CN106536759A - 胎儿染色体的检查方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种从母血可靠地获取源自胎儿的有核红细胞，有效地在短时间内检查源自胎儿的有核红细胞的胎儿染色体的检查方法。本发明的胎儿染色体的检查方法具有：采集工序，从妊娠母体获取母血；浓缩工序，对母血中的有核红细胞进行浓缩；分选工序，根据核的形状及400～650nm的光波长区域中包含的波长中的分光特性，将通过浓缩工序已浓缩有核红细胞的母血中的有核红细胞分选为源自母体的有核红细胞与源自胎儿的有核红细胞；扩增工序，扩增有核红细胞的染色体的核酸；确定工序，确定有核红细胞的扩增产物的量；及决定工序，决定是否存在源自胎儿的染色体数量异常。

Description

胎儿染色体的检查方法
技术领域
本发明涉及一种胎儿染色体的检查方法，尤其涉及一种利用从妊娠母体的血液采集的源自胎儿的红细胞来进行检查的胎儿染色体的检查方法。
背景技术
作为产前诊断，一直以来进行通过羊膜穿刺术来查看羊水中的胎儿细胞的染色体的羊水检查。然而，该方法中，作为重大问题被指出存在流产的可能性。
另一方面，最近得知胎儿细胞在妊娠母体(以下，还简称为“母体”)的血液中移动，该胎儿细胞与血液一同在母体中循环。因此，若能够利用母血以良好的再现性可靠地分析母血中的胎儿细胞的染色体的DNA(脱氧核糖核酸：deoxyribonucleicacid)，则能够实现流产可能性较低的安全的产前诊断。
然而，存在于母体的血液中的胎儿细胞(有核红细胞)在母血数mL(1mL＝10-6m3)中仅存在1个左右。可靠地获取如此极少的胎儿细胞(有核红细胞)对利用母血进行的产前诊断而言是非常重大的课题。
对这种课题，下述专利文献1及非专利文献1中，利用如下方法获取母血中的作为胎儿细胞的有核红细胞，例如：对有核红细胞进行浓缩的方法；利用密度梯度离心分离去除血浆成分及母亲的红细胞成分的技术；利用对白细胞表面的蛋白质特异地免疫反应的抗体，通过磁力分离母亲的白细胞的技术(MACS法：Magnetic activated cell sorting)；利用对胎儿血红蛋白的γ链发生特异的免疫反应的抗体与荧光色素分离胎儿的有核红细胞的技术(FACS法：Fluorescence activated cell sorting)等。这些方法是有助于对源自胎儿的有核红细胞进行浓缩来提高获取目标细胞的概率的技术。
并且，公开有利用光学信息识别细胞种类并获取所需细胞的技术。例如，专利文献2中，记载有对细胞质进行染色来生成透射可见光的吸收图像，照射激发光来形成核的荧光图像，利用细胞质与核的对比度图像判别有核红细胞的方式。并且，专利文献3中，记载有利用血红蛋白的最大波长区域附近的波长的光进行测定，判别血细胞种类的血细胞种类判别装置。专利文献4中，记载有利用生物组织的光学性质的生物信息分析装置。非专利文献2中，公开有对源自胎儿的有核红细胞进行浓缩，并根据细胞的形态信息识别源自胎儿的有核红细胞的方法。
并且，作为获取胎儿细胞(有核红细胞)之后，检测胎儿中的染色体异常的方法，专利文献5中记载有扩增胎儿细胞的染色体，确定扩增产物的量，检测染色体不均衡引起的疾病的方法。
以往技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2010-525832号公报
专利文献2：日本特表2002-514304号公报
专利文献3：日本特开昭58-115346号公报
专利文献4：日本特开2014-14485号公报
专利文献5：日本特表2004-531271号公报
非专利文献
非专利文献1：铃木稚子等人“基于来自母血的有核红细胞的浓缩与自动分析的鉴定的效率化”昭和医学会杂志第72卷第4号〔471-478页，2012〕
非专利文献2：D.Cha et al.,“A simple and sensitive erythroblast scoringsystem to identify fetal cells in maternal blood”,Prenat Diagn 2003；23:68-73
发明的概要
发明要解决的技术课题
如此，对从妊娠母体的母血选择源自胎儿的有核红细胞的方法进行各种研究，但为了有效地进行产前诊断，要求分离源自母体的有核红细胞与源自胎儿的有核红细胞，并可靠地获取源自胎儿的有核红细胞的方法。上述以往技术文献中记载的方法虽然能够提高从母血中获取源自胎儿的有核红细胞的概率，但在检查染色体之前并不知道是源自母体的有核红细胞还是源自胎儿的有核红细胞。因此，经检查的细胞为源自母体的有核红细胞时，需进行染色体的检查，直至分选到源自胎儿的有核红细胞，并再次进行检查，因此花费时间。
本发明是鉴于这种情况而完成的，其目的在于提供一种能够从母血可靠地获取源自胎儿的有核红细胞，有效地在短时间内检查源自胎儿的有核红细胞的胎儿染色体的检查方法。
用于解决技术课题的手段
为了实现所述目的，本发明提供一种胎儿染色体的检查方法，其具有：采集工序，从妊娠母体获取母血；浓缩工序，对母血中的有核红细胞进行浓缩；分选工序，根据核的形状及400～650nm的光波长区域中包含的波长中的分光特性，将通过浓缩工序已浓缩有核红细胞的母血中的有核红细胞分选为源自母体的有核红细胞与源自胎儿的有核红细胞；扩增工序，扩增至少源自胎儿的有核红细胞的染色体的核酸；确定工序，确定通过扩增工序扩增的至少源自胎儿的有核红细胞的扩增产物的量；及决定工序，通过所确定的扩增产物的量与母体染色体或已知没有异常的胎儿染色体的扩增产物之间的比较，决定是否存在源自胎儿的染色体数量异常。
根据本发明的胎儿染色体的检查方法，通过根据核的形状及400～650nm的光波长区域中的分光特性分选妊娠母体中包含的源自母体的有核红细胞与源自胎儿的有核红细胞，能够可靠地分选源自胎儿的有核红细胞。因此，能够有效且可靠地进行利用母血的基于基因的胎儿染色体的检查。
本发明的另一方式中，优选分选工序包括：第1分选工序，至少根据核的形状分选有核红细胞候选；及第2分选工序，根据分光特性对已通过第1分选工序分选的有核红细胞候选进行分选。
根据该方式，分选工序具有包括根据核的形状分选有核红细胞候选的工序的第1分选工序及根据分光特性分选有核红细胞候选的第2分选工序，因此能够通过以不同方法进行有核红细胞的分选来可靠地分选源自胎儿的有核红细胞。并且，第1分选工序中，通过根据核的形状进行分选，能够排除无核的红细胞，能够分选有核红细胞。分选有核红细胞之后，根据分光特性分选源自胎儿的有核红细胞及源自母体的有核红细胞，由此能够有效地分选源自胎儿的有核红细胞。
