JPWO2016021310A1 - 胎児の染色体の検査方法 - Google Patents
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Abstract
母体血から胎児由来の有核赤血球を確実に取得し、効率よく短時間で胎児由来の有核赤血球を検査する胎児の染色体の検査方法を提供する。妊娠母体から母体血を取得する採取工程と、母体血中の有核赤血球を濃縮する濃縮工程と、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血中の有核赤血球を、核の形状、および、400〜650nmの光波長域に含まれる波長における分光特性により、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球に選別する選別工程と、有核赤血球の染色体の核酸を増幅する増幅工程と、有核赤血球の増幅産物の量を確定する確定工程と、胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する決定工程と、を有する。
Description
本発明は、胎児の染色体の検査方法に係り、特に、妊娠母体の血液から採取した胎児由来の赤血球を用いて検査を行う胎児の染色体の検査方法に関する。
出生前診断として、従来より、羊水穿刺により羊水中の胎児細胞の染色体を調べる羊水検査が行われている。しかしながら、この方法では、流産の可能性のあることが大きな問題として指摘されている。
一方、妊娠母体(以下、単に「母体」ともいう)の血液中に胎児細胞が移行し、この胎児細胞が母体中を血液とともに循環していることが最近わかってきた。そこで、母体血を用いて、母体血中の胎児細胞の染色体のDNA(デオキシリボ核酸:deoxyribonucleic acid)を再現性よく確実に分析することができれば、流産の可能性の低い安全な出生前診断を実現することができることとなる。
しかしながら、母体の血液中に存在する胎児細胞(有核赤血球)は、母体血数mL(1mL=10−6m3)中に1個程度しか存在しない。このように非常に少ない胎児細胞(有核赤血球)を確実に取得することが、母体血を利用した出生前診断を行う上で非常に大きな課題である。
このような課題に対して、下記の特許文献1、および、非特許文献1では、有核赤血球を濃縮する方法、例えば、密度勾配遠心分離を用いて、血漿成分、および母親の赤血球成分を取り除く技術、白血球の表面の蛋白質に特異的に免疫反応する抗体を用いて、磁気により母親の白血球を分離する技術(MACS法:Magnetic activated cell sorting)、胎児ヘモグロビンのγ鎖に特異的に免疫反応する抗体と蛍光色素を用いて胎児の有核赤血球を分離する技術(FACS法:Fluorescence activated cell sorting)などを用いて、母体血中の胎児細胞である有核赤血球を取得することが行われている。これらの方法は、胎児由来の有核赤血球を濃縮し、目的の細胞を取得する確率を高めるのに有用な技術である。
また、光学的な情報を用いて、細胞の種類を識別し、求める細胞を取得する技術が開示されている。例えば、特許文献2には、細胞質を染色して透過可視光の吸収画像を生成し、励起光を照射して核の蛍光画像を形成し、細胞質と核のコントラスト画像を用いて有核赤血球を判別することが記載されている。また、特許文献3には、ヘモグロビンの最大波長域付近の波長の光を用いて測定を行い、血球の種別を判別する血球種判別装置が記載されている。特許文献4には、生体組織の光学的性質を利用した生体情報分析装置が記載されている。非特許文献2には、胎児由来の有核赤血球を濃縮し、細胞の形態情報から胎児由来の有核赤血球を識別する方法が開示されている。
また、胎児細胞(有核赤血球)を取得した後、胎児における染色体異常を検出する方法として、特許文献5に、胎児細胞の染色体を増幅し、増幅産物の量を確定し、染色体不均衡による疾患を検出する方法が記載されている。
鈴木稚子、他「母体血からの有核赤血球の濃縮と自動解析による同定の効率化」昭和医学会雑誌 第72巻 第4号〔471-478頁,2012〕
D.Cha et al., "A simple and sensitive erythroblast scoring system to identify fetal cells in maternal blood", Prenat Diagn 2003; 23: 68-73
このように、妊娠母体の母体血から胎児由来の有核赤血球を選択する方法が各種検討されているが、出生前診断を効率よく行うためには、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球を分離し、胎児由来の有核赤血球を確実に取得する方法が求められている。上記先行技術文献に記載されている方法は、母体血中から胎児由来の有核赤血球を取得する確率を上げることはできるが、母体由来の有核赤血球または胎児由来の有核赤血球であるかは、染色体を検査するまでわからなかった。したがって、検査を行った細胞が母体由来の有核赤血球であった場合、胎児由来の有核赤血球を選別するまで、染色体の検査を行う必要があり、再度、検査を行うため時間がかかっていた。
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、母体血から確実に胎児由来の有核赤血球を取得し、効率よく短時間で胎児由来の有核赤血球を検査することができる胎児の染色体の検査方法を提供することを目的とする。
本発明は前記目的を達成するために、妊娠母体から母体血を取得する採取工程と、母体血中の有核赤血球を濃縮する濃縮工程と、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血中の有核赤血球を、核の形状、および、400〜650nmの光波長域に含まれる波長における分光特性により、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球に選別する選別工程と、少なくとも胎児由来の有核赤血球の染色体の核酸を増幅する増幅工程と、増幅工程により増幅した少なくとも胎児由来の有核赤血球の増幅産物の量を確定する確定工程と、確定した増幅産物の量と、母体の染色体、または、異常がないことが既知の胎児の染色体の増幅産物との比較により、胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する決定工程と、を有する胎児の染色体の検査方法を提供する。
本発明の胎児の染色体の検査方法によれば、妊娠母体中に含まれる母体由来の有核赤血球と、胎児由来の有核赤血球と、を核の形状、および、400〜650nmの光波長域における分光特性により選別することで、確実に胎児由来の有核赤血球に選別することができる。したがって、母体血を用いた遺伝子による胎児の染色体の検査を効率良く、確実に行うことができる。
本発明の別の態様においては、選別工程は、少なくとも核の形状により有核赤血球候補を選別する第1の選別工程と、第1の選別工程により選別された有核赤血球候補を、分光特性により選別を行う第2の選別工程と、からなることが好ましい。
この態様によれば、選別工程を核の形状により有核赤血球候補を選別する工程を含む第1の選別工程と、分光特性により有核赤血球候補を選別する第2の選別工程と、を有しているから、異なる方法で有核赤血球の選別を行うことで、確実に胎児由来の有核赤血球を選別することができる。また、第1の選別工程で、核の形状により選別を行うことで、核のない赤血球を除くことができ、有核赤血球を選別することができる。有核赤血球を選別した後、分光特性により胎児由来の有核赤血球および母体由来の有核赤血球を選別することで、効率よく胎児由来の有核赤血球を選別することができる。
本発明の別の態様においては、第1の選別工程は、有核赤血球候補となる細胞の細胞質の面積をC、有核赤血球候補となる細胞の核の面積をN、有核赤血球候補となる細胞の核に外接する円形の直径の長さまたは楕円形の長径の長さをLとしたとき、(1)式(式1ともいう)および(2)式(式2ともいう)を満たす有核赤血球候補を選択する工程を含むことが好ましい。
0.25<N/C<1.0 (1)
0.65<N/(L×L)<0.785 (2)
この態様は、核の形状による選別の具体的な条件を規定したものであり、(1)式は細胞質と核の面積比率、(2)式は核の円形度合いを規定したものである。上記(1)式、および(2)式の条件の核を有する細胞は赤血球である可能性が高いため、分光特性による選別で、胎児由来の有核赤血球を選択する可能性を高めることができる。
0.65<N/(L×L)<0.785 (2)
この態様は、核の形状による選別の具体的な条件を規定したものであり、(1)式は細胞質と核の面積比率、(2)式は核の円形度合いを規定したものである。上記(1)式、および(2)式の条件の核を有する細胞は赤血球である可能性が高いため、分光特性による選別で、胎児由来の有核赤血球を選択する可能性を高めることができる。
本発明の別の態様においては、第1の選別工程は、さらに、2つの工程からなり、第1の工程は核を有する可能性のある細胞を抽出し、第2の工程は、第1の工程で抽出した細胞から(1)式および(2)式により有核赤血球候補を選別することが好ましい。
この態様によれば、第1の選別工程が、さらに2つの工程からなり、第1の工程で核を有する可能性のある細胞を抽出することで粗ふるいし、第2の工程で上記(1)式、(2)式に基づいて形状情報で選別することで、より確実に胎児由来の有核赤血球を選別することができる。
第1の工程の「核を有する可能性のある細胞を抽出する」方法としては、例えば、細胞を白色光で撮影して得られた画像の輝度情報を所定の閾値で2値化し、2値化した画像から点状および島状の連続領域を抽出する。そして、連続領域のうち、大きさが1〜5μmのものを細胞核である可能性がある領域とし、該領域を含む細胞を、細胞核を有する可能性のある細胞とする。大きさとしては、例えば、連続領域に外接する最小楕円の長径とすることができる。なお、2値化した画像は、Erosion・Dilationなどのモルフォロジー処理を施して、連続領域の形状を整えた上で、大きさを求めてもよい。
本発明の別の態様においては、分光特性が、吸収係数であることが好ましい。
分光特性として吸収係数を用いることで、赤血球中に含まれるヘモグロビンの酸化ヘモグロビンと還元ヘモグロビンの吸収係数の差を用いて選別を行うことができる。
