CN108410799A - 一种分离胎儿滋养细胞的方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种分离胎儿滋养细胞的方法，所述方法结合胎儿滋养细胞体积巨大的特性，利用单次或多次过滤的方法来去除体积偏小的非滋养细胞，从而得到纯的滋养细胞。另外，本发明公开一种上述所述的胎儿滋养细胞在制备产前诊断药物或试剂盒中的用途，分离得到单个或多个胎儿滋养细胞后，进行细胞裂解，可以直接得到滋养细胞的DNA、RNA、蛋白、small RNA、甲基化的DNA和RNA、线粒体的DNA等，从而获得胎儿的信息。本发明分离胎儿滋养细胞的方法及在产前诊断中的用途，比以往胎儿全基因组获取方法更为简单、经济、操作方便，具有广泛的经济实用性和临床推广价值。

Description

一种分离胎儿滋养细胞的方法及其用途
技术领域
本发明涉及一种无创性获取胎儿滋养细胞并检测胎儿细胞的DNA信息用于产前诊断的方法，属于医学领域。
背景技术
遗传突变是指7000余种已知罕见致病遗传突变甚至包括未知突变和常见病的致病突变，而现有技术仅对21号染色体三体综合征(即唐氏综合征)，爱德华综合征(T18)、帕陶氏综合征(T13)染色体疾病的产前诊断。而胎儿除了染色体数目的异常，还有其它大量的如遗传性单基因疾病和多基因疾病。
目前市场上对胎儿进行遗传信息检测的技术方案中其中一种是无创产前诊断，参考文献：【Chiu RW,Chan KC,Gao Y,Lau VY,Zheng W,Leung TY,Foo CH,Xie B,Tsui NB,Lun FM,Zee BC,Lau TK,Cantor CR,Lo YM.Noninvasive prenatal diagnosis of fetalchromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA inmaternal plasma.Proc Natl Acad Sci U S A.2008 Dec 23；105(51):20458-63】、【Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA frommaternal blood.Fan HC,Blumenfeld YJ,Chitkara U,Hudgins L,Quake SR.Proc NatlAcad Sci U S A.2008 Oct 21；105(42):16266-71】。此技术利用孕妇外周血里的胎儿游离DNA来检测染色体数目异常，该方法取代了传统的羊膜腔穿刺取羊水或绒毛膜细胞培养后进行染色体分析，其特点是无创，对胎儿无任何风险，准确。
但是此方法有局限性：第一，此法所能检测的遗传疾的数目是非常有限，仅有三种；不能检测的遗传基因疾病，比如单基因疾病和多基因疾病的异常，以及一些胎儿基因组中的微细变化，尤其是一些导致严重疾病或发育障碍的基因异常；第二，做出诊断的时间点较晚，已到中期引产期，一旦诊断出胎儿有遗传缺陷，则做的引产手术对母亲的健康影响较大。
孕妇外周血中存在少量的胎儿细胞，参考文献：【Walknowska J,Conte FA,Grumbach MM.1969.Practical and theoretical implications of fetal-maternallymphocyte transfer.Lancet 1:1119–1122.】，孕妇外周血中有许多种胎儿细胞，如胎儿红细胞，胎儿淋巴细胞，胎儿白细胞，以及胎儿滋养细胞。这些胎儿细胞可透过胎盘屏障进入母亲体内，进入母亲的血液循环。在这些胎儿细胞中，有两种细胞较易分离。一种是胎儿的红细胞，因为母亲的红细胞没有细胞核，是飞盘形状；而胎儿的红细胞有细胞核，是球型的；两种红细胞的明显的区别，使得我们很容易利用一些特殊性状分开这两种细胞。另一种较易分离的细胞，是胎儿滋养细胞。这种细胞的体积巨大(直径30-80微米)，母亲血液中完全没有其他相似体积的细胞类型(其他细胞类型的直径均为18微米以下)，这种超大的体积，使得胎儿滋养细胞比胎儿红细胞更容易分离，因为紧靠大小就可做到分离，所以可以做到准确，快速，简单，便宜。