本发明的另一方式中，优选第1分选工序中包括如下工序：将成为有核红细胞候选的细胞的细胞质的面积设为C，将成为有核红细胞候选的细胞的核的面积设为N，将与成为有核红细胞候选的细胞的核外接的圆形的直径长度或椭圆形的长径长度设为L时，选择满足(1)式(还称为式1)及(2)式(还称为式2)的有核红细胞候选。
0.25＜N/C＜1.0 (1)
0.65＜N/(L×L)＜0.785 (2)
该方式中，规定了根据核的形状进行分选的具体条件，(1)式规定细胞质与核的面积比率，(2)式规定核的圆形程度。具有上述(1)式及(2)式的条件的核的细胞是红细胞的可能性较高，因此能够通过根据分光特性进行的分选提高选择源自胎儿的有核红细胞的可能性。
本发明的另一方式中，优选第1分选工序还包括两个工序，第1工序中提取有可能具有核的细胞，第2工序中根据(1)式及(2)式从第1工序中提取的细胞分选有核红细胞候选。
根据该方式，优选第1分选工序还包括两个工序，第1工序中通过提取有可能具有核的细胞来进行粗筛，第2工序中根据上述(1)式、(2)式并根据形状信息进行分选，由此能够更可靠地分选源自胎儿的有核红细胞。
作为第1工序的“提取有可能具有核的细胞”的方法，例如，以规定的阈值对以白色光拍摄细胞来获得的图像的亮度信息进行二值化，从二值化的图像提取点状及岛状的连续区域。并且，连续区域中，将大小为1～5μm的区域作为有可能是细胞核的区域，将包含该区域的细胞作为有可能具有细胞核的细胞。作为大小，例如能够设为与连续区域外接的最小椭圆的长径。另外，二值化的图像可在实施Erosion·Dilation等形态学处理来整理连续区域的形状的基础上求出大小。
本发明的另一方式中，优选分光特性为吸收系数。
通过作为分光特性使用吸收系数，能够利用红细胞中包含的血红蛋白的氧化血红蛋白与还原血红蛋白的吸收系数之差进行分选。
本发明的另一方式中，优选分选工序通过包含第1光波长区域的波长与第2光波长区域的波长的至少用两种以上的各个波长测定有核红细胞的吸光度，所述第1光波长区域的波长中，源自胎儿的有核红细胞的吸光度超过源自母体的有核红细胞的吸光度，所述第2光波长区域的波长中，源自母体的有核红细胞的吸光度超过源自胎儿的有核红细胞的吸光度。
根据该方式，首先，第一，能够进行所分选的有核红细胞(成为源自胎儿的有核红细胞候选的细胞)是否具有血红蛋白的吸收系数的分选，能够排除不具有血红蛋白的吸收系数的源自白细胞的细胞。接着，具有血红蛋白的吸收系数的细胞中，针对分选工序中使用的波长，通过选自源自胎儿的有核红细胞的吸光度高于源自母体的有核红细胞的吸光度的第1波长域与源自母体的有核红细胞的吸光度高于源自胎儿的有核红细胞的吸光度的第2波长域的各种波长进行测定，从而各个波长的吸光度中，源自胎儿的有核红细胞的吸光度与源自母体的有核红细胞的吸光度的大小被反转。因此，通过比较以各个波长测定的吸光度，能够明确源自母体的有核红细胞与源自胎儿的有核红细胞之差，而能够分选源自母体的有核红细胞与源自胎儿的有核红细胞。作为吸光度的比较，通过求出以各个波长测定的吸光度之比，吸光度之比的差变大而能够进行分选。
另外，能够通过以3种以上的各个波长进行测定来降低噪声的影响。利用3种以上的波长时，在错开波长的多个波长中测定吸光度，并将这些的平均值作为用于分选的吸光度，由此能够降低噪声的影响。
本发明的另一方式中，优选分选工序根据以两种以上的各个波长对源自母体的有核红细胞与源自胎儿的有核红细胞测定的吸光度的不同，对源自胎儿的有核红细胞的可能性进行排序。
根据该方式，通过利用两种以上的波长对吸光度进行测定，能够以各个波长求出源自胎儿的有核红细胞与源自母体的有核红细胞的吸光度之差。因此，能够根据这些吸光度的不同对源自胎儿的有核红细胞的可能性进行排序，因此通过该位次分选源自胎儿的有核红细胞，能够从多个有核红细胞即候选细胞中精度良好地分选源自胎儿的有核红细胞。
本发明的另一方式中，优选第1光波长区域为超过450nm且小于480nm的波长域，第2光波长区域为超过550nm且小于575nm的波长域。
该方式中，具体规定用于测定分光特性的第1光波长区域及第2光波长区域，通过利用该范围的光波长区域的波长，能够反转吸光度的大小，能够明确源自母体的有核红细胞与源自胎儿的有核红细胞之间的光学特性的差异。
本发明的另一方式中，优选浓缩工序通过密度梯度离心分离法进行。
根据该方式，通过密度梯度离心分离法进行浓缩工序，由此能够不破坏细胞而提高母血中的有核红细胞的浓度。
发明效果
根据本发明的胎儿染色体的检查方法，能够可靠地分选源自母体的有核红细胞与源自胎儿的有核红细胞，因此能够可靠且有效地进行利用母血的胎儿的基因检查。
附图说明
图1是表示胎儿染色体的检查方法的步骤的流程图。
图2是表示分选工序的第1分选工序的步骤的流程图。
图3A是表示欲选择的细胞形状的示意图。
图3B是表示欲排除的细胞形状的示意图。
图4是表示相对于还原血红蛋白(Hb)与氧化血红蛋白(HbO2)的波长的吸收系数的曲线图。
图5是表示根据光学特性进行分选的第1实施方式的步骤的流程图。
图6是说明测定吸光度时波长的选择方法的说明图。
图7是说明根据参考红细胞的数量设定搜索范围的方法的图。
图8是表示根据参考红细胞的数量设定搜索范围的步骤的流程图。
图9是说明针对参考红细胞根据有核红细胞的面积设定搜索范围的方法的图。
图10是表示针对参考红细胞根据有核红细胞的面积设定搜索范围的步骤的流程图。
图11是表示根据光学特性进行分选的第2实施方式的步骤的流程图。
具体实施方式
以下，根据附图对本发明所涉及的胎儿染色体的检查方法进行说明。另外，本说明书中，“～”以作为下限值及上限值包含记载于其前后的数值的含义使用。
[胎儿染色体的检查方法]
图1是表示本实施方式中的胎儿染色体的检查方法的步骤的流程图。本实施方式的胎儿染色体的检查方法具有：采集工序(步骤S12)，从妊娠母体采集母血；浓缩工序(步骤S14)，对母血中的有核红细胞进行浓缩；分选工序(步骤S16)，根据核的形状及400～650nm的光波长区域中的分光特性，将通过浓缩工序已浓缩有核红细胞的母血中的有核红细胞分选为源自母体的有核红细胞与源自胎儿的有核红细胞；扩增工序(步骤S18)，扩增至少源自胎儿的有核红细胞的染色体的核酸；确定工序(步骤S20)，确定通过扩增工序扩增的至少源自胎儿的有核红细胞的扩增产物的量；决定工序(步骤S22)，通过所确定的扩增产物的量与母体染色体或已知没有异常的胎儿染色体的扩增产物的量之间的比较，决定是否存在源自胎儿的染色体的数量异常。以下，对各工序进行详细说明。
＜采集工序(步骤S12)＞
采集工序为采集作为血液试料的母血的工序。作为母血，优选不会造成侵入的妊娠母体的外周血。
