CN1266104A - 一种多重归一化基因扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多重归一化基因扩增方法,它采用在扩增物的5′端增加长度为17~25核苷酸的共有引物片段,经初始特异扩增后,然后用共有引物引发扩增,最后归一化为共引物的扩增。本发明所提供的方法,理论上可同时扩增无数个基因,实际工作中可同时扩增30个以上的基因,大大提高了基因分析的工作效率。
Description
本发明涉及一种基因扩增方法,尤其涉及一种多重基因的归一化基因扩增方法。
基因扩增技术或称聚合酶链式反应(Polymol/Lerase Chain Reaction.PCR)是八十年代发展起来的一项分子生物技术,其原理类似体内天然DNA复制,主要是利用DNA聚合酶依赖DNA模板的特性,模仿体内DNA复制过程,在附加的一对引物之间诱发聚合反应。PCR全过程是基于一套“三步曲”的若干次的循环组合而成,其中每一步的转换则是通过温度的改变来控制,三步过程分别为1、DNA热变性:加热使靶DNA双链解离;2、引物退火,体系温度降低,使两个引物分别结合到靶DNA的两条链的3′末端;3、引物延伸,在DNA聚合酶的催化下,引物沿着靶DNA链的3′末端向5′末端延伸,至此完成一个循环,整个PCR过程一般需要30~50循环,可将DNA扩增百万倍以上(《PCR技术指南》C.W迪芬巴赫和G.S德维克斯勒者、黄培堂等译,科学出版社1999年),这种基轩扩增技术广泛应用于生命科学、医学研究、遗传工程、疾病诊断、法医学、农业、考古学等领域的基因分析,基因克隆等,但这种扩增方法对多基因分析有缺陷,即仅对单一基因,且最多仅能同时扩增10个左右的基因,不能同时扩增更多的基因,这给大量基因的分析工作带来了局限性。
本发明的目的是提供一套多重基因扩增方法,此法利用巧妙的PCR引物设计,可有效解决多基因的同时扩增。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的:首先在扩增引物的5′端增加长度为17~25核苷酸的共有引物片段,进行初始扩增,然后用共有引物引发扩增,形成归一化扩增。
如附图所示。
初始化扩增是指由特异性引物引发的特异基因片段的扩增。
归一化扩增是指由共有引物引发的扩增。
优选方法可采用1、三次扩增:①逆转录和初始化扩增;②第二次扩增;③第三次扩增;2、二次循环法;3、一次扩增。
第二次扩增是取初始扩增产物1~2μmol/L,加入反应体系,另加特异引物进行的扩增;第三次扩增是取第二次扩增产物1~2μmol/L,加入反应体系及共有引物进行的扩增;二次循环法中第一循环引物为各0.001~0.01μmol/L,N和RT引物,扩增25循环,第二循环引物为0.1~0.3μmol/L,T引物,扩增25~40循环;一次扩增是取引物N和RT 0.001~0.01μmol/L,T为0.1~0.3μmol/L,扩增35~45循环。
第二次扩增中,另加的特异引物是R和N引物,含0.005~0.05μmol/L的T引物的RT引物。
本发明基于巧妙的PCR引物设计,可大量分析多重基因的归一化PCR方法,这种方法理论上可同时扩增无数个基因,实际工作中可同时扩增30个以上的基因,大大提高了基因分析的工作效率。
附图为本发明技术方案示意图。其中,R:针对目的基因的常规特异性引物RT:带有共有序列的常规特异性引物N:位于R和RT之间带有共有序列的常规特异性引物
T:共有引物
下面结合扩增精液cDNA为例对本发明做进一步说明。
1.样品制备
1.1裂解液:220mmol/L KOH加入500mmol/L DTT,混合比例9∶1
1.2中和缓冲液:200mmol/L HCl 900mmol/L Tris-HCl(PH=8.3)
1.3步骤:
①20μl(精液)加入100μl裂解液60℃10分钟。
②加100μl中和缓冲液。
③乙醇沉淀,沉淀样做PCR。
注:①不同的样品可用不同的裂解液,或用其他样品制备方法。
②若用裂解液直接用做PCR,注意K+离子浓度影响扩增。
2.扩增