由于母亲血液中的胎儿滋养细胞不是很多，因此需要具备对几个细胞甚至一个细胞进行分析的技术，包括全基因组的扩增和对污染的有效控制。细胞分离不是难点。目前分离滋养细胞的方法主要是采用滋养细胞特有的标记物通过磁珠活化细胞分选(Magnetically-activated cell sorting，MACS),荧光激活细胞分选(Fluorescence-activated cell sorting，FACS)方法，参考文献：【Durrant LG1,Martin WL,McDowall KM,Liu DT.Isolation of fetal trophoblasts and nucleated erythrocytes from theperipheral blood of pregnant women for prenatal diagnosis of fetalaneuploides.Early Hum Dev.1996 Dec 30；47Suppl:S79-83】、【Bruch JF1,Metezeau P,Garcia-Fonknechten N,Richard Y,Tricottet V,Hsi BL,Kitzis A,Julien C,PapiernikE.Prenat Diagn.1991 Oct；11(10):787-98.Trophoblast-like cells sorted fromperipheral maternal blood using flow cytometry:a multiparametric studyinvolving transmission electron microscopy and fetal DNA amplification】，此类方法步骤繁琐，不经济，需要一定的仪器设备。另外，有人用滋养细胞大小过滤来达到富集目的，后续仍需滋养细胞的特有标记物或者激光显微捕获的分离方法才达到分离效果，参考文献：【Mouawia H1,Saker A,Jais JP,Benachi A,Bussières L,Lacour B,BonnefontJP,Frydman R,Simpson JL,Paterlini-Brechot P.Circulating trophoblastic cellsprovide genetic diagnosis in 63 fetuses at risk for cystic fibrosis or spinalmuscular atrophy.Reprod Biomed Online.2012 Nov；25(5):508-20】，因此目前的分离胎儿滋养细胞的方法中存在操作繁琐、缺乏经济实用性的缺陷，
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种快速、简便的分离滋养细胞的方法，从而达到完全分离滋养细胞而不是仅仅是富集滋养细胞，并且无需后续的如采用标记物来分离滋养细胞的一种快速的分离方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：胎儿滋养细胞在制备产前诊断药物或试剂盒中的用途。
本申请的发明人结合滋养细胞的体积巨大的特性，利用单次或多次过滤的方法来去除体积偏小的非滋养细胞，从而得到纯的滋养细胞，分离得到单个或多个滋养细胞后，进行细胞裂解，可以直接得到滋养细胞的DNA、RNA、蛋白、small RNA、甲基化的DNA和RNA、线粒体的DNA等，从而获得胎儿的信息，为无创性产前遗传诊断应用提供了物质基础。
优选的，所述胎儿滋养细胞源自孕妇的外周血或尿液。
优选的，所述孕妇为妊娠5～38周的孕妇。
另外，本发明公开一种分离胎儿滋养细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)获取孕妇的外周血或尿液；
2)过滤去除所述外周血或尿液中的非胎儿滋养细胞，即得胎儿滋养细胞。
优选的，所述步骤1)和步骤2)之间还设有固定所述外周血或尿液中的细胞的步骤。
优选的，所述步骤2)中，通过固定液固定所述外周血或尿液中的细胞，所述固定液例如可采用Rarecells公司的Proprietary buffer，固定细胞这个步骤可以省去，可先不固定细胞，先收集到滋养细胞细胞收集后直接进行细胞裂解，也可收集到滋养细胞后固定，利于保存。
优选的，所述孕妇外周血或尿液的采集量为1～20ml。
更优选的，所述孕妇外周血或尿液的采集量为10ml。
优选的，所述过滤去除所述外周血或尿液中的非胎儿滋养细胞的步骤反复进行多次。
分离之后，将所得细胞在显微镜下进行检测，如果所得细胞中仍有其它细胞，比如淋巴细胞、粒细胞等，则可进行多次重复过滤，直到所得细胞仅含有胎儿滋养细胞。
