CN106661633A - 胎儿染色体有无非整倍性的检测方法 - Google Patents

胎儿染色体有无非整倍性的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，该方法包括：扩增由从妊娠母体采集的生物样品获得的染色体DNA而得到一次扩增产物的一次扩增工序；将一次扩增产物作为模板并进行多个目标区域的多重扩增而得到二次扩增产物的二次扩增工序；对二次扩增产物的两末端附加标记而得到被标记的二次扩增产物的工序；将被标记的二次扩增产物作为模板并使用对标记进行退火的引物对进行扩增而得到三次扩增产物的三次扩增工序；及根据三次扩增产物来确定多个目标区域的碱基序列和扩增量的工序，在一次扩增工序中将DNA的总量扩增至6000倍～30000倍，且在二次扩增工序中将DNA的总量扩增至3倍～150倍。

Description

胎儿染色体有无非整倍性的检测方法
技术领域
本发明涉及一种胎儿染色体有无非整倍性的检测方法。
背景技术
作为产前基因检查，以往进行了如下羊水染色体检查：从通过羊膜穿刺采集的羊水分离来源于胎儿的细胞，并检验来源于胎儿的细胞中的染色体。然而，羊膜穿刺存在流产的危险性。
另一方面，作为无创产前基因检查，已知有分析妊娠母体血液中存在的来源于胎儿的无细胞DNA或妊娠母体血液中存在的来源于胎儿的细胞的染色体DNA来检测胎儿染色体的异常的检查。
即使在无创产前基因检查中，分析来源于胎儿的无细胞DNA的检查也已被实用化。另一方面，分析来源于胎儿的细胞的染色体DNA检查至今未被实用。作为其理由，可举出来源于胎儿的细胞(例如，来源于胎儿的有核红细胞)为在母体血细胞计数ml中仅存在1个左右的稀有细胞。然而，若能够分析来源于胎儿的细胞的染色体DNA，则可期待检查精度进一步优异的无创产前基因检查。
但是，为了分析来源于胎儿的细胞的染色体DNA，以得到足够分析使用的量的DNA为目的，需要从微量染色体DNA扩增DNA。此时，为了检测染色体的非整倍性(例如三体性、单体性)，需要如实地再现非整倍性的同时扩增DNA。
然而，例如，在日本专利第4404553号公报、日本特表2014-502845号公报、日本特表2004-511215号公报及日本特开平6-327476号公报中公开有从通过由人体外周血采集DNA并进行多个阶段的DNA扩增而获得的扩增产物得到序列信息来进行疾病的诊断或亲子鉴定的方法。并且，在日本特表2006-505268号公报中公开有进行多重扩增反应对多个核酸量的初始比率进行定量的方法。
发明内容
发明要解决的技术课题
如在日本专利第4404553号公报、日本特表2014-502845号公报、日本特表2004-511215号公报、日本特开平6-327476号公报及日本特表2006-505268号公报中所公开，已知有扩增样品中以少量存在的DNA，并分析序列信息或DNA量比的技术。然而，上述文献中所公开的技术并不是出于提高染色体的非整倍性的检测能力的观点而成的技术。并且，上述文献中，即使记载有关于扩增DNA的聚合酶链反应的循环数的内容，但均未记载关于扩增前后的DNA量的倍率的内容。
本发明的一实施方式基于上述情况而成。
本发明的一实施方式的目的在于，提供一种检测能力优异的胎儿染色体有无非整倍性的检测方法。
用于解决技术课题的手段
所述用于解决课题的手段包括以下方式。
[1]一种胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，该方法包括：一次扩增工序，扩增由从妊娠母体采集的生物样品获得的染色体DNA而得到一次扩增产物；二次扩增工序，将一次扩增产物作为模板，并使用多个引物对进行多个目标区域的多重扩增而得到二次扩增产物；第一附加工序，对二次扩增产物的两末端附加作为寡核苷酸的第一标记而得到被标记的二次扩增产物；三次扩增工序，将被标记的二次扩增产物作为模板，并使用对第一标记进行退火的引物对进行扩增而得到三次扩增产物；及序列分析工序，根据三次扩增产物确定多个目标区域的碱基序列和扩增量，一次扩增工序为将DNA的总量扩增至6000倍以上且30000倍以下的工序，二次扩增工序为将DNA的总量扩增至3倍以上且150倍以下的工序。
[2]根据[1]所述的胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，其中，三次扩增工序为将DNA的总量扩增至6倍以上且24倍以下的工序。
[3]根据[1]或[2]所述的胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，其中，序列分析工序使用新一代测序仪进行。
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，该方法还包括：第二附加工序，对三次扩增产物的两末端附加作为寡核苷酸的第二标记而得到被标记的三次扩增产物。
[5]根据[4]所述的胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，其中，三次扩增工序中所使用的引物在5’末端具有第二标记的碱基序列，通过进行三次扩增工序，三次扩增产物的两末端被附加第二标记而得到被标记的三次扩增产物，由此一同进行三次扩增工序和第二附加工序。
[6]根据[1]至[5]中任一项所述的胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，其中，所述二次扩增工序中所使用的引物在5’末端具有第一标记的碱基序列，通过进行二次扩增工序，二次扩增产物的两末端被附加第一标记而得到被标记的二次扩增产物，由此一同进行二次扩增工序和第一附加工序。
[7]根据[1]至[6]中任一项所述的胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，其中，一次扩增工序为基于染色体DNA进行全基因组扩增的工序。
[8]根据[1]至[7]中任一项所述的胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，其中，染色体DNA为从1个细胞获得的染色体DNA，一次扩增工序为基于1个细胞进行全基因组扩增的工序。
