JP2017067524A - 有核赤血球の選別方法および有核赤血球の選別装置 - Google Patents

Abstract

【課題】遺伝子検査の精度を悪化させることなく、有核赤血球を選別する有核赤血球の選別方法および選別装置を提供する。【解決手段】母体血中の血球細胞から、ヘモグロビンの吸収波長領域にピーク波長を有する第１の波長領域の光を用いて、赤血球を識別する赤血球識別工程と、赤血球識別工程で識別した赤血球から、第２の波長領域の光を照射した際の自家蛍光画像を確認することで、有核赤血球を識別する有核赤血球識別工程と、を有する有核赤血球の選別方法、および、この選別方法に用いられる選別装置である。【選択図】図５

Description

本発明は、有核赤血球の選別方法および有核赤血球の選別装置に係り、特に、光学的な情報を利用して、妊娠母体の血液中の胎児由来の有核赤血球を特定する有核赤血球の選別方法および有核赤血球の選別装置に関する。

出生前診断として、従来より、羊水穿刺により羊水中の胎児細胞の染色体を調べる羊水検査が行われている。しかしながら、この方法では、流産の可能性のあることが問題として指摘されている。

一方、妊娠母体（以下、単に「母体」ともいう）の血液中に胎児細胞が移行し、この胎児細胞が母体中を血液とともに循環していることが最近わかってきた。そこで、母体血を用いて、母体血中の胎児細胞の染色体のＤＮＡ（デオキシリボ核酸：deoxyribonucleic acid）を再現性よく確実に分析することができれば、流産の可能性のない安全な出生前診断を実現することができることとなる。

しかしながら、母体の血液中に存在する胎児細胞（有核赤血球）は、母体血数ｍＬ中に１個程度しか存在しない。このように非常に少ない胎児細胞（有核赤血球）を確実に取得することが、母体血を利用した出生前診断を行う上で非常に大きな課題である。

母体血中から胎児細胞である有核赤血球を取得する方法として、有核赤血球を濃縮する方法、例えば、密度勾配遠心分離を用いて、血漿成分、および母親の赤血球成分を取り除く技術がある。また、白血球の表面の蛋白質に特異的に免疫反応する抗体を用いて、磁気により母親の白血球を分離する技術（MACS法：Magnetic activated cell sorting）、胎児ヘモグロビンのγ鎖に特異的に免疫反応する抗体と蛍光色素を用いて胎児の有核赤血球を分離する技術（FACS法：Fluorescence activated cell sorting）などを用いて、母体血中の胎児細胞である有核赤血球を取得することが行われている。

また、光学的な情報を用いて、細胞の種類を識別し、求める細胞を取得する技術が開示されている。例えば、特許文献１には、細胞質を染色して透過可視光の吸収画像を生成し、励起光を照射して核の蛍光画像を形成し、細胞質と細胞核のコントラスト画像を用いて有核赤血球を判別することが記載されている。また、特許文献２には、生体組織の光学的性質を利用した生体情報分析装置が記載されている。

特表２００２−５１４３０４号公報 特開２０１４−１４４８５号公報

上記の特許文献に記載されているような、光学的な情報を用いて細胞を選別する技術は、有核赤血球を選別する上で非常に有用な技術である。しかしながら、特許文献１に記載の方法は、胎児ヘモグロビンを優先的に染色する色素として、青色沈殿物を使用しており、染色した色素が遺伝子解析の精度を悪化させる懸念があった。また、特許文献２は、酸化ヘモグロビンと還元ヘモグロビンの区別から生体組織内の病変部の有無を観察するものであり、血球分離を行うものではないため、核を遺伝子解析する際の染色による検査精度の悪化の点については検討されていなかった。

本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、遺伝子検査の精度を悪化させずに、有核赤血球、または、胎児由来の有核赤血球を選別する選別方法、および、有核赤血球の選別装置を提供することを目的とする。

本発明は、上記目的を達成するために、母体血中の血球細胞から、ヘモグロビンの吸収波長領域にピーク波長を有する第１の波長領域の光を用いて、赤血球を識別する赤血球識別工程と、赤血球識別工程で識別した赤血球から、第２の波長領域の光を照射した際の自家蛍光画像を確認することで、有核赤血球を識別する有核赤血球識別工程と、を有する有核赤血球の選別方法を提供する。

本発明の有核赤血球の選別方法によれば、赤血球の識別をヘモグロビンの吸収波長により行い、有核赤血球の核の識別を核の自家蛍光画像を確認することで行っているので、細胞を染色することなく、有核赤血球の選別を行うことができる。したがって、有核赤血球を選別した後、単離回収した有核赤血球の遺伝子検査をする際、染色する色素により遺伝子検査の精度を悪化させる懸念がないので、精度良く遺伝子検査を行うことができる。

本発明の別の態様においては、有核赤血球識別工程は、第２の波長領域の光が、ピーク波長が５３０ｎｍ以下の励起光であり、核から発する自家蛍光により識別することが好ましい。

この態様によれば、有核赤血球を識別する第２の波長領域の光として、ピーク波長が５３０ｎｍ以下の励起光を用いることで、有核赤血球の核が発する自家蛍光を高い蛍光強度で確認することができる。

本発明の別の態様においては、第１の波長領域の光は、ピーク波長が３８０ｎｍ以上６５０ｎｍ以下の波長領域に含まれる光であり、有核赤血球識別工程により識別した有核赤血球を、第１の波長領域の光におけるヘモグロビンの酸素親和性に起因する分光特性により、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別する選別工程と、を有することが好ましい。

この態様によれば、ヘモグロビンは、３８０ｎｍから６５０ｎｍの間に吸収を持つため、ピーク波長が上記の波長領域に含まれる光を用いることで、ヘモグロビンの吸収により赤血球を識別することができる。また、酸化ヘモグロビンと還元ヘモグロビンは、上記の波長領域において、異なる吸光度を示すため、上記の波長領域に含まれる波長の光で測定した吸光度を用いて母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別することができる。

本発明の別の態様においては、第２の波長領域の光の照射による自家蛍光画像の蛍光の分光特性が、ピーク波長が４５０ｎｍ以上６５０ｎｍ以下の波長領域に含まれる光であることが好ましい。

この態様によれば、自家蛍光画像の蛍光の分光特性を、ピーク波長が上記範囲の波長領域に含まれる光とすることで、有核赤血球の核と細胞質、または、他の細胞との間で蛍光強度の差を明確にすることができる。したがって、有核赤血球の核を確実に識別することができ、有核赤血球を識別することができる。

本発明の別の態様においては、第１の波長領域の光が、ピーク波長が３８０ｎｍ以上４７０ｎｍ以下の波長領域の光であることが好ましい。

この態様は、第１の波長領域の光をさらに限定したものである。ヘモグロビンは、ポルフィリン環に由来する３８０ｎｍから４５０ｎｍ付近にＳｏｒｅｔ帯と呼ばれる吸収を有するため、上記範囲の波長領域の光を用いることで、ヘモグロビンの検出を行うことができ、ヘモグロビンの検出の精度を高めることができる。

本発明の別の態様においては、第１の波長領域の光、および、第２の波長領域の光が、ＬＥＤまたはＬＡＳＥＲの光、および、干渉フィルタを通過した単色光を主波長とする光のいずれかであることが好ましい。

この態様は、第１の波長領域の光、および、第２の波長領域の光として使用できる光源を規定したものであり、上記の光源を用いることで、狭い波長領域の光で血球細胞の識別を行うことができ、吸光度の測定を精度良く行うことができる。

本発明の別の態様においては、第１の波長領域の光、および、第２の波長領域の光が共通の光であり、透過光により赤血球を識別する画像、および、自家蛍光画像を共通の光により取得することが好ましい。

この態様によれば、第１の波長領域の光と第２の波長領域の光を共通の光とし、１度の照射で、赤血球を識別する画像と、有核赤血球を識別するための自家蛍光画像と、を取得することができ、効率良く作業を行うことができる。

本発明の別の態様においては、有核赤血球識別工程は、自家蛍光画像の赤血球像領域内の、蛍光強度の高い領域を核、蛍光強度の低い領域を細胞質と識別し、核の有無を識別することが好ましい。

この態様によれば、有核赤血球から発する自家蛍光は、核が発する蛍光強度と細胞質が発する蛍光強度とを比較すると核が発する蛍光強度の方が高い。したがって、赤血球の領域内で高い蛍光強度と低い蛍光強度を示す赤血球を有核赤血球として識別することができる。