优选的，所述步骤3)中，过滤采用过滤装置进行，所述过滤装置的过滤孔径大小为大于30μm且小于80μm。
优选的，所述孔径大小为35μm。
目前关于孕妇外周血中滋养细胞孔径大小的数据非常有限，有文献报道滋养细胞在子宫静脉里面观察到滋养细胞(syncytiotrophoblast cells)细胞的大小是23-88μm，参考文献：【Chua S1,Wilkins T,Sargent I,Redman C.Trophoblast deportation in pre-eclamptic pregnancy.Br J Obstet Gynaecol.1991 Oct；98(10)：973-9.】。因外周血不同于子宫静脉血，本申请发明人测量了孕妇外周血中滋养细胞大小，滋养细体积较大，约在45-50μm或者更大，而外周血中的有核细胞小于20μm，因此本发明不采用富集细胞的8μm的方法，而选择大于30μm，小于80μm的范围的孔径大小，并且优先选择了35μm孔径大小。
优选的，所述孕妇为妊娠5～38周的孕妇。
优选的，所述步骤2)中，先将所述外周血或尿液使用缓冲液稀释8～15倍，再进行过滤。所述缓冲液例如可采用Rarecells公司的Proprietarybuffer。
优选的，所述分离胎儿滋养细胞的方法包括以下步骤：取妊娠5～38周孕妇外周静脉血1～20ml，优选妊娠8～15周，最佳采血量为10ml，将10ml血收集至EDTA抗凝管内；在采血4小时内，将10ml血加入专有缓冲液中，按照1:10稀释；10分钟后，将此血样经过30-80μm过滤孔径的过滤装置或用一次性过滤漏斗过滤去除非滋养细胞，即得胎儿滋养细胞。
具体地，所述分离胎儿滋养细胞的方法为：取妊娠5～38周孕妇外周静脉血1～20ml,优选妊娠8～15周，最佳采血量为10ml,将10ml血收集至EDTA抗凝管(产品号：366643，BD)内；在采血4小时内，将10ml血加入专有缓冲液(Proprietary Buffer，Rarecells)按照1:10稀释，此Buffer可以裂解红细胞和固定有核细胞；10分钟后，将此血样经过35μm过滤孔径的过滤装置(Molecular Biotechnology，产品号：S1014)或用一次性过滤漏斗(Chemrusdisposable filter funnel，Chemrus，产品号：CR-1008-300，40μm)过滤去除非滋养细胞，即得胎儿滋养细胞。
另外，本发明公开一种上述所述的分离胎儿滋养细胞的方法在产前诊断中的用途。
优选的，采用胎儿滋养细胞进行产前诊断的方法为：收集胎儿滋养细胞后，进行细胞裂解，然后进行单细胞或者少量细胞的全基因组扩增，进行测序或阵列检测，从而得到基因信息。
优选的，胎儿滋养细胞分离及产前诊断的步骤为：A.获得孕妇外周血或尿液；B.固定液固定细胞；C.固定后的细胞经过过滤装置过滤去除非滋养细胞；D.收集滋养细胞后，细胞裂解，进行单细胞或者少量细胞的全基因组扩增；E.进行测序或Array检测，得到基因信息。
其中，步骤B.固定液固定细胞可以省去，可先不固定细胞，先收集到滋养细胞细胞收集后直接进行细胞裂解，也可收集到滋养细胞后固定，利于保存。
其中胎儿滋养细胞分离及产前诊断的具体实验流程图如图1所示。
本发明中少量细胞或者单细胞的全基因组扩增可以采用现有的Multipledisplacement amplification(MDA),Degenerative oligonucleotide primer(DOP-PCR)，Primer extension pre-amplification(PEP)PCR，Multiple Annealing and LoopingBased Amplification Cycles(MALBAC)等方法进行扩增。
为了观察胎儿甲基化的变化，可以先将细胞裂解后，现在一般采用如DNA的亚硫酸盐转化后进行DNA全基因组扩增，扩增方法可以使用上述的MDA,DOP-PCR,PEP PCR和MALBAC等方法进行扩增。DNA检测方法有多种，大致可以分为两类：特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化分析，后者也称为甲基化图谱分析。全基因组的甲基化分析可以采用基于芯片的检测方法，高通量测序，现在一般采用如DNA的亚硫酸盐转化与目标基因组捕获和测序进行检测，飞行质谱如Sequenom公司的MassARRAY平台用于甲基化检测。此方法在收集后的胎儿细胞可以检测genomic DNA和DNA甲基化，还可以检测RNA、small RNA和蛋白等，如RNA扩增可以采用线性扩增或非线性扩增的方法，可以采用Clontech公司的SMARTer的RNA扩增。全基因扩增后可以采用芯片，目标基因组捕获和第二代或第三代测序平台进行测序进行检测检测，如illumina公司提供的测序平台。测序结果处理后，要与数据库进行比对，我们建立和发展了新的数据库，里面包含了7000多种单基因疾病的SNP位点，根据这些SNP位点的基因型信息，可检测出胎儿是否含有致病SNP，从而提供遗传信息。根据中国人遗传病的发病率，另外我们还设计了针对中国人群的遗传发病率相对高新的数据库。