[9]根据[1]至[8]中任一项所述的胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，其中，生物样品为血液，染色体DNA为从血液中的细胞获得的染色体DNA。
[10]根据[9]所述的胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，其中，血液中的细胞为有核红细胞。
[11]根据[9]或[10]所述的胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，其中，血液中的细胞为通过密度梯度离心分离和图像分析而被分离的细胞。
发明效果
根据本发明的一实施方式，可提供一种检测能力优异的胎儿染色体有无非整倍性的检测方法。
具体实施方式
本说明书中，“工序”一词不仅指独立的工序，即使在无法与其他工序明确区分的情况下，若可实现该工序所期望的目的，则也包含于本术语中。
本说明书中，利用“～”表示的数值范围表示将记载于“～”的前后的数值分别作为最小值及最大值而包含的范围。
本说明书中，在组合物中存在多种相当于各成分的物质的情况下，只要无特别限定，则组合物中的各成分的量指存在于组合物中的该多种物质的合计量。
以下，对本发明的实施方式进行说明。这些说明及实施例为例示本发明的列，而并不限制本发明的范围。
本公开的方法为如下方法：由从妊娠母体采集的生物样品获得染色体DNA而扩增染色体DNA上的多个区域，从而检查胎儿染色体有无非整倍性。本公开的方法中，通过一次扩增工序、二次扩增工序及三次扩增工序，以多个阶段扩增DNA，确定扩增产物的碱基序列和量来检测胎儿染色体有无非整倍性。本公开的方法例如可应用于检测13号染色体、18号染色体及21号染色体的三体性、性染色体过剩等产前基因检查。
本公开的方法中，一次扩增工序、二次扩增工序及三次扩增工序中使用DNA聚合酶扩增DNA。一次扩增工序为将DNA的总量扩增至6000倍～30000倍的工序，二次扩增工序为将DNA的总量扩增至3倍～150倍的工序。
本公开的方法中，通过将一次扩增工序及二次扩增工序中的DNA总量的扩增倍率(扩增后的DNA总量÷扩增钱的DNA总量)设为上述范围，胎儿染色体有无非整倍性的检测能力优异。其原因被推测为不束缚于特定的机理，而基于以下进行说明的机理。
基于DNA聚合酶的DNA扩增中，根据扩增区域的碱基序列、扩增区域的长度、引物序列的特异性、反应温度、反应时间等而扩增难易度(扩增效率)按每一扩增区域有所不同，且每一次重复扩增循环时积累扩增效率之差，结果扩增区域之间的扩增产物量比有时并不再现原来的DNA量比。
并且，作为DNA扩增方法之一的聚合酶链反应(polymerase chain reaction；PCR)理论上是通过重复循环数而使DNA呈指数扩增的反应，但实际上若重复循环数则DNA浓度(即扩增产物量)达到平稳状态。因此，若循环数过剩，则即使原来的DNA量中存在差异，扩增产物量也变得大致相同而导致丢失原来的DNA量比地信息。
相对于此，本公开的方法中，将一次扩增工序中的DNA总量的扩增倍率设为30000倍以下。若扩增倍率大于30000倍，则为了实现该扩增倍率而需要相应的扩增循环数，每一次重复扩增循环时积累扩增效率之差，结果扩增区域之间的扩增产物量比与染色体中的原来的DNA量比相差悬殊。因此，本公开的方法中，一次扩增工序中的DNA总量的扩增倍率为30000倍以下。若一次扩增工序中的DNA总量的扩增倍率为30000倍以下，则通过一次扩增工序扩增的各个扩增区域的每一个扩增倍率也大致控制在30000倍以下的范围内，而且扩增倍率的分布中偏差较少，确保了染色体的非整倍性信息。例如，DNA总量的扩增倍率为10000倍的情况下，各个扩增区域的每一个扩增倍率分布在10000倍附近且偏差较少。
可以说二次扩增工序中的DNA总量的扩增倍率与上述机理相同。因此，本公开的方法中，二次扩增工序中的DNA总量的扩增倍率为150倍以下。并且，二次扩增工序通常以PCR进行，因此从避免因过度扩增而丢失染色体的非整倍性信息的情况的观点考虑，也优选扩增循环数不要过多，且DNA总量的扩增倍率为150倍以下。若二次扩增工序中的DNA总量的扩增倍率为150倍以下，则通过二次扩增工序扩增的各个扩增区域的每一个扩增倍率也大致控制在150倍以下的范围内，而且扩增倍率的分布中偏差较少，确保了染色体的非整倍性的信息。例如，DNA总量的扩增倍率为100倍的情况下，各个扩增区域的每一个扩增倍率分布在100倍附近且偏差较少。
另一方面，需要从生物样品中的微量染色体DNA获得足够分析使用的量的DNA，因此一次扩增工序中的DNA总量的扩增倍率为6000倍以上，二次扩增工序中的DNA总量的扩增倍率为3倍以上。
根据上述理由，一次扩增工序为将DNA的总量扩增至6000倍～30000倍的工序，更优选为扩增至6000倍～25000倍的工序，进一步优选为扩增至6000倍～20000倍的工序。
根据上述理由，二次扩增工序为将DNA的总量扩增至3倍～150倍工序，更优选为扩增至3倍～100倍的工序，进一步优选为扩增至3倍～60倍的工序。
本公开的方法中，三次扩增工序中的DNA总量的扩增倍率并无特别限制。三次扩增工序中，将成为模板的DNA的长度在某种程度上一致，并且所使用的引物对通常被限定为一种，因此认为有关DNA扩增的所述问题并不像一次扩增工序及二次扩增工序那样明显。但是，根据与二次扩增工序相同的理由及机理，三次扩增工序中的DNA总量的扩增倍率优选为6倍～24倍，更优选为6倍～20倍，进一步优选为6倍～15倍。若三次扩增工序中的DNA总量的扩增倍率为上述范围，则胎儿染色体有无非整倍性的检测能力优异。
通过以上说明的一次扩增工序、二次扩增工序及三次扩增工序以多个阶段扩增的最终扩增产物，即三次扩增产物的全部或一部分为在序列分析工序中被用在序列分析用装置的物质。三次扩增产物可以说是测序用文库。本公开的方法中，多个目标区域之间的三次扩增产物量比良好地再现了染色体DNA的原来的DNA量比(即，染色体的非整倍性)，从而根据本公开的方法能够高精度地检测染色体有无非整倍性。
以下，对各工序进行详细说明。
[一次扩增工序]