本発明は上記目的を達成するために、母体血に含まれる有核赤血球を選別する有核赤血球の選別装置であって、ヘモグロビンの吸収波長領域にピーク波長を有する第１の波長領域の光、および、有核赤血球の核が自家蛍光を発する第２の波長領域の光を出力する光源装置と、第１の波長領域の光が照射されることにより母体血を透過する透過光を撮像する第１の撮像装置と、第２の波長領域の光が照射されることにより母体血から発せられる自家蛍光のみを透過するエミッションフィルタと、エミッションフィルタを透過した自家蛍光を撮像する第２の撮像装置と、第１の撮像装置で撮像された第１の画像に基づいて赤血球を識別し、第２の撮像装置で撮像された第２の画像に基づいて赤血球から核の有無を識別し、有核赤血球を識別する画像処理装置と、を備える有核赤血球の選別装置を提供する。

本発明の有核赤血球の選別装置によれば、第１の波長領域の光でヘモグロビンの有無により赤血球を識別し、第２の波長領域の光で発する自家蛍光により有核赤血球を識別することで、細胞を染色することなく、有核赤血球を選別することができる。したがって、有核赤血球を選別した後、単離回収した有核赤血球の遺伝子検査をする際、染色する色素により遺伝子検査の精度を悪化させる懸念がないので、精度良く遺伝子検査を行うことができる。

また、赤血球の識別に用いられる画像は、母体血を透過する透過光であり、有核赤血球の識別に用いられる画像は、エミッションフィルタを透過した自家蛍光であるので、第１の波長領域の光、および、第２の波長領域の光に影響されることなく画像を取得することができる。

本発明の別の態様においては、第２の波長領域の光から、ピーク波長が５３０ｎｍ以下の波長領域の励起光のみを通過させる励起フィルタを備え、励起フィルタを通過した光を母体血に照射することが好ましい。

本発明の別の態様においては、第１の波長領域の光が、ピーク波長が３８０ｎｍ以上６５０ｎｍ以下の波長領域に含まれる光であり、画像処理装置は、第１の波長領域の光におけるヘモグロビンの酸素親和性に起因する分光特性により、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別することが好ましい。

本発明の別の態様においては、エミッションフィルタは、ピーク波長が４５０ｎｍ以上６５０ｎｍ以下の波長領域に含まれる自家蛍光を通過させることが好ましい。

本発明の別の態様においては、第１の波長領域の光、および、第２の波長領域の光が、ＬＥＤまたはＬＡＳＥＲの光、および、干渉フィルタを通過した単色光を主波長とする光のいずれかであることが好ましい。

本発明の別の態様においては、光源装置により出力される第１の波長領域の光、および、第２の波長領域の光が共通の光であることが好ましい。

本発明の別の態様においては、画像処理装置は、第２の画像の赤血球像領域中の、蛍光強度の高い領域を核、蛍光強度の低い領域を細胞質と識別し、核の有無を識別することが好ましい。

本発明の有核赤血球の選別方法および有核赤血球の選別装置によれば、ヘモグロビンの吸収波長を用いて赤血球を識別し、赤血球中の核の自家蛍光により有核赤血球の識別をしているので、染色を行うことなく、有核赤血球の選別を行うことができる。したがって、選別した有核赤血球の遺伝子検査をする際に、染色する色素により遺伝子検査の精度を悪化させる懸念がないので、精度良く遺伝子検査を行うことができる。

有核赤血球の選別方法を含む検査方法の手順を示すフローチャート図である。 還元ヘモグロビン（Ｈｂ）と、酸化ヘモグロビン（ＨｂＯ_２）の波長に対する吸収係数を示すグラフ図である。 塗抹標本の自家蛍光画像の写真（Ａ）および図（Ｂ）である。 図３の自家蛍光画像の検出波長に対する蛍光強度の関係を示す図である。 有核赤血球の選別装置の構成を示す概略構成図である。 フィルタキューブの構成を示す図である。

以下、添付図面に従って、本発明に係る有核赤血球の選別方法および有核赤血球の選別装置について説明する。なお、本明細書において「〜」とは、その前後に記載される数値を下限値および上限値として含む意味で使用される。

＜有核赤血球の選別方法＞
図１は、本発明の有核赤血球の選別方法を含む検査方法の一実施形態の手順を示すフローチャート図である。本発明の有核赤血球の選別方法は、母体血中の有核赤血球を、基板上で検出する態様が好ましい。この態様においては、まず、基板上に、有核赤血球を含む母体血の画分を塗抹する。母体血の画分を塗抹する方法として、妊娠母体からの母体血を採取する採取工程（ステップＳ１２）と、母体血中の有核赤血球を濃縮する濃縮工程（ステップＳ１４）と、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血の画分を基板上に塗抹する塗抹工程（ステップＳ１６）と、からなる方法により、基板上に有核赤血球を含む画分を塗抹し、塗抹標本を作製することができる。

次に、本発明の有核赤血球の選別方法は、好ましくは作製した塗抹標本に対して、第１の波長領域の光を用いて、母体血中の血球細胞から赤血球を識別する赤血球識別工程（ステップＳ１８）と、識別した赤血球から第２の波長領域の光を照射した際の自家蛍光画像により、有核赤血球を識別する有核赤血球識別工程と（ステップＳ２０）、を有する。また、本実施形態の選別方法は、ヘモグロビンの吸収波長領域にピーク波長を有する光を用いて、識別した有核赤血球を母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球と、に選別する選別工程（ステップＳ２２）と、を有してもよい。なお、有核赤血球識別工程（ステップＳ２０）、選別工程（ステップＳ２２）で選別した有核赤血球は、光学的情報を基に選別した有核赤血球である確率の高い有核赤血球の候補細胞であり、次の遺伝子解析により、有核赤血球、および、胎児由来または母体由来の有核赤血球であることを確認することができる。

その後、有核赤血球、あるいは、胎児由来の有核赤血球または母体由来の有核赤血球として選別した有核赤血球の候補細胞を基板上から単離する細胞単離工程（ステップＳ２４）と、単離した有核赤血球の染色体に含まれる核酸を増幅する増幅工程（ステップＳ２６）と、増幅産物の量を確定するとともに、遺伝子解析により胎児由来の有核赤血球であることを確定する確定工程（ステップＳ２８）と、により胎児由来の有核赤血球であることを確定することができる。

＜採取工程（ステップＳ１２）＞
採取工程は、血液試料である母体血を採取する工程である。母体血としては、侵襲のおそれのない妊娠母体の末梢血であることが好ましい。

母体の末梢血には、母体由来の好酸球、好中球、好塩基球、単核球、リンパ球等の白血球や、核のない成熟した赤血球に加えて、母体由来の有核赤血球、そして胎児由来の有核赤血球が含まれる。胎児由来の有核赤血球は、妊娠後、６週程度から母体血中に存在するといわれている。出生前診断を行う本実施形態においては、妊娠後６週程度以降の母体の末梢血を検査することが好ましい。

胎児由来の有核赤血球は、胎盤を通過して、母体の血液中に存在する赤血球前駆体である。母体が妊娠中には、胎児の赤血球は有核であり得る。この赤血球には染色体が存在するため、侵襲性が低い手段で、胎児由来の染色体および胎児遺伝子の入手が可能となる。この胎児由来の有核赤血球は、母体血中の細胞の１０^６個に１個程度の割合で存在しているといわれており、母体の末梢血中には非常に存在確率が少ない。

＜濃縮工程（ステップＳ１４）＞
次に、濃縮工程により、採取工程で採取した母体血中の有核赤血球の濃縮を行うことが好ましい。濃縮工程としては、公知の方法、例えば、密度勾配遠心分離法、ＭＡＣＳ法、ＦＡＣＳ法、レクチン法、あるいは、フィルタ濾過法などを用いることができる。なかでも、血球細胞の特性を利用し、簡便な濃縮方法として、密度勾配遠心分離法により濃縮を行うことが好ましい。濃縮工程の一例として、以下に、密度勾配遠心分離法について説明する。

〔密度勾配遠心分離法〕
密度勾配遠心分離法は、血液中の成分の密度の差を利用して分離する方法である。密度勾配遠心分離法は、分離用媒体を使用しない方法、また、１種の分離用媒体を使用してその分離用媒体の上下で分離する方法、あるいは、２種の分離用媒体を使用して目的の成分の密度領域を分離用媒体の間に挟み込むように分離する方法等を利用して、目的の成分（本実施形態においては有核赤血球）を集めることができる。そして、目的の成分を含む画分を採取することで、母体血から有核赤血球を濃縮することができる。

分離用媒体を使用しない方法としては、血液試料である母体の末梢血（希釈液で希釈されていてもよい）を遠心管に充填し、遠心分離を行った後に、目的の成分を採取することで有核赤血球の濃縮を行うことができる。

１種の分離用媒体を使用する方法としては、遠心管の底部に分離用媒体を注入し、分離用媒体の上に血液試料である母体の末梢血（希釈液で希釈されていてもよい）を積層した後に遠心分離を行い、遠心分離後の分離用媒体の上部（分離用媒体の一部を含んでもよい）を採取することで有核赤血球の濃縮を行うことができる。

