identified red blood cell image was analyzed for density at a peak wavelength of 617 nm to detect nuclei and identify nucleated red blood cells.
  • the nucleated red blood cells to be isolated were determined from the information obtained by the nucleated red blood cell identification process. Using the obtained cell position information, 8 cells were isolated from one maternal blood smear using a micromanipulator and collected in a microtube.
  • the obtained amplification product was purified using QIAquick PCR Purification Kit (manufactured by QIAGEN), and then the concentration of the amplification product was measured using Quantus Fluorometer dsDNA System (manufactured by Promega).
  • Multiplex PCR Primers used for multiplex PCR were prepared from multiple chromosomal positions for the purpose of analyzing fetal cells and chromosomal aberrations (SEQ ID NOs: 1-46; Tables 1 and 2).
  • Primers were prepared so that the PCR-amplified base length of each detection region was 100 to 150 base pairs, and the positions of the primers were designed so that each detection region contained a genetic polymorphism. 46 types of primers were mixed so that the final concentration of each primer was 25 nmol / L.
  • Multiplex PCR was performed using a Multiplex PCR Assay kit (manufactured by Takara Bio Inc.). As reaction conditions, 10 ng of whole genome amplification product obtained from each of fetal nucleated erythrocyte candidate cells as a template, 8 ⁇ L of 46 mixed primers, 0.125 ⁇ L Multiplex PCR Mix 1, 12.5 ⁇ L Multiplex PCR Mix 2 The reaction was carried out with 25 ⁇ L final solution with water.
  • the reaction was carried out in 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 90 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds.
  • the obtained PCR product was purified using QIAquick PCR Purification Kit (manufactured by QIAGEN).
  • D501-F SEQ ID NO: 47
  • D701-R SEQ ID NO: 48
  • D702-R SEQ ID NO: 49
  • D703-R SEQ ID NO: 50
  • D704-R SEQ ID NO: 50 shown in Table 3
  • D705-R SEQ ID NO: 52
  • D706-R SEQ ID NO: 53
  • the obtained PCR product was purified using AMPure XP Kit (manufactured by BECKMAN COULTER, AMPure is a registered trademark), and the concentration was measured using BioAnalyzer.
  • quantification was performed using KAPA Library Quantification Kits manufactured by Nippon Genetics.
  • the generation of the nuclear shadow could be reduced by including the first cell treatment agent in the cleaning solution.
  • the nuclear shadow could be eliminated by setting the concentration of the first cell treatment agent in the cleaning solution to 1.7% by mass or more.
  • the amplification property of DNA was good by including the second cell treatment agent in the washing solution and the staining solution.
  • the amplification rate of DNA recovered from the sorted cells was very high when the amount was preferably used, and the effect of the present invention was confirmed.

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Abstract

　標本作製時の細胞の破壊を防止し、目的となる細胞の解析を確実に行うことを可能にする。妊娠母体血中の有核赤血球を濃縮する濃縮工程と、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血の画分を洗浄する洗浄工程と、洗浄工程後の画分を基板に塗抹する塗抹工程と、基板上の画分中の血球細胞を染色する染色工程と、染色工程後の血球細胞を解析し、有核赤血球の候補細胞を識別する識別工程と、識別工程で識別された有核赤血球の候補細胞を基板上から取得する取得工程と、を有し、洗浄工程は、第一の細胞処理剤を含む洗浄液で洗浄し、洗浄工程および塗抹工程の少なくともいずれか１つの工程は、画分を第二の細胞処理剤で処理する工程を有し、染色工程は、染色色素および第二の細胞処理剤を含む染色液を用いて染色する有核赤血球候補細胞の単離方法である。

Description

有核赤血球候補細胞の単離方法
　本発明は、有核赤血球候補細胞の単離方法に係り、特に、妊娠母体血中の有核赤血球を検査するための有核赤血球候補細胞の単離方法に関する。
　出生前診断としては、従来より羊水検査等が行われている。しかし、この方法では、流産の可能性のあることが大きな問題として指摘されている。
　一方、妊娠母体（以下、単に「母体」ともいう）の血液中に胎児細胞が移行し、この胎児細胞が母体中を血液とともに循環していることが最近わかってきた。そこで、母体血を用いて、母体血中の胎児細胞の染色体のＤＮＡ（デオキシリボ核酸：deoxyribonucleic acid）を再現性よく確実に分析することができれば、流産の可能性の低い出生前診断を実現することができることとなる。
　しかしながら、母体血液中に存在する胎児細胞（有核赤血球）は、母体血数ｍＬ中に数個程度しか存在しないと言われており、胎児細胞を確実に取得することが、母体血を利用した出生前診断を行う上での大きな課題となっている。
　母体血中から胎児細胞である有核赤血球を取得する方法として、有核赤血球を濃縮する方法、例えば、密度勾配遠心分離を用いて、血漿成分、および母親の赤血球成分を取り除く技術がある。また、白血球の表面の蛋白質に特異的に免疫反応する抗体を用いて、磁気により母親の白血球を分離する技術（MACS法：Magnetic activated cell sorting）、胎児ヘモグロビンのγ鎖に特異的に免疫反応する抗体と蛍光色素を用いて胎児の有核赤血球を分離する技術（FACS法：Fluorescence activated cell sorting）等を用いて、母体血中の胎児細胞である有核赤血球を取得することが行われている。
　これらの方法は、血液中の胎児由来の有核赤血球の濃度を増加させ、目的の細胞を取得する確率を高めるのに有用な技術である。しかしながら、これらの技術は、目的の細胞である確率を高めることはできても、確実に短時間で胎児由来の有核赤血球を取得するには不十分であった。
　また、光学的な情報を用いて、細胞の種類を識別し、求める細胞を取得する技術が開示されている。例えば、下記の特許文献１には、細胞核および細胞質を染色して透過可視光の吸収画像を生成し、励起光を照射して核の蛍光画像を形成した後、細胞質と核のコントラスト画像を用いて有核赤血球を判別することが記載されている。特許文献２には、ヘモグロビンの最大吸収波長付近の４１５ｎｍの波長の光を用いて血球透過光と散乱光を測定することで、血球種類を識別する装置が記載されている。