本発明の別の態様においては、選別工程は、胎児由来の有核赤血球の吸光度が母体由来の有核赤血球の吸光度を超える第1の光波長域の波長と、母体由来の有核赤血球の吸光度が胎児由来の有核赤血球の吸光度を超える第2の光波長域の波長とを含む、少なくとも2種類以上の各々の波長で有核赤血球の吸光度を測定することが好ましい。
この態様によれば、まず、第一に、選別する有核赤血球(胎児由来の有核赤血球の候補となる細胞)が、ヘモグロビンの吸収係数を有するかどうかの選別が可能となり、ヘモグロビンの吸収係数をもたない白血球由来の細胞を除外することが可能となる。次に、ヘモグロビンの吸収係数をもつ細胞において、選別工程で用いられる波長を、胎児由来の有核赤血球の吸光度が母体由来の有核赤血球の吸光度より高い第1の波長域と、母体由来の有核赤血球の吸光度が胎児由来の有核赤血球の吸光度より高い第2の波長域と、から選ばれる各々の波長で測定することで、それぞれの波長の吸光度において、胎児由来の有核赤血球の吸光度と母体由来の有核赤血球の吸光度とで大きさが逆転することになる。したがって、各々の波長で測定した吸光度を比較することで、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球との差を明確にすることができ、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球を選別することができる。吸光度の比較としては、各々の波長で測定した吸光度の比を求めることで、吸光度の比の差が大きくなり選別することができる。
なお、3種類以上の各々の波長で測定することにより、ノイズの影響を低減することができる。3種類以上の波長を用いる場合は、波長をずらした複数波長において吸光度を測定し、それらの平均値を選別に用いる吸光度とすることで、ノイズの影響を低減することができる。
本発明の別の態様においては、選別工程は、母体由来の有核赤血球と、胎児由来の有核赤血球とを2種類以上の各々の波長で測定した吸光度の違いに基づいて、胎児由来の有核赤血球である可能性に順位をつけることが好ましい。
この態様によれば、2種類以上の波長を用いて測定することにより、それぞれの波長で、胎児由来の有核赤血球と母体由来の有核赤血球の差を求めることができる。したがって、これらの吸光度の違いから、胎児由来の有核赤血球である可能性に順位をつけることができるので、この順位に基づいて胎児由来の有核赤血球を選別することで、複数の有核赤血球である候補細胞の中から胎児由来の有核赤血球を精度良く選別することができる。
本発明の別の態様においては、第1の光波長域は、450nmを超え480nm未満の波長域であり、第2の光波長域は、550nmを超え575nm未満の波長域であることが好ましい。
この態様は、分光特性の測定に用いられる第1の光波長域、および、第2の光波長域を具体的に規定したものであり、この範囲の光波長域の波長を用いることで、吸光度の大きさを逆転することができ、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球との光学特性の差異を明確にすることができる。
本発明の別の態様においては、濃縮工程は、密度勾配遠心分離法により行うことが好ましい。
この態様によれば、濃縮工程を密度勾配遠心分離法により行うことで、細胞を壊すことなく、母体血中の有核赤血球の濃度を高くすることができる。
本発明の胎児の染色体の検査方法によれば、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とを、確実に選別することができるので、母体血を用いた胎児の遺伝子検査を、確実に効率よく行うことができる。
以下、添付図面に従って、本発明に係る胎児の染色体の検査方法について説明する。なお、本明細書において「〜」とは、その前後に記載される数値を下限値および上限値として含む意味で使用される。
[胎児の染色体の検査方法]
図1は、本実施形態における胎児の染色体の検査方法の手順を示したフローチャート図である。本実施形態の胎児の染色体の検査方法は、妊娠母体から母体血を採取する採取工程(ステップS12)と、母体血中の有核赤血球を濃縮する濃縮工程(ステップS14)と、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血中の有核赤血球を、核の形状、および、400〜650nmの光波長域における分光特性により、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別する選別工程(ステップS16)と、少なくとも胎児由来の有核赤血球の染色体の核酸を増幅する増幅工程(ステップS18)と、増幅工程により増幅した少なくとも胎児由来の有核赤血球の増幅産物の量を確定する確定工程(ステップS20)と、確定した増幅産物の量を、母体の染色体、または、異常がないことが既知の胎児の染色体との比較により、胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する決定工程(ステップS22)と、を有する。以下、各工程について詳説する。
図1は、本実施形態における胎児の染色体の検査方法の手順を示したフローチャート図である。本実施形態の胎児の染色体の検査方法は、妊娠母体から母体血を採取する採取工程(ステップS12)と、母体血中の有核赤血球を濃縮する濃縮工程(ステップS14)と、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血中の有核赤血球を、核の形状、および、400〜650nmの光波長域における分光特性により、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別する選別工程(ステップS16)と、少なくとも胎児由来の有核赤血球の染色体の核酸を増幅する増幅工程(ステップS18)と、増幅工程により増幅した少なくとも胎児由来の有核赤血球の増幅産物の量を確定する確定工程(ステップS20)と、確定した増幅産物の量を、母体の染色体、または、異常がないことが既知の胎児の染色体との比較により、胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する決定工程(ステップS22)と、を有する。以下、各工程について詳説する。
<採取工程(ステップS12)>
採取工程は、血液試料である母体血を採取する工程である。母体血としては、侵襲のおそれのない妊娠母体の末梢血であることが好ましい。
採取工程は、血液試料である母体血を採取する工程である。母体血としては、侵襲のおそれのない妊娠母体の末梢血であることが好ましい。
母体の末梢血には、母体由来の好酸球、好中球、好塩基球、単核球、リンパ球等の白血球や、核のない成熟した赤血球に加えて、母体由来の有核赤血球、そして胎児由来の有核赤血球が含まれる。胎児由来の有核赤血球は、妊娠後、6週程度から母体血中に存在するといわれている。出生前診断を行う本実施形態においては、妊娠後6週程度以降の母体の末梢血を検査する。
胎児由来の有核赤血球は、胎盤を通過して、母体の血液中に存在する赤血球前駆体である。母体が妊娠中には、胎児の赤血球は有核であり得る。この赤血球には染色体が存在するため、侵襲性が低い手段で、胎児由来の染色体および胎児遺伝子の入手が可能となる。この胎児由来の有核赤血球は、母体血中の細胞の106個に1個の割合で存在しているといわれており、母体の末梢血中には非常に存在確率が少ない。
<濃縮工程(ステップS14)>
次に、濃縮工程により、採取工程で採取した母体血中の有核赤血球の濃縮を行う。濃縮工程は、密度勾配遠心分離法により行うことが好ましい。
次に、濃縮工程により、採取工程で採取した母体血中の有核赤血球の濃縮を行う。濃縮工程は、密度勾配遠心分離法により行うことが好ましい。
〔密度勾配遠心分離法〕
密度勾配遠心分離法は、血液中の成分の密度の差により分離する方法であり、分離する成分の密度値を挟むように、第1の媒体および第2の媒体を選択することで、遠心分離後の第1の媒体と第2の媒体の間の界面に目的の成分(本実施形態においては、胎児由来の有核赤血球)を集めることができる。そして、この第1の媒体と第2の媒体の間の界面に存在する画分を採取することで、有核赤血球が濃縮された血液を得ることができる。
密度勾配遠心分離法は、血液中の成分の密度の差により分離する方法であり、分離する成分の密度値を挟むように、第1の媒体および第2の媒体を選択することで、遠心分離後の第1の媒体と第2の媒体の間の界面に目的の成分(本実施形態においては、胎児由来の有核赤血球)を集めることができる。そして、この第1の媒体と第2の媒体の間の界面に存在する画分を採取することで、有核赤血球が濃縮された血液を得ることができる。
具体的には、遠沈管の底部に第1の媒体を注入する工程と、第1の媒体を収めた遠沈管を冷却する工程と、遠沈管内の冷却された第1の媒体の上に第2の媒体を積層する工程と、遠沈管内の第2の媒体の上に血液試料である母体の末梢血を積層する工程と、遠沈管に収容された第1の媒体、第2の媒体および血液試料を遠心分離にかける工程と、遠心分離後の第1の媒体と第2の媒体の間の層から、胎児由来の有核赤血球を含む画分を採取する工程と、を含む方法で有核赤血球の濃縮を行うことができる。
国際公開WO2012/023298号公報には、胎児の有核赤血球を含めた母体の血液の密度が記載されている。その記載によると、想定される胎児由来の有核赤血球の密度は、1.065〜1.095g/mL程度、母体の血球の密度は、赤血球が1.070〜1.120g/mL程度、好酸球は1.090〜1.110g/mL程度、好中球は1.075〜1.100g/mL程度、好塩基球が、1.070〜1.080g/mL程度、リンパ球が、1.060〜1.080g/mL程度、単核球が、1.060〜1.070g/mL程度である。密度の数値に関して、グラム毎ミリリットル[g/mL]で表される単位からSI単位系への換算は容易であり、1グラム毎ミリリットル[g/mL]は、1000キログラム毎立方メートル[kg/m3]である。