一次扩增工序为扩增由从妊娠母体采集的生物样品获得的染色体DNA而得到一次扩增产物的工序。一次扩增工序也可以为DNA聚合酶进行的DNA链的合成反应。关于从妊娠母体采集的生物样品将后述。
一次扩增优选通过全基因组扩增(whole genome amplification；WGA)进行。全基因组扩增例如可扩增生物样品中所包含的微量的染色体DNA片段或从单一细胞得到的微量的染色体DNA，使染色体DNA的分析简易化。
全基因组扩增的方法并无特别限制，可以通过周知的方法进行。全基因组扩增例如包括使用表面活性剂和蛋白水解酶来溶解细胞的工序和将从细胞溶出的基因组DNA设为模板并通过DNA聚合酶来扩增DNA的工序。
全基因组扩增可以应用市售的试剂来进行。作为基于PCR的试剂，例如可举出PicoPLEX WGA Kit(New England Biolabs公司)、GenomePlex Single Cell Whole GenomeAmplification Kit(Sigma-Aldrich公司)、国际公开第2012/166425号中公开的MALBAC法(Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles)所涉及的试剂。作为基于链取代型DNA合成反应的试剂，例如可举出GenomiPhi DNA Amplification Kit(GEHEALTHCARE公司，GenomiPhi为注册商标)，REPLI-g Single Cell Kit(QIAGEN公司，REPLI-g为注册商标)。本公开的方法中，优选使用PicoPLEX WGA Kit(New England Biolabs公司)。
PicoPLEX WGA Kit(New England Biolabs公司)为在一个反应容器中依次进行(i)Sample Preparation(制备样品)、(ii)DNA Pre-Amplification(预扩增DNA)、(iii)DNAAmplification(扩增DNA)这3个工序的试剂盒。
工序(i)为从1个细胞提取基因组DNA的工序，使用含有表面活性剂及蛋白水解酶的缓冲剂来溶解细胞。
工序(ii)为使用从细胞提取的基因组DNA、随机引物及耐热性DNA聚合酶来预扩增DNA的工序。
工序(iii)为使用耐热性DNA聚合酶来进行PCR并扩增DNA的工序。
一次扩增工序中应用PicoPLEX WGA Kit(New England Biolabs公司)的情况下，优选进行工序(i)及工序(ii)，而省略工序(iii)，进一步优选调节工序(ii)的扩增循环数，以使DNA总量扩增至6000倍～30000倍。
优选在一次扩增工序结束之后，进行琼脂糖凝胶电泳来确认有无一次扩增产物。一次扩增产物优选进行提纯。提纯例如使用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司，QIAquick为注册商标)来进行。一次扩增产物的量例如可通过使用NanoDrop(注册商标，Thermo Fisher Scientific公司)，BioAnalyzer(Agilent公司)、Quantus Fluorometer(Promega公司)测定浓度来确认。
[二次扩增工序、第一附加工序]
二次扩增工序为将一次扩增产物作为模板并使用多个引物对进行多个目标区域的多重扩增而得到二次扩增产物的工序。二次扩增产物为多种扩增产物的混合物。二次扩增工序优选通过PCR来实现，即优选多重PCR(multiplex PCR)。
二次扩增工序中所使用的引物对为以检测胎儿染色体的非整倍性为目的而设计的引物对，且为与多处染色体位置(目标区域)相对应的多个引物对。目标区域的长度，即被扩增的区域的长度例如为100～180碱基对。与引物中的目标区域互补的碱基序列优选15～25碱基，更优选20碱基。
第一附加工序为对二次扩增产物的两末端附加第一标记而得到被标记的二次扩增产物的工序。第一标记为寡核苷酸，三次扩增工序中所使用的引物为退火序列。附加于二次扩增产物一末端的第一标记和附加于另一末端的第一标记的碱基序列可以相同也可以不同。本公开中，与两者的碱基序列的不同点无关，将附加于二次扩增产物的两末端的标记统称为“第一标记”。
关于第一标记，三次扩增工序中所使用的引物为退火序列，因此通过使第一标记在二次扩增产物之间通用，能够在三次扩增工序中以一种引物对进行PCR。第一标记优选15～20碱基，更优选17碱基。
作为将第一标记附加于二次扩增产物的两末端的方法，例如可举出基于DNA连接酶的结扎、基于PCR的附加，本公开的方法中，优选基于PCR的附加。基于PCR的附加为如下，即使用在5’末端具有第一标记的碱基序列的引物进行PCR，由此得到在两末端附加有第一标记的二次扩增产物。该情况下，二次扩增工序和第一附加工序一同进行。
二次扩增工序中所使用的引物具有第一标记的碱基序列和与目标区域互补的碱基序列的情况下，引物整体的长度优选30～45碱基，更优选35～40碱基，进一步优选37碱基。
二次扩增工序的多重PCR中，能够使用在通常的PCR中所使用的耐热性DNA聚合酶及反应缓冲剂。作为应用于二次扩增工序的PCR试剂，例如可举出Multiplex PCR AssayKit(TAKARA BIO INC.)、Multiplex PCR Assay Kit ver2(TAKARA BIO INC.)、KAPALibrary Amplification Kit(NIPPON Genetics Co,Ltd)、Platinum Multiplex PCRMaster Mix Kit(Life Technologies Corporation，Platinum为注册商标)。本公开的方法中，优选使用Multiplex PCR Assay Kit(TAKARA BIO INC.)。多重PCR中，退火的最适温度按每一引物对而不同，因此优选研究反应条件。
检测染色体有无非整倍性的本公开的方法中，为了避免因过度扩增而丢失染色体的非整倍性的信息，优选二次扩增工序的PCR的循环数为10～30循环。PCR的循环数优选预先进行基于实时PCR的研究，并根据其结果进行设定。在PCR的中途可以改变反应温度和/或反应时间。