我们所采取的产前诊断方法不是如现有技术所述采用母亲外周血游离DNA，而是采用母亲外周血中的胎儿细胞。此产前诊断方法除了继续拥有无创性以外，还拥有几大特殊的优势：第一，细胞中的全基因组，使得所能检测的遗传疾的数目不再局限于三种；理论上可以检测所有的遗传病，包括单基因疾病和多基因疾病的异常，以及一些胎儿基因组中的微细变化，尤其是一些导致严重疾病或发育障碍的基因异常；第二，胚胎滋养细胞在第5周即可出现在母体外周血中，参考文献：【Mouawia H1,Saker A,Jais JP,Benachi A,Bussières L,Lacour B,Bonnefont JP,Frydman R,Simpson JL,Paterlini-BrechotP.Circulatingtrophoblastic cells provide genetic diagnosis in 63 fetuses atrisk for cystic fibrosis or spinal muscular atrophy.Reprod Biomed Online.2012Nov；25(5):508-20】，这使得做出诊断的时间点大大提前，到正常的人工流产期，对母亲的健康影响较小；第三，分析方法更为简单直接准确，由于样本中只有胎儿细胞的DNA，没有母亲的DNA，所以不再像母亲外周血游离DNA那样在分析中受到母亲DNA的数据干扰，对数据分析方法的要求大为降低，准确率也会大为提高。
目前没有成熟的无创胎儿完整基因组的获取技术，与现有的胎儿遗传物质获取方法(羊水穿刺取细胞及分离外周血游离DNA片断)相比，本发明具有如下有益效果：1、及早性：最早可在孕5周进行遗传检测，对相关疾病可做到早发现早预防早治疗，而羊水穿刺一般要到15周后胎儿发育足够大后才能进行；2、经济实用性；现有的胎儿细胞富集方法存在操作过程繁琐、价格昂贵、实用性较差的缺陷，而本发明方法的成本比往胎儿全基因组获取方法更为简单、经济、操作方便，具有广泛的经济实用性和临床推广价值；3、精确性：可从母亲的外周血液中，精确找出胎儿的细胞，而分离孕妇外周血的游离DNA方法会受到母源基因的干扰，只能对特定的基因区域或疾病进行遗传检测；4、普适性：通过提取纯化胎儿游离DNA或(和)RNA的方法，无法获得完整的胎儿基因组，而且容易为母源基因污染，而本发明能获取源自胎儿的完整全基因组DNA，可进行大量的单个和全基因组水平上的各单基因病诊断、个体药物耐受性、多基因病致病风险甚至细胞遗传学分析(染色体缺失及微缺失、重复、易位等重组)等遗传诊断，无需为诊断不同的遗传病而设计不同的遗传检测方案；本发明仅需要少数几个，或一个滋养细胞就能完成胎儿基因组的提取，避免了由于细胞数量不足导致的检测失败，不仅大大提高了产前检查的成功率，更节省了资源消耗。本发明可精确获得胎儿来源的全基因组DNA，为无创性产前遗传诊断应用提到了物质基础，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为胎儿滋养细胞分离及产前诊断的具体实验流程。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 Genomic DNA的分析
1)、母体外周血胎儿滋养细胞的分离
取妊娠5～38周孕妇外周静脉血1～20ml,优选妊娠8～15周，最佳采血量为10ml,将10ml血收集至EDTA抗凝管(产品号：366643，BD)内；在采血4小时内，将10ml血加入Proprietary Buffer(Rarecells)按照1:10稀释，此Buffer可以裂解红细胞和固定有核细胞；10分钟后，将此血样经过35μm过滤孔径的过滤装置(Molecular Biotechnology，产品号：S1014)或用Chemrus disposable filter funnel(Chemrus,产品号：CR-1008-300，40μm)过滤去除非滋养细胞；若镜下仍有其它细胞，比如淋巴细胞，粒细胞等，可多次重复过滤，直到得到纯的母体外周血胎儿滋养细胞；
