CN103382469A - 一种纯净的胎儿完整基因组dna的分离获取方法 - Google Patents

一种纯净的胎儿完整基因组dna的分离获取方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种纯净的胎儿完整基因组DNA的分离获取方法，包括以下步骤：从母体（孕妇）外周血中分离有核红细胞；鉴定胎儿母亲和/或父亲的个体遗传特征分型；将有核红细胞分离单细胞进行高保真全基因组DNA扩增；根据遗传规律鉴定胎儿的个体遗传特征分型，确定胎儿来源的基因组DNA。本发明所提供的胎儿来源的纯净的全基因组DNA为产前遗传诊断的应用奠定了物质基础。

Description

一种纯净的胎儿完整基因组DNA的分离获取方法
技术领域
本发明属于医学领域，具体地说，是关于一种纯净的胎儿完整基因组DNA的分离获取方法。
背景技术
产前遗传诊断是在遗传咨询的基础上，主要通过遗传学检测和影像学检查，对高风险胎儿进行明确诊断，使人们有科学依据地在妊娠期做出适当的选择或治疗，从而降低出生缺陷率，提高优生质量和人口素质。
产前遗传诊断包括有创和无创两种类型。前者主要包括羊膜腔穿刺、绒毛取样、脐血取样、胎儿镜和胚胎活检等，后者包括超声波检查、母体外周血清标志物测定、无创胎儿基因和细胞遗传学分析等。
目前产前遗传诊断中仍以创伤性方法为主，以羊膜腔穿刺和绒毛取样两种最常用，然而，对胎儿有创取材时存在以下风险：1、胎儿一过性心动过缓；2、0.1%～0.9%的被检者发生早产或胎儿宫内死亡；3、脐带取血后脐带胎盘渗血；4、羊膜腔内感染；5、羊膜破裂；6、胎儿畸形。
在无创性方法中，超声波检查只能从形态上分辨一些有明显先天畸形的胎儿，对于形态正常而带有其它遗传缺陷的胎儿则无法鉴别。母体外周血清标志物测定是从母体血清标志物进行间接检测，因此检查的项目有限，现在开展的主要是唐氏筛查，这只是染色体三体综合征中的一种，绝大多数的遗传病都无法以类似的无创方法进行检测。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本申请的发明人提供了一种从孕妇外周血中分离并鉴定胎儿完整基因组DNA的方法，该方法能够无创性地获得纯净的胎儿完整基因组DNA，从而为全面、准确的产前遗传诊断的应用提供了物质基础。
因此，本发明的目的在于提供一种纯净的胎儿完整基因组DNA的分离获取方法。
本发明的纯净的胎儿完整基因组DNA的分离获取方法包括以下步骤：
A）从母体（孕妇）外周血中分离有核红细胞；
B）从胎儿母亲和/或父亲的体细胞中提取基因组DNA或分离单细胞进行高保真全基因组DNA扩增，鉴定胎儿母亲和/或父亲的个体遗传特征分型；
C）将有核红细胞分离单细胞进行高保真全基因组DNA扩增；
D）以胎儿母亲和/或父亲的个体遗传特征分型为对照，根据遗传规律对有核红细胞单细胞全基因组DNA扩增产物进行鉴定并确定胎儿的个体遗传特征分型，从而确定胎儿来源的基因组DNA。
根据本发明，所述母体（孕妇）外周血为妊娠9～38周的母体（孕妇）外周静脉血。
根据本发明，所述个体遗传特征分型包括使用SNP组合或STR组合等的基因分型鉴定，优选SNP组合。
根据本发明，所述分离有核红细胞的方法包括：免疫磁珠分选法或称磁激活细胞分选法、流式细胞分选法或称荧光激活细胞分选法、电荷流式分离法、培养筛选富集法或密度梯度离心法等。
根据本发明，所述母亲和/或父亲的体细胞来源自：头皮屑、口腔上皮或孕前母亲的外周血等。
根据本发明，所述鉴定个体遗传特征分型的方法包括：基因芯片法、PCR测序法、MGB荧光PCR法、限制性片断长度多态性法、单链构象多态性法、变性梯度凝胶电泳法、飞行质谱仪检测法或变性高效液相色谱法等。
本发明具有如下优点：
1.无创性，产前取孕妇外周血，对胎儿无创伤，对孕妇的影响也极其轻微。
2.超前性，最早可在孕9周进行遗传检测，可对遗传病做到早发现、早预防、早诊断、早治疗。
3.准确性，以母亲和/或父亲的基因组DNA为对照，采用个体特异性遗传标记鉴定胎儿单细胞来源的全基因组DNA，保证胎儿细胞及全基因组DNA来源准确；源于胎儿不同细胞的全基因组DNA可进行多个平行诊断实验，并相互确认，避免基因组扩增误差而带来的误诊问题，确保诊断结果准确可靠。
4.纯净性，经鉴定为胎儿的基因组，只源于单个细胞，不会受母体（孕妇）DNA的污染，从而保证后续遗传诊断的准确性。
5.普适性，能获取源自胎儿的完整全基因组DNA，选择不同的位点或使用不同的标记及标记组合，即可进行大量的单个和全基因组水平上的各类基因（DNA）分析、单基因病诊断、个体药物耐受性、多基因病致病风险等除细胞遗传学分析外的所有的遗传诊断。