二次扩增产物优选进行提纯。提纯例如使用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司)，AMPure XP Kit(BECMAN COULTER公司)来进行。二次扩增产物的量例如可通过使用NanoDrop(Thermo Fisher Scientific公司)、BioAnalyzer(Agilent公司)、QuantusFluorometer(Promega公司)测定浓度来确认。
[三次扩增、第二附加工序]
三次扩增工序为将被标记的二次扩增产物作为模板并使用对第一标记进行退火的引物对进行扩增而得到三次扩增产物的工序。三次扩增工序优选通过PCR实现。
三次扩增工序中所使用的引物为对第一标记进行退火的引物。引物中对第一标记进行退火的序列的碱基长度优选与第一标记的碱基长度相同，具体而言，优选15～20碱基，更优选17碱基。
第二附加工序为对三次扩增产物的两末端附加第二标记而得到被标记的三次扩增产物的工序。第二标记为寡核苷酸，并以使用新一代测序仪分析扩增产物为目的附加于三次扩增产物。附加于三次扩增产物的一末端的第二标记和附加于另一末端的第二标记的碱基序列可以相同也可以不同。本公开中，与两者的碱基序列的不同点无关，将附加于三次扩增产物的两末端的标记统称为“第二标记”。
第二标记为以使用新一代测序仪进行扩增产物的分析为目的而附加于三次扩增产物的寡核苷酸，因此该碱基序列根据新一代测序仪的分析原理而设计(新一代测序仪的详细内容将后述)。关于第二标记的碱基长度，作为一例可举出59～64碱基。
作为新一代测序仪使用Illumina公司.的MiSeq或HiSeq2000的情况下，作为第二标记，例如可举出下述一对寡核苷酸。下述两个寡核苷酸中的一个被附加于三次扩增产物的一末端，另一个被附加于三次扩增产物的另一末端。
·具有对固定在流动池上的寡核苷酸进行杂交的P5序列、包括6～8碱基的样品识别序列(索引序列)及测序引物进行退火的序列(读段序列)的寡核苷酸。
·具有对固定在流动池上的寡核苷酸进行杂交的P7序列、包括6～8碱基的样品识别序列(索引序列)及测序引物进行退火的序列(读段序列)的寡核苷酸。
索引序列位于成对的两个寡核苷酸的至少一个中即可，从提高分析精度的观点考虑，优选位于两者中。读段序列可应用第一标记，在该情况下，无需单独设置读序列。
上述的例为一例，本公开的方法中，第二标记并不限定于上述例。
作为将第二标记附加于三次扩增产物的两末端的方法，例如可举出基于DNA连接酶的结扎、基于PCR的附加，本公开的方法中，优选基于PCR的附加。基于PCR的附加为如下，即使用在5’末端具有第二标记的碱基序列的引物来进行PCR，由此得到在两末端附加有第二标记的三次扩增产物。该情况下，三次扩增工序和第二附加工序一同进行。
以下，有时将通过PCR附加第二标记的情况称为“索引附加PCR”。
作为应用于三次扩增工序的PCR试剂，可举出Multiplex PCR Assay Kit(TAKARABIO INC.)、Multiplex PCR Assay Kit ver2(TAKARA BIO INC.)、KAPA LibraryAmplification Kit(NIPPON Genetics Co,Ltd)、Platinum Multiplex PCR Master MixKit(Life Technologies Corporation)。本公开的方法中，优选使用Multiplex PCR AssayKit(TAKARA BIO INC.)。
检测染色体有无非整倍性的本公开的方法中，为了避免因过度扩增而丢失染色体的非整倍性的信息，优选三次扩增工序的PCR的循环数为5～18循环。PCR的循环数优选预先进行基于实时PCR的研究，并根据其结果进行设定。在PCR的中途可以改变反应温度和/或反应时间。
三次扩增产物优选进行提纯。提纯例如使用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司)、AMPure XP Kit(BECMAN COULTER公司)来进行。三次扩增产物的量例如可通过使用NanoDrop(Thermo Fisher Scientific公司)、BioAnalyzer(Agilent公司)、QuantusFluorometer(Promega公司)、KAPA Library Quantification Kits(NIPPON Genetics Co,Ltd)测定浓度来确认。
[序列分析工序]
序列分析工序为根据三次扩增产物确定多个目标区域的每一个碱基序列和扩增量的工序。从分析精度及速度、1次进可处理的样品数的多少等方面考虑，序列分析工序优选使用新一代测序仪来进行。
本公开中，新一代测序仪(Next Generation Sequencer；NGS)是指，与利用桑格法的毛细管测序仪(被称为第一代测序仪)进行对比来分类的测序仪。新一代测序仪包括第二代、第三代、第四代及今后将开发的测序仪。当前最普及的新一代测序仪为如下原理的测序仪：捕获与基于DNA聚合酶的互补链合成或基于DNA连接酶的互补链键合连动的荧光或发光来确定碱基序列。具体而言，可举出MiSeq(Illumina公司)、HiSeq2000(Illumina公司，HiSeq为注册商标)、Roche454(Roche公司)等。
本公开的方法中，作为新一代测序仪，优选Illumina公司的MiSeq及HiSeq2000。MiSeq可一次测定最多96种PCR产物。96种PCR产物可以为1个多重PCR产物，也可以为多个多重PCR产物的混合物。混合多个多重PCR产物并以MiSeq进行分析的情况下，期待高精度地对各自的PCR产物进行定量。定量例如使用BioAnalyzer(Agilent公司)、QuantusFluorometer(Promega公司)或KAPA Library Quantification Kits(NIPPON GeneticsCo,Ltd)来进行。
作为对通过MiSeq等新一代测序仪得到的序列数据进行校准的机构，可举出Burrows-Wheeler Aligner(BWA)，优选通过BWA向已知人体基因组序列映射序列数据。作为分析基因的机构，可举出SAMtools及BEDtools，优选通过这些分析机构分析基因多态性、基因突变及染色体数。