2)、细胞裂解和DNA扩增
收集胎儿单个细胞或少量细胞后，可以使用市场上的DNA扩增试剂盒，如GenomePlex WGA4(Sigma Aldrich)，PicoPLEX WGA(Rubicon Genomics)和REPLI-g SingleCell Kit(QIAGEN),按照试剂盒的说明书来进行细胞裂解和扩增；
3)、检测基因型或测序
将扩增的后的DNA进行纯化后定量，后续可以做基因测序或基因芯片检测，可以获得全基因组的信息，也可以用我们自己建立和发展了新的芯片筛查技术，里面包含了7000多种单基因疾病的SNP位点；
4)、数据分析和遗传基因信息报告
我们建立了现有的单基因疾病的数据库，里面包含了7000多种单基因疾病。根据SNP芯片或者测序的结果可以得出单SNP的信息，根据数据库可以判断出此胎儿是否含有致病的单基因疾病，根据这些结果整理出报告。
实施例2 RNA表达的分析
1)、母体外周血胎儿滋养细胞的分离
取妊娠5～38周孕妇外周静脉血1～20ml,优选妊娠8～15周，最佳采血量为10ml，将10ml血收集至EDTA抗凝管(产品号：366643，BD)内。在采血4小时内，将10ml血加入Proprietary Buffer(Rarecells)按照1:10稀释，此Buffer可以裂解红细胞和固定有核细胞。10分钟后，将此血样经过35μm过滤孔径的过滤装置(Molecular Biotechnology,产品号：S1014)或用Chemrus disposable filter funnel(Chemrus,产品号：CR-1008-300，40μm)过滤去除非滋养细胞。若镜下仍有其它细胞，比如淋巴细胞，粒细胞等，可多次重复过滤，直到得到纯的母体外周血胎儿滋养细胞；
2)、细胞裂解，RT逆转录和RNA扩增
收集胎儿单个细胞或少量细胞后，可以采用Clontech公司的试剂盒SMARTerUltra Low kits(SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing)，按照试剂盒说明书进行样品制备，包括细胞裂解，SMARTer逆转录第一条链的合成，双链LD-PCR的扩增，纯化和定量，以及测序文库的制备；
3)、检测基因型或测序
可以全基因组测序，如二代测序仪illumina平台，三代测序仪如PacificBioscience等进行测序，测序后分析，Mapping后，进行RNA表达的分析。
实施例3 DNA甲基化的分析
1)、母体外周血胎儿滋养细胞的分离
取妊娠5～38周孕妇外周静脉血1～20ml,优选妊娠8～15周，最佳采血量为10ml,将10ml血收集至EDTA抗凝管(产品号：366643，BD)内。在采血4小时内，将10ml血加入Proprietary Buffer(Rarecells)按照1:10稀释，此Buffer可以裂解红细胞和固定有核细胞。10分钟后，将此血样经过35μm过滤孔径的过滤装置(Molecular Biotechnology,产品号：S1014)或用Chemrus disposable filter funnel(Chemrus,产品号：CR-1008-300，40μm)过滤去除非滋养细胞，若镜下仍有其它细胞，比如淋巴细胞，粒细胞等，可多次重复过滤，直到得到纯的母体外周血胎儿滋养细胞；
2)、细胞裂解，RT逆转录和RNA扩增
收集胎儿单个细胞或少量细胞后，可以采用Clontech公司的试剂盒SMARTerUltra Low kits(SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing)，按照试剂盒说明书进行样品制备，包括细胞裂解，SMARTer逆转录第一条链的合成，双链LD-PCR的扩增，纯化和定量，以及测序文库的制备。
3)、检测基因型或测序
可以全基因组测序，如二代测序仪illumina平台，三代测序仪如PacificBioscience等进行测序，测序后分析，Mapping后，进行DNA甲基化的分析。
实施例4 Small RNA的分析
1)、母体外周血胎儿滋养细胞的分离