積層する媒体(第1の媒体および第2の媒体)の密度は、密度が1.065〜1.095g/mL程度の胎児由来の有核赤血球を、母体中の他の血球成分と分離するために、設定される。胎児由来の有核赤血球の中心の密度は、1.080g/mL程度であるため、この密度を挟む2つの異なる密度の媒体を作成し、隣接して重層することで、その界面に所望の胎児由来の有核赤血球を集めることが可能となる。好ましくは、第1の媒体の密度を1.08g/mL以上1.10g/mL以下、第2の媒体の密度は1.06g/mL以上1.08g/mL以下として設定することが好ましい。更に好ましくは、第1の媒体の密度を1.08g/mL以上1.09g/mL以下、第2の媒体の密度を1.065g/mL以上1.08g/mL以下である。具体的な例としては、第1の媒体の密度を1.085g/mL、第2の媒体の密度を1.075g/mLに設定することで、血漿成分、および好酸球、単核球を、回収する所望の画分から分離することが可能となる。また、赤血球、好中球、リンパ球の一部も分離することが可能となる。本発明では、第1の媒体と、第2の媒体は同じ種類でも、異なる種類でも、本発明の効果を実現できる限りにおいて制限はないが、同じ種類の媒体を用いることが好ましい態様である。
濃縮工程で用いられる、第1の媒体および第2の媒体としては、ポリビニルピロリドンでコートされた直径15〜30nmのケイ酸コロイド粒子分散液であるPercoll(登録商標)、ショ糖から作られた側鎖に富んだ中性の親水性ポリマーであるFicoll(登録商標)-Paque、ポリスクロースとジアトリゾ酸ナトリウムによる溶液であるHistopaque(登録商標)等の媒体を使用することができる。本実施形態では、Percoll(登録商標)、およびHistopaque(登録商標)を好ましく使用することができる。Percoll(登録商標)は、密度(比重)1.130の製品が市販されており、希釈することで目的とする密度(比重)の媒体を調製することが可能である。Histopaque(登録商標)は、市販されている密度1.077の媒体と、密度1.119の媒体を用いて、第1の媒体および第2の媒体を所望の密度に調製することが可能である。
〔他の濃縮方法〕
有核赤血球を濃縮する方法として、上記の密度勾配遠心分離法の他に、通常の白血球の抗原であるCD45(CD: Cluster of Differentiation)(CD分類に基づくモノクローナル抗体の分類番号)に特異的に結合する抗体を利用し、磁気効果を用いて、白血球を分離することで、有核赤血球を濃縮することもできる。
有核赤血球を濃縮する方法として、上記の密度勾配遠心分離法の他に、通常の白血球の抗原であるCD45(CD: Cluster of Differentiation)(CD分類に基づくモノクローナル抗体の分類番号)に特異的に結合する抗体を利用し、磁気効果を用いて、白血球を分離することで、有核赤血球を濃縮することもできる。
<選別工程(ステップS16)>
選別工程は、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血中の有核赤血球を、核の形状および分光特性により、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別する工程である。
選別工程は、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血中の有核赤血球を、核の形状および分光特性により、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別する工程である。
濃縮工程で濃縮された有核赤血球を含む末梢血には、有核赤血球の他に、白血球などの他の血液成分も含まれる。白血球などの血液成分は、濃縮工程により、母体血から除くことができるが、完全に除去することは困難であるため、選別工程において、核の形状により選別を行う第1の選別工程と、分光特性により選別を行い第2の選別工程により、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球を選別する。
選別工程は、濃縮工程で濃縮された有核赤血球を含む末梢血を、透明基板、好ましくは、スライドガラス上に塗布し、分析用の標本を作製し、分析用の標本を用いて行われる。
(細胞の形状の情報による選別)
上記分析用の標本を用いて、まず細胞の形状の情報(以下、「細胞の形状」ともいう)により胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球を選別する。
上記分析用の標本を用いて、まず細胞の形状の情報(以下、「細胞の形状」ともいう)により胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球を選別する。
細胞の形状の情報による選別としては、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合、核の円形度合い、核領域の面積、核の明度、核のつぶれ方、などを挙げることができる。なかでも、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合、および、核の円形度合いを満たす条件を有する細胞を、胎児由来の有核赤血球候補として選別することが好ましい。細胞質の面積、及び核領域の面積は、分析用の標本の観察される面における面積である。
図2は、選別工程における細胞の形状(核の形状)により選別を行う第1の選別工程の一例の手順を示したフローチャート図である。
細胞の形状による選別は、まず、細胞を抽出する(ステップS32)。細胞であるか否かの判断は、2値化画像を用いて行われる。白色光光源を用いて分析用の標本を撮影して得られた画像の輝度情報を所定の閾値を用いて2値化画像を生成し、生成された2値化画像から点状および島状の連続領域を有するもの、すなわち、任意の閉曲線で閉じられている領域を細胞として抽出する。
次に、ステップS32で抽出した細胞を核の有無により選択する(ステップS34)。核の有無は、細胞内に核(点状物)が存在するか否かにより選別する。核の有無の判断にも2値化画像を用いることができる。細胞として抽出された領域の中に、細胞として抽出された領域未満の面積を有する任意の閉曲線で閉じられている領域が存在する場合には、当該領域を核として抽出することができる。
次に、細胞の核の大きさ(点状および島状の連続領域の大きさ)が、1〜5μmのものを抽出する(ステップS36)。1〜5μmの大きさの核を有する細胞を選択することは有核赤血球を選別するのに有効である。なお、「点状および島状の連続領域の大きさ」とは、核の外形を表す閉曲線を円形、又は楕円形に近似し、核の外形を近似した円形の直径、又は核の外形を近似した楕円形の長径とすることができる。
核の外形を近似した円形の例として、核の外形を表す閉曲線に外接する円形のうち直径が最小のものが挙げられる。核の外形を近似した楕円形の例として、核の外形を表す閉曲線に外接する楕円形のうち長径が最小のものが挙げられる。核の外形を近似した円形の直径、または、核の外形を近似した楕円形の長径が1〜5μmのものを抽出する。
次に、核の形状により細胞を選別する(ステップS38)。図3Aは、選択したい細胞の形状を示す模式図であり、図3Bは除きたい細胞の形状を示す模式図である。核の形状による選別の具体例として、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合により選別を行う方法、および、核の円形度合いにより選別を行う方法を説明する。細胞質の面積に対する核領域の面積の割合が、下記(1)式を満たす場合に、胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球として選択される。細胞の細胞質の面積をC、細胞の核の面積をNとした場合、Cに対するNの割合が0.25を超え1.0未満の核を有する細胞が胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球として選択される。
0.25<(N/C)<1.0 (1)
また、核の円形度合いの選択条件を満たす場合としては、下記(2)式を満たす場合が挙げられる。核の直径又は核の長径をLとしたとき、核の直径又は核の長径平方に対する核の面積の割合が0.65を超え0.785未満である核を有する細胞が胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球として選択される。なお、核の直径又は核の長径としては、ステップS34で核の大きさを求めた場合と同様の方法により求めることができる。
また、核の円形度合いの選択条件を満たす場合としては、下記(2)式を満たす場合が挙げられる。核の直径又は核の長径をLとしたとき、核の直径又は核の長径平方に対する核の面積の割合が0.65を超え0.785未満である核を有する細胞が胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球として選択される。なお、核の直径又は核の長径としては、ステップS34で核の大きさを求めた場合と同様の方法により求めることができる。
0.65<(N/(L×L))<0.785 (2)
細胞の形状による選別は、ステップS32〜ステップS36による第1の工程で、粗ふるいし、ステップS38による第2の工程で、核の形状により選別を行うことで、画像処理により選別を行う胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球の数を減らすことができ、胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球の選別を効率良く行うことができる。
細胞の形状による選別は、ステップS32〜ステップS36による第1の工程で、粗ふるいし、ステップS38による第2の工程で、核の形状により選別を行うことで、画像処理により選別を行う胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球の数を減らすことができ、胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球の選別を効率良く行うことができる。
形状による選別は、ステップS32〜ステップS38のすべての条件を満たす必要がある。ステップS32〜ステップS38の条件のうち、一つでも満たさないものは、胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球として選択されない。