根据通过序列分析工序得到的目标区域的碱基序列和扩增量检测染色体有无非整倍性。关于序列分析工序及非整倍性的检测方法的详细内容，以将母体血液中的有核红细胞作为样品的情况为例将后述。
[从妊娠母体采集的生物样品]
从妊娠母体采集的生物样品为母体血液、脐带血、羊水、绒毛组织、胎盘组织等，已知存在来源于胎儿的细胞的组织即可。从极力抑制对妊娠母体的侵害性的观点考虑，作为生物样品，优选母体外周血。本公开中，血液包含血液本身及以生理盐水稀释的血液、向血液添加了葡萄糖或抗凝血剂等添加剂的保存血液、这些的分馏物等血液样品。
[妊娠母体的外周血]
妊娠母体的外周血包含来源于母亲的嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等白细胞；来源于母亲的无核成熟红细胞；来源于母亲的有核红细胞；来源于胎儿的有核红细胞等血液细胞。本公开的方法中，优选根据这些血液细胞来识别来源于胎儿的有核红细胞，并由来源于胎儿的有核红细胞得到染色体DNA。据说来源于胎儿的有核红细胞从妊娠后6周左右开始存在于母体血液中。因此，本公开的方法中的血液优选为从妊娠后6周左右之后的妊娠母体采集的外周血或由从妊娠后6周左右之后的妊娠母体采集的外周血制备的血液样品。
来源于胎儿的有核红细胞为通过胎盘而存在于母体的血液中的红细胞前体。母体在妊娠时，胎儿的红细胞可为有核红细胞。在有核红细胞中存在染色体，因此通过分离来源于胎儿的有核红细胞，可得到胎儿染色体及胎儿基因。据说来源于胎儿的有核红细胞以母体血液中的细胞的约每106个细胞中存在1个的比例存在，妊娠母体的外周血中它的存在概率非常低。
来源于胎儿的有核红细胞例如通过密度梯度离心分离和图像分析，可与从妊娠母体采集的血液中存在的的其他血液细胞进行识别而被分离。
[有核红细胞的密度梯度离心分离(有核红细胞的浓缩)]
有核红细胞通过密度梯度离心分离可与存在于血液中的血浆成分或其他血液细胞进行分离。用于分离有核红细胞的密度梯度离心分离可以应用周知的方法。例如，在离心管层叠了密度(比重)不同的两种介质的不连续密度梯度的基础上，可通过层叠以生理盐水进行稀释的血液来进行离心而分馏并浓缩有核红细胞。
国际公开第2012/023298号中记载有包含来源于胎儿的有核红细胞的母体的细胞的密度。根据该记载，被估算的来源于胎儿的有核红细胞的密度为1.065～1.095g/mL左右，关于母亲的血球密度中，红细胞为1.070～1.120g/mL左右，嗜酸性粒细胞为1.090～1.110g/mL左右，嗜中性粒细胞为1.075～1.100g/mL左右，嗜碱性粒细胞为1.070～1.080g/mL左右，淋巴细胞为1.060～1.080g/mL左右，单核细胞为1.060～1.070g/mL左右。
为了将密度1.065～1.095g/mL左右的来源于胎儿的有核红细胞与其他血液细胞进行分离而设定所层叠的介质的密度(比重)。来源于胎儿的有核红细胞的中心密度为1.080g/mL左右，因此通过将该密度的以上及以下的两个不同的密度的介质相邻层叠，可在其界面采集具有来源于胎儿的有核红细胞的组分。优选将底层的介质的密度设为1.08g/mL～1.10g/mL(更优选1.08g/mL～1.09g/mL)，并将上层的介质的密度设为1.06g/mL～1.08g/mL(更优选1.065g/mL～1.08g/mL)。本公开的方法中，底层的介质与上层的介质可以为相同种类也可以为不同种类，优选使用相同种类的介质。
作为介质，可举出涂布有聚乙烯吡咯烷酮的直径15nm～30nm的硅酸胶体粒子分散液即Percoll(注册商标)、由蔗糖制成且富含于侧链的中性亲水性聚合物即Ficoll-Paque(注册商标)、包含聚蔗糖和泛影酸钠的Histopaque(注册商标)等。本公开的方法中，优选使用Percoll和/或Histopaque。关于Percoll，市售有密度1.130的产品，可通过以水进行稀释可制备密度梯度。Histopaque可使用市售的密度1.077的介质及密度1.119的介质和水可制备密度梯度。
两层不连续密度梯度例如如以下形成于离心管中。首先，将处于凝固点以上且14℃以下(优选8℃以下)的温度状态的底层的介质容纳于离心管的底部或将底层的介质容纳于离心管的底部之后在14℃以下(优选8℃以下)的温度下保存并冷却。接着，在底层的介质上层叠上层的介质。
[血液细胞的图像分析]
关于血液细胞的图像分析，以选择来源于胎儿的有核红细胞的候补为目的，获取基板(优选为透明基板)上的血液细胞的形态信息来进行分析。
为了对血液细胞进行图像分析，将通过密度梯度离心分离而得到的包含有核红细胞的组分涂布于透明基板(优选为载玻片)上并干燥，从而制作了图像分析用标本。从该标本获取血液细胞的形态信息来进行分析，从而选择来源于胎儿的有核红细胞的候补。
关于图像分析用的标本中，为了便于血液细胞的观察，优选血液细胞被染色。血液细胞的染色法并无特别限制，可以通过周知的方法进行。作为血液细胞的染色法，例如可举出吉姆萨染色、梅-格-吉染色。
血液细胞的形态信息优选通过配备有光学显微镜、数码相机、载玻片用载物台、光学传送系统、图像处理用个人计算机(PC)、控制用PC及显示器的系统，从标本获取并进行图像分析。光学传送系统例如具备物镜和CCD相机。图像处理用PC例如具备进行数据分析、数据存储的处理系统。控制用PC例如具备控制载玻片用载物台的位置或控制整体的处理的控制系统。
来源于胎儿的有核红细胞的候补可通过相对于细胞质的面积的核的面积比例、核的圆度、核的面积等来识别。从可靠性的观点考虑，作为来源于胎儿的有核红细胞的候补优选识别满足相对于细胞质的面积的核的面积比例及核的圆度的至少一个条件(优选为两个条件)的细胞。
关于相对于细胞质的面积的核的面积比例，优选选择满足下述式(a)的细胞。关于核的圆度，优选选择满足下述式(b)的细胞。
(a)0.25＜(N/C)＜1.0
(b)0.65＜(N/(L×L))＜0.785
式中，C为细胞质的面积，N为核的面积，L为核的长径长度或与呈复杂形状的核外切的椭圆的长径长度。