　さらに、標本を作製する際に、細胞が破壊されて、目的の細胞を取得できないことを防止するため、細胞を保護する必要がある。例えば、特許文献３には、造血幹細胞等、有核細胞が高率に回収できる有核細胞分離回収方法において、細胞保護等の目的で、アルブミンやトレハロース等を添加しても良いことが記載されている。また、特許文献４には、ＳＰ細胞（Side Population）を濃縮する方法において、細胞保護等の目的で必要に応じ、ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）、アルブミン、トレハロース、ポリビニルピロリドン等を添加してもよいことが記載されている。特許文献５には、細胞診断用に適する細胞を回収する方法において、細胞保護等の目的で必要に応じ、ＥＤＴＡ、アルブミン、トレハロース、ポリビニルピロリドン等を添加してもよいことが記載されている。
　また、特許文献６には、母親全血試料中の母親及び胎児有核赤血球等の有核細胞を濃縮し単離する方法において、面への接着を低減させるためにウシ血清アルブミン等の物質で処理することが記載されている。また、細胞膜の安定性を改善するためにトレハロースやマルトースを用いることが記載されている。
特表２００２－５１４３０４号公報 特開昭５８－１１５３４６号公報 特開平１１－３２２６１８号公報 特開２００３－１１６５２１号公報 特開２００３－２０２３３４号公報 特表２０１４－５３３５０９号公報
　しかしながら、特許文献６に記載されている方法においても、細胞の保護が十分でなく、塗抹標本上で標的とする細胞を探す場合に、基板への塗抹、固定、染色あるいは水洗する過程で、標的とする細胞の細胞膜が破壊されて細胞が無くなり、細胞核の痕跡のみが残って核影となる細胞が観察されることがあった。母体血中の胎児由来の細胞等のように、非常に希少な細胞を探索して選別する場合には、目的の細胞の細胞膜が破壊されることは極力避ける必要がある。また、基板上に固定した細胞を剥離した後に、ＤＮＡ増幅を行うが、ＤＮＡ増幅を確実に行う必要がある。
　本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、標本作製時の細胞の破壊を防止し、目的となる細胞の解析を確実に行うことができる有核赤血球候補細胞の単離方法を提供することを目的とする。
　本発明は上記目的を達成するために、妊娠母体血中の有核赤血球を濃縮する濃縮工程と、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血の画分を洗浄する洗浄工程と、洗浄工程後の画分を基板に塗抹する塗抹工程と、基板上の画分中の血球細胞を染色する染色工程と、染色工程後の血球細胞を解析し、有核赤血球の候補細胞を識別する識別工程と、識別工程で識別された有核赤血球の候補細胞を基板上から取得する取得工程と、を有し、洗浄工程は、第一の細胞処理剤を含む洗浄液で洗浄し、洗浄工程および塗抹工程の少なくともいずれか１つの工程は、画分を第二の細胞処理剤で処理する工程を有し、染色工程は、染色色素および第二の細胞処理剤を含む染色液を用いて染色する有核赤血球候補細胞の単離方法を提供する。
　本発明の有核赤血球候補細胞の単離方法によれば、洗浄工程において、第一の細胞処理剤を含む洗浄液で洗浄を行うことで、塗抹工程において細胞質が破壊されることを防止することができ、目的となる有核赤血球候補細胞を安定して塗抹することができる。また、塗抹工程及び染色工程において、各工程の最後に乾燥を行うが、この乾燥時に第二の細胞処理剤を血球細胞が含むことにより、乾燥時の血球細胞の物理的ダメージを低減することができる。したがって、洗浄工程と塗抹工程の少なくともいずれか一方、および、染色工程において、第二の細胞処理剤で処理することで、血球細胞のダメージを減らし、細胞の単離後の解析において、ＤＮＡ増幅性阻害を低減することができ、遺伝子解析を確実に行うことができる。
　本発明の別の態様においては、血球細胞を固定する固定工程を有し、固定工程は、第二の細胞処理剤を含む固定液で処理することが好ましい。
　この態様によれば、固定工程においても最後に乾燥を行うため、第二の細胞処理剤を含む固定液で固定工程を行うことで、乾燥時に第二の細胞処理剤を血球細胞に含ませることができる。したがって、乾燥時の血球細胞の物理的ダメージを低減することができ、細胞の単離後の解析において、ＤＮＡ増幅性阻害を低減することができ、遺伝子解析を確実に行うことができる。
　本発明の別の態様においては、固定液中の第二の細胞処理剤の含有濃度が、１．２質量％以上９．０％質量以下であることが好ましい。
　本発明の別の態様においては、固定液中の第二の細胞処理剤の含有濃度が、飽和状態であることが好ましい。
　上記の態様は、固定液中の第二の細胞処理剤の含有濃度を規定したものであり、上記の範囲とすることで、ＤＮＡ増幅性を確保しつつ、第二の細胞処理剤が過剰になることを防止することができる。
　本発明の別の態様においては、第一の細胞処理剤が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、アルブミン、および、ポリビニルピロリドンから選ばれる少なくとも１つを含むことが好ましい。
　この態様は、第一の細胞処理剤の成分を限定したものであり、第一の細胞処理剤として上記の成分を含有することで、塗抹工程における細胞質の破壊を防止することができる。
　本発明の別の態様においては、第二の細胞処理剤が、スクロース、メレジトース、トレハロース、および、アルギニンから選ばれる少なくとも１つを含むことが好ましい。
　この態様は、第二の細胞処理剤の成分を限定したものであり、第二の細胞処理剤として上記の成分を含有することで、塗抹工程、染色工程、及び固定工程における乾燥において、血球細胞の物理的ダメージを減らすことができ、遺伝子解析を確実に行うことができる。
　本発明の別の態様においては、洗浄液中の第一の細胞処理剤の含有濃度が、１．５質量％以上９．０質量％以下であることが好ましい。
　本発明の別の態様においては、洗浄液中の第一の細胞処理剤の含有濃度が、２．０質量％以上５．０質量％以下であることが好ましい。
　上記の態様は、洗浄液中の第一の細胞処理剤の含有濃度を規定したものであり、上記の範囲とすることで、塗抹工程時の細胞質の破壊を防止し、核影の発現を無くすことができ、かつ、第一の細胞処理剤が過剰になることを防止することができる。
　本発明の別の態様においては、洗浄工程および塗抹工程の少なくともいずれか１つの工程において、第二の細胞処理剤を含む処理液中の第二の細胞処理剤の含有濃度が、１．２質量％以上９．０質量％以下であることが好ましい。
　本発明の別の態様においては、染色液中の第二の細胞処理剤の含有濃度が、１．２質量％以上９．０質量％以下であることが好ましい。
　本発明の別の態様においては、染色液中の第二の細胞処理剤の含有濃度が、２．０質量％以上５．０質量％以下であることが好ましい。
　上記の態様は、洗浄工程および塗抹工程に用いられる処理液中、および、洗浄液中の第二の細胞処理剤の含有濃度を規定したものであり、上記の範囲とすることで、ＤＮＡ増幅性を確保しつつ、第二の細胞処理剤が過剰になることを防止することができる。なお、「処理液」とは、洗浄工程においては洗浄液のことをいい、塗抹工程においては、塗抹物を分散した分散液、または、塗抹標本に接触させて処理する場合は、接触させる液のことをいう。
　本発明の別の態様においては、染色色素が、塩基性色素であることが好ましい。
　この態様によれば、染色色素として塩基性色素を用いることで、細胞核の染色を行うことができるので、ヘモグロビンの吸収波長領域ではない波長の光を用いることで、有核赤血球と、核の無い赤血球との識別を行うことができる。
　本発明の別の態様においては、染色色素が、ヘマトキシリン、トルイジンブルー、メチレンブルー、アズールブルー、クレシルバイオレット、ヨウ化プロピジウム、メチルグリーン、および、ヌクレアファストレッドから選ばれるいずれか１つであることが好ましい。
　この態様は、用いられる染色色素を限定したものであり、上記の染色色素はヘモグロビンの吸収帯と重なる波長領域に吸収を有さないため、ヘモグロビンの検出を精度良く行うことができ、ヘモグロビンの検出能力の低下を防止することができる。
　本発明の別の態様においては、取得工程において、レーザーマイクロダイセクションシステムでレーザーパルスを照射して、識別工程で識別された有核赤血球の候補細胞の単離を行う際、回収液を使用することが好ましい。
　この態様によれば、レーザーマイクロダイセクションシステムで有核赤血球の候補細胞の単離を行う際、今までの工程で用いられた第二の細胞処理剤に加えて、回収液を使用することで、単離した細胞の物理的ダメージを低減することができ、遺伝子解析を確実に行うことができる。
　本発明の有核赤血球候補細胞の単離方法によれば、洗浄工程において、第一の細胞処理剤を含む洗浄液で洗浄を行うことで、細胞膜が破壊されることを防止し、目的となる有核赤血球候補細胞を安定して塗抹することができる。また、洗浄工程および塗抹工程の少なくともいずれかの工程と、染色工程において、第二の細胞処理剤で処理することで、細胞の単離後の解析において、ＤＮＡ増幅阻害を低減することができ、遺伝子解析を確実に行うことができる。
図１は、有核接球候補細胞の単離方法の手順を示したフローチャート図である。 図２は、還元ヘモグロビン（Ｈｂ）と、酸化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）の波長に対する吸収係数を示すグラフ図である。
　以下、添付図面に従って、本発明に係る有核赤血球候補細胞の単離方法について説明する。なお、本明細書において「～」とは、その前後に記載される数値を下限値および上限値として含む意味で使用される。また、以下では、胎児由来の有核赤血球の取得及び解析を行う例で説明するが、母体由来の有核赤血球に対しても、核影を低減し、ＤＮＡ解析性を確保するとの効果を有する。
　図１は、有核赤血球候補細胞の単離方法の手順を示したフローチャート図である。有核赤血球候補細胞の単離方法は、妊娠母体からの母体血を採取する採取工程（ステップＳ１２）と、妊娠母体血中の有核赤血球を濃縮する濃縮工程（ステップＳ１４）と、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血の画分を洗浄する洗浄工程（ステップＳ１６）と、洗浄工程後の画分を基板に塗抹する塗抹工程（ステップＳ１８）と、血球細胞を固定する固定工程（ステップＳ２０）と、基板上の血球細胞を染色する染色工程（ステップＳ２２）と、染色工程後の血球細胞を解析し、有核赤血球の候補細胞を識別する識別工程（ステップＳ２４）と、識別工程で識別された有核赤血球の候補細胞を基板上から取得する取得工程（ステップＳ２６）と、を有する。