２種の分離用媒体を使用する方法では、遠心管の底部に第１の分離用媒体を注入し、第１の分離用媒体の上に第２の分離用媒体を積層し、第２の分離用媒体の上に血液試料である母体の末梢血（希釈液で希釈されていてもよい）を積層した後に遠心分離にかけ、遠心分離後の第１の分離用媒体と第２の分離用媒体の間の層（第１の分離用媒体および／または第２の分離用媒体のそれぞれ一部を含んでもよい）を採取することで有核赤血球の濃縮を行うことができる。なお、第１の分離用媒体を積層した遠心管を第２の分離用媒体を積層する前に冷却すると、第１と第２の分離用媒体の境界領域での混合を抑制できる。

国際公開ＷＯ２０１２／０２３２９８号公報には、胎児の有核赤血球を含めた母体の血液の密度が記載されている。その記載によると、想定される胎児由来の有核赤血球の密度は、１．０６５〜１．０９５ｇ／ｍＬ程度、母体の血球の密度は、赤血球が１．０７０〜１．１２０ｇ／ｍＬ程度、好酸球は１．０９０〜１．１１０ｇ／ｍＬ程度、好中球は１．０７５〜１．１００ｇ／ｍＬ程度、好塩基球が１．０７０〜１．０８０ｇ／ｍＬ程度、リンパ球が１．０６０〜１．０８０ｇ／ｍＬ程度、単核球が１．０６０〜１．０７０ｇ／ｍＬ程度である。

積層する分離用媒体の密度は、密度が１．０６５〜１．０９５ｇ／ｍＬ程度の胎児由来の有核赤血球を、母体中の他の血球成分と分離するために設定される。例えば、２種の分離用媒体を使用する方法では、胎児由来の有核赤血球の中心の密度は、１．０８０ｇ／ｍＬ程度であるため、この密度を挟む２つの異なる密度の分離用媒体を作成し、隣接して重層することで、その界面に所望の胎児由来の有核赤血球を集めることが可能となる。好ましくは、第１の分離用媒体の密度を１．０８ｇ／ｍＬ以上１．１０ｇ／ｍＬ以下、第２の分離用媒体の密度は１．０６ｇ／ｍＬ以上１．０８ｇ／ｍＬ以下として設定することが好ましい。更に好ましくは、第１の分離用媒体の密度を１．０８ｇ／ｍＬ以上１．０９ｇ／ｍＬ以下、第２の分離用媒体の密度を１．０６５ｇ／ｍＬ以上１．０８ｇ／ｍＬ以下である。具体的な例としては、第１の分離用媒体の密度を１．０８５ｇ／ｍＬ、第２の分離用媒体の密度を１．０７５ｇ／ｍＬに設定することで、血漿成分、好酸球および単核球を、回収する所望の画分から分離することが可能となる。また、赤血球、好中球、リンパ球の一部も分離することが可能となる。本実施形態では、第１の分離用媒体と、第２の分離用媒体は同じ種類でも、異なる種類でも、本発明の効果を実現できる限りにおいて制限はないが、同じ種類の媒体を用いることが好ましい態様である。

濃縮工程で用いられる密度勾配遠心分離用の分離用媒体としては、ポリスクロースとジアトリゾ酸ナトリウムを含む溶液であるＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）、非透析性ポリビニルピロリドンをコーティングした直径１５〜３０ｎｍのシリカゾルを含む溶液であるＰｅｒｃｏｌｌ（登録商標）、ショ糖から作られた側鎖に富んだ中性の親水性ポリマー溶液であるＦｉｃｏｌｌ（登録商標）−Ｐａｑｕｅなどの分離用媒体を使用することができる。本実施形態では、ＨｉｓｔｏｐａｑｕｅおよびＰｅｒｃｏｌｌを使用することが好ましい。

密度勾配遠心分離の分離用媒体は、希釈液あるいは密度（比重）の異なる分離用媒体の混合により所望の密度に調製することが可能である。例えば、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）は、市販されている密度１．０７７の媒体と、密度１．１１９の媒体を用いて、第１の分離用媒体および第２の分離用媒体を所望の密度に調整することが可能である。また、これらの密度勾配遠心分離用媒体は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）などの添加により浸透圧を調節することができる。

＜塗抹工程（ステップＳ１６）＞
次に、濃縮工程で有核赤血球が濃縮された母体血の画分を基板上に塗抹することが好ましい。塗抹工程としては、引きガラス法（ウエッジ法）、クラッシュ法（押し潰し法）、手伸ばし法、スピン法などにより行うことができ、特に引きガラス法で行うことが好ましい。

引きガラス法としては、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血の画分を第１の基板上に、滴下する。第１の基板上に滴下した画分に、第２に基板を接触させて、その状態を維持することで、第１の基板と第２の基板とが接触した接触位置で、第１の基板と第２の基板とで囲まれた空間に、母体血の画分を広げる。その後、第２の基板を一定の速度で第１の基板上を移動させることで、第１の基板上に画分を広げ、塗抹標本を作製する。また、塗抹する前に、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血の画分の血球濃度を所望の濃度に調整する工程を塗抹工程に含むことも好ましい態様である。

また、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血の画分を、チャンバースライドを用いて、遠心塗抹法によりガラス基板上に血球細胞を敷設し、塗抹標本を作製する。この方法によれば、血球細胞を液中に存在させた状態で、塗抹標本を作製することができるので、細胞が乾燥状態を経ることがない。したがって、細胞の物理的ダメージを防止することができ、遺伝子解析の精度を高くすることができる。

上記のようにして作製した塗抹標本に対して、以下のように、有核赤血球の選別を行う。

＜赤血球識別工程（ステップＳ１８）＞
次に、有核赤血球を識別する前段階として、第１の波長領域の光を用いて塗抹標本上の血球細胞から赤血球を識別する。

図２は、還元ヘモグロビン（Ｈｂ）と、酸化ヘモグロビン（ＨｂＯ_２）の波長に対する吸収係数を示すグラフ図である（特開２０１４−１４４８５号公報に記載）。有核赤血球は、脱核して赤血球になる前駆体であり、白血球にないヘモグロビンを有する。よく知られているように、ヘモグロビンは鉄―ポルフィリン錯体であり、ポルフィリン環に由来する３８０ｎｍから４５０ｎｍ付近にＳｏｒｅｔ帯と呼ばれる吸収をもち（図２では不図示）、５００ｎｍから６００ｎｍ程度にＱ帯と呼ばれる吸収をもつ錯体である。

赤血球識別工程は、このヘモグロビンの有無を識別するために、ヘモグロビンの吸収波長領域にピーク波長を有する第１の波長領域の光を用いて、赤血球を識別する。第１の波長領域の光は、吸収ピークが上記の波長領域に存在する光であり、３８０ｎｍ以上６５０ｎｍ以下の波長領域にピーク波長を有する光が好ましく、より好ましくは３８０ｎｍ以上４７０ｎｍ以下の波長領域にピーク波長を有する光である。

上記条件を満たす光として、例えば、ＬＥＤ（light emitting diode）またはＬＡＳＥＲ（light amplification by stimulated emission of radiation）の光、および、干渉フィルタを通過した単色光を主波長とする光などが使用可能であり、ＬＥＤまたはＬＡＳＥＲの光が好ましく使用される。なお、「単色光を主波長とする光」とは、単色光そのものか、あるいは、単色光と単色光の波長近傍の波長の光とを含む光、とする。

第１の波長領域の光として、具体的には、４０５ｎｍのピークを持つＴＨＯＲＬＡＢＳ社製のＬＥＤ，４２０ｎｍのピークを持つＴＨＯＲＬＡＢＳ社製のＬＥＤなどを使用する態様が好ましい。４０５ｎｍのピークを持つＬＥＤを用いて、塗抹標本上の血球細胞の透過光の画像を得た場合には、ヘモグロビンを有する有核赤血球を含む赤血球は、透過光の量が少なくなるので、この画像を記録することで、ヘモグロビンを有する細胞の識別が可能となり、位置を記録することができる。

＜有核赤血球識別工程（ステップＳ２０）＞
次に、赤血球識別工程で識別した赤血球から、第２の波長領域の光を照射した際に発する自家蛍光画像を確認することで、有核赤血球を識別する。

自家蛍光により有核赤血球を識別することで、核の染色が不要となるため、染色色素を使用する必要がない。したがって、細胞の核もしくは核の周辺に染色色素が付着することがないため、選別された有核赤血球の細胞核からの遺伝子解析をより正確に、精度良く行うことが可能となる。

核の有無を識別する第２の波長領域の光としては、励起波長が５３０ｎｍ以下の励起光であることが好ましく、より好ましくは、励起波長が３００ｎｍ以上４５０ｎｍ以下の励起光であり、さらに好ましくは、励起波長が３５０ｎｍ以上４１０ｎｍ以下の励起光である。

また、塗抹標本上の有核赤血球の核から発する蛍光発光は、４５０ｎｍ以上６５０ｎｍ以下の波長領域の光として確認することが好ましく、より好ましくは４５０ｎｍ以上５５０ｎｍ以下である。