細胞の形状の情報を用いて胎児由来の有核赤血球の候補なる有核赤血球を選別するシステムの構成例としては、光学顕微鏡、デジタルカメラ、スライドガラス用のステージ、光学搬送系、画像処理PC(personal computer)、制御PC、ディスプレイを装備しているシステムを挙げることができる。光学搬送系は、対物レンズとCCD(Charge Coupled Device)カメラを備え、画像処理PCは、データ解析、データ記憶を行う処理系を備える構成が挙げられる。制御PCは、スライドガラス用のステージの位置制御や、全体の処理を制御する制御系を備える構成が挙げられる。
(光学特性による選別)
光学特性による選別は、赤血球に含まれるヘモグロビンの酸素親和性の違いに起因する分光特性を利用することができる。図4は、還元ヘモグロビン(Hb)と、酸化ヘモグロビン(HbO2)の波長に対する吸収係数を示すグラフ図である(特開2014−1485号公報に記載)。ここで、吸収係数とは、光がある媒質に入射したとき、その媒質がどのくらいの光を吸収するかを示す定数である。図4に示すように、ヘモグロビンは酸素との相互作用によって、吸収係数が変化することが知られている。即ち、酸化ヘモグロビンは赤い色調を有しており、還元ヘモグロビンになるに従い、青味を帯びてくる。
光学特性による選別は、赤血球に含まれるヘモグロビンの酸素親和性の違いに起因する分光特性を利用することができる。図4は、還元ヘモグロビン(Hb)と、酸化ヘモグロビン(HbO2)の波長に対する吸収係数を示すグラフ図である(特開2014−1485号公報に記載)。ここで、吸収係数とは、光がある媒質に入射したとき、その媒質がどのくらいの光を吸収するかを示す定数である。図4に示すように、ヘモグロビンは酸素との相互作用によって、吸収係数が変化することが知られている。即ち、酸化ヘモグロビンは赤い色調を有しており、還元ヘモグロビンになるに従い、青味を帯びてくる。
光学特性による選別においては、胎児由来の有核赤血球が、母親の赤血球、および、わずかに存在する母体由来の有核赤血球に対して、ヘモグロビンの酸素親和性が異なることを利用して母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球と、を選別する。例えば、ガラス基板上に塗布された血液成分を用いることにより、有核赤血球と、この有核赤血球の近傍に存在する赤血球との分光特性の差異を利用して、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別するものである。
分光特性とは、還元ヘモグロビンと酸化ヘモグロビンとの吸収係数の差異の存在する波長域で差を検出するものである。成人の赤血球中のヘモグロビンは、4量体α2β2(HbA)である。一方、胎児の赤血球中のヘモグロビンは、2本のα鎖と2本のγ鎖によって作られた4量体α2γ2(HbF)であり、生後、大部分を占めるHbAと少数のHbFからなるHbA2に置き換わっていくことが知られている。胎盤中では、血液中の妊娠母体のヘモグロビン(HbA)から酸素の提供を受けることで、胎児のヘモグロビンは酸素を得ている。そして、成人の血液中の赤血球に含まれるヘモグロビン(HbA)は、4量体α2β2であるが、胎児型のヘモグロビン(HbF)はα2γ2であり、HbAに比べて酸素親和性が高いという特徴を有する。出生前診断においては、血液試料として妊娠母体の末梢血を採取し、検査を行うことが好ましい。末梢血は、通常、静脈から採取するものであり、静脈中の血液の酸素の量は、動脈中の酸素の量より乏しくなる。健常人では、中心静脈血の酸素飽和度は、60〜80%が正常値といわれており、この値は、全身の酸素需要により上下する。HbAとHbFは、酸素親和性が異なるため、静脈血中においても、HbAとHbFの酸素結合量が異なり、HbFの酸素結合量がHbAの酸素結合量よりも高くなるという特徴を有している。
母体のヘモグロビン(HbA)と胎児のヘモグロビン(HbF)においても、静脈中で酸素親和性に差があり、図4に示すように、還元ヘモグロビンと酸化ヘモグロビンは、吸収係数に差が生じるので、この差を用いて母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球を選別する。吸光度の測定には、400〜650nmの光波長域が適用される。この光波長域から選択される波長を有する少なくとも1つの単色光を用いて吸光度が測定される。
また、吸光度の測定は、異なる波長の複数単色光を用いて、各波長の吸光度を測定し、各波長の測定値の割合を検出することでより確実に有核赤血球の選別を行うことができる。好ましくは、400〜500nmの光波長域から選択された波長の単色光を用いる態様であり、より好ましくは450nmを超え480nm未満の光波長域から選択された波長の単色光、および、550nmを超え575nm未満の光波長域から選択された波長の単色光をそれぞれ用い、各波長の吸光度の割合により選別することが好ましい。また、光波長域は、550nmを超え575nm未満の光波長域から選択された波長の単色光、および、575nmを超え585nm未満の光波長域から選択された波長の単色光をそれぞれ用い、各波長の吸光度の割合により選別することが好ましい。2種類以上の異なる単色光により測定した吸光度の割合を導出することで、個々の細胞間に、細胞の厚みや面積などの細胞間に起因する吸光度の誤差を排除することができる。これらの光波長域は、図4に示すように、酸化ヘモグロビン(HbO2)と還元ヘモグロビン(Hb)とで、吸収係数の差が大きいので、この光波長域を用いることで、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球のとの選別を確実に行うことができる。
また、光学特性により選別する光波長域は、図4に示すグラフの吸収係数が還元ヘモグロビンの吸収係数と酸化ヘモグロビンの吸収係数の大きさが逆転する波長を挟んでそれぞれの光波長域の波長で測定することが好ましい。すなわち、胎児由来の有核赤血球(酸化ヘモグロビンの割合が高い)の吸収係数が、母体由来の有核赤血球(酸化ヘモグロビンの割合が低い)の吸収係数より高い第1の光波長域の波長と、母体由来の有核赤血球の吸収係数が胎児由来の有核赤血球の吸収係数より高い第2の光波長域の波長と、で吸光度を測定する。そして、第1の光波長域の波長で測定した吸光度と、第2の光波長域の波長で測定した吸光度の割合を求め、比較することで、胎児由来の有核赤血球の割合と母体由来の有核赤血球の割合の差を大きくすることができるので、胎児由来の有核赤血球の選別を確実に行うことができる。
第1の光波長域としては、400nmを超え500nm未満、525nmを超え550nm未満、および、575nmを超え585nm未満の光波長域を挙げることができる。また、第2の光波長域としては、550nmを超え575nm未満の光波長域を挙げることができる。
また、各光波長域で、複数の波長で吸光度を測定し、それら吸光度の平均値を用いて選別を行うこともできる。吸光度の平均値により選別することで、吸光度の測定値に含まれるノイズの影響を低減することができる。
≪第1実施形態≫
図5は、光学特性による選別の第1実施形態の手順を示すフローチャート図である。図6は、吸光度を測定する際の波長の選択方法の説明図である。
図5は、光学特性による選別の第1実施形態の手順を示すフローチャート図である。図6は、吸光度を測定する際の波長の選択方法の説明図である。
まず、細胞の形状により胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球を複数選別する。選別された複数の胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球に対して、光学特性により選別を行うために、吸光度を測定する波長を2種類選択する。例えば、図6の波長λ1、及び波長λ4を選択する。一方の波長λ4で吸光度2を測定する(ステップS52)。同様に、他方の波長λ1で吸光度1を測定する(ステップS54)。上述したように、吸光度を測定する波長を2種類λ1、及びλ4を選択した後、波長λ1からずらした波長λ2および波長λ3、波長λ4からずらした波長λ5および波長λ6のそれぞれについても吸光度を測定する。波長λ1、波長λ2、及び波長λ3で測定した吸光度の平均値を求め、この平均値を吸光度1とし、波長λ4、波長λ5、及び波長λ6で測定した吸光度の平均を求め、この平均値を吸光度2とすることもできる。このように、複数の波長で測定した吸光度の平均値を吸光度1、および、吸光度2とすることで、吸光度の測定値に含まれるノイズの影響を低減することができる。
次に、吸光度1および吸光度2から、細胞が、実際にヘモグロビンを有するかの判別を行う(ステップS56)。ヘモグロビンの有無は、既知のヘモグロビンの波長に対する吸光度と比較することにより判別する。ヘモグロビンを有することで、細胞が有核赤血球であることを確定する。続いて、胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球ごとに吸光度の比(吸光度1/吸光度2)を計算により求め(図5のステップS58)、吸光度の比の値が大きい順に並べる(図5のステップS60)。最後に、それぞれ選択した波長での酸化ヘモグロビンと還元ヘモグロビンの関係を基に、測定した波長、および、酸化ヘモグロビン、還元ヘモグロビンの吸光度から、吸光度の比の理論値を求め、測定した胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球の吸光度の比と比較することで、胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球を、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別する(図5のステップS62)。
≪第2実施形態≫
分光特性により、胎児由来の有核赤血球と母体由来の有核赤血球とを選別する方法として、選別対象の有核赤血球の周囲に存在する核を有さない赤血球を参照赤血球とし、この参照赤血球と比較することで、選別対象の有核赤血球が胎児由来の有核赤血球か、母体由来の有核赤血球かを選別する。参照赤血球を、選別対象の有核赤血球と同じ波長の単色光で吸光度を測定し、その割合を求め、選別する有核赤血球の吸光度の割合と、参照赤血球の吸光度の割合を比較することで、より確実に選別対象の有核赤血球の中から胎児由来の有核赤血球を選別することができる。