　＜採取工程（ステップＳ１２）＞
　採取工程は、血液試料である母体血を採取する工程である。母体血としては、侵襲のおそれのない妊娠母体の末梢血であることが好ましい。
　母体の末梢血には、母体由来の好酸球、好中球、好塩基球、単核球、リンパ球等の白血球や、核のない成熟した赤血球に加えて、母体由来の有核赤血球、そして胎児由来の有核赤血球が含まれる。胎児由来の有核赤血球は、妊娠後、６週程度から母体血中に存在するといわれている。出生前診断を行う本実施形態においては、妊娠後６週程度以降の母体の末梢血を検査する。この末梢血中で核を有する細胞としては、白血球と、希少な母体由来および胎児由来の有核赤血球が存在する。
　胎児由来の有核赤血球は、胎盤を通過して、母体の血液中に存在する赤血球前駆体である。母体が妊娠中には、胎児の赤血球は有核であり得る。この赤血球には染色体が存在するため、侵襲性が低い手段で、胎児由来の染色体および胎児遺伝子の入手が可能となる。この胎児由来の有核赤血球は、母体血中の細胞の１０６個に１個の割合で存在しているといわれており、母体の末梢血中には非常に存在確率が少ない。
　＜濃縮工程（ステップＳ１４）＞
　次に、濃縮工程により、採取工程で採取した母体血中の有核赤血球の濃縮を行う。母体血中に含まれる有核赤血球は極めて少ないことから、母体血を濃縮して有核赤血球の存在比率を上げることが必要となる。本発明においては、母体血を濃縮することにより、有核赤血球がより多く含有された画分を得ることが好ましい。
　濃縮工程において、母体血の濃縮に用いられる方法としては、公知の方法、例えば、密度勾配遠心分離法、ＭＡＣＳ法、ＦＡＣＳ法、レクチン法、あるいは、フィルタ濾過法などを用いることができる。なかでも、血球細胞の特性を利用し、簡便な濃縮方法として、密度勾配遠心分離法により濃縮を行うことが好ましい。濃縮工程の一例として、以下に、密度勾配遠心分離法について説明する。
　〔密度勾配遠心分離法〕
　密度勾配遠心分離法は、血液中の成分の密度の差を利用して分離する方法である。密度勾配遠心分離法は、分離用媒体を使用しない方法、また、１種の分離用媒体を使用してその分離用媒体の上下で分離する方法、あるいは、２種の分離用媒体を使用して目的の成分の密度領域を分離用媒体の間に挟み込むように分離する方法等を利用して、目的の成分（本実施形態においては、胎児由来を含む有核赤血球）を集めることができる。そして、目的の成分を含む画分を採取することで、母体血から有核赤血球を濃縮することができる。
　分離用媒体を使用しない方法としては、血液試料である母体の末梢血（希釈液で希釈されていてもよい）を遠心管に充填し、遠心分離を行った後に、目的の成分を採取することで有核赤血球の濃縮を行うことができる。
　１種の分離用媒体を使用する方法としては、遠心管の底部に分離用媒体を注入し、分離用媒体の上に血液試料である母体の末梢血（希釈液で希釈されていてもよい）を積層した後に遠心分離を行い、遠心分離後の分離用媒体の上部（分離用媒体の一部を含んでもよい）を採取することで有核赤血球の濃縮を行うことができる。
　２種の分離用媒体を使用する方法では、遠心管の底部に第１の分離用媒体を注入し、第１の分離用媒体の上に第２の分離用媒体を積層し、第２の分離用媒体の上に血液試料である母体の末梢血（希釈液で希釈されていてもよい）を積層した後に遠心分離にかけ、遠心分離後の第１の分離用媒体と第２の分離用媒体の間の層（第１の分離用媒体および／または第２の分離用媒体のそれぞれ一部を含んでもよい）を採取することで有核赤血球の濃縮を行うことができる。なお、第１の分離用媒体を積層した遠心管を第２の分離用媒体を積層する前に冷却すると、第１と第２の分離用媒体の境界領域での混合を抑制できる。
　国際公開ＷＯ２０１２／０２３２９８号公報には、胎児の有核赤血球を含めた母体の血液の密度が記載されている。その記載によると、想定される胎児由来の有核赤血球の密度は、１．０６５～１．０９５ｇ／ｍＬ程度、母体の血球の密度は、赤血球が１．０７０～１．１２０ｇ／ｍＬ程度、好酸球は１．０９０～１．１１０ｇ／ｍＬ程度、好中球は１．０７５～１．１００ｇ／ｍＬ程度、好塩基球が１．０７０～１．０８０ｇ／ｍＬ程度、リンパ球が１．０６０～１．０８０ｇ／ｍＬ程度、単核球が１．０６０～１．０７０ｇ／ｍＬ程度である。
　積層する分離用媒体の密度は、密度が１．０６５～１．０９５ｇ／ｍＬ程度の胎児由来の有核赤血球を、母体中の他の血球成分と分離するために設定される。例えば、２種の分離用媒体を使用する方法では、胎児由来の有核赤血球の中心の密度は、１．０８０ｇ／ｍＬ程度であるため、この密度を挟む２つの異なる密度の分離用媒体を作成し、隣接して重層することで、その界面に所望の胎児由来の有核赤血球を集めることが可能となる。好ましくは、第１の分離用媒体の密度を１．０８ｇ／ｍＬ以上１．１０ｇ／ｍＬ以下、第２の分離用媒体の密度は１．０６ｇ／ｍＬ以上１．０８ｇ／ｍＬ以下として設定することが好ましい。更に好ましくは、第１の分離用媒体の密度を１．０８ｇ／ｍＬ以上１．０９ｇ／ｍＬ以下、第２の分離用媒体の密度を１．０６５ｇ／ｍＬ以上１．０８ｇ／ｍＬ以下である。具体的な例としては、第１の分離用媒体の密度を１．０８５ｇ／ｍＬ、第２の分離用媒体の密度を１．０７５ｇ／ｍＬに設定することで、血漿成分、好酸球および単核球を、回収する所望の画分から分離することが可能となる。また、赤血球、好中球、リンパ球の一部も分離することが可能となる。本実施形態では、第１の分離用媒体と、第２の分離用媒体は同じ種類でも、異なる種類でも、本発明の効果を実現できる限りにおいて制限はないが、同じ種類の媒体を用いることが好ましい態様である。
　濃縮工程で用いられる密度勾配遠心分離用の分離用媒体としては、ポリスクロースとジアトリゾ酸ナトリウムを含む溶液であるＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）、非透析性ポリビニルピロリドンをコーティングした直径１５～３０ｎｍのシリカゾルを含む溶液であるＰｅｒｃｏｌｌ（登録商標）、ショ糖から作られた側鎖に富んだ中性の親水性ポリマー溶液であるＦｉｃｏｌｌ（登録商標）－Ｐａｑｕｅなどの分離用媒体を使用することができる。本実施形態では、ＨｉｓｔｏｐａｑｕｅおよびＰｅｒｃｏｌｌを使用することが好ましい態様である。
　密度勾配遠心分離の分離用媒体は、希釈液あるいは密度（比重）の異なる分離用媒体の混合により所望の密度に調製することが可能である。例えば、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅは、市販されている密度１．０７７の媒体と、密度１．１１９の媒体を用いて、第１の分離用媒体および第２の分離用媒体を所望の密度に調整することが可能である。また、これらの密度勾配遠心分離用媒体は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）などの添加により浸透圧を調節することができる。
　有核赤血球が濃縮された母体血の画分は、以下の洗浄工程後、塗抹液として調製される。
　＜洗浄工程（ステップＳ１６）＞
　次に、洗浄工程により、濃縮工程で有核赤血球が濃縮された母体血の画分の洗浄を行う。母体血の画分の洗浄は、洗浄液としてリン酸緩衝液（ＰＢＳ：Phosphate buffered saline）を用い、洗浄液を母体血の画分に添加し、振盪（遠心分離）を行うことで、洗浄することができる。
　また、本実施形態においては、洗浄液中に第一の細胞処理剤を含有し、第一の細胞処理剤を含む洗浄液で母体血の画分の洗浄を行う。
　第一の細胞処理剤を含む洗浄液を用いて洗浄を行うことで、核影の発生を低減させることができる。核影とは、血球細胞の塗抹標本において、崩壊した細胞の内容物が下地に広がったと思われる多数の痕跡のことであり、塗抹工程において有核血球が壊れて、核が下地に付着したものと考えられる。核影は、細胞単離においてコンタミネーションの原因となり、単離後の遺伝子解析結果のバラツキの原因となる。第一の細胞処理剤を含む洗浄液を用いて洗浄を行うことで、細胞の保護を行うことができ、塗抹工程での核影の発生を低減させることができる。
　第一の細胞処理剤としては、アルブミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：polyethylene glycol）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ：polyvinyl alcohol）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ：polyvinylpyrrolidone）から選ばれる少なくとも１つを用いることができ、なかでもアルブミンを用いることが好ましく、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：Bovine serum albumin）が更に好ましい。
　洗浄液中の第一の細胞処理剤の含有濃度は、１．５質量％以上９．０質量％以下であることが好ましく、２．０質量％以上５．０質量％以下であることが好ましい。含有濃度が１．５質量％以上であると、核影をほぼ無くすことができる。また、９．０質量％以下とすることで、核影を無くすという効果を有しつつ、第一の細胞処理剤の含有量が過剰量とはならないため好ましい。なお、第一の細胞処理剤として、複数の成分を洗浄液中に含んで使用する場合は、成分の合計濃度を上記範囲内とすることが好ましい。
　また、洗浄液中に第二の細胞処理剤を含有させ、洗浄工程において、有核赤血球が濃縮された母体血の画分を第二の細胞処理剤で処理することもできる。第二の細胞処理剤としては、スクロース、メレジトース、トレハロース及びアルギニンのうちから選ばれる少なくとも１つを用いることが好ましく、なかでもトレハロースを用いることが好ましい。第二の細胞処理剤で処理することで、塗抹標本から単離した細胞のＤＮＡ増幅を確実に行うことができ、解析を確実に行うことができる。基板上に塗抹した細胞が乾燥するときに、第二の細胞処理剤を含む水溶液が細胞内に浸透して、細胞内に第二の細胞処理剤が存在する状態で乾燥される。第二の細胞処理剤が存在しない状態で乾燥が進むと、乾燥によりＤＮＡが損傷する場合があるが、第二の細胞処理剤が存在する状態で乾燥を行うことで、第二の細胞処理剤が水の代わりとなり、乾燥によるＤＮＡへの損傷を低減できると推測される。