母体的外周血中，除了源自母体的嗜酸性细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等白细胞或无核的成熟红细胞以外，还包含源自母体的有核红细胞及源自胎儿的有核红细胞。认为源自胎儿的有核红细胞在妊娠之后从6周左右开始存在于母血中。进行产前诊断的本实施方式中，检查妊娠后6周左右以后的母体的外周血。
源自胎儿的有核红细胞为通过胎盘而存在于母体的血液中的红细胞前体。母体在妊娠期间，胎儿的红细胞有可能有核。该红细胞中存在染色体，因此能够以侵入性较低的方法获得源自胎儿的染色体及胎儿基因。认为该源自胎儿的有核红细胞以在母血中的细胞的每106个中存在1个的比例存在，母体的外周血中的存在概率非常小。
＜浓缩工序(步骤S14)＞
接着，通过浓缩工序，对在采集工序中采集的母血中的有核红细胞进行浓缩。浓缩工序优选通过密度梯度离心分离法进行。
〔密度梯度离心分离法〕
密度梯度离心分离法为根据血液中的成分的密度之差进行分离的方法，通过以夹着所分离的成分的密度值的方式选择第1介质及第2介质，能够在离心分离之后的第1介质与第2介质之间的界面聚集目标成分(本实施方式中，为源自胎儿的有核红细胞)。并且，通过采集存在于该第1介质与第2介质之间的界面的组分，能够获得已浓缩有核红细胞的血液。
具体而言，能够通过包括如下工序的方法进行有核红细胞的浓缩：在离心管的底部注入第1介质的工序；冷却收集到第1介质的离心管的工序；在离心管内的已冷却的第1介质上层叠第2介质的工序；在离心管内的第2介质上层叠作为血液试料的母体的外周血的工序；对容纳于离心管的第1介质、第2介质及血液试料施以离心分离的工序；及从离心分离之后的第1介质与第2介质之间的层采集包含源自胎儿的有核红细胞的组分的工序。
国际公开WO2012/023298号公报中记载有包含胎儿的有核红细胞的母体的血液密度。根据该记载，所设想的源自胎儿的有核红细胞的密度为1.065～1.095g/mL左右，母体的血细胞的密度为，红细胞为1.070～1.120g/mL左右，嗜酸性粒细胞为1.090～1.110g/mL左右，中性粒细胞为1.075～1.100g/mL左右，嗜碱性粒细胞为1.070～1.080g/mL左右，淋巴细胞为1.060～1.080g/mL左右，单核细胞为1.060～1.070g/mL左右。关于密度数值，从以克每毫升[g/mL]表示的单位向SI单位系统的换算较为容易，1克每毫升[g/mL]为1000千克每立方米[kg/m3]。
关于所层叠的介质(第1介质及第2介质)的密度，为了分离密度为1.065～1.095g/mL左右的源自胎儿的有核红细胞与母体中的其他血细胞成分而设定。源自胎儿的有核红细胞的中心密度为1.080g/mL左右，因此制作夹着该密度的两个不同密度的介质并相邻层叠，由此能够在其界面收集所希望的源自胎儿的有核红细胞。优选将第1介质的密度设为1.08g/mL以上且1.10g/mL以下，第2介质的密度设定为1.06g/mL以上且1.08g/mL以下。更优选第1介质的密度为1.08g/mL以上且1.09g/mL以下，第2介质的密度为1.065g/mL以上且1.08g/mL以下。作为具体例，通过将第1介质的密度设定为1.085g/mL，将第2介质的密度设定为1.075g/mL，能够从回收的所希望的组分中分离血浆成分及嗜酸性粒细胞、单核细胞。并且，还能够分离红细胞、中性粒细胞、淋巴细胞的一部分。本发明中，只要能够实现本发明的效果，则并不限制第1介质与第2介质，两者可以是相同种类也可以是不同种类，但使用相同种类的介质是优选方式。
作为浓缩工序中使用的第1介质及第2介质，可使用用聚乙烯吡咯烷酮涂布的直径15～30nm的硅酸胶体粒子分散液即Percoll(注册商标)、富含于侧链的由蔗糖制成的中性的亲水性聚合物即Paque、基于多聚蔗糖与泛影酸钠的溶液即Histopaque(注册商标)等介质。本实施方式中，能够优选使用Percoll(注册商标)及Histopaque(注册商标)。Percoll(注册商标)市售有密度(比重)1.130的产品，能够通过稀释制备目标密度(比重)的介质。Histopaque(注册商标)能够利用市售的密度1.077的介质与密度1.119的介质将第1介质及第2介质制备为所希望的密度。
〔其他浓缩方法〕
作为对有核红细胞进行浓缩的方法，除了上述的密度梯度离心分离法以外，还能够利用与作为通常的白细胞抗原的CD45(CD:Cluster of Differentiation)(基于CD分类的单克隆抗体的分类编号)特异键合的抗体，利用磁力效果分离白细胞，由此对有核红细胞进行浓缩。
＜分选工序(步骤S16)＞
分选工序为根据核的形状及分光特性将通过浓缩工序已浓缩有核红细胞的母血中的有核红细胞分选为源自母体的有核红细胞与源自胎儿的有核红细胞的工序。
包含在浓缩工序被浓缩的有核红细胞的外周血中，除了有核红细胞以外，还包含白细胞等其他血液成分。白细胞等血液成分能够通过浓缩工序从母血去除，但很难完全去除，因此在分选工序中，通过根据核的形状进行分选的第1分选工序与根据分光特性进行分选的第2分选工序，分选源自母体的有核红细胞与源自胎儿的有核红细胞。
分选工序中，将包含在浓缩工序中被浓缩的有核红细胞的外周血涂布于透明基板，优选将其涂布于载玻片上，制作分析用标本，利用分析用标本进行分选。
(根据细胞的形状信息进行的分选)
利用上述分析用标本，首先根据细胞的形状信息(以下，还称为“细胞的形状”)对成为源自胎儿的有核红细胞候选的有核红细胞进行分选。
作为根据细胞的形状信息进行的分选，能够举出核区域的面积相对于细胞质的面积的比例、核的圆形程度、核区域的面积、核的明度、核的变平方式等。其中，优选将具有满足核区域的面积相对于细胞质的面积的比例及核的圆形程度的条件的细胞分选为源自胎儿的有核红细胞候选。细胞质的面积及核区域的面积为分析用标本的观察面中的面积。
图2是表示分选工序中的根据细胞的形状(核的形状)进行分选的第1分选工序的一例的步骤的流程图。
根据细胞的形状进行的分选中，首先提取细胞(步骤S32)。利用二值化图像判断是否为细胞。利用规定的阈值，将利用白色光光源拍摄分析用标本来获得的图像的亮度信息生成为二值化图像，从所生成的二值化图像提取具有点状及岛状的连续区域的区域即提取被任意的闭合曲线包围的区域作为细胞。
接着，根据核的有无选择在步骤S32中提取的细胞(步骤S34)。对于核的有无，根据细胞内是否存在核(点状物)来决定。对于核的有无的判断也能够利用二值化图像。作为细胞而提取的区域中存在具有小于作为细胞提取的区域面积的被任意的闭合曲线包围的区域时，能够提取该区域作为核。