分光特性により、胎児由来の有核赤血球と母体由来の有核赤血球とを選別する方法として、選別対象の有核赤血球の周囲に存在する核を有さない赤血球を参照赤血球とし、この参照赤血球と比較することで、選別対象の有核赤血球が胎児由来の有核赤血球か、母体由来の有核赤血球かを選別する。参照赤血球を、選別対象の有核赤血球と同じ波長の単色光で吸光度を測定し、その割合を求め、選別する有核赤血球の吸光度の割合と、参照赤血球の吸光度の割合を比較することで、より確実に選別対象の有核赤血球の中から胎児由来の有核赤血球を選別することができる。
<参照赤血球の選択方法>
参照赤血球の選択は次の方法により行うことができる。図7〜10は、参照赤血球を選択する方法を説明する図であり、図7は参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する方法を説明する図であり、図8は参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する手順を示したフローチャート図である。また、図9は注目している有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定する方法を説明する図であり、図10は注目している有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定する手順を示したフローチャート図である。
参照赤血球の選択は次の方法により行うことができる。図7〜10は、参照赤血球を選択する方法を説明する図であり、図7は参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する方法を説明する図であり、図8は参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する手順を示したフローチャート図である。また、図9は注目している有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定する方法を説明する図であり、図10は注目している有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定する手順を示したフローチャート図である。
{参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する方法}
図7及び8は、参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する方法の説明図である。まず、選別対象の有核赤血球候補30を決定する(図8のステップS72)。選別対象の有核赤血球候補30は、先に説明したように形状により決定することができる。次に、探索する参照血球数を設定する(図8のステップS74)。図8には、探索する参照赤血球を5個とした場合を説明する。次に、選別対象の有核赤血球候補30を中心に、設定された探索する参照血球の数になるまで、参照赤血球32を選択する(図8のステップS76)。参照赤血球32は、選別対象の有核赤血球候補30の中心から、参照赤血球32の中心までの距離Dが短い順に選択される。
図7及び8は、参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する方法の説明図である。まず、選別対象の有核赤血球候補30を決定する(図8のステップS72)。選別対象の有核赤血球候補30は、先に説明したように形状により決定することができる。次に、探索する参照血球数を設定する(図8のステップS74)。図8には、探索する参照赤血球を5個とした場合を説明する。次に、選別対象の有核赤血球候補30を中心に、設定された探索する参照血球の数になるまで、参照赤血球32を選択する(図8のステップS76)。参照赤血球32は、選別対象の有核赤血球候補30の中心から、参照赤血球32の中心までの距離Dが短い順に選択される。
有核赤血球候補30の中心は有核赤血球候補30の平面形状を円形と近似した場合の円形の中心とすることができる。同様に、参照赤血球32の中心は、参照赤血球32の平面形状を円形と近似した場合の円形の中心とすることができる。以下の説明においても同様である。また、有核赤血球候補30の重心から、参照赤血球32の重心までの距離が短い順に参照赤血球を選択してもよい。
なお、図7においては、参照赤血球の選択数を5個で説明しているが、参照赤血球の選択数は2個以上20個以下であることが好ましい。参照赤血球の選択数を上記範囲とし、複数の参照赤血球の光学的な情報を取得して平均することで、選別対象の有核赤血球候補との差異となる基準を、ばらつきなく決定することができる。また、参照赤血球の選択数は、3個以上10個以下とすることがより好ましい。参照赤血球の数は多いほど光学的な情報を平均化することができるので、好ましいが、数が多くなると参照赤血球の測定に時間がかかるので、上記範囲とすることが好ましい。
{選別対象の有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定する方法}
図9、10は、選別対象の有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定する方法の説明図である。かかる方法においても、参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する方法と同様に、まず、選別対象の有核赤血球候補30を決定する(図10のステップS82)。次に、参照赤血球32の探索範囲36を設定する(図10のステップS84)。図9において、探索範囲36は実線により図示する。図9に図示した探索範囲36は、選別対象の有核赤血球候補30の100細胞分(10×10細胞分)とする。
図9、10は、選別対象の有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定する方法の説明図である。かかる方法においても、参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する方法と同様に、まず、選別対象の有核赤血球候補30を決定する(図10のステップS82)。次に、参照赤血球32の探索範囲36を設定する(図10のステップS84)。図9において、探索範囲36は実線により図示する。図9に図示した探索範囲36は、選別対象の有核赤血球候補30の100細胞分(10×10細胞分)とする。
探索範囲36は、選別対象の有核赤血球候補30を中心とした1辺が有核赤血球候補30の10細胞分の正方形、または、直径が10細胞分の円形とすることが好ましい。また、探索範囲36は、段階的に設定しておき、探索範囲36内に参照赤血球が見つからない場合は、探索範囲36を広げていくことが好ましい。例えば、探索範囲36が、一辺が有核赤血球候補30の10細胞分の正方形、または、直径が10細胞分の円形とした場合に、参照赤血球32が見つからない場合は、更に、1辺が20細胞分の正方形、または、直径が20細胞分の円形まで探索範囲を広げて、参照赤血球を決定することが好ましい。
次に、探索範囲36内の核のない赤血球を参照赤血球32として探索する(図10のステップS86)。参照赤血球32として選択する基準は、参照赤血球32の中心、または、重心が探索範囲36内に入っているか否かで判断する。
なお、参照赤血球32の選択数、および、探索範囲36の面積については特に限定されず、任意に設定することが可能である。
図11は、参照赤血球32を選択した後、選別対象の有核赤血球を選別する手順を示すフローチャート図である。
参照赤血球32を選択した後、(1)選別対象の有核赤血球候補30、(2)参照赤血球32、(3)選別対象の有核赤血球候補30および参照赤血球32の周囲34(図7、9に破線で示す)を、選択した波長で吸光度2を測定する(図11のステップS92)。選別する有核赤血球候補30および参照赤血球32の周囲34とは、図7、9においては、対象となる赤血球の周囲の9細胞分(3×3細胞分)の範囲である。同様に、図11のステップS92で選択した波長と異なる波長で、(1)選別する有核赤血球候補30、(2)参照赤血球32、(3)選別する有核赤血球候補30および参照赤血球32の周囲34の吸光度1を測定する(図11のステップS94)。
吸光度1、2を測定後、有核赤血球候補30から有核赤血球候補30の周囲34の吸光度を引くことで、(4)有核赤血球候補30の吸光度1、2の真値を求める。また、参照赤血球32の吸光度から、参照赤血球32のそれぞれ赤血球の周囲34の吸光度を引くことで、(5)参照赤血球32の吸光度1、2の真値を求める(図11のステップS96)。
有核赤血球候補30の吸光度1および吸光度2から、有核赤血球候補30が、実際にヘモグロビンを有するかの判別を行う(図11のステップS98)。ヘモグロビンの有無は、既知のヘモグロビンの波長対する吸光度と比較することにより判別する。ヘモグロビンを有することで、有核赤血球候補30が有核赤血球であることを確定する。
次に、有核赤血球の吸光度の比、参照赤血球の吸光度の比を求める(ステップS100)。有核赤血球の吸光度の比は、「吸光度1の真値/吸光度2の真値」により求める。また、参照赤血球の吸光度の比は、複数の参照赤血球の吸光度1の真値の平均値、および、吸光度2の真値の平均値を求め、この「吸光度1の真値の平均値/吸光度2の真値の平均値」により求めることができる。
最後に、「有核赤血球の吸光度の比/参照赤血球の吸光度の比」を求める(ステップS102)。参照赤血球は、母体由来の有核赤血球であるため、「有核赤血球の吸光度の比/参照赤血球の吸光度の比」の値が、「1」からの差が小さいほど、有核赤血球は、母体由来の有核赤血球である可能性が高く、「1」からの差が大きいほど、胎児由来の有核赤血球である可能性が高く、胎児由来の有核赤血球として選別することができる(ステップS104)。このように、「有核赤血球の吸光度の比/参照赤血球の吸光度の比」を求め、この値の「1」からの差が一番大きく異なる有核赤血球から胎児由来の有核赤血球である可能性に順位をつけることで、胎児由来の有核赤血球の選別を行うことができる。