　洗浄液中の第二の細胞処理剤の含有濃度は、１．２質量％以上９．０質量％以下であることが好ましく、２．０質量％以上５．０質量％以下であることが好ましい。第二の細胞処理剤の含有濃度を１．２質量％以上とすることで、ＤＮＡ増幅性を確保することができる。また、９．０質量％以下とすることで、ＤＮＡ増幅性の確保という効果を有しつつ、第二の細胞処理剤の含有量が過剰量とならないため好ましい。なお、第二の細胞処理剤として、複数の成分を洗浄液中に含んで使用する場合は、成分の合計濃度を上記濃度範囲内とすることが好ましい。
　＜塗抹工程（ステップＳ１８）＞
　次に、洗浄工程後の画分を基板に塗抹し、塗抹標本の作製を行う。塗抹方法としては、公知の技術により行うことができる。
　洗浄工程で、洗浄液中に第二の細胞処理剤を含まない場合は、塗抹工程において、第二の細胞処理剤を含有する溶液を母体血の血球細胞に接触させることによって処理を行うことができる。また、洗浄工程と塗抹工程の両方において、第二の細胞処理剤による処理を行ってもよい。
　塗抹工程における第二の細胞処理剤の処理は、濃縮工程及び洗浄工程後の、濃縮された母体血の画分を基板に塗抹する直前に、母体血の画分に加えて使用することができる。また、濃縮された母体血の画分が基板に塗抹された塗抹標本に、第二の細胞処理剤を含有する溶液を接触させることで行うことができる。
　塗抹前に、第二の細胞処理剤を母体血の画分に加える場合は、母体血の画分中（または、画分の希釈液中）の第二の細胞処理剤の濃度が１．２質量％以上９．０質量％以下となるように添加することが好ましく、より好ましくは２．０質量％以上５．０質量％以下である。
　また、母体血の画分が塗抹された基板を第二の細胞処理剤を含有する溶液に接触させる場合、第二の細胞処理剤の濃度が１．２質量％以上９．０質量％以下であるリン酸緩衝液等のバッファーを積載する方法、あるいはバッファーに浸漬させる方法により接触させることで処理することができる。
　母体血の画分の基板上への塗抹終了後、塗抹標本を乾燥する。塗抹標本の乾燥は、風乾などにより行うことができる。この乾燥の際、第二の細胞処理剤が血球細胞中に存在することで、乾燥による細胞へのダメージを低減することができる。第二の細胞処理剤は、塗抹工程の風乾時に存在すればよいため、洗浄工程、および、塗抹工程の基板に画分を塗抹する前、または、塗抹後のいずれかにおいて、血球細胞に接触させることができればよい。
　＜固定工程（ステップＳ２０）＞
　次に、基板上に塗抹された細胞の固定化を行うことが好ましい態様である。細胞の固定化は、細胞の形態や組織構造の安定化、細胞サンプルの強化、染色性向上、タンパク質分解酵素の不活性化、微生物のコンタミネーション、及び腐食の抑制を主目的に行うものである。細胞質及び核内のタンパク質の凝固・脱水を行うことにより、細胞の変質を防ぎ、形態学的特徴の変化を最小限に止めることが可能である。
　固定方法としては、分子架橋やタンパク質不溶化を行う化学的固定、乾燥や凍結を行う物理的固定などがあり、具体的には、サンプルを固定液に浸けて固定化する浸漬法、採取して生理食塩水を潅流した後、固定液を潅流することで、深部組織に迅速に固定化する潅流法、低温凍結用包理剤（ＯＣＴ（Optimal Cutting Temperature）コンパウンドなど）に浸してから凍結して液体窒素中で保存する凍結法、サンプルを風乾してから炎などにより基板上に加熱固定する乾燥法などにより行うことができる。
　上記の固定方法の中で、固定液を用いて行う場合は、固定液中に第二の細胞処理剤を含有することが好ましい。また、確実に細胞の解析を行う場合は、第二の細胞処理剤を含む固定液を用いて細胞の固定を行うことが好ましい。
　第二の細胞処理剤は、固定液中に水と第二の細胞処理剤を混合させて用いることができる。固定液中に第二の細胞処理剤を混合させることで、ＤＮＡの損傷が少なく、確実にＤＮＡの回収をすることができる。固定液中に含まれる第二の細胞処理剤としては、上記の洗浄工程及び／又は塗抹工程で用いる第二の細胞処理剤と同様のものを用いることができ、なかでもトレハロースを用いることが好ましい。また、固定液中の第二の細胞処理剤の濃度は、固定液中に第二の細胞処理剤が飽和状態で含有していることが好ましい。さらに好ましくは、１．２質量％以上９．０質量％以下であり、２．０質量％以上５．０質量％以下であることがより好ましい。固定液中の第二の細胞処理剤の含有量を１．２質量％以上とすることでＤＮＡ増幅性を確保することができる。また、９．０質量％以下とすることで、ＤＮＡ増幅性の確保という効果を有しつつ、第二の細胞処理剤の含有量が過剰量とならないため好ましい。なお、第二の細胞処理剤として、複数の成分を洗浄液中に含んで使用する場合は、成分の合計濃度を上記濃度範囲内とすることが好ましい。
　本実施形態においては、いずれの固定方法も使用することができるが、簡便さの点で、化学的固定を行うことが好ましい。この場合、固定液はホルムアルデヒド系やアルコール系を使用することが好ましく、エタノール水溶液を使用することが安全性や取り扱いやすさの点で最も好ましい。
　エタノール水溶液は、エタノール含有量が５０～９９．８％を使用することができ、７０～９５％であることが好ましい。７５～８５％であることがより好ましい。
　塗抹標本を固定する場合、固定レベルは血球細胞が基板面に接着する強度に影響する。固定レベルが低すぎると、その後の塗抹標本の取り扱いにおいて、細胞が基板から剥がれ落ちる可能性がある。塗抹標本の血球細胞を固定する場合、血球細胞の剥離が生じない固定レベルを満たす必要がある。
　本実施形態においては、血球細胞の剥離が生じないレベルで、固定レベルが低いことが好ましい。固定レベルは固定液に接触させている時間で制御することができる。本実施形態における固定時間は０～６０分とすることが好ましく、３～３０分とすることがより好ましい。
　塗抹標本に対して固定液を用いて固定工程を行った場合、その後、塗抹標本を乾燥する。塗抹標本の乾燥は、風乾などにより行うことができる。この乾燥の際、第二の細胞処理剤が血球細胞中に存在することで、乾燥し、水がなくなることによる細胞へのダメージを低減することができる。
　なお、本実施形態においては、塗抹工程後に固定工程を行う態様で説明したが、本発明はこれに限定されず、固定工程を行う時期は、濃縮工程から染色工程までの間に実施することができる。具体的には、塗抹液をスライドに塗抹する前には、塗抹液中の血球細胞に対して固定処理を行うことができる。また、塗抹工程後は、塗抹標本に対して固定処理を行うことができる。なかでも、血球細胞の凝集防止の観点から、母体血の塗抹標本に対して固定処理を行うことが好ましい。
　＜染色工程（ステップＳ２２）＞
　次に、塗抹標本上の血球細胞を染色する。この血球細胞の染色は、特に、細胞核を染色することを含む態様が好ましい。この細胞核の染色は、染色を目的とする染色液で染色し、乾燥させる工程である。ここで、染色とは、母体血中の細胞、特に、細胞核を有する細胞を光の情報で識別可能にするために染料、あるいは、色素を用いて細胞を染めることを含む。
　この染色工程で、細胞核を染色する染色色素と、第二の細胞処理剤と、を含む染色液を用いて染色を行うことで、ＤＮＡへの損傷が少なく、しかも確実にＤＮＡを回収することができる。
　染色液中に含まれる第二の細胞処理剤としては、上記の洗浄工程及び／又は塗抹工程と、固定工程で用いる第二の細胞処理剤と同様のものを用いることができ、なかでもトレハロースを用いることが好ましい。また、染色液中の第二の細胞処理剤の濃度は、１．２質量％以上９．０質量％以下であることが好ましく、２．０質量％以上５．０質量％以下であることがより好ましい。染色液中の第二の細胞処理剤の含有量を１．２質量％以上とすることでＤＮＡ増幅性を確保することができる。また、９．０質量％以下とすることで、ＤＮＡ増幅性の確保という効果を有しつつ、第二の細胞処理剤の含有量が過剰量とならないため好ましい。なお、第二の細胞処理剤として、複数の成分を洗浄液中に含んで使用する場合は、成分の合計濃度を上記濃度範囲内とすることが好ましい。
　［染色色素］
　本実施形態においては、赤血球中に存在するヘモグロビンが有する３８０ｎｍから４７０ｎｍの波長領域の光吸収を利用して、赤血球とそれ以外の血球を区別する。染色色素成分として、ヘモグロビンの吸収帯と重なる波長領域に吸収をもつ色素成分を含む場合、ヘモグロビンの検出能力が低下する弊害が生じる場合があり、求める有核赤血球の識別が困難となる。したがって、染色色素成分は、ヘモグロビンが有する上記の吸収波長領域と重ならない染色色素を用いることが好ましい。
　本実施形態においては、染色色素としてヘマトキシリン、トルイジンブルー、メチレンブルー、アズールブルー、クレシルバイオレット、ヨウ化プロピジウム、メチルグリーン、及びヌクレアファストレッド等を使用することができる。これらの染色色素は、ヘモグロビン検出能力を低下させる弊害が実質的にない。また、細胞核のみを染色する染色色素を用いることが好ましい。細胞核のみを染色することで、有核細胞の検出を容易に行うことができる。また、細胞質が染色されないことで、ヘモグロビンの検出を行うことができ、赤血球と他の血球細胞の識別性を向上させることができる。
　広く使用されている血球の代表的な染色法としては、ギムザ染色、メイ・グリュンワルド・ギムザ染色、ライト・ギムザ染色及びヘマトキシリン・エオジン染色等がある。しかしながら、これらの染色色素にはヘモグロビンの吸収帯と重なる波長領域に吸収帯をもつため、本発明においては好ましくない。
　ヘマトキシリンは、代表的染色法であるヘマトキシリン・エオジン染色でも使用される染色色素である。ヘマトキシリン自体は負に荷電した色素で染色性はもたないが、ヘマトキシリンが酸化されて生じたヘマテインが媒染剤の金属部分と錯体を形成して正に荷電することで、負に帯電している細胞核やリボソームのリン酸基と結合して染色する。具体的には、マイヤーヘマトキシリン溶液（ヘマトキシリン１．０ｇ、カリウムミョウバン５０ｇ、ヨウ素酸ナトリウム０．２ｇ、抱水クロラール５０ｇ、結晶性クエン酸(一水和物)１．０ｇ、蒸留水で１０００ｍＬにメスアップの混合液）が使用される。