2.1溶液:①10×PCR缓冲液
100mmol/L Tris-HCl(PH8.3)
500mmol/L KCl
20mmol/L MgCl2
100μg/ml
②900mmol/L Tris-HCl(PH8.3)
2.2三步扩增法
2.2.1逆转录和初始扩增
①样品中加入反应体系
1×PCR缓冲液
90mmol/L Tris-HCl(PH8.3)
100mmol/L dNTP
0.005μmol/L R和RT引物。
Rnasin和逆转录酶(视具体情况确定用量)
②PCR循环前43℃温育40分钟(逆转录过程),95℃变性2分钟,然后PCR循环30周期,条件为95℃30秒,55℃30秒,72℃1分钟。
2.2.2第二次扩增
取第一次扩增产物1.5μl,加入反应体系(不含逆转录酶,R、RT引物)①中,另加入等浓度的T和N引物,含0.025μmol/L的T引物的RT引物,扩增条件同②,循环10周期。
2.2.3第三次扩增
取第二次扩增产物1.5μl,加入反应体系(不含逆转录酶和PCR引物)及0.2μl的T引物,扩增条件同②,扩增32循环。
2.3二次循环法
反应体系和扩增条件同2.2,第一循环引物为各0.005μmol/L,N和RT引物,扩增25循环,第二循环引物为0.1~0.3μmol/L,T引物,扩增32循环。
2.4一次扩增
反应体系和扩增条件同2.3,引物N和RT各为0.005μmol/L,T为0.1~0.3μmol/L,扩增35~45循环。
反应体系、扩增条件可根据不同样品作相应改变。
Claims (6)
1.一种多重归一化基因扩增方法,其特征是,在扩增引物的5′端增加长度为17~25核苷酸的共有引物片段,进行初始扩增,然后用共有引物引发扩增,形成归一化扩增。
2.根据权利要求1所述的多重归一化基因扩增方法,其特征是,所说的初始扩增是指由特异性引物引发的特异基因片段的扩增。
3.根据权利要求1或2所述的多重归一化基因扩增方法,其特征是,所说的归一化扩增是指由共有引物引发的扩增。
4.根据权利要求3所述的多重归一化基因扩增方法,其特征是,优选方法可采用:
(1)三次扩增
①逆转录和初始化扩增;
②第二次扩增;
③第三次扩增;
(2)二次循环法;
(3)一次扩增。
5.根据权利要求4所述的多重归一化基因扩增方法,其特征是,第二次扩增是取初始扩增产物1~2μmol/L,加入反应体系,另加特异引物进行的扩增;第三次扩增是取第二次扩增产物1~2μmol/L,加入反应体系及共有引物进行的扩增;二次循环法中第一循环引物为各0.001~0.01μmol/L,N和RT引物,扩增22~29循环,第二循环引物为0.1~0.3μmol/L,T引物,扩增25~40循环,一次扩增是取引物N和RT 0.001~0.01μmol/L,T为0.1~0.3μmol/L,扩增35~45循环;R为针对目的基因的常规特异性引物,RT为带有共有序列的常规特异性引物,N为位于R和RT之间带有共有序列的常规特异性引物,T为共有引物。
6.根据权利要求5所述的多重归一化基因扩增方法,其特征是,第二次扩增中,另加的特异引物是R和N引物,含0.005~0.05μmol/L的T引物的RT引物。
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CN 00110816 CN1266104A (zh) | 2000-01-10 | 2000-01-10 | 一种多重归一化基因扩增方法 |
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CN (1) | CN1266104A (zh) |
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CN106661633A (zh) * | 2014-09-11 | 2017-05-10 | 富士胶片株式会社 | 胎儿染色体有无非整倍性的检测方法 |
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