参照赤血球を選択する方法としては、図7及び図8に図示した参照赤血球数に基づき探索範囲を設定して参照赤血球を選択する方法、図9及び図10に図示した選別対象の有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定して参照赤血球を選択する方法を例示したが、これに限定されず、これらを組み合わせた方法で選別することも可能である。例えば、選別対象の有核赤血球の面積により探索範囲を決定しておき、この範囲内に含まれる赤血球数が予め設定した個数を上回る場合には、すべてを測定することも可能であり、予め設定した個数を選択して測定することも可能である。選択する方法としては、上述したように、選別対象の有核赤血球と参照赤血球との中心同士の距離が短いもの、または、重心同士の距離が短いものから、順次選択する。また、探索範囲内の参照赤血球の数が、予め設定した個数を下回る場合には、下回ることが判明した時点で、探索範囲を拡大して、拡大したことにより増加した面積に含まれる参照赤血球を検出する。この操作を、予め決められた個数の赤血球が得られるまで、繰り返すことが好ましい。
また、参照赤血球との比較により選別する場合は、複数の波長で測定した吸光度の比を用いて選別する方法に限定されず、1種類の波長で吸光度を測定し、選別する有核赤血球と参照赤血球を比較することで判別することもできる。参照赤血球は、母体由来の赤血球であるので、参照赤血球と吸光度の値が近い有核赤血球が母体由来であり、吸光度の値が遠い有核赤血球を胎児由来として判別することができる。
以上の方法により、選別工程により、母体血液中に存在する有核赤血球を胎児由来の有核赤血球と母体由来の有核赤血球とに選別することができる。
<増幅工程(ステップS18)>
増幅工程は、選別工程により選別された少なくとも胎児由来の有核赤血球の染色体に含まれる核酸を増幅する工程である。
増幅工程は、選別工程により選別された少なくとも胎児由来の有核赤血球の染色体に含まれる核酸を増幅する工程である。
選別工程により、選別された胎児由来の有核赤血球は、マイクロマニュピュレータを用いて標本から分離される。標本から分離され取得された細胞からDNAを抽出して、全ゲノム増幅を行う。全ゲノム増幅は、市販のキットを用いて行うことが可能である。
本実施形態で用いる全ゲノム増幅法としては、取得した細胞から、一般的な方法である界面活性剤を用いた細胞溶解、プロテアーゼK等を用いたタンパク質分解工程を経ることで、細胞から溶出することにより得られたゲノムDNAを用いる。
全ゲノム増幅試薬としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR:polymerase chain reaction)に基づく試薬Single cell WGA kit(New England Biolabs社)、GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification kit(Sigma-Aldrich社)、MALBAC法(Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles)(国際公開WO2012/166425A2号公報に掲載)を用いることが出来る。また、鎖置換型DNA合成反応に基づく試薬GenomiPhi(GEヘルスケア社)、REPLI-g(QIAGEN社)も同様に用いることが出来る。本実施形態では、Single cell WGA kit(New England Biolabs社)を用いることが好ましい。
全ゲノム増幅により得られたDNAの増幅産物は、アガロースゲル電気泳動により増幅有無を確認することが好ましい。更に、全ゲノム増幅産物をQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社)を用いて精製することが好ましい。
また、全ゲノム増幅により得られたDNAの増幅産物の濃度について、NanoDrop(Thermo Fisher Scientific社)、BioAnalyzer(Agilent社)を用いて測定することが好ましい。
増幅工程においては、少なくとも胎児由来の有核赤血球の染色体に存在する核酸であるDNAを増幅する。増幅工程の対象物である胎児由来の有核赤血球の数は、少なくとも1つでよいが、複数の胎児由来の有核赤血球から取得した核酸を増幅することが好ましい。更には、後の決定工程で胎児の染色体の数的異常を決定するために、増幅産物の量を比較する基準として、数的異常が存在しない母体由来の有核赤血球の染色体を選択することも好ましい態様である。母体由来の有核赤血球を基準と比較する場合、選別工程により選別した母体由来の有核赤血球の染色体の核酸を増幅することも好ましい態様の一つである。
<確定工程(ステップS20)>
確定工程は、増幅工程により増幅した少なくとも胎児由来の有核赤血球の増幅産物の量を確定する工程である。
確定工程は、増幅工程により増幅した少なくとも胎児由来の有核赤血球の増幅産物の量を確定する工程である。
(核酸断片の数の決定)
胎児由来の有核赤血球の細胞として同定され、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたDNAであって、数的異常を検査する対象となる染色体に対して、あらかじめ決定された100〜150bp(base pair:ベースペア)の領域の配列を有するDNAの増幅産物の量をシークエンサーで求める。本発明においては、胎児由来の有核赤血球の染色体であり、数的異常を検査する対象となる染色体は、好ましくは13番染色体、18番染色体、21番染色体、およびX染色体からなる群から選択される。
胎児由来の有核赤血球の細胞として同定され、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたDNAであって、数的異常を検査する対象となる染色体に対して、あらかじめ決定された100〜150bp(base pair:ベースペア)の領域の配列を有するDNAの増幅産物の量をシークエンサーで求める。本発明においては、胎児由来の有核赤血球の染色体であり、数的異常を検査する対象となる染色体は、好ましくは13番染色体、18番染色体、21番染色体、およびX染色体からなる群から選択される。
<決定工程(ステップS22)>
決定工程は、確定工程により確定したDNAの増幅産物の量を比較することで、胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する工程である。
決定工程は、確定工程により確定したDNAの増幅産物の量を比較することで、胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する工程である。
胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する基準(あるいは参照)として、数的異常を検査する対象染色体以外の染色体を選択し、予め決定された100〜150bpの領域の配列を有するDNAの増幅産物の増幅量をシークエンサーで求める。基準となる染色体(基準染色体)としては、胎児由来の有核赤血球の染色体の中から数的異常を検査する対象染色体以外の染色体の少なくとも1つを選択する態様、または、母体由来の有核赤血球であると同定された細胞に存在する染色体を選択する態様から選ばれる。本実施形態においては、母体由来の有核赤血球であると同定された細胞に存在する染色体を選択することが好ましい。
次に、数的異常の検査の対象染色体のDNAの増幅産物の量と、基準染色体のDNAの増幅産物の量との比率により、胎児の染色体に数的異常が存在するか決定する。胎児が正常な状態であれば、数的異常を検査する胎児由来の対象染色体のDNAの増幅産物の量と、基準染色体のDNAの増幅産物の量とは、ほぼ、1:1の量比となると予想される。染色体が3本存在するトリソミーである数的異常である場合には、1.0:1.5(あるいは2:3)の比になると予想される。
また、決定工程に先立って、予め、複数の妊娠母体から採取した、正常な胎児を妊娠した場合の母体由来の染色体のDNAの増幅産物の量に対する胎児由来の染色体のDNAの増幅産物の量の比を複数求めた結果の分布と、トリソミーの胎児を妊娠した母体の、母親由来のDNAの増幅産物の量に対する胎児由来のDNAの増幅産物の量の比を複数求めた結果の分布とを求め、この2つの分布が重ならない領域にカットオフ値を設定しておき、このカットオフ値と、DNAの増幅産物の量の比を比較して数的異常が存在するかどうかを決定することも可能である。この場合、DNAの増幅産物の量の比がカットオフ値以下であれば、胎児は正常であり、カットオフ値以上であれば、トリソミーである数的異常であると、検査結果を解釈することができる。
(実施例1)
以下に実施例を挙げ、本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
以下に実施例を挙げ、本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
(取得工程[末梢血液試料取得工程])
7mL採血管に抗凝固剤として、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)のナトリウム塩を10.5mg添加した後、母体のボランティアから、インフォームドコンセントを行った後にボランティア血として末梢血7mLを採血管内に得た。その後、生理食塩水を用いて、血液を希釈した。
7mL採血管に抗凝固剤として、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)のナトリウム塩を10.5mg添加した後、母体のボランティアから、インフォームドコンセントを行った後にボランティア血として末梢血7mLを採血管内に得た。その後、生理食塩水を用いて、血液を希釈した。
(濃縮工程[有核赤血球の濃縮工程])
Percoll液(登録商標)を使用して、密度1.070g/mLと、密度1.095g/mLの液を調製し、遠沈管に、遠沈管の底部に密度1.095g/mLの液2mlを添加した。続けて、密度1.095g/mLの液の上に、界面が乱れないようにゆっくり、密度1.070g/mLの液2mLを重層した。その後、密度1.070g/mLの媒体の上に、上記で採血した血液の希釈液11mLをゆっくり、遠沈管に添加した。その後、遠心分離を2000rpm(回転数毎分)で20分間行った。その後、遠沈管を取り出し、密度1.070g/mLと、密度1.090g/mLの液の間に沈積した画分をピペットを用いて採取した。このように採取した血液の画分を片手で第1のガラス基板を保持し、その1端に1滴採取した血液の画分を置いた。もう一方の手で別のガラス基板(第2のガラス基板)を持ち、第2のガラス基板の1端を第1のガラス基板に30度の角度で接触させ、第2のガラス基板の接触下面を血液の画分に触れると、毛管現象で2枚のガラスに囲まれた空間に広がる。次に角度を保ったまま、第2ガラス基板を第1のガラス基板の血液を置いた領域と反対の領域の方向に滑らせて、第1のガラス基板上に塗布した。その後、送風で1時間以上十分に乾燥させた。この第1のガラス基板をメイ・ギュルンワルド染色液に3分浸漬し、リン酸Buffer液に浸漬して洗浄後、ギムザ染色液(リン酸Buffer液で希釈して濃度3%とした)に10分浸漬した。その後、純水で洗浄後乾燥させた。このようにして染色済みのガラス基板を複数枚作製した。