　トルイジンブルーは、ヘマトキシリンなどと同様に塩基性色素に分類される染色色素である。細胞内の多くのものが染色されるが、特に核酸とその結合タンパクの多いところが強く染色される。
　メチレンブルーは、チアジン系の塩基性色素で陽性に荷電し、細胞内の酸性物質（核のＤＮＡ、ＲＮＡ（リボ核酸：ribonucleic acid）、タンパク成分）を青色の色調に染める。また好塩基性の顆粒も染めるがメタクロマジーをおこして青紫色となる。
　メチレンブルーから成熟したアズールブルーは水溶液では（＋）に荷電し、（－）に荷電している好塩基性成分（例えば、リン酸基を有する核酸やカルボキシル基を有するグルタミン酸が豊富な蛋白質など）と結合する。即ち、ＤＮＡリン酸基を有する核には塩基性色素のアズールブルーが結合して紫色となる。
　クレシルバイオレットは、塩基性色素の一種である。
　ヨウ化プロピジウムは、ＤＮＡの二重螺旋構造にインターカレートすることにより赤色蛍光が増強される核染色色素である。またフローサイトメトリーへの応用例も数多い。
　メチルグリーンは、核酸に含まれるリン酸基と反応することから、特にＤＮＡ染色のため病理検査や生物学分野の研究で使用されている。
　ヌクレアファストレッドは、細胞核をピンク又は赤色に染色する。
　染色工程は、染色性の観点から母体血の画分が塗抹された塗抹標本に対して行うことが好ましい。しかしながら、濃縮工程以降であれば、どの段階においても実施することができる。母体血の濃縮工程から塗抹液を基板に塗抹する前は、溶液中の血球に対して染色処理を行うことができる。また、基板に塗抹後は、塗抹標本に対して染色処理を行うことができる。
　染色工程終了後、塗抹標本を乾燥する。塗抹標本の乾燥は、風乾などにより行うことができる。この乾燥の際、第二の細胞処理剤が血球細胞中に存在することで、乾燥し、水がなくなることによる細胞へのダメージを低減することができる。
　このように、塗抹工程、染色工程、および、固定工程においては、各工程後に基板上の細胞を乾燥させる工程を有するが、塗抹工程、および、染色工程の塗抹標本を乾燥させる工程において、それぞれに用いられる塗抹液、および、染色液に第二の細胞処理剤を含有させることで、細胞へのダメージを低減することができる。細胞へのダメージを低減することで、細胞の単離後の解析において、ＤＮＡ増幅阻害を低減することができ、遺伝子解析を確実に行うことができる。
　また、洗浄工程において、第一の細胞処理剤を含む洗浄液で洗浄を行うことで、塗抹時の細胞質の破壊を防止することができ、目的となる細胞を安定して塗抹することができる。
　＜識別工程（ステップＳ２４）＞
　さらに、本発明は、染色された細胞核を有する血球細胞を解析して母体血中の有核赤血球を識別する識別工程を有する。識別工程としては、ヘモグロビンの分光情報により赤血球を識別する赤血球識別工程と、染色した細胞核を検出し、有核赤血球を識別する有核赤血球識別工程と、を含むことが好ましい。
　〔赤血球識別工程〕
　赤血球識別工程は、赤血球中に存在するヘモグロビンが有する３８０ｎｍから４７０ｎｍの波長領域での光吸収を利用して、赤血球とそれ以外の血球を識別する。核の有無を識別する染色色素として、実質的にヘモグロビンの光吸収波長領域に光吸収を有さない、上述したヘマトキシリン、トルイジンブルー、メチレンブルー、アズールブルー、クレシルバイオレット、ヨウ化プロピジウム、メチルグリーン、ヌクレアファストレッド等を用いることで、赤血球の識別を行うことができる。そのため、血球の代表的な染色法である、ギムザ染色、メイ・グリュンワルド・ギムザ染色、ライト・ギムザ染色及びヘマトキシリン・エオジン染色等の染色法は用いないことが好ましい。
　本実施形態においては、母体血の塗抹標本に対して、最大ピーク波長が３８０ｎｍから４７０ｎｍの波長の光を照射してその透過画像を取得することによって赤血球と、細胞質にヘモグロビンの吸収の無い赤血球以外の血球と、を識別することができる。画像取得に用いられる光の波長は、最大ピーク波長が３９０ｎｍから４３０ｎｍであることが好ましく、４００ｎｍから４１５ｎｍであることが更に好ましい。
　〔有核赤血球識別工程〕
　赤血球識別工程により、ヘモグロビンを有する血球である赤血球が識別される。これらの赤血球の中には、核を有する有核赤血球も含まれる。有核赤血球を含む赤血球から、有核赤血球を識別するために、染色に用いた染色色素の光吸収を利用して、有核赤血球とそれ以外の核のない赤血球を識別する。
　有核赤血球を識別した後、単離する有核赤血球を決定し、画像情報と同時に取得した細胞位置情報を細胞単離装置に転送する。
　（母体由来または胎児由来の有核赤血球の選別）
　さらに、有核赤血球識別工程において、赤血球に含まれるヘモグロビンの酸素親和性の違いに起因する分光特性を利用して、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球と、を選別することができる。有核赤血球の選別は、例えば、ガラス基板上に塗布された血液成分を用いることにより、有核赤血球と、この有核赤血球の近傍に存在する赤血球との分光特性の差異を利用して、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別することができる。識別工程において、胎児由来の有核赤血球を選別することで、取得工程で単離する細胞が胎児由来の有核赤血球である確率を高めることができ、ＤＮＡ解析を行う細胞の数を減らすことができる。
　図２は、還元ヘモグロビン（Ｈｂ）と、酸化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）の波長に対する吸収係数を示すグラフ図である（特開２０１４－０１４４８５号公報に記載）。ここで、吸収係数とは、光がある媒質に入射したとき、その媒質がどのくらいの光を吸収するかを示す定数である。図２に示すように、ヘモグロビンは酸素との相互作用によって、吸収係数が変化することが知られている。即ち、酸化ヘモグロビンは赤い色調を有しており、還元ヘモグロビンになるに従い、青味を帯びてくる。
　母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球との選別に用いられる分光特性は、還元ヘモグロビンと酸化ヘモグロビンとの吸収係数の差異の存在する波長域で差を検出するものである。成人の赤血球中のヘモグロビンは、４量体α２β２（ＨｂＡ）である。一方、胎児の赤血球中のヘモグロビンは、２本のα鎖と２本のγ鎖によって作られた４量体α２γ２（ＨｂＦ）であり、生後、大部分を占めるＨｂＡと少数のＨｂＦからなるＨｂＡ２に置き換わっていくことが知られている。胎盤中では、血液中の妊娠母体のヘモグロビン（ＨｂＡ）から酸素の提供を受けることで、胎児のヘモグロビンは酸素を得ている。そして、成人の血液中の赤血球に含まれるヘモグロビン（ＨｂＡ）は、４量体α２β２であるが、胎児型のヘモグロビン（ＨｂＦ）はα２γ２であり、ＨｂＡに比べて酸素親和性が高いという特徴を有する。出生前診断においては、血液試料として妊娠母体の末梢血を採取し、検査を行うことが好ましい。末梢血は、通常、静脈から採取するものであり、静脈中の血液の酸素の量は、動脈中の酸素の量より乏しくなる。健常人では、中心静脈血の酸素飽和度は、６０～８０％が正常値といわれており、この値は、全身の酸素需要により上下する。ＨｂＡとＨｂＦは、酸素親和性が異なるため、静脈血中においても、ＨｂＡとＨｂＦの酸素結合量が異なり、ＨｂＦの酸素結合量がＨｂＡの酸素結合量よりも高くなるという特徴を有している。
　母体のヘモグロビン（ＨｂＡ）と胎児のヘモグロビン（ＨｂＦ）においても、静脈中で酸素親和性に差があり、図２に示すように、還元ヘモグロビンと酸化ヘモグロビンは、吸収係数に差が生じるので、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球の吸光度の差を用いて選別する。吸光度の測定には、４００～６５０ｎｍの光波長域が適用される。この光波長域から選択される波長を有する少なくとも１つの単色光を用いて吸光度が測定される。 
　また、吸光度の測定は、異なる波長の複数単色光を用いて、各波長の吸光度を測定し、各波長の測定値の割合を検出することでより確実に有核赤血球の選別を行うことができる。好ましくは、４００～５００ｎｍの光波長域から選択された波長の単色光を用いる態様であり、より好ましくは４５０ｎｍを超え４８０ｎｍ未満の光波長域から選択された波長の単色光、および、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の光波長域から選択された波長の単色光をそれぞれ用い、各波長の吸光度の割合により選別することが好ましい。また、光波長域は、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の光波長域から選択された波長の単色光、および、５７５ｎｍを超え５８５ｎｍ未満の光波長域から選択された波長の単色光をそれぞれ用い、各波長の吸光度の割合により選別することが好ましい。２種類以上の異なる単色光により測定した吸光度の割合を導出することで、個々の細胞間に、細胞の厚みや面積などの細胞間に起因する吸光度の誤差を排除することができる。これらの光波長域は、図２に示すように、酸化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）と還元ヘモグロビン（Ｈｂ）とで、吸収係数の差が大きいので、この光波長域を用いることで、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球のとの選別を確実に行うことができる。
　また、光学特性により選別する光波長域は、図２に示すグラフの吸収係数が還元ヘモグロビンの吸収係数と酸化ヘモグロビンの吸収係数の大きさが逆転する波長を挟んでそれぞれの光波長域の波長で測定することが好ましい。すなわち、胎児由来の有核赤血球（酸化ヘモグロビンの割合が高い）の吸収係数が、母体由来の有核赤血球（酸化ヘモグロビンの割合が低い）の吸収係数より高い第１の光波長域の波長と、母体由来の有核赤血球の吸収係数が胎児由来の有核赤血球の吸収係数より高い第２の光波長域の波長と、で吸光度を測定する。そして、第１の光波長域の波長で測定した吸光度と、第２の光波長域の波長で測定した吸光度の割合を求め、比較することで、胎児由来の有核赤血球の割合と母体由来の有核赤血球の割合の差を大きくすることができるので、胎児由来の有核赤血球の選別を確実に行うことができる。