自家蛍光画像の一例を図３に示す。図３は、塗抹標本に励起波長４００ｎｍの励起光を照射させた際の自家蛍光画像を示す写真（Ａ）および図（Ｂ）である。また、図４は、図３（Ｂ）に示すＡ〜Ｅの位置の波長（検出波長）４２０ｎｍ〜７００ｎｍに対する蛍光強度の関係を示す図である。

有核赤血球に第２の波長領域の光を照射すると、自家蛍光は核からだけでなく、細胞質からも発生する。しかしながら、蛍光強度は、位置ＡとＢの比較から、核の方が細胞質よりも発光が強いため、赤血球の領域の中で、蛍光の強い領域を核、蛍光の低い領域を細胞質として判断することができる。したがって、赤血球像領域中で、特に発光の強い領域を確認することで、有核赤血球を識別することができる。また、位置Ｂと、Ｃ〜Ｅの蛍光強度を比較すると、Ｃ〜Ｅの蛍光強度が低い傾向にある。これにより、有核赤血球と核のない赤血球では、有核赤血球の細胞質の方が、蛍光強度が高いため、細胞全体として蛍光強度の高い細胞を有核赤血球の可能性の高い細胞として識別することができる。

第２の波長領域の光は、第１の波長領域の光と同様に、例えば、ＬＥＤまたはＬＡＳＥＲの光、および、干渉フィルタを通過した単色光を主波長とする光などが使用可能であり、ＬＥＤまたはＬＡＳＥＲの光が好ましく使用される。

第１の波長領域の光と第２の波長領域の光が、同じ波長の光を使用する場合は、第１の波長の光と第２の波長の光を共通の光とすることができる。共通の光とすることで、１度の照射で、塗抹標本上の血球細胞を透過した透過光により赤血球を識別し、自家蛍光により核の有無を識別し、有核赤血球の識別をすることができる。

＜選別工程（ステップＳ２２）＞
選別工程は、有核赤血球識別工程で識別した有核赤血球を母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別する工程である。なお、本実施形態においては、有核赤血球を母体由来、あるいは、胎児由来に選別することは、選別工程で行っても良いし、選別工程は行わず、有核赤血球識別工程で識別した有核赤血球を、次の細胞単離工程で取得し、その後の工程の遺伝子解析により、母体由来、あるいは、胎児由来の有核赤血球であることの確認をすることもできる。

選別工程は、ヘモグロビンの酸素親和性に起因する分光特性により、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別する。成人の赤血球中のヘモグロビンは、４量体α２β２（ＨｂＡ）である。一方、胎児の赤血球中のヘモグロビンは、２本のα鎖と２本のγ鎖によって作られた４量体α２γ２（ＨｂＦ）であり、生後、大部分を占めるＨｂＡと少数のＨｂＦからなるＨｂＡ２に置き換わっていくことが知られている。胎盤中では、血液中の妊娠母体のヘモグロビン（ＨｂＡ）から酸素の提供を受けることで、胎児のヘモグロビンは酸素を得ている。母体のヘモグロビン（ＨｂＡ）と胎児のヘモグロビン（ＨｂＦ）は、静脈中で酸素親和性に差があり、図２に示すように、還元ヘモグロビンと酸化ヘモグロビンは、吸収係数に差が生じるので、この差を用いて母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球を選別する。

選別工程において、ヘモグロビンの酸素親和性に起因する分光特性は、３８０ｎｍ以上６５０ｎｍ以下の波長領域に含まれる波長における吸光度であることが好ましい。酸化ヘモグロビンと還元ヘモグロビンは、３８０ｎｍ以上６５０ｎｍ以下の波長領域において、異なる吸光度を示すため、この波長域に含まれる波長において吸光度を測定することで、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とを選別することができる。

選別工程は、上記波長の光を照射することで行ってもよく、赤血球識別工程で、第１の波長領域の光が、３８０ｎｍ以上６５０ｎｍ以下の波長領域の光であれば、赤血球識別工程で取得した画像を用いて選別工程を行うこともできる。

また、別の態様においては、分光特性は、３８０ｎｍ以上６５０ｎｍ以下の波長領域から選択される２種類以上の単色光における吸光度であることが好ましい。この態様によれば、分光特性を３８０ｎｍ以上６５０ｎｍ以下の波長領域から選択される２種類以上の単色光を用いて吸光度を測定することで、異なる吸光度を示す波長で分光特性を測定することができる。したがって、分光特性の差異を明確にすることができ、精度良く選別することができる。

さらに、別の態様においては、分光特性は、胎児由来の有核赤血球の吸光度が母体由来の有核赤血球の吸光度を超える第３の波長領域の光と、母体由来の有核赤血球の吸光度が胎児由来の有核赤血球の吸光度を超える第４の波長領域の光と、を含む少なくとも２種類以上の各々の波長の光で有核赤血球の吸光度を測定することが好ましい。

ヘモグロビンの吸収係数をもつ細胞において、分光特性の測定に用いられる波長を、胎児由来の有核赤血球の吸光度が母体由来の有核赤血球の吸光度を超える第３の波長領域の波長と、母体由来の有核赤血球の吸光度が胎児由来の有核赤血球の吸光度を超える第４の波長領域の波長と、から選ばれる各々の波長で測定することで、胎児由来の有核赤血球と母体由来の有核赤血球とで、第３の光波長領域の吸光度の大きさと、第４の光波長領域の吸光度の大きさとが、逆転することになる。したがって、各々の波長で測定した吸光度を比較することで、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球との差を明確にすることができ、精度良く、有核赤血球の選別を行うことができる。例えば、第３の波長領域の波長、および、第４の波長領域の波長で測定した吸光度の比を求めることで、胎児由来の有核赤血球の吸光度の比と、母体由来の有核接球の吸光度の比と、の差が大きくなるので、有核赤血球を胎児由来と母体由来とに選別することができる。

具体的には、第３の波長領域としては、３８０ｎｍを超え以上５００ｎｍ未満の波長領域、５２５ｎｍを超え５５０ｎｍ未満の波長領域、および、５７５ｎｍを超え５８５ｎｍ未満の波長領域であり、第４の波長領域としては、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の波長領域、および、５９０ｎｍを超え６５０ｎｍ未満の波長領域であることが好ましい。

第３の波長領域である、３８０ｎｍを超え５００ｎｍ未満の波長領域で好ましく用いられる光源としては、４２５ｎｍ、４５５ｎｍ、４７０ｎｍに発光ピークを持つＬＥＤや、４１０ｎｍ、４４５ｎｍに発光ピークを持つ半導体レーザー、５２５ｎｍを超え５５０ｎｍ未満の波長領域で好ましく用いられる光源としては、５３０ｎｍに発光ピークを持つＬＥＤ、５７５ｎｍを超え５８５ｎｍ未満の波長領域で好ましく用いられる光源としては、干渉フィルタを用いた単色光を主波長とする光、が挙げられる。また、第４の波長領域である、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の波長領域で好ましく用いられる光源としては、５６５ｎｍに発光ピークを持つＬＥＤ、５９０ｎｍを超え６５０ｎｍ未満の波長領域で好ましく用いられる光源としては、６１７ｎｍや、６２５ｎｍに発光ピークを持つＬＥＤ、が挙げられる。

また、有核赤血球と、核のない赤血球との吸光度の比、または差分に基づいて、胎児由来の有核赤血球である可能性に順位をつけることで選別することもできる。

核のない赤血球は、母体由来の血液成分であるので、有核赤血球の吸光度と核のない赤血球の吸光度との比が、「１」からの差が一番大きく異なる細胞を胎児由来の有核赤血球、「１」からの差が一番小さい細胞を母体由来の有核赤血球として、胎児由来の有核赤血球である可能性に順位をつけることができる。また、吸光度の差分に基づいて順位をつける場合は、有核赤血球と核のない赤血球との差分が最も大きい有核赤血球を、胎児由来の有核赤血球である可能性の高い赤血球とし、有核赤血球と核のない赤血球との差分が最も小さい赤血球を、母体由来の有核赤血球である可能性の高い赤血球として順位をつけることができる。そして、この順位に基づいて、遺伝子解析を行うことで、複数の有核赤血球の候補細胞の中から胎児由来の有核赤血球を精度良く選別することができる。

＜細胞単離工程（ステップＳ２４）＞
細胞単離工程は、有核赤血球識別工程で識別した有核赤血球、または、選別工程で胎児由来または母体由来の有核赤血球として選別した有核赤血球を、基板上から選択的に１つずつ単離する工程である。細胞の単離には、レーザーマイクロダイセクション装置や、マイクロマニピュレータを使用することができる。