满足式(a)及式(b)的细胞中，可以按核的形状接近圆形或椭圆的顺序来排序，并从位次高的细胞优选提供给之后的工序。并且，进行判别有核红细胞的来源的工序为止，在位次高的多个细胞中未包含来源于胎儿的细胞的情况下，可以分析位次第二高的多个细胞。
作为有核红细胞而识别的细胞例如通过具备玻璃容器的显微操纵器从透明基板上一个一个回收。从所回收的细胞提取染色体DNA来作为一次扩增工序的模板。
[来源于胎儿的有核红细胞的鉴定]
从妊娠母体采集的血液中的有核红细胞中混合有来源于母亲的有核红细胞和来源于胎儿的有核红细胞，从而需要鉴定该有核红细胞为来源于胎儿的有核红细胞。作为通过基因序列识别个人的方法，可举出检验等位基因来检测存在于该等位基因的基因多态性的方法。作为一例，判别父子关系时，应用了检测作为基因多态性的一种的STR(shorttandem repeat)的方法，进行个人识别时，应用了检测SNP(Single NucleotidePolymorphism，单核苷酸多态性)的方法。本公开的方法中，根据通过序列分析工序得到的序列信息，例如通过等位基因上的STR和/或SNP的差异来识别来源于胎儿的细胞和来源于母亲的细胞。优选获取白细胞(几乎可以断定白细胞来源于母亲)并以相同的方式分析STR和/或SNP，由此提高来源于胎儿的细胞的鉴定可靠性。
[为男孩儿时的Y染色体检测]
妊娠母体的超声波检查中确认到胎儿为男孩儿的情况下，若确认到在所分离出的有核红细胞内存在Y染色体，则可鉴定为该有核红细胞为来源于胎儿的有核红细胞。作为细胞内有无Y染色体的检测方法，已知有使用Y染色体特异性荧光探测器的FISH(Fluorescence in situ hybridization)法。作为FISH法的检查试剂盒的一例，可举出CEPX/Y DNA Probe Kit(Abbott公司，CEP为注册商标)。本公开的方法中，优选制作在Y染色体具有特异性碱基序列的引物对并利用PCR确认其有无扩增，由此鉴定有核红细胞为来源于男孩儿的胎儿的有核红细胞。
[染色体有无非整倍性的检测]
关于从鉴定为来源于胎儿的有核红细胞的细胞得到的染色体，例如使用新一代测序仪分析扩增产物量。作为基准(或参考)，关于从鉴定为来源于母亲的有核红细胞的细胞得到的染色体，例如使用新一代测序仪分析扩增产物量。若胎儿不具有染色体的非整倍性，则可预测来源于母亲的扩增产物量与来源于胎儿的扩增产物量的量比大致成为1:1。在胎儿中扩增区域所处的染色体为三体性的情况下，可预测来源于母亲的扩增产物量与来源于胎儿的扩增产物量的量比大致成为1:1.5(或2:3)。
本公开的方法中，可通过在下述方法预先确定截止值而将该截止值使用于分析结果的说明中。
根据从多个判定怀有不具有染色体的非整倍性的胎儿的母体采集的生物样品，通过本公开的方法分析相对于来源于母亲的扩增产物量的来源于胎儿的扩增产物量的比来求出其分布。并且，根据从多个判定怀有三体性胎儿的母体采集的生物样品，通过本公开的方法分析相对于来源于母亲的扩增产物量的来源于胎儿的扩增产物量的比来求出其分布。将该两个分布不重叠的区域作为截止值。将该截止值和检查对象中的相对于来源于母亲的扩增产物量的来源于胎儿的扩增产物量的比进行比较，从而可得到如下分析结果：若该比为截止值以下，则胎儿并非三体性，若该比为截止值以上，则胎儿为三体性。
实施例
以下举出实施例对本发明进行进一步具体的说明。以下的实施例中所示的材料、处理顺序等在不脱离本发明的宗旨的范围内可适当进行变更。因此，本发明的范围不应由以下所示的具体例进行限定性解释。
＜实施例1＞
[外周血的采集]
利用添加EDTA(乙二胺四乙酸)的钠盐10.5mg作为抗凝血剂的7mL采集采血管，从孕妇志愿者一人采集外周血7mL。之后，使用生理盐水稀释血液。来自孕妇志愿者的采血在得到知情同意的基础上进行。
[基于密度梯度离心分离的有核红细胞的浓缩]
使用Percoll液(Sigma-Aldrich公司制)制备密度1.070的液和密度1.095的液，向离心管添加密度1.095的液2mL，在4℃下放置30分钟来冷却。之后，在密度1.095的液上，以不破坏界面的方式缓慢叠加密度1.070的液2mL。接着，在密度1.070的液上，缓慢叠加稀释后的血液11mL，并以2000rpm进行20分钟的离心分离。接着，使用吸液管采集沉积在密度1.070的液与密度1.095的液之间的组分。
[对基板的血液涂布]
以单手支撑载玻片1，并对其一端滴落一滴所采集的组分。用另一支手拿另一载玻片2，使其一端以30度的角度与载玻片1相接触，并使载玻片2的接触下表面与组分相接触并通过毛管现象使组分向被两枚载玻片包围的空间扩散。接着在保持上述角度不变的情况下，使载玻片2向与放置载玻片1的组分的区域相反的区域的方向滑动而在载玻片1上均匀地涂布组分。涂布后，通过送风经一小时以上充分进行干燥。
[血液细胞的染色]
将已涂布组分的载玻片1在梅-格染色液中浸渍3分钟，接着浸渍于磷酸缓冲液之后进行清洗，然后在吉姆萨染色液(用磷酸缓冲液中进行稀释而将浓度设为3％(v/v))中浸渍10分钟。接着，以纯水清洗之后，进行干燥。如此，制作了多枚图像分析用标本载片。
[基于图像分析的有核红细胞的识别]
准备具备图像分析系统，其具备：光学显微镜，具备电动XY载物台、物镜及CCD相机；控制部，具备XY载物台控制部及Z方向控制部；及分析部，具备图像输入部、图像处理部及XY位置记录部。将标本载片放置于XY载物台，将焦点对焦于标本载片上来进行扫描，从光学显微镜将图像读入分析部来搜索有核红细胞。
通过图像分析，检测满足下述式(a)及式(b)的细胞，并作为有核红细胞的候补进行识别并记录XY位置。
(a)0.25＜(N/C)＜1.0
(b)0.65＜(N/(L×L))＜0.785
式中，C为细胞质的面积，N为核的面积，L为核的长径长度或与呈复杂形状的核外切的椭圆的长径长度。
[有核红细胞的回收]
通过显微操纵器操纵玻璃针和玻璃管，使用这些玻璃容器从标本载片上一个一个回收了已进行识别的共11个有核红细胞的候补。
[一次扩增工序(所有基因组扩增)]