接着，提取细胞的核的大小(点状及岛状的连续区域的大小)为1～5μm的细胞(步骤S36)。选择具有1～5μm大小的核的细胞有助于分选有核红细胞。另外，“点状及岛状的连续区域的大小”能够使表示核的外形的闭合曲线近似于圆形或椭圆形，并设为近似于核的外形的圆形的直径或近似于核的外形的椭圆形的长径。
作为近似于核的外形的圆形的例子，可举出与表示核的外形的闭合曲线外接的圆形中直径最小的圆形。作为近似于核的外形的椭圆形的例子，可举出与表示核的外形的闭合曲线外接的椭圆形中长径最小的椭圆。提取近似于核的外形的圆形的直径或近似于核的外形的椭圆形的长径为1～5μm的细胞。
接着，根据核的形状分选细胞(步骤S38)。图3A是表示欲选择的细胞的形状的示意图，图3B是表示欲排除的细胞的形状的示意图。作为根据核的形状进行的分选的具体例，对根据核区域的面积相对于细胞质的面积的比例进行分选的方法及根据核的圆形程度进行分选的方法进行说明。核区域的面积相对于细胞质的面积的比例满足下述(1)式时，细胞被选为成为源自胎儿的有核红细胞候选的有核红细胞。将细胞的细胞质的面积设为C，将细胞的核的面积设为N时，具有N相对于C的比例超过0.25且小于1.0的核的细胞被选为成为源自胎儿的有核红细胞候选的有核红细胞。
0.25＜(N/C)＜1.0 (1)
并且，作为满足核的圆形程度的选择条件的情况，可举出满足下述(2)式的情况。将核的直径或核的长径设为L时，具有核的面积相对于核的直径或核的长径平方的比例超过0.65且小于0.785的核的细胞被选为成为源自胎儿的有核红细胞候选的有核红细胞。另外，作为核的直径或核的长径，能够通过与在步骤S34中求出核的大小的情况相同的方法求出。
0.65＜(N/(L×L))＜0.785 (2)
根据细胞的形状进行的分选中，通过在基于步骤S32～步骤S36的第1工序中进行粗筛，在基于步骤S38的第2工序中根据核的形状进行分选，能够减少通过图像处理进行分选的成为源自胎儿的有核红细胞候选的有核红细胞的数量，能够有效地进行成为源自胎儿的有核红细胞候选的有核红细胞的分选。
根据形状进行的分选需要满足步骤S32～步骤S38的所有条件。步骤S32～步骤S38的条件中，只要不满足其中一个条件，则不会被选为成为源自胎儿的有核红细胞候选的有核红细胞。
作为利用细胞的形状信息分选成为源自胎儿的有核红细胞候选的有核红细胞的系统的结构例，可举出安装有光学显微镜、数码相机、载玻片用载物台、光传输系统、图像处理PC(personal computer)、控制PC、显示器的系统。光传输系统具备物镜与CCD(ChargeCoupled Device)相机，图像处理PC可举出具备进行数据分析、数据存储的处理系统的结构。控制PC可举出具备载玻片用载物台的位置控制或控制整体处理的控制系统的结构。
(根据光学特性进行的分选)
根据光学特性进行的分选能够利用源于红细胞中包含的血红蛋白的氧亲和性的不同的分光特性。图4是表示相对于还原血红蛋白(Hb)与氧化血红蛋白(HbO2)的波长的吸收系数的曲线图(记载于日本特开2014-14485号公报)。其中，吸收系数是表示光入射到某个介质时该介质吸收多少光的常数。如图4所示，已知血红蛋白通过与氧的相互作用，其吸收系数发生变化。即，氧化血红蛋白具有红色色调，随着成为还原血红蛋白而带蓝色。
根据光学特性进行的分选中，利用源自胎儿的有核红细胞相对于母亲的红细胞及少量存在的源自母体的有核红细胞，其血红蛋白的氧亲和性不同的现象，分选源自母体的有核红细胞与源自胎儿的有核红细胞。例如，通过使用涂布于玻璃基板上的血液成分，利用有核红细胞与存在于该有核红细胞附近的红细胞之间的分光特性的差异，分选为源自母体的有核红细胞与源自胎儿的有核红细胞。
分光特性是以存在还原血红蛋白与氧化血红蛋白之间的吸收系数的差异的波长域来检测差的特性。成人的红细胞中的血红蛋白为四聚体α2β2(HbA)。另一方面，已知胎儿的红细胞中的血红蛋白为由两条α链与两条γ链组成的四聚体α2γ2(HbF)，出生之后，逐渐被取代为包含占大部分的HbA与少数的HbF的HbA2。胎盘中，通过从血液中的妊娠母体的血红蛋白(HbA)接受氧的供给，胎儿的血红蛋白获得氧。并且，成人的血液中的红细胞中包含的血红蛋白(HbA)为四聚体α2β2，而胎儿型的血红蛋白(HbF)为α2γ2，具有氧亲和性高于HbA的特征。产前诊断中，优选作为血液试料采集妊娠母体的外周血来进行检查。外周血通常从静脉采集，静脉中的血液的氧量少于动脉中的氧量。认为健康人的中心静脉血的氧饱和度的正常值为60～80％，该值根据全身的氧需要而浮动。HbA与HbF的氧亲和性不同，因此在静脉血中，HbA与HbF的氧键合量也不同，具有HbF的氧键合量变得高于HbA的氧键合量的特征。
母体的血红蛋白(HbA)与胎儿的血红蛋白(HbF)中，在静脉中也存在氧亲和性的差，如图4所示，还原血红蛋白与氧化血红蛋白在吸收系数上产生差，因此利用该差分选源自母体的有核红细胞与源自胎儿的有核红细胞。吸光度的测定中，适用400～650nm的光波长区域。利用具有从该光波长区域选择的波长的至少一个单色光来测定吸光度。
并且，关于吸光度的测定，利用不同波长的多个单色光来测定各波长的吸光度，并检测各波长的测定值的比例，由此能够更加可靠地进行有核红细胞的分选。优选为利用从400～500nm的光波长区域选择的波长的单色光的方式，更优选分别利用从超过450nm且小于480nm的光波长区域选择的波长的单色光及从超过550nm且小于575nm的光波长区域选择的波长的单色光，并根据各波长的吸光度的比例进行分选。并且，关于光波长区域，优选分别利用从超过550nm且小于575nm的光波长区域选择的波长的单色光及从超过575nm且小于585nm的光波长区域选择的波长的单色光，根据各波长的吸光度的比例进行分选。通过导出利用两种以上的不同单色光测定的吸光度的比例，能够排除各个细胞之间因细胞的厚度和面积等而在细胞之间引起的吸光度的误差。如图4所示，这些光波长区域中，氧化血红蛋白(HbO2)与还原血红蛋白(Hb)中吸收系数之差较大，因此通过利用该光波长区域，能够可靠地进行源自母体的有核红细胞与源自胎儿的有核红细胞的分选。
并且，根据光学特性进行分选的光波长区域优选夹着如下波长，以各个光波长区域的波长进行测定，该波长为有关图4所示的曲线图中的吸收系数中，还原血红蛋白的吸收系数与氧化血红蛋白的吸收系数的大小被反转的波长。即，以源自胎儿的有核红细胞(氧化血红蛋白的比例较高)的吸收系数高于源自母体的有核红细胞(氧化血红蛋白的比例较低)的吸收系数的第1光波长区域的波长、源自母体的有核红细胞的吸收系数高于源自胎儿的有核红细胞的吸收系数的第2光波长区域的波长测定吸光度。并且，通过求出以第1光波长区域的波长测定的吸光度与以第2光波长区域的波长测定的吸光度的比例并进行比较，能够加大源自胎儿的有核红细胞的比例与源自母体的有核红细胞的比例之差，因此能够可靠地进行源自胎儿的有核红细胞的分选。