　第１の光波長域としては、４００ｎｍを超え５００ｎｍ未満、５２５ｎｍを超え５５０ｎｍ未満、および、５７５ｎｍを超え５８５ｎｍ未満の光波長域を挙げることができる。また、第２の光波長域としては、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の光波長域を挙げることができる。
　また、各光波長域で、複数の波長で吸光度を測定し、それら吸光度の平均値を用いて選別を行うこともできる。吸光度の平均値により選別することで、吸光度の測定値に含まれるノイズの影響を低減することができる。
　分光特性により、胎児由来の有核赤血球と母体由来の有核赤血球とを選別する方法として、選別対象の有核赤血球の周囲に存在する核を有さない赤血球を参照赤血球とし、この参照赤血球と比較することで、選別対象の有核赤血球が胎児由来の有核赤血球か、母体由来の有核赤血球かを選別する。参照赤血球を、選別対象の有核赤血球と同じ波長の単色光で吸光度を測定し、その割合を求め、選別する有核赤血球の吸光度の割合と、参照赤血球の吸光度の割合を比較することで、より確実に選別対象の有核赤血球の中から胎児由来の有核赤血球を選別することができる。
　＜取得工程（ステップＳ２６）＞
　取得工程は、識別工程により標的細胞の細胞位置情報が送られた細胞単離装置で、塗抹標本から標的細胞を単離し、取得する工程である。
　単離方法としては、公知の方法を用いることができ、特に、マイクロマニピュレーション（ＭＭ：micromanipulation）法あるいはレーザーマイクロダイセクション（ＬＭＤ：laser microdissection）法を用いることが好ましい。
　マイクロマニピュレーションシステムは、例えば、株式会社ナリシゲの各種マイクロマニピュレーターを組み合せることができる。また、レーザーマイクロダイセクションシステムは、例えば、ＺＥＩＳＳ社製のレーザーマイクロダイセクションシステムであるＰＡＬＭ ＭｉｃｒｏＢｅａｍ等の市販されているシステムを使用することができる。
　細胞単離方法としてマイクロマニピュレーション法を使用する場合、回収液を使用する。回収液としては純水を使用することが好ましい。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）等の溶液を使用すると、溶液が蒸発することにより塩の析出が生じ、これにより細胞を壊してしまう可能性があるためである。
　回収液の供給は、ボロシリケイト製ガラス管をプーラーで引いて二分し、マイクロフォージで先端処理した一方のガラス管を超純水（回収液）の供給用に使用する。単離しようとする標的細胞領域に数μＬ程度の超純水を滴下し、もう一方の鋭利な先端のガラス管を用いて、標的細胞を拾い上げ、マイクロチューブに採取を行うことで、細胞単離を行う。
　また、細胞単離方法としてレーザーマイクロダイセクション法を使用する場合、母体血の塗抹標本を作製する際に、スライドガラス基板上に予めポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ：polyethylene naphthalate）又はポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ：polyethylene terephthalate）、その他のフィルムをコートしたメンブレンスライドを使用することもできるが、スライドガラス基板上に、直接、母体血の濃縮液が塗抹された標本を使用することが好ましい。
　レーザーマイクロダイセクション法で、基板上に、直接、母体血の濃縮液が塗抹された塗抹標本を用いて、標的細胞に直接レーザーパルスを照射して細胞単離を行う場合、単離した細胞に与える物理的影響として、単離した細胞の遺伝子解析性が悪化することが、これまでに問題となっていた。本実施形態においては、洗浄工程から染色工程において使用した第二の細胞処理剤が存在することと、回収液を使用することにより、単離した細胞の物理的ダメージを低減し、遺伝子解析性を良好にすることができる。なお、単離した細胞の物理的ダメージの低減は、第二の細胞処理剤の存在が必要であり、第一の細胞処理剤のみでは発現しないことも明らかとなった。
　レーザーマイクロダイセクション法で用いられる回収液としても純水を使用することが好ましい。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）等の溶液を使用すると、溶液が蒸発することにより塩の析出が生じ、これにより細胞を壊してしまう可能性があるためである。回収液は、単離しようとする標的細胞領域に１～１００μＬの超純水を滴下することで使用し、その後、レーザーマイクロダイセクションのレーザーパルスを照射することで、細胞の単離を行う。
　＜増幅工程＞
　増幅工程は、識別工程により識別された少なくとも胎児由来の有核赤血球の染色体に含まれる核酸を増幅する工程である。増幅工程は、塗抹標本から単離された細胞からＤＮＡを抽出して、ゲノム増幅を行う。ゲノム増幅は、市販のキットを用いて行うことが可能である。
　本実施形態で用いるゲノム増幅法としては、取得した細胞から、一般的な方法である界面活性剤を用いた細胞溶解、プロテアーゼＫ等を用いたタンパク質分解工程を経ることで、細胞から溶出することにより得られたゲノムＤＮＡを用いる。
　全ゲノム増幅試薬としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）に基づく試薬ＰｉｃｏＰＬＥＸ ＷＧＡ ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、ＰｉｃｏＰＬＥＸは登録商標）、ＧｅｎｏｍｅＰｌｅｘ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ　Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＧｅｎｏｍｅＰｌｅｘは登録商標）、国際公開ＷＯ２０１２／１６６４２５Ａ２号公報に開示されている、ＭＡＬＢＡＣ法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｏｐｉｎｇ－Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｙｃｌｅｓ）に係る試薬を用いることができる。また、鎖置換型ＤＮＡ合成反応に基づく試薬として、例えば、ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（ＧＥヘルスケア社、ＧｅｎｏｍｉＰｈｉは登録商標）、ＲＥＰＬＩ－ｇ（Ｑｉａｇｅｎ社、ＲＥＰＬＩ－ｇは登録商標）も同様に用いることができる。本実施形態では、ＰｉｃｏＰＬＥＸ ＷＧＡ ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いることが好ましい。
　全ゲノム増幅により得られたＤＮＡの増幅産物は、アガロースゲル電気泳動等により増幅有無を確認することが可能である。更に、全ゲノム増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、ＱＩＡｑｕｉｃｋは登録商標）を用いて精製することが好ましい。
　また、全ゲノム増幅により得られたＤＮＡの増幅産物の濃度について、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＮａｎｏＤｒｏｐは登録商標）、Ｑｕａｎｔｕｓ　Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｑｕａｎｔｕｓは登録商標）、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて測定することが可能である。
　増幅工程においては、少なくとも胎児由来の有核赤血球の染色体に存在する核酸であるＤＮＡを増幅する。増幅工程の対象物である胎児由来の有核赤血球の数は、少なくとも１つでよいが、複数の胎児由来の有核赤血球から取得した核酸を増幅することが好ましい。更には、後の決定工程で胎児の染色体の数的異常を決定するために、増幅産物の量を比較する基準として、数的異常が存在しない母体由来の有核赤血球の染色体を選択することも好ましい態様である。母体由来の有核赤血球を基準として比較する場合、有核赤血球識別工程により識別した母体由来の有核赤血球の染色体の核酸を増幅することも好ましい態様の一つである。
　＜確定工程＞
　確定工程は、増幅工程により増幅した少なくとも胎児由来の有核赤血球の増幅産物の量を確定するとともに、有核赤血球識別工程で識別した胎児由来の有核赤血球を遺伝子解析により胎児由来の有核赤血球であることを確認する工程である。
　〔遺伝子解析〕
　遺伝子解析は、ＤＮＡマイクロアレイ、デジタルＰＣＲ、次世代シーケンサー、ｎＣｏｕｎｔｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ社、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標））を用いることが可能であるが、本実施形態においては、解析の精度及び速さ、１度に処理可能な試料数の多さ等の点で次世代シーケンサーを用いることが好ましい。
　本発明において次世代シーケンサーとは、サンガー法を利用したキャピラリーシーケンサー（第一世代シーケンサーと呼ばれる）に対比して分類されるシーケンサーを意味する。次世代シーケンサーは、第二世代、第三世代、第四世代、及び今後開発されるシーケンサーを含む。現時点で最も普及している次世代シーケンサーは、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成又はＤＮＡリガーゼによる相補鎖結合に連動した蛍光又は発光をとらえ塩基配列を決定する原理のシーケンサーである。具体的には、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、ＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、ＨｉＳｅｑは登録商標）、Ｒｏｃｈｅ４５４（Ｒｏｃｈｅ社）などが挙げられる。