取妊娠5～38周孕妇外周静脉血1～20ml,优选妊娠8～15周，最佳采血量为10ml,将10ml血收集至EDTA抗凝管(产品号：366643，BD)内。在采血4小时内，将10ml血加入Proprietary Buffer(Rarecells)按照1:10稀释，此Buffer可以裂解红细胞和固定有核细胞。10分钟后，将此血样经过35μm过滤孔径的过滤装置(Molecular Biotechnology,产品号：S1014)或用Chemrus disposable filter funnel(Chemrus,产品号：CR-1008-300，40μm)过滤去除非滋养细胞。若镜下仍有其它细胞，比如淋巴细胞，粒细胞等，可多次重复过滤，直到得到纯的母体外周血胎儿滋养细胞；
2)、细胞裂解，RT逆转录和RNA扩增
收集胎儿单个细胞或少量细胞后，经过细胞裂解裂解后，检测胎儿的smallRNA可用TruSeq Small RNA Library Prep Kit(illumina)进行Library制备，此试剂盒包括链接adapter,逆转录，PCR扩增，胶纯化来制备样品；
3)、检测基因型或测序
可以全基因组测序，如二代测序仪illumina平台，三代测序仪等进行测序，测序后分析，Mapping后，进行small RNA的分析。
实施例5 蛋白检测
1)、母体外周血胎儿滋养细胞的分离
取妊娠5～38周孕妇外周静脉血1～20ml,优选妊娠8～15周，最佳采血量为10ml,将10ml血收集至EDTA抗凝管(产品号：366643，BD)内。在采血4小时内，将10ml血加入Proprietary Buffer(Rarecells)按照1:10稀释，此Buffer可以裂解红细胞和固定有核细胞。10分钟后，将此血样经过35μm过滤孔径的过滤装置(Molecular Biotechnology,产品号：S1014)或用Chemrus disposable filter funnel(Chemrus,产品号：CR-1008-300，40μm)过滤去除非滋养细胞。若镜下仍有其它细胞，比如淋巴细胞，粒细胞等，可多次重复过滤，直到得到纯的母体外周血胎儿滋养细胞；
2)、细胞裂解和蛋白的质谱检测
收集胎儿单个细胞或少量细胞后，可以采用质谱的方法来检测蛋白水平参考文献：【Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cellfates in the 16-cell embryo，Rosemary M.Onjiko,Sally A.Moody,and PeterNemesa.Proc Natl Acad Sci U S A.2015 May 26；112(21):6545–6550.】。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.胎儿滋养细胞在制备产前诊断药物或试剂盒中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述胎儿滋养细胞源自孕妇的外周血或尿液。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述孕妇为妊娠5～38周的孕妇。
4.一种分离胎儿滋养细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)获取孕妇的外周血或尿液；
2)过滤去除所述外周血或尿液中的非胎儿滋养细胞，即得胎儿滋养细胞。
5.如权利要求4所述的分离胎儿滋养细胞的方法，其特征在于，所述步骤1)和步骤2)之间还设有固定所述外周血或尿液中的细胞的步骤。
6.如权利要求4所述的分离胎儿滋养细胞的方法，其特征在于，所述步骤2)中，通过固定液固定所述外周血或尿液中的细胞，所述固定液包括Rarecells公司的Proprietarybuffer---中的至少一种，固定细胞这个步骤可以省去，可先不固定细胞，先收集到滋养细胞细胞收集后直接进行细胞裂解，也可收集到滋养细胞后固定，利于保存。
7.如权利要求4所述的分离胎儿滋养细胞的方法，其特征在于，所述过滤去除所述外周血或尿液中的非胎儿滋养细胞的步骤反复进行多次。
8.如权利要求4所述的分离胎儿滋养细胞的方法，其特征在于，所述步骤3)中，过滤采用过滤装置进行，所述过滤装置的过滤孔径大小为大于30μm且小于80μm。
9.如权利要求7所述的分离胎儿滋养细胞的方法，其特征在于，所述孔径大小为35μm。
10.如权利要求4所述的分离胎儿滋养细胞的方法，其特征在于，所述孕妇为妊娠5～38周的孕妇。
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