作为第1光波长区域，可举出超过400nm且小于500nm、超过525nm且小于550nm及超过575nm且小于585nm的光波长区域。并且，作为第2光波长区域，可举出超过550nm且小于575nm的光波长区域。
并且，还能够在各光波长区域中以多个波长测定吸光度，并利用这些吸光度的平均值进行分选。通过根据吸光度的平均值进行分选，能够降低吸光度的测定值中包含的噪声的影响。
《第1实施方式》
图5是表示根据光学特性进行分选的第1实施方式的步骤的流程图。图6是表示测定吸光度时的波长的选择方法的说明图。
首先，根据细胞的形状分选成为源自胎儿的有核红细胞候选的多个有核红细胞。为了对所分选的成为源自胎儿的有核红细胞候选的多个有核红细胞，根据光学特性进行分选，选择两种测定吸光度的波长。例如，选择图6的波长λ1及波长λ4。以一个波长λ4测定吸光度2(步骤S52)。同样地以另一个波长λ1测定吸光度1(步骤S54)。如上述，选择测定吸光度的两种波长λ1及λ4之后，针对错开波长λ1的波长λ2及波长λ3、错开波长λ4的波长λ5及波长λ6的每一个，也测定吸光度。还能够求出以波长λ1、波长λ2及波长λ3测定的吸光度的平均值，将该平均值作为吸光度1，求出以波长λ4、波长λ5及波长λ6测定的吸光度的平均值，将该平均值作为吸光度2。如此，通过将以多个波长测定的吸光度的平均值作为吸光度1及吸光度2，能够降低吸光度的测定值中包含的噪声的影响。
接着，根据吸光度1及吸光度2进行细胞是否实际上具有血红蛋白的判别(步骤S56)。根据与已知的相对于血红蛋白的波长的吸光度进行比较来判别有无血红蛋白。根据具有血红蛋白，确定细胞为有核红细胞。接着，通过计算按成为源自胎儿的有核红细胞候选的每个有核红细胞求出吸光度之比(吸光度1/吸光度2)(图5的步骤S58)，按吸光度之比的值从大到小的顺序排列(图5的步骤S60)。最后，根据分别选择的波长下的氧化血红蛋白与还原血红蛋白的关系，根据所测定的波长及氧化血红蛋白、还原血红蛋白的吸光度求出吸光度之比的理论值，与所测定的成为源自胎儿的有核红细胞候选的有核红细胞的吸光度之比进行比较，由此能够将成为源自胎儿的有核红细胞候选的有核红细胞分选为源自母体的有核红细胞与源自胎儿的有核红细胞(图5的步骤S62)。
《第2实施方式》
作为根据分光特性分选源自胎儿的有核红细胞与源自母体的有核红细胞的方法，将存在于分选对象的有核红细胞周围的不具有核的红细胞作为参考红细胞，通过与该参考红细胞进行比较，对分选对象的有核红细胞是源自胎儿的有核红细胞还是源自母体的有核红细胞进行分选。以与分选对象的有核红细胞相同的波长的单色光测定参考红细胞的吸光度，并求出其比例，对所分选的有核红细胞的吸光度的比例与参考红细胞的吸光度的比例进行比较，由此能够更加可靠地从分选对象的有核红细胞中分选源自胎儿的有核红细胞。
＜参考红细胞的选择方法＞
能够通过以下方法进行参考红细胞的选择。图7～10是说明选择参考红细胞的方法的图，图7是说明根据参考红细胞的数量设定搜索范围的方法的图，图8是表示根据参考红细胞的数量设定搜索范围的步骤的流程图。并且，图9是说明根据所关注的有核红细胞的面积设定搜索范围的方法的图，图10是表示根据所关注的有核红细胞的面积设定搜索范围的步骤的流程图。
{根据参考红细胞的数量设定搜索范围的方法}
图7及8是说明根据参考红细胞的数量设定搜索范围的方法的说明图。首先，决定分选对象的有核红细胞候选30(图8的步骤S72)。如之前已说明，分选对象的有核红细胞候选30能够根据形状决定。接着，设定所搜索的参考红细胞数(图8的步骤S74)。图8中说明将所搜索的参考红细胞设为5个的情况。接着，以分选对象的有核红细胞候选30为中心选择参考红细胞32，直至成为所设定的搜索的参考红细胞数(图8的步骤S76)。参考红细胞32按分选对象的有核红细胞候选30的中心至参考红细胞32的中心为止的距离D从近到远的顺序选择。
有核红细胞候选30的中心能够设为使有核红细胞候选30的平面形状近似于圆形时的圆形的中心。同样地，参考红细胞32的中心能够设为使参考红细胞32的平面形状近似于圆形时的圆形的中心。以下的说明中也相同。并且，可以按有核红细胞候选30的重心至参考红细胞32的重心为止的距离从近到远的顺序选择参考红细胞。
另外，图7中，以参考红细胞的选择数量为5个的情况进行了说明，但是参考红细胞的选择数量优选为2个以上20个以下。通过将参考红细胞的选择数量设为上述范围，获取多个参考红细胞的光学信息并进行平均，能够均匀地决定成为与分选对象的有核红细胞候选之间的差异的基准。并且，参考红细胞的选择数量更优选设为3个以上10个以下。参考红细胞的数越多，越能够平均化光学信息，因此优选，但若数量增多，则参考红细胞的测定中花费时间，因此优选设为上述范围。
{根据分选对象的有核红细胞的面积设定搜索范围的方法}
图9、10是根据分选对象的有核红细胞的面积设定搜索范围的方法的说明图。该方法中，与根据参考红细胞的数量设定搜索范围的方法相同，首先决定分选对象的有核红细胞候选30(图10的步骤S82)。接着，设定参考红细胞32的搜索范围36(图10的步骤S84)。图9中，通过实线图示搜索范围36。图9所示的搜索范围36设为分选对象的有核红细胞候选30的100细胞量(10×10细胞量)。
关于搜索范围36，优选设为以分选对象的有核红细胞候选30为中心的一边为有核红细胞候选30的10细胞量的正方形或直径为10细胞量的圆形。并且，优选预先阶段性地设定搜索范围36之后，当搜索范围36内未观察到参考红细胞时，逐渐扩大搜索范围36。例如，搜索范围36设为一边为有核红细胞候选30的10细胞量的正方形或直径为10细胞量的圆形时，未观察到参考红细胞32时，优选将搜索范围进一步扩大到一边为20细胞量的正方形或直径为20细胞量的圆形，从而决定参考红细胞。
接着，将搜索范围36内的无核红细胞作为参考红细胞32来搜索(图10的步骤S86)。对于选为参考红细胞32的基准，以参考红细胞32的中心或重心是否进入到搜索范围36内来判断。
另外，对于参考红细胞32的选择数量及搜索范围36的面积，并无特别限定，能够任意设定。
图11是表示选择参考红细胞32之后对分选对象的有核红细胞进行分选的步骤的流程图。