有核红细胞在孕妇外周血中存量大，且生命周期短，不受前次妊娠的影响，是无创法鉴定胎儿基因型的最理想材料，本发明结合个体遗传特征鉴定的方法获取胎儿来源的全基因组DNA，具无创性、超前性、准确性、纯净性和普适性，为产前遗传诊断应用奠定了物质基础。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
以下实施例中分离有核红细胞的方法包括但不限于：免疫磁珠分选法（magnetic activated cell sorting，MACS）或称磁激活细胞分选法、流式细胞分选法（fluorescence activated cell sorting，FACS）或称荧光激活细胞分选法、电荷流式分离法（charge flow separation，CFS）、培养筛选富集法、密度梯度离心法等。
以下实施例中母亲和/或父亲的体细胞来源自但不限于：头皮屑、口腔上皮、孕前母亲的外周血等。
以下实施例中鉴定个体遗传特征分型的方法包括但不限于：SNP组合、STR组合等。
以下实施例中鉴定个体遗传特征分型的实验技术包括但不限于：基因芯片法、PCR测序法、MGB荧光PCR法、限制性片断长度多态性法、单链构象多态性法、变性梯度凝胶电泳法、飞行质谱仪检测法、变性高效液相色谱法等。
实施例1、分离和获取纯净的胎儿完整基因组
1.1、母体外周血中有核红细胞的分离
取妊娠9～38周的母体（孕妇）外周静脉血10ml，采用4mmol/L的EDTA抗凝，然后用磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）按1：1稀释。在15ml的Falcon离心管内，加入5ml细胞分离液
Figure BDA00003038186600041
（Sigma公司），沿着离心管壁缓慢加入上述稀释的孕妇血10ml，使血液覆盖在细胞分离液
Figure BDA00003038186600042
上，400×g室温离心30min。吸取位于血浆和
Figure BDA00003038186600043
之间的单核细胞层，用PBS缓冲液（含5mmol/L EDTA和含体积分数为0.5%的BSA）洗涤1次，以大约每107个细胞加80μL PBS缓冲液（pH7.4）的比例制成单核细胞悬液。
将包被有CD71抗体的CD71免疫磁珠以每个靶细胞4个磁珠的比例加入上述单核细胞悬液中，4℃孵育45分钟，将磁珠标记的单核细胞悬液放入DynalMPC磁性柱内，静置2分钟，吸附被磁珠标记的有核红细胞，吸掉未被吸附的细胞。将磁珠标记的有核红细胞经PBS缓冲液洗涤后，以适当比例悬浮于PBS缓冲液中。
取1μL上述有核红细胞悬液加入9μL PBS缓冲液，在显微镜下用血球计数板计数，确定每微升中细胞的数量，分装为每管约100个细胞后加抗冻剂液氮冻存。
1.2、胎儿母亲和/或父亲的个体遗传特征分型的鉴定
取孕妇及胎儿生物学父亲头皮屑各1mg以上，利用QIAamp DNAInvestigator Kit（QIAGEN公司），按照说明书操作步骤提取孕妇及胎儿生物学父亲头皮屑中的基因组DNA。
个体遗传特征分型（基因指纹）鉴定方法如下：
以中国人群多态性比较高且相互无联锁关系的SNP位点（确保不同个体重复概率在100亿分之一以下）进行母亲或/和父亲个体鉴定，检测并记录SNP位点的基因分型。SNP位点的参考序列可以在NCBI数据库中获得（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/），位点登录号如下：rs12041538，rs12041538，rs7520495，rs1160336，rs7421375，rs11130440，rs6549011，rs7655916，rs1503627，rs12516484，rs6940304，rs6938545，rs4717331，rs2317774，rs2447542，rs2920296，rs971984，rs1414252，rs7900633，rs293325，rs10768140，rs12223762，rs4842610，rs10454027，rs1333100，rs12896399，rs12594957，rs4781118，rs9940450，rs7251903，rs6073995，rs11088302，rs4823460，rs2385622，rs9814835，rs1466329，rs3013148，rs3807337，rs1484646，rs6560626，rs293325，rs111234106，rs4930860，rs1885193，rs16965880。