关于已回收的11个细胞的每一个，使用PicoPLEX WGA Kit(New England Biolabs公司)进行所有基因组扩增。根据PicoPLEX WGA Kit的附件，向容纳1个细胞的PCR管添加5μL的Cell Extraction Buffer之后，添加5μL的Extraction Cocktail(4.8μL的ExtractionEnzyme Dilution Buffer与0.2μL的Cell Ectraction Enzyme的混合液)来设为合计10μL。之后，进行75℃/10分钟及95℃/4分钟的细胞溶解反应。接着，制备Pre-Amp Cocktail(4.8μL的Pre-Amp Reaction Mix与0.2μL的Pre-Amp Enzyme的混合液)，并向细胞溶解后的反应液添加5μL来设为合计15μL。作为DNA的扩增反应，进行相当于PicoPLEX WGA Kit的工序(ii)的反应。即以95℃/2分钟使DNA改性之后，以95℃/15秒钟、15℃/50秒钟、25℃/40秒钟、35℃/30秒钟、65℃/40秒钟及75℃/40秒钟进行30循环。
使用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司)，并通过去除引物或缓冲剂成分等杂质而对所得到的扩增产物进行了提纯。使用Quantus Fluorometer dsDNA System(Promega公司)测定提纯后的扩增产物的浓度，确认到各细胞的扩增产物量在45ng～90ng(相当于1个人体细胞的染色体DNA量的9000倍～18000倍)的范围内。
[二次扩增工序及第一附加工序(多重PCR)]
以鉴定来源于胎儿的细胞为目的，并且以分析染色体的非整倍性为目的设计了扩增染色体上的16处区域的16对引物对。将16处区域设为在其内部具有SNP的区域。16处区域所处的基因名及16处区域的碱基长度如表1所示。
[表1]
各引物为包含第一标记的碱基序列17碱基和与目标区域互补的碱基序列20碱基的共计37碱基的寡核苷酸，且第一标记的碱基序列位于5’末端。将正向引物上的第一标记的碱基序列设为CGCTCTTCCGATCTCTG(序列号1)，且将反向引物上的第一标记的碱基序列设为CGCTCTTCCGATCTGAC(序列号2)。
混合所有引物，使其最终浓度成分别成为25nmol/L而制备了引物混合液。
将10ng的一次扩增产物(所有基因组扩增产物)使用于二次扩增工序中。多重PCR使用Multiplex PCR Assay Kit(TAKARA BIO INC.)进行反应。混合10ng的作为模板的从各细胞得到的一次扩增产物、8μL的引物混合液、0.125μL的Multiplex PCR Mix1、12.5μL的Multiplex PCR Mix2及水而制备了反应液(最终液量为25μL)。PCR反应中，以94℃/60秒钟改性之后，以94℃/30秒钟、60℃/90秒钟及72℃/30秒钟进行了15循环。预先进行基于实时PCR的研究，并根据其结果设定了P CR的循环数。
使用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司)，并通过去除引物或缓冲剂成分等杂质而对所得到的扩增产物进行了提纯。使用Quantus Fluorometer dsDNA System(Promega公司)测定提纯后的扩增产物的浓度。确认到各细胞的扩增产物量为300ng～600ng(相当于模板量的30倍～60倍)的范围内。
[三次扩增工序及第二附加工序(索引附加PCR)]
作为三次扩增中所使用的引物对，设计了下述寡核苷酸。
·从5’末端依次具有流动池键合用序列(由Illumina公司提供的P5序列)、样品识别用索引序列及对第一标记进行退火的序列的寡核苷酸。作为索引序列使用了由Illumina公司提供的D501。
·从5’末端依次具有流动池键合用序列(由Illumina公司提供的P7序列)、样品识别用索引序列及对第一标记进行退火的序列的寡核苷酸。作为索引序列，对11个细胞分别使用了由Illumina公司提供的D701～D711中的任一个。
将5ng被标记的二次扩增产物使用于三次扩增工序。PCR使用Multiplex PCRAssay kit(TAKARA BIO INC.)进行反应。混合5ng的作为模板的二次扩增产物、各1μL的引物(1.25μmol/L)、0.125μL的Multiplex PCR Mix1、12.5μL的Multiple x PCR Mix2及水制备了反应液(最终液量为25μL)。PCR反应中，以94℃/3分钟改性之后，以94℃/45秒钟、50℃/60秒钟及72℃/30秒钟进行5循环之后，以94℃/45秒钟、55℃/60秒钟及72℃/30秒钟进行11循环。预先进行基于实时PCR的研究，并根据其结果设定了PCR的循环数。
使用AMPure XP Kit(BECMAN COULTER公司)对所得到的扩增产物进行了提纯。使用BioAnalyzer(Agilent公司)测定了提纯后的扩增产物的浓度。作为更加准确的扩增产物的定量，使用KAPA Library Quantification Kits(NIPPON Genetics Co,Ltd)进行了定量。确认到各细胞的扩增产物量在50ng～75ng(相当于模板量的10倍～15倍)的范围内。
关于各扩增工序，若总结11个细胞的扩增产物量及扩增倍率则如表2。
[表2]
一次扩增工序 二次扩增工序 三次扩增工序
扩增产物量 45ng～90ng 300ng～600ng 50ng～75ng
扩增倍率 9000倍～18000倍 30倍～60倍 10倍～15倍
[序列分析工序]
混合来源于11个细胞的三次扩增产物，并使用MiSeq(Illumina公司)及MiSeqReagent Kit v2 300 Cycle(Illumina公司)进行测序。使用BWA(Burrows-WheelerAligner)来将所得到的FastQ文件映射于人类参考基因组(hg19)，从SAMtools提取基因多态性信息，并通过BEDtools计算各扩增区域的序列读段数来进行分析。
[来源于细胞的鉴定]