选择参考红细胞32之后，以所选择的波长对(1)分选对象的有核红细胞候选30、(2)参考红细胞32、(3)分选对象的有核红细胞候选30及参考红细胞32的周围34(图7、9中以虚线表示)测定吸光度2(图11的步骤S92)。所分选的有核红细胞候选30及参考红细胞32的周围34在图7、9中为成为对象红细胞的周围的9细胞量(3×3细胞量)的范围。同样地，以与在图11的步骤S92中选择的波长不同的波长测定(1)所分选的有核红细胞候选30、(2)参考红细胞32、(3)所分选的有核红细胞候选30及参考红细胞32的周围34的吸光度1(图11的步骤S94)。
测定吸光度1、2之后，从有核红细胞候选30的吸光度减去有核红细胞候选30的周围34的吸光度，由此求出(4)有核红细胞候选30的吸光度1、2的真值。并且，从参考红细胞32的吸光度减去参考红细胞32的各个红细胞的周围34的吸光度，由此求出(5)参考红细胞32的吸光度1、2的真值(图11的步骤S96)。
根据有核红细胞候选30的吸光度1及吸光度2，进行有核红细胞候选30是否实际上具有血红蛋白的判别(图11的步骤S98)。对于血红蛋白的有无，通过比较相对于波长的吸光度的已知的血红蛋白来进行判别。根据具有血红蛋白，确定有核红细胞候选30为有核红细胞。
接着，求出有核红细胞的吸光度之比、参考红细胞的吸光度之比(步骤S100)。有核红细胞的吸光度之比根据“吸光度1的真值/吸光度2的真值”求出。并且，参考红细胞的吸光度之比能够通过求出多个参考红细胞的吸光度1的真值的平均值及吸光度2的真值的平均值，并根据“吸光度1的真值的平均值/吸光度2的真值的平均值”来求出。
最后，求出“有核红细胞的吸光度之比/参考红细胞的吸光度之比”(步骤S102)。参考红细胞为源自母体的有核红细胞，因此“有核红细胞的吸光度之比/参考红细胞的吸光度之比”的值与“1”的差越小，有核红细胞为源自母体的有核红细胞的可能性越高，与“1”的差越大，源自胎儿的有核红细胞的可能性越高，能够分选为源自胎儿的有核红细胞(步骤S104)。如此，求出“有核红细胞的吸光度之比/参考红细胞的吸光度之比”，从该值与“1”的差最大的有核红细胞对源自胎儿的有核红细胞的可能性进行排序，由此能够进行源自胎儿的有核红细胞的分选。
作为选择参考红细胞的方法，例示了图7及图8中图示的根据参考红细胞数设定搜索范围来选择参考红细胞的方法、图9及图10中图示的根据分选对象的有核红细胞的面积设定搜索范围来选择参考红细胞的方法，但并不限定于此，还能够通过组合这些的方法进行分选。例如，预先根据分选对象的有核红细胞的面积决定搜索范围，该范围内包含的红细胞数超过预先设定的个数时，能够测定全部，也能够选择预先设定的个数来进行测定。作为选择方法，如上述，从分选对象的有核红细胞与参考红细胞的中心彼此的距离较近或重心彼此的距离较近的细胞依次选择。并且，搜索范围内的参考红细胞的数量低于预先设定的个数时，在判定出低于该个数的时点，扩大搜索范围，检测通过扩大而增加的面积中包含的参考红细胞。优选反复进行该操作，直至获得预先确定的个数的红细胞。
并且，通过与参考红细胞的比较来进行分选时，并不限定于利用以多个波长测定的吸光度之比进行分选的方法，还能够通过以1种波长测定吸光度，并对所分选的有核红细胞与参考红细胞进行比较来判别。参考红细胞为源自母体的红细胞，因此吸光度的值接近参考红细胞的有核红细胞为源自母体，能够将吸光度的值较远的有核红细胞判别为源自胎儿。
通过以上的方法并通过分选工序，能够将母体血液中存在的有核红细胞分选为源自胎儿的有核红细胞与源自母体的有核红细胞。
＜扩增工序(步骤S18)＞
扩增工序是对通过分选工序分选的包含于至少源自胎儿的有核红细胞的染色体中的核酸进行扩增的工序。
通过分选工序分选的源自胎儿的有核红细胞利用显微操纵器从标本分离。自从标本分离来获取的细胞中提取DNA，进行全基因组扩增。全基因组扩增能够利用市售的套件进行。
作为本实施方式中利用的全基因组扩增法，利用如下基因组DNA，即，从所获取的细胞，通过经过作为通常方法的利用界面活性剂的细胞溶解、利用蛋白酶K等的蛋白质分解工序而从细胞溶出来获得。
作为全基因组扩增试剂，能够利用基于聚合酶连锁反应(PCR：polymerase chainreaction)的试剂Single cell WGA kit(New England Biolabs公司)、GenomePlex SingleCell Whole Genome Amplification kit(Sigma-Aldrich公司)，作为全基因组扩增法，能够使用MALBAC法(Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles)(记载于国际公开WO2012/166425A2号公报)。并且，同样能够利用基于链置换型DNA合成反应的试剂GenomiPhi(GENERAL ELECTRIC COMPANY)、REPLI-g(QIAGEN公司)。本实施方式中，优选利用Single cell WGA kit(New England Biolabs公司)。
通过全基因组扩增获得的DNA的扩增产物优选通过琼脂糖凝胶电泳确认有无扩增。进一步优选利用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司)对全基因组扩增产物进行提纯。
并且，优选利用NanoDrop(Thermo Fisher Scientific公司)、BioAnalyzer(Agilent公司)，对通过全基因组扩增获得的DNA的扩增产物的浓度进行测定。
扩增工序中，扩增至少源自胎儿的有核红细胞的染色体中存在的核酸即DNA。作为扩增工序的对象物的源自胎儿的有核红细胞的数量为至少1个即可，但优选扩增从多个源自胎儿的有核红细胞的核酸。而且，为了在之后的决定工序中决定胎儿的染色体的数量异常，作为比较扩增产物的量的基准，选择不存在数量异常的源自母体的有核红细胞的染色体也是优选方式。对源自母体的有核红细胞与基准进行比较时，对通过分选工序分选的源自母体的有核红细胞的染色体的核酸进行扩增也是优选方式之一。
＜确定工序(步骤S20)＞
确定工序是对通过扩增工序扩增的至少源自胎儿的有核红细胞的扩增产物的量进行确定的工序。
(核酸碎片的数量的决定)
对鉴定为源自胎儿的有核红细胞的细胞，并通过聚合酶连锁反应扩增的DNA，且成为数量异常的检查对象的染色体，通过定序器求出具有预先决定的100～150bp(basepair：基对)区域的排列的DNA的扩增产物的量。本发明中，源自胎儿的有核红细胞的染色体且成为数量异常的检查对象的染色体优选选自包含13号染色体、18号染色体、21号染色体及X染色体的组。