〔レーザーマイクロダイセクション〕
レーザーマイクロダイセクションとは、例えば市販されているZeiss社のPALM Micro Beamなどの顕微鏡とレーザーを組み合わせて微小領域の切断、加工を行うことができる装置システムのことである。レーザーマイクロダイセクションでは、基板に塗沫されたサンプルの目的の部位のみを選択的にレーザーで切り取り採取することができる装置である。このため、基板に均一に細胞もしくは組織が塗抹されていることが好ましい。これにより、目的の単一細胞のみを取得することが可能となる。

有核赤血球を基板上から単離する細胞単離工程では、分光特性により分別した基板上の細胞の位置情報をあらかじめ取得しておき、レーザーマイクロダイセクション装置へその位置情報を入力する。レーザーマイクロダイセクション装置に基板をセットすると、装置は位置情報を基に目的の位置に自動的に移動し、あらかじめ登録しておいたレーザー出力条件によって目的の細胞のみをレーザーで取得し、専用の回収チューブに細胞を分取する。

〔マイクロマニピュレータ〕
マイクロマニピュレータは，顕微鏡下で細胞をハンドリングすることが可能な装置である。例えば、市販の顕微鏡システムに付け加える形でナリシゲ社のマイクロインジェクションシステムやマイクロマニピュレータシステムなどを使用する。顕微鏡下で目的の細胞を塗沫したサンプル基板から、任意の単一細胞を取得することが可能である。

有核赤血球を基板上から単離する細胞単離工程では、上記レーザーマイクロダイセクションと同様に分光特性により分別した基板上の細胞の位置情報をあらかじめ取得しておき、マイクロマニピュレータシステムに位置座標を入力する。マイクロマニピュレータシステムにセットした基板は位置情報を基に目的の細胞の取得位置まで移動する。その後マニピュレータを動作させ、目的の細胞のみを取得し、細胞回収液を入れたチューブに封入する。チューブに封入した細胞のＤＮＡを解析する場合には、細胞回収液は、ＤＮＡフリーである細胞回収液であることが好ましい。

＜増幅工程（ステップＳ２６）＞
増幅工程は、細胞単離工程で単離された有核赤血球、あるいは、少なくとも胎児由来の有核赤血球の染色体に含まれる核酸を増幅する工程である。

本実施形態で用いる全ゲノム増幅法としては、取得した細胞から、一般的な方法である界面活性剤を用いた細胞溶解、プロテアーゼＫ等を用いたタンパク質分解工程を経ることで、細胞から溶出することにより得られたゲノムＤＮＡを用いる。

全ゲノム増幅試薬としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）に基づく試薬ＰｉｃｏＰＬＥＸ ＷＧＡ ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ＧｅｎｏｍｅＰｌｅｘ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、国際公開ＷＯ２０１２／１６６４２５Ａ２号に開示されている、ＭＡＬＢＡＣ法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ａｎｄ Ｌｏｏｐｉｎｇ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｙｃｌｅｓ）に係る試薬を用いることができる。また、鎖置換型ＤＮＡ合成反応に基づく試薬として、例えば、ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（ＧＥヘルスケア社、ＧｅｎｏｍｉＰｈｉは登録商標）、ＲＥＰＬＩ−ｇ（Ｑｉａｇｅｎ社、ＲＥＰＬＩ−ｇは登録商標）も同様に用いることができる。本実施形態では、ＰｉｃｏＰＬＥＸ ＷＧＡ ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いることが好ましい。

全ゲノム増幅により得られたＤＮＡの増幅産物は、アガロースゲル電気泳動等により増幅有無を確認することが可能である。更に、全ゲノム増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製することが好ましい。

また、全ゲノム増幅により得られたＤＮＡの増幅産物の濃度について、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｑｕａｎｔｕｓ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて測定することが好ましい。

増幅工程においては、有核赤血球の染色体に存在する核酸、あるいは、選別工程を行った場合は、少なくとも胎児由来の有核赤血球の染色体に存在する核酸であるＤＮＡを増幅する。胎児由来の有核赤血球の数は、少なくとも１つでよいが、複数の胎児由来の有核赤血球から取得した核酸を増幅することが好ましい。更には、後工程で胎児の染色体の数的異常を決定するために、増幅産物の量を比較する基準として、数的異常が存在しない母体由来の有核赤血球の染色体を選択することも好ましい態様である。母体由来の有核赤血球を基準と比較する場合、選別工程により選別した母体由来の有核赤血球の染色体の核酸を増幅することも好ましい態様の一つである。

＜確定工程（ステップＳ２８）＞
確定工程は、増幅工程により増幅した有核赤血球の増幅産物の量を確定するとともに、有核赤血球を遺伝子解析により胎児由来あるいは母体由来の有核赤血球であることを確認する工程である。

〔遺伝子解析〕
遺伝子解析は、ＤＮＡマイクロアレイ、デジタルＰＣＲ、次世代シーケンサー、ｎＣｏｕｎｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ社）を用いることが可能であるが、本実施形態においては、解析の精度および速さ、１度に処理可能な試料数の多さ等の点で次世代シーケンサーを用いることが好ましい。

本実施形態において次世代シーケンサーとは、サンガー法を利用したキャピラリーシーケンサー（第一世代シーケンサーと呼ばれる）に対比して分類されるシーケンサーを意味する。次世代シーケンサーは、第二世代、第三世代、第四世代、および今後開発されるシーケンサーを含む。現時点で最も普及している次世代シーケンサーは、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成又はＤＮＡリガーゼによる相補鎖結合に連動した蛍光又は発光をとらえ塩基配列を決定する原理のシーケンサーである。具体的には、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、ＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、ＨｉＳｅｑは登録商標）、Ｒｏｃｈｅ４５４（Ｒｏｃｈｅ社）などが挙げられる。

増幅工程で得られたＤＮＡの増幅産物を次世代シーケンサーで解析する場合、全ゲノムシーケンス、エキソームシーケンス、アンプリコンシーケンスを用いることが可能である。

次世代シーケンサーで得られた配列データをアライメントする手段としては、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）が挙げられ、ＢＷＡによって既知のヒトゲノム配列へ配列データをマッピングすることが好ましい。遺伝子を解析する手段としては、ＳＡＭｔｏｏｌｓおよびＢＥＤｔｏｏｌｓが挙げられ、これらの解析手段により遺伝子多型、遺伝子変異、および染色体数を解析することが好ましい。

≪対立遺伝子による分析≫
増幅工程により全ゲノム増幅を行った後、対立遺伝子の配列を決定することで、有核赤血球が胎児由来の有核赤血球であることを確認することができる。

選別工程において胎児由来の有核赤血球の細胞として同定され、ポリメラーゼ連鎖反応（増幅工程）により増幅されたＤＮＡであって、数的異常を検査する対象となる染色体に対して、あらかじめ決定された１００〜１５０ｂｐ（ｂａｓｅ ｐａｉｒ：ベースペア）の領域の配列を有するＤＮＡの増幅産物の量をシーケンサーで求める。本実施形態においては、検査する対象となる染色体は、１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、Ｘ染色体であることが好ましい。胎児由来の有核赤血球は、通常、父親および母親から１組ずつの染色体を受け継いでおり、性染色体を除き、２本ずつの染色体を有している。これらの１組の染色体の対立遺伝子を分析し、父親由来の遺伝子の存在を確認することで、有核赤血球が胎児由来の有核赤血球か母体由来の有核赤血球かを選別することができる。

父親由来の遺伝子の存在の確認は、母親由来の細胞についても同時に遺伝子解析を行い、母親由来の細胞にはない対立遺伝子が存在する場合に、この対立遺伝子が父親由来の遺伝子であると認定することができる。父親由来の遺伝子が確認された場合、その有核赤血球は胎児由来の有核赤血球であると選別することができる。遺伝子解析を行う母親由来の細胞は、特に限定されないが、母体血の塗抹標本上に存在する白血球からのＤＮＡ分析を行うことが好ましい。

分析する対立遺伝子は、一塩基多型（ＳＮＰ（ＳＮＰｓ）：Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、または、コピー数多型（ＣＮＰ（ＣＮＰｓ）Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ），縦列型反復配列（ＳＴＲ：Ｓｈｏｒｔ Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔ）を分析することが好ましい。

胎児の遺伝子は、両親から一対ずつの遺伝子を受け継いでおり、遺伝情報は４種類の塩基の化学物質の配列で記録されている。ヒトの場合には、約３０億個の塩基があるが、１０００〜２０００個に１個の割合で、個人によって異なる配列部分が存在し、これを一塩基多型という。この一塩基多型を分析し、母体由来の有核赤血球か、または母体由来の細胞である白血球等の核を有する血球細胞と比較することで、有核赤血球に一塩基多型の配列を確認することができれば、有核赤血球は胎児由来であると確認することができる。