　増幅工程で得られたＤＮＡの増幅産物を次世代シーケンサーで解析する場合、全ゲノムシーケンス、エキソームシーケンス、及びアンプリコンシーケンス等を用いることが可能である。
　次世代シーケンサーで得られた配列データをアライメントする手段としては、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ　Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）が挙げられ、ＢＷＡによって既知のヒトゲノム配列へ配列データをマッピングすることが好ましい。遺伝子を解析する手段としては、ＳＡＭｔｏｏｌｓ及びＢＥＤｔｏｏｌｓが挙げられ、これらの解析手段により遺伝子多型、遺伝子変異、及び染色体数を解析することが好ましい。
　≪対立遺伝子による分析≫
　増幅工程により全ゲノム増幅を行った後、対立遺伝子の配列を決定することで、有核赤血球が胎児由来の有核赤血球であることを確認することができる。
　有核赤血球識別工程において胎児由来の有核赤血球の細胞として同定され、ポリメラーゼ連鎖反応（増幅工程）により増幅されたＤＮＡであって、数的異常を検査する対象となる染色体に対して、あらかじめ決定された１００～１５０ｂｐ（ｂａｓｅ ｐａｉｒ：ベースペア）の領域の配列を有するＤＮＡの増幅産物の量をシーケンサーで求める。本実施形態においては、検査する対象となる染色体は、１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、Ｘ染色体であることが好ましい。胎児由来の有核赤血球は、通常、父親および母親から１組ずつの染色体を受け継いでおり、性染色体を除き、２本ずつの染色体を有している。これらの１組の染色体の対立遺伝子を分析し、父親由来の遺伝子の存在を確認することで、有核赤血球が胎児由来の有核赤血球か母体由来の有核赤血球かを選別することができる。
　父親由来の遺伝子の存在の確認は、母親由来の細胞についても同時に遺伝子解析を行い、母親由来の細胞にはない対立遺伝子が存在する場合に、この対立遺伝子が父親由来の遺伝子であると認定することができる。父親由来の遺伝子が確認された場合、その有核赤血球は胎児由来の有核赤血球であると選別することができる。遺伝子解析を行う母親由来の細胞は、特に限定されないが、母体血の塗抹標本上に存在する白血球からのＤＮＡ分析を行うことが好ましい。
　分析する対立遺伝子は、一塩基多型（ＳＮＰ（ＳＮＰｓ）：Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、または、コピー数多型（ＣＮＰ（ＣＮＰｓ）Ｃｏｐｙ　Ｎｕｍｂｅｒ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）又は縦列型反復配列（ＳＴＲ：Ｓｈｏｒｔ Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔ）を分析することが好ましい。
　胎児の遺伝子は、両親から一対ずつの遺伝子を受け継いでおり、遺伝情報は４種類の塩基の化学物質の配列で記録されている。ヒトの場合には、約３０億個の塩基があるが、１０００～２０００個に１個の割合で、個人によって異なる配列部分が存在し、これを一塩基多型という。この一塩基多型を分析し、母体由来の細胞である白血球と比較することで、有核赤血球に一塩基多型の配列を確認することができれば、有核赤血球は胎児由来であると確認することができる。
　コピー数多型及び縦列型反復配列とは、ＤＮＡの中に、あるＤＮＡ配列が一つの単位となり、このＤＮＡ配列が直列に、繰り返し並んでいる領域があり、この繰り返し領域のことである。胎児は、コピー数多型、縦列型反復配列を父親および母親から引き継ぐため、母体由来の白血球と異なるコピー数多型、縦列型反復配列を有する有核赤血球は胎児由来の有核赤血球であると確認することができる。
　≪Ｙ染色体による分析≫
　胎児が男児である場合、増幅工程により全ゲノム増幅を行った後、Ｙ染色体の存在の有無を確認することで、有核赤血球が胎児由来の有核赤血球であるかを確認することができる。
　Ｙ染色体は、男性にしか存在しないため、母体由来の有核赤血球には存在しない。したがって、胎児が男児である場合、Ｙ染色体の存在を確認することができれば、有核赤血球は胎児由来の有核赤血球であると確認することができる。
　＜決定工程＞
　決定工程は、確定工程により確定した胎児由来の有核赤血球のＤＮＡの増幅産物の量を比較することで、胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する工程である。
　胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する基準（あるいは参照）として、数的異常を検査する対象染色体以外の染色体を選択し、予め決定された１００～１５０ｂｐの領域の配列を有するＤＮＡの増幅産物の増幅量をシーケンサーで求める。基準となる染色体（基準染色体）としては、胎児由来の有核赤血球の染色体の数的異常を検査する対象染色体以外の染色体の少なくとも１つを選択する態様、または、母体由来の有核赤血球であると同定された細胞に存在する染色体を選択する態様から選ばれる。本実施形態においては、母体由来の有核赤血球であると同定された細胞に存在する染色体を選択することが好ましい。
　次に、数的異常の検査の対象染色体のＤＮＡの増幅産物の量と、基準染色体のＤＮＡの増幅産物の量との比率により、胎児由来の染色体に数的異常が存在するか決定する。胎児が正常な状態であれば、数的異常を検査する胎児由来の対象染色体のＤＮＡの増幅産物の量と、基準染色体のＤＮＡの増幅産物の量とは、ほぼ、１：１の量比となると予想される。正常であれば２本である染色体が、３本存在するトリソミーである数的異常である場合には、１．０：１．５（あるいは２：３）の比になると予想される。
　また、決定工程に先立って、予め、複数の妊娠母体から採取した、正常な胎児を妊娠した場合の母体由来の染色体のＤＮＡの増幅産物の量に対する胎児由来の染色体のＤＮＡの増幅産物の量の比を複数求めた結果の分布と、トリソミーの胎児を妊娠した母体の、母親由来のＤＮＡの増幅産物の量に対する胎児由来のＤＮＡの増幅産物の量の比を複数求めた結果の分布とを求め、この２つの分布が重ならない領域にカットオフ値を設定しておき、このカットオフ値と、ＤＮＡの増幅産物の量の比を比較して数的異常が存在するかどうかを決定することも可能である。この場合、ＤＮＡの増幅産物の量の比がカットオフ値以下であれば、胎児は正常であり、カットオフ値以上であれば、トリソミーである数的異常であると、検査結果を解釈することができる。
　以下に実施例を挙げ、本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
　＜実施例１＞
　（母体血の採取）
　ボランティアの妊婦から、インフォームドコンセントを行った後に、抗凝固剤としてＥＤＴＡ-２Ｎａ（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム）を含む７ｍＬ真空採血管 ２本に、末梢血１４ｍＬを得た。濃縮工程で処理するまでの間、取得した母体血は４℃で保存した。
　（濃縮工程）
　密度勾配遠心分離用媒体としてＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）（シグマ－アルドリッチ社）を使用し、密度１．０９５ｇ／ｍＬの分離用媒体を調製した。調製した分離用媒体３．０ｍＬをピペットで遠心管に分注した。採血管に得た母体血を室温に戻した後、遠心管に移して、希釈液（Ｄ－ＰＢＳ（－）＋０．０６質量％ＥＤＴＡ＋０．１質量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン；和光純薬工業(株)社製））で２倍希釈した。
　遠心管の分離用媒体の上部に、ピペットで希釈血液７．０ｍＬを重層した後、２２℃・１４３０ｒｐｍ・３０分間で遠心分離した。遠心分離終了後、分離用媒体の上部をピペットで採取して遠心管に移し、濃縮した母体血の画分を得た。
　（洗浄工程）
　濃縮した母体血球の洗浄を以下の要領で行い、塗抹液を調整した。
　濃縮した母体血の画分を希釈液（Ｄ－ＰＢＳ（－）＋０．０６質量％ＥＤＴＡ＋３．０質量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン；和光純薬工業(株)社製）＋３．０質量％トレハロース（和光純薬工業(株)社製）；以下ＰＥＢＴと呼ぶ）で１５ｍＬとして分散し、２２℃・２０００ｒｐｍ・５分間の遠心分離を行った。遠心分離終了後、アスピレーターで上清を取り除いた。
　上清を除去後、母体血の画分を希釈液（ＰＥＢＴ）で１５ｍＬとして分散し、２２℃・１１３０ｒｐｍ・５分間の遠心分離を行った後、アスピレーターで上清を取り除いた。さらに、母体血の画分を希釈液（ＰＥＢＴ）で１５ｍＬとして分散した後、分散液１０μＬを採取して、セルカウンターで細胞数を測定した。そして、２２℃・１１３０ｒｐｍ・５分間の遠心分離後、細胞数の測定結果から、必要量を残して、アスピレーターで上清を取り除いて塗抹液とした。
　（塗抹工程）
　塗抹液をマイクロピペットで採取してスライドガラスに点着し、引きガラス法で均一に一層塗抹して母体血の塗抹標本を作製し、風乾した。
　（固定工程）
　乾燥させた塗抹標本を、トレハロースで飽和させた８０％エタノール水溶液に２０分間浸漬後、風乾した。トレハロース濃度として、３．０質量％であった。
　（染色工程）
　固定した塗抹標本の乾燥後、トルイジンブルー水溶液（０．００２質量％トルイジンブルー、３．０質量％トレハロースを含む）に５分間浸漬後、３．０質量％トレハロース水溶液で５分間洗浄した後、風乾した。
　＜実施例２～１１、比較例１、２＞
　実施例１と同様の方法により、複数の異なるボランティアの妊婦から、インフォームドコンセントを行った後に、母体血を採取し、表４に示す、洗浄液、固定液、染色液中の第一の細胞処理剤、第二の細胞処理剤の濃度を変更し、塗抹標本を作製し、実施例２～１１、比較例１及び２とした。実施例１１のみ、第二の細胞処理剤を表４に示す量となるように塗抹液に加えて塗抹液を調製した。
　（画像検出工程）