Percoll液(登録商標)を使用して、密度1.070g/mLと、密度1.095g/mLの液を調製し、遠沈管に、遠沈管の底部に密度1.095g/mLの液2mlを添加した。続けて、密度1.095g/mLの液の上に、界面が乱れないようにゆっくり、密度1.070g/mLの液2mLを重層した。その後、密度1.070g/mLの媒体の上に、上記で採血した血液の希釈液11mLをゆっくり、遠沈管に添加した。その後、遠心分離を2000rpm(回転数毎分)で20分間行った。その後、遠沈管を取り出し、密度1.070g/mLと、密度1.090g/mLの液の間に沈積した画分をピペットを用いて採取した。このように採取した血液の画分を片手で第1のガラス基板を保持し、その1端に1滴採取した血液の画分を置いた。もう一方の手で別のガラス基板(第2のガラス基板)を持ち、第2のガラス基板の1端を第1のガラス基板に30度の角度で接触させ、第2のガラス基板の接触下面を血液の画分に触れると、毛管現象で2枚のガラスに囲まれた空間に広がる。次に角度を保ったまま、第2ガラス基板を第1のガラス基板の血液を置いた領域と反対の領域の方向に滑らせて、第1のガラス基板上に塗布した。その後、送風で1時間以上十分に乾燥させた。この第1のガラス基板をメイ・ギュルンワルド染色液に3分浸漬し、リン酸Buffer液に浸漬して洗浄後、ギムザ染色液(リン酸Buffer液で希釈して濃度3%とした)に10分浸漬した。その後、純水で洗浄後乾燥させた。このようにして染色済みのガラス基板を複数枚作製した。
(細胞の形状に基づき選別する工程)
ガラス基板上に塗布した濃縮処理後の血液から、胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球を選別するため、電動二次元ステージ(以下、XYステージと記載する。)と、対物レンズ、CCDカメラを備えた光学顕微鏡の測定系と、XYステージ制御部、垂直方向(以下、Z方向と記載する)移動機構を制御するZ方向制御部とを備えた制御部と、画像入力部と画像処理部、およびXY位置記録部とを備えた制御ユニット部を準備した。上記のように準備した、ガラス基板上に塗布した血液細胞をXYステージに乗せて、ガラス基板上に焦点を合わせてスキャンし、光学顕微鏡より得られた画像を取り込み、画像解析により標的細胞である有核赤血球を探索した。
ガラス基板上に塗布した濃縮処理後の血液から、胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球を選別するため、電動二次元ステージ(以下、XYステージと記載する。)と、対物レンズ、CCDカメラを備えた光学顕微鏡の測定系と、XYステージ制御部、垂直方向(以下、Z方向と記載する)移動機構を制御するZ方向制御部とを備えた制御部と、画像入力部と画像処理部、およびXY位置記録部とを備えた制御ユニット部を準備した。上記のように準備した、ガラス基板上に塗布した血液細胞をXYステージに乗せて、ガラス基板上に焦点を合わせてスキャンし、光学顕微鏡より得られた画像を取り込み、画像解析により標的細胞である有核赤血球を探索した。
画像解析は、以下の式(1)、式(2)の条件を満たす細胞を検出し、解析対象の画像に直交する二軸からなる座標系を設定し、二軸の一方をX軸、二軸の他方をY軸とした場合の、検出された細胞のX方向の細胞の位置、及びY方向の位置を記録した。
0.25<(N/C)<1.0 (1)
0.65<(N/(L×L))<0.785 (2)
ここで、Cは、画像解析を行う細胞の細胞質の面積(解析に用いられる画像における細胞質を表す領域の面積)、Nは、画像解析をおこなう細胞の核の面積(解析画像における細胞の核を表す領域の面積)、Lは、画像解析する細胞の核の長径又は直径(解析画像における細胞の核を表す領域を楕円形に近似した際の楕円形の長径、又は解析画像における細胞の核を表す領域を円形に近似した際の円形の直径)、即ち、複雑な形をした細胞核に外接する楕円形の長径または円形の直径と定義する。これら式(1)、式(2)を満たすスライドガラス基板上に存在する胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球を選択し、次の工程の胎児由来の有核赤血球の候補とした。
0.65<(N/(L×L))<0.785 (2)
ここで、Cは、画像解析を行う細胞の細胞質の面積(解析に用いられる画像における細胞質を表す領域の面積)、Nは、画像解析をおこなう細胞の核の面積(解析画像における細胞の核を表す領域の面積)、Lは、画像解析する細胞の核の長径又は直径(解析画像における細胞の核を表す領域を楕円形に近似した際の楕円形の長径、又は解析画像における細胞の核を表す領域を円形に近似した際の円形の直径)、即ち、複雑な形をした細胞核に外接する楕円形の長径または円形の直径と定義する。これら式(1)、式(2)を満たすスライドガラス基板上に存在する胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球を選択し、次の工程の胎児由来の有核赤血球の候補とした。
(光学特性に基づき有核赤血球を選別する工程)
形状の情報により選択された胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球の10個について、顕微分光装置を用いて、光学特性の解析を行った。スライドガラス基板上の胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球10個を特定し、そのうちの1つの有核赤血球に対して、波長が460nmの単色光の吸光度1、および波長が560nmの単色光の吸光度2を測定し、吸光度の比(吸光度1/吸光度2)を計算した。次に、その有核赤血球の近傍位置にある、当該有核赤血球からの距離の短い順に参照赤血球として、核のない赤血球を5個選択し、同様にして一つ一つの参照赤血球に対して、吸光度の比(吸光度1/吸光度2)を計算し、平均値を計算した。
形状の情報により選択された胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球の10個について、顕微分光装置を用いて、光学特性の解析を行った。スライドガラス基板上の胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球10個を特定し、そのうちの1つの有核赤血球に対して、波長が460nmの単色光の吸光度1、および波長が560nmの単色光の吸光度2を測定し、吸光度の比(吸光度1/吸光度2)を計算した。次に、その有核赤血球の近傍位置にある、当該有核赤血球からの距離の短い順に参照赤血球として、核のない赤血球を5個選択し、同様にして一つ一つの参照赤血球に対して、吸光度の比(吸光度1/吸光度2)を計算し、平均値を計算した。
同様の方法で、ガラス基板上の胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球の残りの9個の細胞に対しても同様の計算を行った。この計算結果から、(有核赤血球の吸光度の比/参照赤血球の吸光度の比の平均値)を求め、この値の「1」からの差が一番大きく異なる細胞を胎児由来の有核赤血球と見なして細胞Aとし、「1」からの差が一番小さい細胞を母体由来の有核赤血球と見なして細胞Bとした。
(細胞単離工程)
上記工程で決定された細胞A、細胞Bを、マイクロマニュピュレータを使用して回収した。
上記工程で決定された細胞A、細胞Bを、マイクロマニュピュレータを使用して回収した。
(増幅工程[DNA増幅工程])
有核赤血球の、胎児由来と識別された細胞Aと、母体由来と識別された細胞Bを用いて、New England Biolabs社製Single Cell WGA kitを用いて全ゲノム増幅を行い、説明書記載に則り細胞中の微量なDNAを約100万倍に増幅した。
有核赤血球の、胎児由来と識別された細胞Aと、母体由来と識別された細胞Bを用いて、New England Biolabs社製Single Cell WGA kitを用いて全ゲノム増幅を行い、説明書記載に則り細胞中の微量なDNAを約100万倍に増幅した。
(確定工程[母体由来または胎児由来の確定工程])
各細胞から増幅した全ゲノム増幅産物を等分割してその一方を用いて、ILLUMINA社製ゲノムアナライザーMiseqを用いて、13番染色体のC1QTNF9B遺伝子領域、PCDH9遺伝子領域、BRCA2遺伝子領域、MTRF1遺伝子領域のSNP(Single Nucleotide Polymorphism)(SNP ID:rs3751355、rs1799955、rs2297555、rs9571740)を比較することで、細胞Aと細胞BのSNPが異なることが確認出来た。別途、白血球と予想される細胞Cをマイクロマニュピュレータで回収し、細胞A、細胞Bと同様にしてSNPを調べたところ、細胞BのSNPと一致することが確認された。以上より、細胞Aが胎児由来の有核赤血球、細胞Bが、母親由来の有核赤血球であることが確認された。
各細胞から増幅した全ゲノム増幅産物を等分割してその一方を用いて、ILLUMINA社製ゲノムアナライザーMiseqを用いて、13番染色体のC1QTNF9B遺伝子領域、PCDH9遺伝子領域、BRCA2遺伝子領域、MTRF1遺伝子領域のSNP(Single Nucleotide Polymorphism)(SNP ID:rs3751355、rs1799955、rs2297555、rs9571740)を比較することで、細胞Aと細胞BのSNPが異なることが確認出来た。別途、白血球と予想される細胞Cをマイクロマニュピュレータで回収し、細胞A、細胞Bと同様にしてSNPを調べたところ、細胞BのSNPと一致することが確認された。以上より、細胞Aが胎児由来の有核赤血球、細胞Bが、母親由来の有核赤血球であることが確認された。
(決定工程[数的異常の決定工程])