1.3、有核红细胞的高保真全基因组DNA扩增
取实施例1.1中获得的有核红细胞，在显微镜下分离单细胞，放入PCR管中，进行单细胞全基因组DNA扩增，具体操作方法参见专利201110378904.4，扩增完成后经DNA纯化试剂盒（QIAGEN公司）纯化。
1.4、胎儿来源的基因组DNA的鉴定
将实施例1.3中扩增获得的基因组DNA，按照实施例1.2中所述个体遗传特征分型鉴定方法进行鉴定，确定各个基因组的基因型，并根据不同情况按照如下方法确定胎儿细胞来源的基因组DNA：
如果实施例1.2中获得胎儿母亲和父亲的个体遗传特征分型，则胎儿基因型应不同于父亲、母亲基因型，并且各位点基因型源于父亲或母亲并遵循遗传规律；如果实施例1.2中只获得胎儿母亲的个体遗传特征分型，则胎儿基因型应与母亲不同，且其每个位点有一个是来源于母亲；如果不符合以上规律则为污染细胞，此样品弃用。
如果检测到多个胎儿基因型，应建议孕妇进行超声波检测胎儿数量以验证实验数据。
1.5、标记保存胎儿来源的基因组DNA的标记和保存
将实施例1.4中获得的胎儿来源的基因组DNA标记并于-20℃冷冻保存。
实施例2-6、应用
按照实施例1所述的方法，选取怀孕12-24周的孕妇5位，分别取孕妇外周血20ml，分离有核红细胞。将每位孕妇分离获得的有核红细胞各取10个进行全基因组扩增，然后以母亲体细胞为对照，进行个体鉴定，确定扩增所得基因组中的胎儿基因组，其中有4位孕妇鉴定出1-3个胎儿细胞，有1位孕妇第一次没有检出。对该未检出的孕妇再取10个有核红细胞进行第二轮全基因组扩增和鉴定，发现有2个为胎儿细胞。以上5位志愿者都只鉴定到一种胎儿的SNP分型，说明都只有一名胎儿，此后胎儿陆续单胎出生，充分证明了这一点。
结果如表1所示。
表1、
Figure BDA00003038186600061
综上所述，应用本发明的方法，从孕妇外周血中分离有核红细胞，并从这些有核红细胞中分离单细胞进行高保真全基因组扩增，能够无创、简便、快速地获得胎儿基因组DNA并成功地进行胎儿SNP遗传分型鉴定。同时，该方法能够用于判断胎儿个数，在多个胎儿的情况下同样能够精确地获得每一个胎儿纯净的基因组DNA。
本发明的技术只要采用高效、高保真、高灵敏的单细胞全基因组DNA扩增，即可保证扩增后的胎儿基因组DNA纯净、完整、高保真（扩增效果详见专利201110378904.4）。这为全面、准确的产前遗传诊断的应用提供了物质基础。
本领域技术人员应当理解的是，上述实施例和发明内容中未提及的操作方法、仪器和试剂，应当理解为采用现有技术进行实施、或由本领域技术人员根据现有技术进行选择。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (6)

1.一种纯净的胎儿完整基因组DNA的分离获取方法，其特征在于，包括以下步骤：
A）从母体（孕妇）外周血中分离有核红细胞；
B）从胎儿母亲和/或父亲的体细胞中提取基因组DNA或分离单细胞进行高保真全基因组DNA扩增，鉴定胎儿母亲和/或父亲的个体遗传特征分型；
C）将有核红细胞分离单细胞进行高保真全基因组DNA扩增；
D）以胎儿母亲和/或父亲的个体遗传特征分型为对照，根据遗传规律对有核红细胞单细胞全基因组DNA扩增产物进行鉴定并确定胎儿的个体遗传特征分型，从而确定胎儿来源的基因组DNA。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述母体（孕妇）外周血为妊娠9～38周的母体（孕妇）外周静脉血。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述个体遗传特征分型包括使用SNP组合或STR组合的基因分型鉴定。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离有核红细胞的方法包括：免疫磁珠分选法或称磁激活细胞分选法、流式细胞分选法或称荧光激活细胞分选法、电荷流式分离法、培养筛选富集法或密度梯度离心法。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述母亲和/或父亲的体细胞来源自：头皮屑、口腔上皮或孕前母亲的外周血。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鉴定个体遗传特征分型的方法包括：基因芯片法、PCR测序法、MGB荧光PCR法、限制性片断长度多态性法、单链构象多态性法、变性梯度凝胶电泳法、飞行质谱仪检测法或变性高效液相色谱法。
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