对从13号染色体、18号染色体及21号染色体扩增的区域的SNP进行分析的结果，确认到11个细胞中的1个细胞具有不同的SNP信息。另外，利用显微操纵器来从标本载片上回收根据核的形状预测为白细胞的细胞，并以与11个细胞相同的方式扩增DNA并检验SNP的结果，确认到上述1个细胞以外的10个细胞的SNP与预测为白细胞的细胞的SNP一致。通过以上分析，确认到1个细胞为来源于胎儿的有核红细胞，10个细胞为来源于母亲的有核细胞。
[有无非整倍性的检测]
使用MiSeq确定鉴定为来源于胎儿的有核红细胞的21号染色体的4区域的扩增产物量。并且，使用MiSeq确定鉴定为来源于母亲的10个有核细胞的21号染色体的4区域的扩增产物量。在来源于胎儿的细胞与来源于母亲的各细胞之间计算4区域的扩增产物量的每一个的量比的结果，均为接近1:1的值，从而推定胎儿在21号染色体中不具有非整倍性。
以相同的方式，关于13号染色体、18号染色体、X染色体及Y染色体，也推定胎儿不具有非整倍性。
＜比较例1＞
将从标本载片回收的1个细胞作为材料。一次扩增工序中进行PicoPLEX WGA Kit的工序(i)～工序(iii)而得到了1个人体细胞的染色体DNA量的50万倍的扩增产物，除此以外，以与实施例1相同的方式，对染色体有无非整倍性的检测进行了试验。然而，16区域的扩增产物量之间的偏差较大，大幅度脱离了可检测有无非整倍性的水准。
＜比较例2＞
将从标本载片回收的1个细胞作为材料。二次扩增工序中进行30循环PCR而得到了模板量的500倍的扩增产物，除此以外，以与实施例1相同的方式，对染色体有无非整倍性的检测进行了试验。然而，16区域的扩增产物量之间的偏差较大，大幅度脱离了可检测有无非整倍性的水准。
2014年9月11日申请的日本专利申请2014-185060号中公开的所有内容以引证的方式并入本说明书中。
关于本说明书中所记载的所有文献、专利申请及技术标准，以与具体且分别记载了以引证的方式并入各文献、专利申请及技术标准的情况相同的程度，以引证的方式并入本说明书中。
序列表
<110> 富士胶片公司
<120> 胎儿染色体有无非整倍性的检测方法
<130> FS-F06249-00
<150> JP 2014-185060
<151> 2014-09-11
<160> 2
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物标记
<400> 1
cgctcttccg atctctg 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物标记
<400> 2
cgctcttccg atctgac 17

Claims (11)

1.一种胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，该方法包括：
一次扩增工序，扩增由从妊娠母体采集的生物样品获得的染色体DNA而得到一次扩增产物；
二次扩增工序，将所述一次扩增产物作为模板，并使用多个引物对进行多个目标区域的多重扩增而得到二次扩增产物；
第一附加工序，对所述二次扩增产物的两末端附加作为寡核苷酸的第一标记而得到被标记的二次扩增产物；
三次扩增工序，将所述被标记的二次扩增产物作为模板，并使用对所述第一标记进行退火的引物对进行扩增而得到三次扩增产物；及
序列分析工序，根据所述三次扩增产物确定所述多个目标区域的碱基序列和扩增量，
所述一次扩增工序为将DNA的总量扩增至6000倍以上且30000倍以下的工序，
所述二次扩增工序为将DNA的总量扩增至3倍以上且150倍以下的工序。
2.根据权利要求1所述的胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，其中，
所述三次扩增工序为将DNA的总量扩增至6倍以上且24倍以下的工序。
3.根据权利要求1或2所述的胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，其中，
所述序列分析工序使用新一代测序仪进行。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，该方法还包括：
第二附加工序，对所述三次扩增产物的两末端附加作为寡核苷酸的第二标记而得到被标记的三次扩增产物。
5.根据权利要求4所述的胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，其中，
所述三次扩增工序中所使用的引物在5’末端具有所述第二标记的碱基序列，
通过进行所述三次扩增工序，所述三次扩增产物的两末端被附加所述第二标记而得到所述被标记的三次扩增产物，如此一同进行所述三次扩增工序和所述第二附加工序。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，其中，
所述二次扩增工序中所使用的引物在5’末端具有所述第一标记的碱基序列，
通过进行所述二次扩增工序，所述二次扩增产物的两末端被附加所述第一标记而得到所述被标记的二次扩增产物，如此一同进行所述二次扩增工序和所述第一附加工序。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，其中，
所述一次扩增工序为由所述染色体DNA进行全基因组扩增的工序。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，其中，
所述染色体DNA为从1个细胞获得的染色体DNA，所述一次扩增工序为由1个细胞进行全基因组扩增的工序。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，其中，
所述生物样品为血液，所述染色体DNA为从血液中的细胞获得的染色体DNA。
10.根据权利要求9所述的胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，其中，
所述血液中的细胞为有核红细胞。
11.根据权利要求9或10所述的胎儿染色体有无非整倍性的检测方法，其中，所述血液中的细胞为通过密度梯度离心分离和图像分析而被分离的细胞。
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