＜决定工序(步骤S22)＞
决定工序是比较通过确定工序确定的DNA的扩增产物的量，由此决定是否存在源自胎儿的染色体的数量异常的工序。
作为决定是否存在源自胎儿的染色体的数量异常的基准(或者参考)，选择数量异常的检查对象染色体以外的染色体，通过定序器求出具有预先决定的100～150bp区域的排列的DNA的扩增产物的扩增量。作为成为基准的染色体(基准染色体)，从如下方式选择：从源自胎儿的有核红细胞的染色体中选择数量异常的检查对象染色体以外的染色体的至少1个；或选择存在于鉴定为源自母体的有核红细胞的细胞的染色体。本实施方式中，优选选择存在于鉴定为源自母体的有核红细胞的细胞的染色体。
接着，根据数量异常的检查对象染色体的DNA的扩增产物的量与基准染色体的DNA的扩增产物的量之间的比例，决定胎儿的染色体中是否存在数量异常。若胎儿为正常状态，则预测检查数量异常的源自胎儿的对象染色体的DNA的扩增产物的量与基准染色体的DNA的扩增产物的量大致成为1:1的量比。染色体存在3条的三染色体的数量异常的情况下，预测会成为1.0:1.5(或者2：3)的比。
并且，还能够在决定工序之前，预先求出以下结果分布：求出多个从多个妊娠母体采集的、源自胎儿的染色体的DNA的扩增产物的量与妊娠正常胎儿时的源自母体的染色体的DNA的扩增产物的量的比；求出多个源自胎儿的DNA的扩增产物的量与妊娠三染色体胎儿的母体的源自母亲的DNA的扩增产物的量的比，并预先在该两个分布不会重叠的区域设定截止值，比较该截止值与DNA的扩增产物的量之比，决定是否存在数量异常。此时，能够如下解释检查结果，即，若DNA的扩增产物的量之比为截止值以下，则胎儿为正常，若为截止值以上，则为三染色体的数量异常。
[实施例]
(实施例1)
以下举出实施例，对本发明进行更详细的说明。但是，本发明并不限定于该实施例。
(获取工序[外周血液试料的获取工序])
在7mL采血管中，作为抗凝剂添加10.5mg的EDTA(乙二胺四乙酸)的钠盐之后，获得母体志愿者的知情同意之后，在采血管内作为志愿者血获得了外周血7mL。之后，利用生理盐水稀释了血液。
(浓缩工序[有核红细胞的浓缩工序])
使用Percoll液(注册商标)，制备密度1.070g/mL与密度1.095g/mL的液体，在离心管的底部添加密度1.095g/mL的液体2ml。接着，在密度1.095g/mL的液体上，缓慢叠加密度1.070g/mL的液体2mL，以避免界面紊乱。之后，在密度1.070g/mL的介质上，向离心管中缓慢添加上述中采集的血液的稀释液11mL。之后，以2000rpm(转速每分钟)进行20分钟的离心分离。之后，取出离心管，利用移液管采集沉积在密度1.070g/mL与密度1.090g/mL的液体之间的组分。用一只手保持第1玻璃基板，在其一端放置如此所采集的1滴血液的组分。用另一只手拿起另一玻璃基板(第2玻璃基板)，以30度的角度使第2玻璃基板的一端与第1玻璃基板接触，若使第2玻璃基板的接触下表面与血液的组分接触，则通过毛细管现象在被2张玻璃包围的空间扩散。接着，在保持角度的状态下，使第2玻璃基板向第1玻璃基板的放置血液的区域的相反区域的方向滑动，从而涂布于第1玻璃基板上。之后，进行1小时以上的送风来使其充分干燥。将该第1玻璃基板在迈格林华染色液中浸渍3分钟，并浸渍于磷酸缓冲液中清洗之后，在姬姆萨染色液(用磷酸缓冲液稀释来设为浓度3％)中浸渍10分钟。之后，用纯水清洗之后使其干燥。如此，制作了已染色的多张玻璃基板。
(根据细胞的形状进行分选的工序)
为了从涂布于玻璃基板上的浓缩处理之后的血液，分选成为源自胎儿的有核红细胞候选的有核红细胞，准备了以下:电动二维载物台(以下，记载为XY载物台。)；具备物镜、CCD相机的光学显微镜的测定系统；具备XY载物台控制部、控制垂直方向(以下，记载为Z方向)移动机构的Z方向控制部的控制部；及具备图像输入部与图像处理部及XY位置记录部的控制单元部。将如上述那样准备的、涂布于玻璃基板上的血液细胞放置于XY载物台，对焦于玻璃基板上并进行扫描，读入通过光学显微镜获得的图像，通过图像分析搜索作为目标细胞的有核红细胞。
图像分析中，检测满足以下的式(1)、式(2)的条件的细胞，设定包含与分析对象的图像正交的二轴的坐标系，记录将二轴中的一个设为X轴并将二轴中的另一个设为Y轴时检测到的细胞的X方向的细胞位置及Y方向的位置。
0.25＜(N/C)＜1.0 (1)
0.65＜(N/(L×L))＜0.785 (2)
其中，C定义为进行图像分析的细胞的细胞质的面积(用于分析的图像中的表示细胞质的区域的面积)，N定义为进行图像分析的细胞的核的面积(分析图像中的表示细胞的核的区域的面积)，L定义为进行图像分析的细胞的核的长径或直径(使分析图像中的表示细胞的核的区域近似于椭圆形时的椭圆形的长径或使分析图像中的表示细胞的核的区域近似于圆形时的圆形的直径)，即，定义为与呈复杂的形状的细胞核外接的椭圆形的长径或圆形的直径。选择存在于满足这些式(1)、式(2)的载玻片基板上的成为源自胎儿的有核红细胞候选的有核红细胞，将其作为下一工序的源自胎儿的有核红细胞候选。
(根据光学特性分选有核红细胞的工序)
对于根据形状信息选择的成为源自胎儿的有核红细胞候选的10个有核红细胞，利用显微分光装置进行光学特性的分析。确定载玻片基板上的成为源自胎儿的有核红细胞候选的10个有核红细胞，对其中一个有核红细胞，测定波长为460nm的单色光的吸光度1及波长为560nm的单色光的吸光度2，计算吸光度之比(吸光度1/吸光度2)。接着，按离该有核红细胞的距离从近到远的顺序选择位于该有核红细胞附近的5个无核红细胞作为参考红细胞，同样对每一个参考红细胞，计算吸光度之比(吸光度1/吸光度2)并计算平均值。
通过相同的方法，对玻璃基板上的成为源自胎儿的有核红细胞候选的有核红细胞的剩余9个细胞，也进行相同的计算。根据该计算结果，求出(有核红细胞的吸光度之比/参考红细胞的吸光度之比的平均值)，将该值与“1”的差最大的细胞视作源自胎儿的有核红细胞并设为细胞A，将与“1”的差最小的细胞视作源自母体的有核红细胞并设为细胞B。
(细胞分离工序)
使用显微操纵器回收上述工序中决定的细胞A、细胞B。
(扩增工序[DNA扩增工序])
利用有核红细胞中识别为源自胎儿的细胞A与识别为源自母体的细胞B，利用NewEngland Biolabs公司制造的Single Cell WGA kit进行全基因组扩增，根据说明书的记载，将细胞中的微量DNA扩增为约100万倍。
(确定工序[源自母体或源自胎儿的确定工序])