コピー数多型、縦列型反復配列とは、ＤＮＡの中に、あるＤＮＡ配列が一つの単位となり、このＤＮＡ配列が直列に、繰り返し並んでいる領域があり、この繰り返し領域のことである。胎児は、コピー数多型、縦列型反復配列を父親および母親から引き継ぐため、母体由来の有核赤血球か、または母体由来の白血球等の核を有する血球細胞と異なるコピー数多型、縦列型反復配列を有する有核赤血球は胎児由来の有核赤血球であると確認することができる。

≪Ｙ染色体による分析≫
胎児が男児である場合、増幅工程により全ゲノム増幅を行った後、Ｙ染色体の存在の有無を確認することで、有核赤血球が胎児由来の有核赤血球であるかを確認することができる。

Ｙ染色体は、男性にしか存在しないため、母体由来の有核赤血球には存在しない。したがって、胎児が男児である場合、Ｙ染色体の存在を確認することができれば、有核赤血球は胎児由来の有核赤血球であると確認することができる。

＜有核赤血球の選別装置＞
図５は、有核赤血球の選別装置の構成を示す概略構成図である。

本実施形態の有核赤血球の選別装置１０は、光源装置１２、励起フィルタ、ダイクロイックミラー、および、吸収フィルタ（エミッションフィルタ）を保持したフィルタキューブ１４、レンズ１６、１８、選別する血球細胞が塗抹された塗抹標本２０、第１の撮像装置２２、第２の撮像装置２４、画像処理装置２６、モニター２８を備える。

光源装置１２は、赤血球識別工程で用いられる第１の波長領域の光、有核赤血球識別工程で用いられる第２の波長領域の光、および、選別工程で用いられる第３の波長領域の光および第４の波長領域の光を出力する装置である。このような光源装置１２としては、ＬＥＤ、または、ＬＡＳＥＲを用いることができる。また、光源装置１２としては、タングステンランプ、ハロゲンランプなどを用いることができるが、これらを用いる場合は、干渉フィルタを通過させ、単色光を主波長とする光とすることが好ましい。なお、干渉フィルタとしては、フィルタキューブ１４に含まれる励起フィルタを用いることができる。なお、「単色光を主波長とする光」とは、単色光そのものか、あるいは、単色光と単色光の波長近傍の波長の光とを含む光、とする。

第１の波長領域の光は、ヘモグロビンの吸収波長領域にピーク波長を有する光であり、３８０ｎｍ以上６５０ｎｍ以下の波長領域にピーク波長を有する光が好ましく、より好ましくは３８０ｎｍ以上４７０ｎｍ以下の波長領域にピーク波長を有する光である。

第２の波長領域の光は、励起波長が５３０ｎｍ以下の励起光であることが好ましく、より好ましくは、励起波長が３００ｎｍ以上４５０ｎｍ以下の励起光であり、さらに好ましくは、励起波長が３５０ｎｍ以上４１０ｎｍ以下の励起光である。

また、第３の波長領域の光は、胎児由来の有核赤血球の吸光度が母体由来の有核赤血球の吸光度を超える波長の光であり、３８０ｎｍを超え以上５００ｎｍ未満の波長領域、５２５ｎｍを超え５５０ｎｍ未満の波長領域、および、５７５ｎｍを超え５８５ｎｍ未満の波長領域である。第４の波長領域の光は、母体由来の有核赤血球の吸光度が胎児由来の有核赤血球の吸光度を超える波長の光であり、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の波長領域、および、５９０ｎｍを超え６５０ｎｍ未満の波長領域である。

なお、図５では、１つの光源装置１２が、第１の波長領域の光から第４の波長領域の光を出力する装置として記載しているが、それぞれの波長領域の光を出力する光源装置として、複数の光源装置を用いてもよい。

図６は、フィルタキューブ１４の構成を説明する図である。フィルタキューブ１４は、励起フィルタ３２、ダイクロイックミラー３４、エミッションフィルタ３６を備える。なお、励起フィルタ３２は、光源装置１２として、ＬＥＤ、または、ＬＡＳＥＲを用いる場合は設けなくてもよい。このような、励起フィルタ、ダイクロイックミラー、エミッションフィルタを備えるフィルタキューブ１４としては、例えば、Zeiss Filter Set 49 (DAPI)を用いることができる。

光源装置１２から照射された光は、励起フィルタ３２により、赤血球識別工程で用いられる第１の波長領域の光のみ通過する。または、光源装置１２から第１の波長領域の光が照射される。ダイクロイックミラー３４は、励起フィルタ３２を通過した光を塗抹標本２０の方向に反射する。赤血球識別工程においては、塗抹標本２０を透過した透過光は、レンズ１８を経て第１の撮像装置２２で第１の画像が撮像される。

また、有核赤血球識別工程においては、光源装置１２から照射された光は、励起フィルタ３２により、有核赤血球識別工程で用いられる第２の波長領域の光のみ通過し、ダイクロイックミラー３４により、塗抹標本２０の方向に反射される。または、光源装置１２から照射された第２の波長領域の光を、ダイクロイックミラー３４により、塗抹標本２０の方向に反射する。第２の反射領域の光が照射された塗抹標本２０から発せられる蛍光は、レンズ１６、ダイクロイックミラー３４を通過し、エミッションフィルタ３６を通過し、レンズ３８（図５において不図示）を経て第２の撮像装置２４で第２の画像が撮像される。エミッションフィルタ３６は、第２の波長領域の光は通過せず、塗抹標本２０から発する蛍光のみ、すなわち、母体血から発する蛍光のみ通過させるため、第２の撮像装置２４で、母体血の発する自家蛍光画像を取得することができる。エミッションフィルタ３６を通過させる自家蛍光としては、ピーク波長が、４５０ｎｍ以上６５０ｎｍ以下の波長領域に含まれる蛍光であることが好ましい。

第３の波長領域の光、第４の波長領域の光についても、第１の波長領域の光と同様に、励起フィルタ３２により、選択工程で用いられる光のみ通過し、ダイクロイックミラー３４により塗抹標本２０の方向に反射される。または、光源装置１２から照射された第３の波長領域の光、および、第４の波長領域の光をダイクロイックミラー３４により、塗抹標本２０の方向に反射する。選別工程においても、塗抹標本２０を透過した透過光を第１の撮像装置２２で撮像した画像を用いて、有核赤血球を母体由来および胎児由来の有核赤血球に選別する。

酸化ヘモグロビンと還元ヘモグロビンは、３８０ｎｍ以上６５０ｎｍ以下の波長領域において、異なる吸光度を示すため、この波長領域に含まれる波長において吸光度を測定することで、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別することができる。吸光度の測定は、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別するための画像を新たに取得しても良いが、赤血球を識別するために取得した第１の画像を用いて行うこともできる。また、第３の波長領域の光、第４の波長領域の光を照射した画像を用いて行ってもよい。

また、第１の画像と第２の画像の取得は、使用する波長が同じ光であれば、共通の光を用いて、第１の画像と第２の画像を取得することもできる。光源装置１２から出力された光は、励起フィルタ３２を通過し、ダイクロイックミラー３４に反射され、塗抹標本２０を透過した透過光を第１の撮像装置２２で撮像することで、第１の画像を取得する。また、塗抹標本２０の自家蛍光を第２の撮像装置２４で撮像することで、第２の画像として取得する。これにより、１度の光源装置１２からの光の照射で、赤血球を識別するための画像と、有核赤血球を識別するための画像を取得することができる。

塗抹標本２０としては、上記の有核赤血球の選別方法における、採取工程（ステップＳ１２）から塗抹工程（Ｓ１６）の工程を経て作製した標本を使用することができる。塗抹標本２０は、第１の撮像装置２２、第２の撮像装置２４で撮像された画像を用いて、単離回収する有核赤血球が選別されるため、Ｘ方向、Ｙ方向に移動可能なＸＹステージ上に設置されることが好ましい。また、有核赤血球の選別装置は、取得する細胞の位置を記録する記録部を備えることが好ましい。

第１の撮像装置２２、第２の撮像装置２４としては、塗抹標本２０の透過光、または、自家蛍光を撮像することができれば特に限定されず、例えば、ＣＣＤ（charge-coupled device）カメラを用いることができる。

画像処理装置２６は、第１の撮像装置２２、第２の撮像装置２４で撮像された画像を用いて、赤血球、および、有核赤血球を識別する装置である。画像処理装置２６は、モニター２８を備えており、第１の撮像装置２２で撮像された第１の画像、および、第２の撮像装置で撮像された第２の画像を確認することができる。

画像処理装置２６では、第１の撮像装置２２で撮像された第１の画像に基づいて赤血球を識別する。赤血球の識別は、ヘモグロビンの有無を識別することにより行う。第１の波長領域の光は、ヘモグロビンの吸収波長領域にピーク波長を有する光であり、第１の画像を確認することで、ヘモグロビンの有無を確認することができ、赤血球を識別することができる。