　母体血の塗抹標本に対して、ピーク波長４０５ｎｍの光を含む光で露光し、塗抹標本をスキャニングして、細胞画像とその位置情報を取得した。
　〔赤血球識別工程〕
　得られた細胞画像について、ピーク波長４０５ｎｍ露光の濃度を分析して、赤血球を識別した。
　〔有核赤血球識別〕
　識別した赤血球画像について、ピーク波長６１７ｎｍ露光の濃度を分析して、核を検出し、有核赤血球を識別した。
　（核影の検出）
　作製した母体血の塗抹標本について、１ｍｍ×１ｍｍの領域の３視野を観察し、核影の有無を調べた。評価は以下の基準で行った。
　Ａ・・・核影は観察されなかった。
　Ｂ・・・核影が少し観察されるが、問題ないレベルである。
　Ｃ・・・核影が多く観察される。
　（取得工程）
　有核赤血球識別工程によって得られた情報から、単離する有核赤血球を決定した。取得した細胞位置情報を利用して母体血の塗抹標本からマイクロマニュピュレーターを用いて、採取した血液試料１つに対して８細胞ずつ単離し、マイクロチューブに回収した。
　また、レーザーマイクロダイセクションを用いて採取した血液試料１つずつに対して、それぞれ８細胞を単離し、マイクロチューブに回収した。このとき、取得する標的細胞領域に、回収液として１０μＬの純水を滴下した。
　（増幅工程［全ゲノム増幅］）
　単離したそれぞれの細胞に対して、ＰｉｃｏＰＬＥＸ　ＷＧＡ　ｋｉｔ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて全ゲノム増幅を行い、説明書記載に則り細胞中の微量なゲノムＤＮＡを約１００万倍に増幅した。
　得られた増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した後、Ｑｕａｎｔｕｓ　Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ　ｄｓＤＮＡ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて増幅産物の濃度を測定した。
　（マルチプレックスＰＣＲ）
　胎児細胞の分析、染色体の数的異常を分析する目的で、複数箇所の染色体位置からマルチプレックスＰＣＲに用いるプライマーを作製した（配列番号１～４６；表１および表２）。
　各検出領域のＰＣＲ増幅塩基長としては、１００～１５０塩基対となるようにプライマーを作製、また、各検出領域内は遺伝的多型を含有するようにプライマーの位置を設計した。４６種類のプライマーは、各プライマーの終濃度が２５ｎｍｏｌ／Ｌとなるように混合した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　マルチプレックスＰＣＲは、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＰＣＲ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（タカラバイオ（株）社製）を用いて反応を行った。反応条件としては、鋳型として胎児由来の有核赤血球の候補細胞の各細胞から得られた全ゲノム増幅産物を１０ｎｇ、４６種類混合プライマーを８μＬ、０．１２５μＬ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＰＣＲ　Ｍｉｘ１、１２．５μＬ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＰＣＲ　Ｍｉｘ２および水で２５μＬの最終液量で反応を行った。
　ＰＣＲ条件としては、９４℃で６０秒で変性した後、９４℃で３０秒、６０℃で９０秒、７２℃で３０秒を３０サイクルで反応を行った。
　得られたＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
　次に、Ｍｉｓｅｑを用いたシーケンス反応を行う為に、サンプル識別用のインデックス配列、フローセル結合用Ｐ５、Ｐ７配列をマルチプレックスＰＣＲ産物の両末端へ付加を行った。
　プライマーとしては、表３に示すＤ５０１－Ｆ（配列番号４７）、Ｄ７０１－Ｒ（配列番号４８）、Ｄ７０２－Ｒ（配列番号４９）、Ｄ７０３－Ｒ（配列番号５０）、Ｄ７０４－Ｒ（配列番号５１）、Ｄ７０５－Ｒ（配列番号５２）およびＤ７０６－Ｒ（配列番号５３）を各１．２５μｍｏｌ／Ｌ濃度で用いて、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＰＣＲ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔを用いてＰＣＲを行った。
　ＰＣＲ条件としては、９４℃で３分で変性した後、９４℃で４５秒、５０℃で６０秒、７２℃で３０秒を５サイクルで反応した後、９４℃で４５秒、５５℃で６０秒、７２℃で３０秒を１１サイクルで反応を行った。
　得られたＰＣＲ産物は、ＡＭＰｕｒｅ　ＸＰ　Ｋｉｔ（ＢＥＣＫＭＡＮ　ＣＯＵＬＴＥＲ社製、ＡＭＰｕｒｅは登録商標）を用いて精製し、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒを用いて濃度を測定した。
　さらに正確な増幅産物の定量として、日本ジェネティクス（株）社製のＫＡＰＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔｓを用いて定量を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　（ＤＮＡ増幅性の評価）
　遺伝子解析性は、全ゲノム増幅により得られたＤＮＡの増幅産物の有無と増幅サイズについて、アガロースゲル電気泳動で確認し、マイクロマニュピュレーター（ＭＭ）およびレーザーマイクロダイセクション（ＬＭＤ）で単離した各８細胞のそれぞれに対して６つのプライマーのバンド発現数を１００段階で評価した。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４より、洗浄液中に第一の細胞処理剤を含有させることで、核影の発生を低減させることができることが確認できた。特に、洗浄液中の第一の細胞処理剤の濃度を１．７質量％以上とすることで、核影を無くすことができた。また、洗浄液および染色液に第二の細胞処理剤を含有させることで、ＤＮＡの増幅性が良好であることが確認できた。また、特に、好ましい使用量とすることで、選別した細胞から回収したＤＮＡの増幅率が非常に高いことがわかり、本発明の効果が確認された。

Claims (14)

  1. 　妊娠母体血中の有核赤血球を濃縮する濃縮工程と、
    　前記濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血の画分を洗浄する洗浄工程と、
    　前記洗浄工程後の前記画分を基板に塗抹する塗抹工程と、
    　前記基板上の前記画分中の血球細胞を染色する染色工程と、
    　前記染色工程後の前記血球細胞を解析し、有核赤血球の候補細胞を識別する識別工程と、
    　前記識別工程で識別された前記有核赤血球の候補細胞を前記基板上から取得する取得工程と、を有し、
    　前記洗浄工程は、第一の細胞処理剤を含む洗浄液で洗浄し、
    　前記洗浄工程および前記塗抹工程の少なくともいずれか１つの工程は、前記画分を第二の細胞処理剤で処理する工程を有し、
    　前記染色工程は、染色色素および前記第二の細胞処理剤を含む染色液を用いて染色する有核赤血球候補細胞の単離方法。
  2. 　血球細胞を固定する固定工程を有し、
    　前記固定工程は、前記第二の細胞処理剤を含む固定液で処理する請求項１に記載の有核赤血球候補細胞の単離方法。
  3. 　前記固定液中の前記第二の細胞処理剤の含有濃度が、１．２質量％以上９．０質量％以下である請求項２に記載の有核赤血球候補細胞の単離方法。
  4. 　前記固定液中の前記第二の細胞処理剤の含有濃度が、飽和状態である請求項２または３に記載の有核赤血球候補細胞の単離方法。
  5. 　前記第一の細胞処理剤が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、アルブミン、および、ポリビニルピロリドンから選ばれる少なくとも１つを含む請求項１から４のいずれか１項に記載の有核赤血球候補細胞の単離方法。
  6. 　前記第二の細胞処理剤が、スクロース、メレジトース、トレハロース、および、アルギニンから選ばれる少なくとも１つを含む請求項１から５のいずれか１項に記載の有核赤血球候補細胞の単離方法。
  7. 　前記洗浄液中の前記第一の細胞処理剤の含有濃度が、１．５質量％以上９．０質量％以下である請求項１から６のいずれか１項に記載の有核赤血球候補細胞の単離方法。
  8. 　前記洗浄液中の前記第一の細胞処理剤の含有濃度が、２．０質量％以上５．０質量％以下である請求項１から７のいずれか１項に記載の有核赤血球候補細胞の単離方法。
  9. 　前記洗浄工程および前記塗抹工程の少なくともいずれか１つの工程において、前記第二の細胞処理剤を含む処理液中の前記第二の細胞処理剤の含有濃度が、１．２質量％以上９．０質量％以下である請求項１から８のいずれか１項に記載の有核赤血球候補細胞の単離方法。
  10. 　前記染色液中の前記第二の細胞処理剤の含有濃度が、１．２質量％以上９．０質量％以下である請求項１から９のいずれか１項に記載の有核赤血球候補細胞の単離方法。
  11. 　前記染色液中の前記第二の細胞処理剤の含有濃度が、２．０質量％以上５．０質量％以下である請求項１から１０のいずれか１項に記載の有核赤血球候補細胞の単離方法。
  12. 　前記染色色素が、塩基性色素である請求項１から１１のいずれか１項に記載の有核赤血球候補細胞の単離方法。
  13. 　前記染色色素が、ヘマトキシリン、トルイジンブルー、メチレンブルー、アズールブルー、クレシルバイオレット、ヨウ化プロピジウム、メチルグリーン、および、ヌクレアファストレッドから選ばれるいずれか１つである請求項１から１２のいずれか１項に記載の有核赤血球候補細胞の単離方法。
  14. 　前記取得工程において、レーザーマイクロダイセクションシステムでレーザーパルスを照射して、前記識別工程で識別された前記有核赤血球の候補細胞の単離を行う際、回収液を使用する請求項１から１３のいずれか１項に記載の有核赤血球候補細胞の単離方法。
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