对从各细胞扩增的全基因组扩增产物进行平分，利用其中一部分，利用ILLUMINA公司制造的基因组分析仪Miseq比较13号染色体的C1QTNF9B基因区域、PCDH9基因区域、BRCA2基因区域、MTRF1基因区域的SNP(Single Nucleotide Polymorphism)(SNP ID：rs3751355、rs1799955、rs2297555、rs9571740)，由此确认了细胞A与细胞B的SNP不同。另外，用显微操纵器回收预测为白细胞的细胞C，与细胞A、细胞B相同地调查了SNP，其结果确认到与细胞B的SNP一致。通过以上，确认到细胞A为源自胎儿的有核红细胞、细胞B为源自母亲的有核红细胞。
(决定工序[数量异常的决定工序])
利用对分别从细胞A及细胞B扩增的DNA的扩增产物进行平分后剩下的一部分，判别源自胎儿的有核红细胞是否为21三染色体。利用分别从细胞A及细胞B获得的DNA的扩增产物，利用SureSelect target enrich system(Human All exon v5AgilentTechnologies,Inc.制造)，根据说明书记载，仅浓缩各个细胞的exon部分，利用ILLUMINA公司制造的基因组分析仪Hiseq，计算exon部分的序列读数，比较在细胞A及细胞B的每一个中的21号染色体的exon部分中计算出的序列读数，由此能够检测21三体综合症。
如以上，得知能够根据从妊娠母体获得的血液鉴定源自胎儿的有核红细胞，还能够进行胎儿的染色体的数量异常分析，确认了本发明的效果。
(实施例2)
实施例1中，以以下记载的方法进行(浓缩工序[有核红细胞的浓缩工序])来制作了玻璃基板，除此以外与实施例1相同地进行，确认了本发明的效果。
(浓缩工序[有核红细胞的浓缩工序])
使用Histopaque液(注册商标)，制备密度1.095的液体，在离心管中，向离心管的底部添加密度1.095的液体液3mL。之后，在密度1.095的介质上，缓慢向离心管添加所采集的血液的稀释液12mL。之后，以2000rpm进行了20分钟的离心分离。之后，取出离心管，利用移液管采集密度1.095的液体与血浆之间的组分。用一只手保持第1玻璃基板，在其一端放置如此所采集的1滴血液的组分。用另一只手拿起另一玻璃基板(第2玻璃基板)，以30度的角度使第2玻璃基板的一端与第1玻璃基板接触，若使第2玻璃基板的接触下表面与血液的组分接触，则通过毛细管现象在被两张玻璃包围的空间扩散。接着，在保持角度的状态下，使第2玻璃基板向第1玻璃基板的放置血液的区域的相反区域的方向滑动，从而涂布于第1玻璃基板上。之后，进行1小时以上的送风来使其充分干燥。将该第1玻璃基板在迈格林华染色液中浸渍3分钟，并浸渍于磷酸缓冲液中清洗之后，在姬姆萨染色液(用磷酸缓冲液稀释来设为浓度3％)中浸渍10分钟。之后，用纯水清洗之后使其干燥。如此，制作了已染色的多张玻璃基板。
(实施例3)
实施例1中，利用从其他母体获得的细胞，在实施例1中进行的源自母体或源自胎儿的确定方法中，利用在Y染色体的sex-determining factor(SRY)基因区域中制作的PCR引物，利用Takara Bio Inc.制造的Multiplex PCR Assay Kit进行PCR，通过通常的琼脂糖凝胶电泳法确认有无Y染色体的PCR扩增物，在实施例1的胎儿有核红细胞的分选工序中，确认到从其他母体获得的识别为源自胎儿的细胞为源自男婴胎儿的细胞，除此以外，与实施例1相同地进行了实验，确认了本发明的效果。
符号说明
30-有核红细胞候选，32-参考红细胞，34-周围，36-搜索范围。

Claims (9)

1.一种胎儿染色体的检查方法，其具有：
采集工序，从妊娠母体获取母血；
浓缩工序，对所述母血中的有核红细胞进行浓缩；
分选工序，根据核的形状及400～650nm的光波长区域中包含的波长处的分光特性，将通过所述浓缩工序已浓缩有核红细胞的母血中的有核红细胞分选为源自母体的有核红细胞与源自胎儿的有核红细胞；
扩增工序，扩增至少所述源自胎儿的有核红细胞的染色体的核酸；
确定工序，确定通过所述扩增工序扩增的至少所述源自胎儿的有核红细胞的扩增产物的量；及
决定工序，通过所确定的所述扩增产物的量与母体的染色体或已知没有异常的胎儿的染色体的扩增产物之间的比较，决定是否存在所述源自胎儿的染色体数量异常。
2.根据权利要求1所述的胎儿染色体的检查方法，其中，
所述分选工序包括：第1分选工序，至少根据所述核的形状分选有核红细胞候选；及第2分选工序，根据所述分光特性对已通过所述第1分选工序分选的所述有核红细胞候选进行分选。
3.根据权利要求2所述的胎儿染色体的检查方法，其中，
所述第1分选工序包括如下工序：将成为所述有核红细胞候选的细胞的细胞质的面积设为C，将成为所述有核红细胞候选的细胞的所述核的面积设为N，将与成为所述有核红细胞候选的细胞的所述核外接的圆形的直径长度或椭圆形的长径长度设为L时，选择满足式1及式2的有核红细胞候选，
0.25＜N/C＜1.0 式1；
0.65＜N/(L×L)＜0.785 式2。
4.根据权利要求3所述的胎儿染色体的检查方法，其中，
所述第1分选工序还包括两个工序，第1工序中提取有可能具有核的细胞，第2工序中根据所述式1及所述式2对所述第1工序中提取的细胞分选所述有核红细胞候选。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的胎儿染色体的检查方法，其中，
所述分光特性为吸光系数。
6.根据权利要求5所述的胎儿染色体的检查方法，其中，
所述分选工序中，以包括第1光波长区域的波长与第2光波长区域的波长的至少两种以上波长中的各个波长测定有核红细胞的吸光度，
所述第1光波长区域中，所述源自胎儿的有核红细胞的吸光度超过所述源自母体的有核红细胞的吸光度，
所述第2光波长区域中，所述源自母体的有核红细胞的吸光度超过所述源自胎儿的有核红细胞的吸光度。
7.根据权利要求5或6所述的胎儿染色体的检查方法，其中，
所述分选工序中，根据以两种以上波长中的各个波长对所述源自母体的有核红细胞与所述源自胎儿的有核红细胞测定得到的吸光度的差异，对所述源自胎儿的有核红细胞的可能性进行排序。
8.根据权利要求7所述的胎儿染色体的检查方法，其中，
所述第1光波长区域为超过450nm且小于480nm的波长区域，所述第2光波长区域为超过550nm且小于575nm的波长域。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的胎儿染色体的检查方法，其中，
所述浓缩工序通过密度梯度离心分离法进行。
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