赤血球を識別した後、第２の撮像装置２４で撮像された第２の画像に基づいて有核赤血球を識別する。有核赤血球の識別は、第２の波長領域の光を照射した際に塗抹標本（母体血）２０が発する自家蛍光により識別する。第２の波長領域の光を照射した際に発する自家蛍光は、赤血球中に核を有する場合、有核赤血球の核の方が細胞質より発光が強いため、赤血球の領域の中で、蛍光の強い領域を有する細胞を有核赤血球として識別することができる。また、有核赤血球の細胞質と、核のない赤血球の細胞質とでは、有核赤血球の細胞質の方が、蛍光強度が強いため、細胞全体として蛍光強度の高い細胞を有核赤血球の可能性の高い細胞として識別することができる。

また、識別した有核赤血球が胎児由来の有核赤血球、または、母体由来の有核赤血球の選別を行うこともできる。母体由来または胎児由来の有核赤血球の選別は、上述した選別工程で記載した方法により選別することができ、取得した画像から酸化ヘモグロビンと還元ヘモグロビンの吸光度の違いにより選別することができる。また、２種類以上の単色光を用いて吸光度を測定することで、異なる吸光度を示す波長で分光特性を測定することができ、精度良く選別することができる。

また、第３の波長領域の光および第４の波長領域の光を用いて画像を取得し、第３の波長領域の光で測定した吸光度と第４の波長領域の光で測定した吸光度の比を測定することで、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とで吸光度の比の差が大きくなるので、有核赤血球を母体由来と胎児由来の有核赤血球に選別することができる。さらに、核のない赤血球は、母体由来の血液成分であるので、有核赤血球と核のない赤血球との吸光度の比、または、差分に基づいて、胎児由来の有核赤血球である可能性に順位をつけ、順位の高い細胞から単離回収をすることで、遺伝子解析する有核赤血球が胎児由来の有核赤血球である確率を高めることができ、効率よく解析を行うことができる。

以下に実施例を挙げ、本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明はこの実施例に限定されるものではない。

＜実施例１＞
（採取工程）
７ｍＬ採血管に抗凝固剤として、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸：ethylenediaminetetraacetic acid）のナトリウム塩を１０．５ｍｇ添加した後、妊婦のボランティアから、インフォームドコンセントを行った後に、ボランティア血として末梢血７ｍＬを採血管内に得た。その後、ＰＢＳバッファー液（リン酸緩衝液：Phosphate buffered saline）を用いて、血液を希釈した。

（濃縮工程）
Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ液（登録商標）を使用して、密度１．０９５ｇ／ｍＬの媒体を調製し、遠沈管の底部に３ｍＬを添加した。その後、密度１．０９５ｇ／ｍＬの媒体の上に、採血した血液の希釈液１２ｍＬをゆっくり、遠沈管に添加した。その後、遠心分離を２０００ｒｐｍで２０分間行った。その後、遠沈管を取り出し、密度媒体と、血漿の間の画分を、ピペットを用いて採取した。

（塗抹工程）
このように採取した血液の画分を、片手で第１のガラス基板を保持し、その１端に１滴採取した血液の画分を置いた。もう一方の手で別のガラス基板（第２のガラス基板）を持ち、第２のガラス基板の１端を第１のガラス基板に３０度の角度で接触させ、第２のガラス基板の接触下面を血液の画分に触れると、毛管現象で２枚のガラスに囲まれた空間に広がる。次に角度を保ったまま、第２ガラス基板を第１のガラス基板の血液を置いた領域と反対の領域の方向に滑らせて、第１のガラス基板上に塗抹した。その後、送風で１時間以上十分に乾燥させた。これらの工程を繰り返すことで、血球細胞が塗抹されたスライドガラス基板を複数枚作製した。

（識別工程）
スライドガラス基板上に塗抹した細胞から、有核赤血球候補を選別するため、第１の波長領域の光源である４０５ｎｍのピークを持つＬＥＤ（第１の光源）、第２の波長領域の励起光源であるメタルハライドランプ（第２の光源）および、その励起光を分離して蛍光を確認するためのZeiss Filter Set 49 (DAPI)を準備した。

さらに、電動ＸＹステージと、対物レンズ、ＣＣＤ（charge-coupled device）カメラを備えた蛍光が観察可能な光学顕微鏡の測定系と、ＸＹステージ制御部、Ｚ方向制御部とを備えた制御部と、画像入力部と画像処理部、およびＸＹ位置記録部とを備えた制御ユニット部を準備した。

上記のように準備した、スライドガラス基板上に塗抹した血球細胞をＸＹステージに乗せて、第１の光源を用いてスライドガラス上に焦点を合わせてスキャンし、光学顕微鏡より得られた画像を取り込んだ。続いて、第２の光源、フィルターセットを用いて励起光を照射し、蛍光顕微鏡により得られた蛍光画像を取り込み、得られた画像を解析することにより、標的細胞である有核赤血球を探索した。

画像解析は、第１の光源を用いて得られた画像を用いて赤血球を識別し、スライドガラス上のＸＹ位置を記録した。続いて、第２の光源、フィルターセットを用いて得られた蛍光画像から核を有する細胞を識別し、スライドガラス上のＸＹ位置を記録した。有核赤血球の核は、適切な励起光を照射することで自家蛍光を発生するため、赤血球の一部に特に高い強度の蛍光を発することを確認することで、容易に有核赤血球の核を識別することができる。識別した赤血球のＸＹ位置と核がある細胞のＸＹ位置の比較により、赤血球でかつ核がある細胞（有核赤血球）を識別した。

（細胞単離工程）
上記工程で識別された有核赤血球を、マイクロマニュピュレータを使用して回収した。

（増幅工程）
有核赤血球と識別された細胞を用いて、New England Biolabs社製Single Cell WGA kitを用いて全ゲノム増幅を行い、説明書記載に則り細胞中の微量なＤＮＡを約１００万倍に増幅した。

（確定工程［母体由来または胎児由来の有核赤血球に選別する工程］）
各細胞から増幅した全ゲノム増幅産物を用いて、ILLUMINA社製ゲノムアナライザーMiseqにより、13番染色体の C1QTNF9B遺伝子領域、PCDH9遺伝子領域、BRCA2遺伝子領域、MTRF1遺伝子領域のＳＮＰ（SNP ID：rs3751355、rs1799955、rs2297555、rs9571740）を比較することで、細胞のＳＮＰを確認でき、有核赤血球を母体由来と胎児由来との選別することができた。

＜実施例２＞
（採取工程）
実施例１と同様に、ボランティア血として末梢血７ｍＬを採血管内に得た。その後、ＰＢＳバッファー液を用いて、血液を希釈した。

（濃縮工程）
Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ液（登録商標）を使用して、密度１．０９５ｇ／ｍＬの媒体を調製し、遠沈管の底部に３ｍＬを添加した。その後、密度１．０９５ｇ／ｍＬの媒体の上に、採血した血液の希釈液１２ｍＬをゆっくり、遠沈管に添加した。その後、遠心分離を２０００ｒｐｍで２０分間行った。その後、遠沈管を取り出し、密度媒体と、血漿の間の画分を、ピペットを用いて採取した。

（塗抹工程）
このように採取した血液の画分、血漿を、チャンバースライドを用いて遠心塗抹法でガラス基板上に血球細胞を敷設した。血球は液中に存在するようにして、乾燥しないように、保湿カバー、高湿度環境下で取り扱った。この方法で血球細胞が敷設されたガラス基板を複数枚作製した。

（赤血球識別工程、有核赤血球識別工程）
スライドガラス基板上に敷設した細胞から、胎児由来の有核赤血球を選別するため、第１の波長領域の光源である４０５ｎｍのピークを持つＬＥＤ（第１の光源）、第２の波長領域の励起光源であるメタルハライドランプ（第２の光源）および、その励起光を分離して蛍光を確認するためのZeiss Filter Set 49 (DAPI)を準備した。また、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球を選別するため、第３の波長領域の光源である４７０ｎｍに発光ピークを持つＬＥＤ、第４の波長領域の光源である６２５ｎｍに発光ピークを持つＬＥＤを準備した。

さらに、電動ＸＹステージと、対物レンズ、ＣＣＤ（charge-coupled device）カメラを備えた蛍光が観察可能な光学顕微鏡の測定系と、ＸＹステージ制御部、Ｚ方向制御部とを備えた制御部と、画像入力部と画像処理部、およびＸＹ位置記録部とを備えた制御ユニット部を準備した。

上記のように準備した、スライドガラス基板上に塗抹した血球細胞をＸＹステージに乗せて、第１の光源を用いてスライドガラス上に焦点を合わせてスキャンし、光学顕微鏡より得られた画像を取り込んだ。続いて、第２の光源を用いて蛍光顕微鏡により蛍光画像を取り込み、得られた画像を解析することにより、標的細胞である有核赤血球を探索した。