細胞A及び細胞Bのそれぞれから増幅したDNAの増幅産物を等分割した残りの一方を用いて、胎児由来の有核赤血球が21トリソミーであるかを判別した。細胞A及び細胞Bのそれぞれから得られたDNAの増幅産物を用いて、SureSelect target enrich system(Human All exon v5 アジレント社製)を用いて、説明書記載に則り夫々の細胞のexon部分のみを濃縮しILLUMINA社製ゲノムアナライザーHiseqで、exon部分のシーケンスリード数を算出、細胞A及び細胞Bのそれぞれにおける21番染色体のexon部分で算出されたシーケンスリード数を比較することにより21トリソミーを検出することが可能であった。
細胞A及び細胞Bのそれぞれから増幅したDNAの増幅産物を等分割した残りの一方を用いて、胎児由来の有核赤血球が21トリソミーであるかを判別した。細胞A及び細胞Bのそれぞれから得られたDNAの増幅産物を用いて、SureSelect target enrich system(Human All exon v5 アジレント社製)を用いて、説明書記載に則り夫々の細胞のexon部分のみを濃縮しILLUMINA社製ゲノムアナライザーHiseqで、exon部分のシーケンスリード数を算出、細胞A及び細胞Bのそれぞれにおける21番染色体のexon部分で算出されたシーケンスリード数を比較することにより21トリソミーを検出することが可能であった。
以上のごとく、妊娠母体から得られた血液から胎児由来の有核赤血球を同定でき、胎児の染色体の数的異常の解析も可能であることがわかり、本発明の効果が確認された。
(実施例2)
実施例1において、(濃縮工程[有核赤血球の濃縮工程])を、以下に記載の方法で行い、ガラス基板を作製した以外は、実施例1と同様に行い、本発明の効果を確認した。
実施例1において、(濃縮工程[有核赤血球の濃縮工程])を、以下に記載の方法で行い、ガラス基板を作製した以外は、実施例1と同様に行い、本発明の効果を確認した。
(濃縮工程[有核赤血球の濃縮工程])
Histopaque液(登録商標)を使用して、密度1.095の液を調製し、遠沈管に、遠沈管の底部に密度1.095の液3mLを添加した。その後、密度1.095の媒体の上に、採血した血液の希釈液12mLをゆっくり、遠沈管に添加した。その後、遠心分離を2000rpmで20分間行った。その後、遠沈管を取り出し、密度1.095と、血漿の間の画分を、ピペットを用いて採取した。このように採取した血液の画分を片手で第1のガラス基板を保持し、その1端に1滴採取した血液の画分を置いた。もう一方の手で別のガラス基板2(第2のガラス基板)を持ち、第2のガラス基板の1端を第1のガラス基板に30度の角度で接触させ、第2のガラス基板の接触下面を血液の画分に触れると、毛管現象で2枚のガラスに囲まれた空間に広がる。次に角度を保ったまま、第2のガラス基板を第1のガラス基板の血液を置いた領域と反対の領域の方向に滑らせて、第1のガラス基板上に塗布した。その後、送風で1時間以上十分に乾燥させた。この第1のガラス基板をメイ・ギュルンワルド染色液に3分浸漬し、リン酸Buffer液に浸漬して洗浄後、ギムザ染色液(リン酸Buffer液で希釈して濃度3%とした)に10分浸漬した。その後、純水で洗浄後乾燥させた。このようにして染色済みのガラス基板を複数枚作製した。
Histopaque液(登録商標)を使用して、密度1.095の液を調製し、遠沈管に、遠沈管の底部に密度1.095の液3mLを添加した。その後、密度1.095の媒体の上に、採血した血液の希釈液12mLをゆっくり、遠沈管に添加した。その後、遠心分離を2000rpmで20分間行った。その後、遠沈管を取り出し、密度1.095と、血漿の間の画分を、ピペットを用いて採取した。このように採取した血液の画分を片手で第1のガラス基板を保持し、その1端に1滴採取した血液の画分を置いた。もう一方の手で別のガラス基板2(第2のガラス基板)を持ち、第2のガラス基板の1端を第1のガラス基板に30度の角度で接触させ、第2のガラス基板の接触下面を血液の画分に触れると、毛管現象で2枚のガラスに囲まれた空間に広がる。次に角度を保ったまま、第2のガラス基板を第1のガラス基板の血液を置いた領域と反対の領域の方向に滑らせて、第1のガラス基板上に塗布した。その後、送風で1時間以上十分に乾燥させた。この第1のガラス基板をメイ・ギュルンワルド染色液に3分浸漬し、リン酸Buffer液に浸漬して洗浄後、ギムザ染色液(リン酸Buffer液で希釈して濃度3%とした)に10分浸漬した。その後、純水で洗浄後乾燥させた。このようにして染色済みのガラス基板を複数枚作製した。
(実施例3)
実施例1において、別の母体から得られた細胞を用いて、実施例1で行った、母体由来または胎児由来の確定の方法において、Y染色体のsex-determining factor(SRY)遺伝子領域で作製したPCRプライマーを用いてタカラバイオ社製Multiplex PCR Assay Kitを用いてPCRを行い、Y染色体のPCR増幅物の有無を一般的なアガロースゲル電気泳動法で確認し、実施例1の胎児有核赤血球の選別工程で、別の母体から得た胎児由来と識別した細胞が男児の胎児由来の細胞であることを確認した以外は、実施例1と同様に実験を行い、本発明の効果を確認した。
実施例1において、別の母体から得られた細胞を用いて、実施例1で行った、母体由来または胎児由来の確定の方法において、Y染色体のsex-determining factor(SRY)遺伝子領域で作製したPCRプライマーを用いてタカラバイオ社製Multiplex PCR Assay Kitを用いてPCRを行い、Y染色体のPCR増幅物の有無を一般的なアガロースゲル電気泳動法で確認し、実施例1の胎児有核赤血球の選別工程で、別の母体から得た胎児由来と識別した細胞が男児の胎児由来の細胞であることを確認した以外は、実施例1と同様に実験を行い、本発明の効果を確認した。
30…有核赤血球候補、32…参照赤血球、34…周囲、36…探索範囲
(光学特性による選別)
光学特性による選別は、赤血球に含まれるヘモグロビンの酸素親和性の違いに起因する分光特性を利用することができる。図4は、還元ヘモグロビン(Hb)と、酸化ヘモグロビン(HbO2)の波長に対する吸収係数を示すグラフ図である(特開2014−14485号公報に記載)。ここで、吸収係数とは、光がある媒質に入射したとき、その媒質がどのくらいの光を吸収するかを示す定数である。図4に示すように、ヘモグロビンは酸素との相互作用によって、吸収係数が変化することが知られている。即ち、酸化ヘモグロビンは赤い色調を有しており、還元ヘモグロビンになるに従い、青味を帯びてくる。
光学特性による選別は、赤血球に含まれるヘモグロビンの酸素親和性の違いに起因する分光特性を利用することができる。図4は、還元ヘモグロビン(Hb)と、酸化ヘモグロビン(HbO2)の波長に対する吸収係数を示すグラフ図である(特開2014−14485号公報に記載)。ここで、吸収係数とは、光がある媒質に入射したとき、その媒質がどのくらいの光を吸収するかを示す定数である。図4に示すように、ヘモグロビンは酸素との相互作用によって、吸収係数が変化することが知られている。即ち、酸化ヘモグロビンは赤い色調を有しており、還元ヘモグロビンになるに従い、青味を帯びてくる。
Claims (9)
- 妊娠母体から母体血を取得する採取工程と、
前記母体血中の有核赤血球を濃縮する濃縮工程と、
前記濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血中の有核赤血球を、核の形状、および、400〜650nmの光波長域に含まれる波長における分光特性により、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球に選別する選別工程と、
少なくとも前記胎児由来の有核赤血球の染色体の核酸を増幅する増幅工程と、
前記増幅工程により増幅した少なくとも前記胎児由来の有核赤血球の増幅産物の量を確定する確定工程と、
確定した前記増幅産物の量と、母体の染色体、または、異常がないことが既知の胎児の染色体の増幅産物との比較により、前記胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する決定工程と、
を有する胎児の染色体の検査方法。 - 前記選別工程は、少なくとも前記核の形状により有核赤血球候補を選別する第1の選別工程と、前記第1の選別工程により選別された前記有核赤血球候補を、前記分光特性により選別を行う第2の選別工程と、を含む請求項1に記載の胎児の染色体の検査方法。
- 前記第1の選別工程は、前記有核赤血球候補となる細胞の細胞質の面積をC、前記有核赤血球候補となる細胞の前記核の面積をN、前記有核赤血球候補となる細胞の前記核に外接する円形の直径の長さまたは楕円形の長径の長さをLとしたとき、式1および式2を満たす有核赤血球候補を選択する工程を含む、請求項2に記載の胎児の染色体の検査方法。
0.25<N/C<1.0 式1
0.65<N/(L×L)<0.785 式2 - 前記第1の選別工程は、さらに、2つの工程からなり、第1の工程は核を有する可能性のある細胞を抽出し、第2の工程は、前記第1の工程で抽出した細胞を前記式1および前記式2により前記有核赤血球候補を選別する請求項3に記載の胎児の染色体の検査方法。
- 前記分光特性が、吸光係数である請求項1から4のいずれか1項に記載の胎児の染色体の検査方法。
- 前記選別工程は、前記胎児由来の有核赤血球の吸光度が前記母体由来の有核赤血球の吸光度を超える第1の光波長域の波長と、前記母体由来の有核赤血球の吸光度が前記胎児由来の有核赤血球の吸光度を超える第2の光波長域の波長とを含む、少なくとも2種類以上の各々の波長で有核赤血球の吸光度を測定する請求項5に記載の胎児の染色体の検査方法。
- 前記選別工程は、前記母体由来の有核赤血球と、前記胎児由来の有核赤血球とを2種類以上の各々の波長で測定した吸光度の違いに基づいて、前記胎児由来の有核赤血球である可能性に順位をつける請求項5または6に記載の胎児の染色体の検査方法。
- 前記第1の光波長域は、450nmを超え480nm未満の波長域であり、前記第2の光波長域は、550nmを超え575nm未満の波長域である請求項7に記載の胎児の染色体の検査方法。
- 前記濃縮工程は、密度勾配遠心分離法により行う請求項1から8のいずれか1項に記載の胎児の染色体の検査方法。
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