画像解析は、第１の光源を用いて得られた画像を用いて赤血球を識別し、スライドガラス上のＸＹ位置を記録した。続いて、第２の光源を用いて得られた蛍光画像から、自家蛍光により核を有する細胞を識別し、スライドガラス上のＸＹ位置を記録した。識別した赤血球のＸＹ位置と核がある細胞のＸＹ位置の比較により、赤血球でかつ核がある細胞（有核赤血球）を識別した。

（選別工程）
上記のように、識別された有核赤血球について、顕微分光装置を用いて、光学特性の解析を行った。有核赤血球識別工程により識別されたスライドガラス基板上の有核赤血球の１つに対して、波長が４７０ｎｍのＬＥＤ単色光の吸光度１．および波長が６２５ｎｍのＬＥＤの単色光の吸光度２を測定し、吸光度の比（吸光度１／吸光度２）を計算した。次に、その有核赤血球の近傍位置にある、当該有核赤血球からの距離の短い順に参照赤血球として、核のない赤血球を５個選択し、同様にして一つ一つの参照赤血球に対して、吸光度の比（吸光度１／吸光度２）を計算し、平均値を計算した。

同様の方法で、ガラス基板上の胎児由来の有核赤血球の候補となる残りの有核赤血球の細胞に対しても同様に吸光度の比を計算した。この計算結果から、（有核赤血球の吸光度の比／参照赤血球の吸光度の比の平均値）を求め、この値が「１」からの差が一番大きく異なる細胞を胎児由来の有核赤血球と見なして細胞Ａとし、「１」からの差が一番小さい細胞を母体由来の有核赤血球と見なして細胞Ｂとした。

（細胞単離工程）
上記工程で決定された細胞Ａ、細胞Ｂを、マイクロマニュピュレータを使用して回収した。

（増幅工程［ＤＮＡ増幅工程］）
有核赤血球の、胎児由来と識別された細胞Ａと、母体由来と識別された細胞Ｂを用いて、New England Biolabs社製Single Cell WGA kitを用いて全ゲノム増幅を行い、説明書記載に則り細胞中の微量なＤＮＡを約１００万倍に増幅した。

（確定工程［母体由来または胎児由来の有核赤血球の確定工程］）
各細胞から増幅した全ゲノム増幅酸物を等分割してその一方を用いて、ILLUMINA社製ゲノムアナライザーMiseqを用いて、13番染色体の C1QTNF9B遺伝子領域、PCDH9遺伝子領域、BRCA2遺伝子領域、MTRF1遺伝子領域のＳＮＰ（SNP ID：rs3751355、rs1799955、rs2297555、rs9571740）を比較することで、細胞Ａと細胞ＢのＳＮＰが異なることが確認できた。別途、白血球と予想される細胞Ｃをマイクロマニュピュレータで回収し、細胞Ａ、細胞Ｂと同様にしてＳＮＰを調べたところ、細胞ＢのＳＮＰと一致することが確認された。以上より、細胞Ａが胎児由来の有核赤血球、細胞Ｂが母体由来の有核赤血球であることが確認された。

＜実施例３＞
実施例１において、第２の光源を第１の光源と同じ４０５ｎｍのピークを持つＬＥＤとした（すなわち、第１の光源と第２の光源を共通の光とした）。４０５ｎｍのピークを持つＬＥＤからスライドガラス基板上に塗抹した血球細胞に光を照射し、その透過光を用いて光学顕微鏡より得られた画像を取り込み、ヘモグロビンの検出用として用いるとともに、自家蛍光取得用の励起光を得た。励起光もスライドガラス基板上に塗抹した血球細胞に照射され、蛍光は、励起光との分離のため、Zeiss Filter Set 49 (DAPI)の蛍光フィルタを用いて分離され、細胞核からの自家蛍光を検出し、その際に得られた蛍光画像を取り込んだ。得られた画像を解析することにより、標的細胞である有核赤血球を探索した。

上記以外は、実施例１と同様に検査を行うことで、細胞のＳＮＰを確認出来た。

１０…有核赤血球の選別装置、１２…光源装置、１４…フィルタキューブ、１６、１８、３８…レンズ、２０…塗抹標本、２２…第１の撮像装置、２４…第２の撮像装置、２６…画像処理装置、２８…モニター、３２…励起フィルタ、３４…ダイクロイックミラー、３６…エミッションフィルタ

Claims (15)

1. 母体血中の血球細胞から、ヘモグロビンの吸収波長領域にピーク波長を有する第１の波長領域の光を用いて、赤血球を識別する赤血球識別工程と、
   前記赤血球識別工程で識別した赤血球から、第２の波長領域の光を照射した際の自家蛍光画像を確認することで、有核赤血球を識別する有核赤血球識別工程と、を有する有核赤血球の選別方法。
2. 前記有核赤血球識別工程は、前記第２の波長領域の光が、ピーク波長が５３０ｎｍ以下の励起光であり、核から発する自家蛍光により識別する請求項１に記載の有核赤血球の選別方法。
3. 前記第１の波長領域の光は、ピーク波長が３８０ｎｍ以上６５０ｎｍ以下の波長領域に含まれる光であり、
   前記有核赤血球識別工程により識別した有核赤血球を、前記第１の波長領域の光におけるヘモグロビンの酸素親和性に起因する分光特性により、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別する選別工程と、を有する請求項１または２に記載の有核赤血球の選別方法。
4. 前記第２の波長領域の光の照射による自家蛍光画像の蛍光の分光特性が、ピーク波長が４５０ｎｍ以上６５０ｎｍ以下の波長領域に含まれる光である請求項１から３のいずれか１項に記載の有核赤血球の選別方法。
5. 前記第１の波長領域の光が、ピーク波長が３８０ｎｍ以上４７０ｎｍ以下の波長領域の光である請求項１から４のいずれか１項に記載の有核赤血球の選別方法。
6. 前記第１の波長領域の光、および、前記第２の波長領域の光が、ＬＥＤまたはＬＡＳＥＲの光、および、干渉フィルタを通過した単色光を主波長とする光のいずれかである請求項１から５のいずれか１項に記載の有核赤血球の選別方法。
7. 前記第１の波長領域の光、および、前記第２の波長領域の光が共通の光であり、透過光により赤血球を識別する画像、および、前記自家蛍光画像を前記共通の光により取得する請求項１から６のいずれか１項に記載の有核赤血球の選別方法。
8. 前記有核赤血球識別工程は、前記自家蛍光画像の赤血球像領域内の、蛍光強度の高い領域を核、蛍光強度の低い領域を細胞質と識別し、核の有無を識別する請求項１から７のいずれか１項に記載の有核赤血球の選別方法。
9. 母体血に含まれる有核赤血球を選別する有核赤血球の選別装置であって、
   ヘモグロビンの吸収波長領域にピーク波長を有する第１の波長領域の光、および、有核赤血球の核が自家蛍光を発する第２の波長領域の光を出力する光源装置と、
   前記第１の波長領域の光が照射されることにより前記母体血を透過する透過光を撮像する第１の撮像装置と、
   前記第２の波長領域の光が照射されることにより前記母体血から発せられる自家蛍光のみを透過するエミッションフィルタと、
   前記エミッションフィルタを透過した自家蛍光を撮像する第２の撮像装置と、
   前記第１の撮像装置で撮像された第１の画像に基づいて赤血球を識別し、前記第２の撮像装置で撮像された第２の画像に基づいて前記赤血球から核の有無を識別し、有核赤血球を識別する画像処理装置と、を備える有核赤血球の選別装置。
10. 前記第２の波長領域の光から、ピーク波長が５３０ｎｍ以下の波長領域の励起光のみを通過させる励起フィルタを備え、
    前記励起フィルタを通過した光を前記母体血に照射する請求項９に記載の有核赤血球の選別装置。
11. 前記第１の波長領域の光が、ピーク波長が３８０ｎｍ以上６５０ｎｍ以下の波長領域に含まれる光であり、
    前記画像処理装置は、前記第１の波長領域の光におけるヘモグロビンの酸素親和性に起因する分光特性により、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別する請求項９または１０に記載の有核赤血球の選別装置。
12. 前記エミッションフィルタは、ピーク波長が４５０ｎｍ以上６５０ｎｍ以下の波長領域に含まれる前記自家蛍光を通過させる請求項９から１１のいずれか１項に記載の有核赤血球の選別装置。
13. 前記第１の波長領域の光、および、前記第２の波長領域の光が、ＬＥＤまたはＬＡＳＥＲの光、および、干渉フィルタを通過した単色光を主波長とする光のいずれかである請求項９から１２のいずれか１項に記載の有核赤血球の選別装置。
14. 前記光源装置により出力される前記第１の波長領域の光、および、前記第２の波長領域の光が共通の光である請求項９から１３のいずれか１項に記載の有核赤血球の選別装置。
15. 前記画像処理装置は、前記第２の画像の赤血球像領域中の、蛍光強度の高い領域を核、蛍光強度の低い領域を細胞質と識別し、核の有無を識別する請求項９から１４のいずれか１項に記載の有核赤血球の選別装置。