JP2020065488A - 重症熱性血小板減少症候群(sfts)ウイルス検出用プライマーセット - Google Patents
重症熱性血小板減少症候群(sfts)ウイルス検出用プライマーセット Download PDFInfo
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Abstract
【課題】重症熱性血小板減少症候群(SFTS)ウイルスを高感度且つ迅速に検出できる方法を提供することを目的とする。【解決手段】SFTSウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、LAMP法によりSFTSウイルスに特異的な塩基配列を増幅することを含む、SFTSウイルスの検出方法。【選択図】なし
Description
本発明は、重症熱性血小板減少症候群(severe fever with thrombocytopenia syndrome:SFTS;以下、「SFTS」と称する)ウイルスの検出方法に関し、さらに詳しくは遺伝子の、高感度且つ迅速な検出法を利用したSFTSウイルス感染症の診断方法に関するものである。
国立感染症研究所(日本)が公表する情報によれば、SFTSは、2011年に中国の研究者等によって発表されたブニヤウイルス科フレボウイルス属に分類される新しいウイルスによるダニ媒介性感染症である。
SFTSウイルスに感染すると、6日〜2週間の潜伏期を経て、発熱、消化器症状(食欲低下、嘔気、嘔吐、下痢、腹痛)を生じ、その他には頭痛、筋肉痛、意識障害や失語等の神経症状、リンパ節腫脹、皮下出血や下血等の出血症状等を起こす。
また、SFTSウイルスに感染すると、白血球減少、血小板減少、AST・ALT・LDHの血清逸脱酵素の上昇が多くの症例で認められ、血清フェリチンの上昇や骨髄での血球貪食像も認められることがある。さらに、致死率は6.3〜30%と報告されている。
SFTSウイルスの感染経路は主にマダニ(フタトゲチマダニ等)を介したものであるが、血液等の患者体液との接触によりヒトからヒトへの感染も報告されている。
従来において、SFTSの治療は対症的な方法しかなく、有効な薬剤やワクチンが存在しない。従って、SFTSに対するワクチンや効率的なSFTSウイルスの検出方法の開発が望まれている。
一方、特許文献1〜4は、SFTSウイルスを検出する方法を開示する。特許文献4は、LAMP法によりSFTSウイルスを構成するS、M、およびLの各セグメントを増幅して検出しているが、各セグメントを単独で増幅した場合には感度や特異性が十分ではなく、3つのセグメントをすべて増幅する方法が好ましいと記載されている。LAMP法は他の核酸増幅法と比較して感度や特異性が優れた方法であるが、特許文献4はLAMP法の特徴を十分に生かしているとは言えず、感度や特異性がより向上したSFTSウイルスの検出方法が望まれている。
本発明は、上述の実情に鑑み、SFTSウイルスを高感度且つ迅速に検出できる方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、SFTSウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、LAMP(Loop-mediated Isothermal Amplification)法によりSFTSウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、SFTSウイルスを高感度且つ迅速に検出できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下を包含する。
(1)以下の(a)〜(d)のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含む、SFTSウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(a) 5'-CCTCCTCAGGAAGCATCTG-3'(配列番号1)
(b) 5'-TCCTCTTTGTTCTTGTAGTACCC-3'(配列番号2)
(c) 5'-CATTCTACCCTCCCCTCTCTATGCATGGTGCGAATTG-3'(配列番号3)
(d) 5'-GGGAGGAACATTTCATGCGCAGCTGTTGACCATATTCTC-3'(配列番号4)
(2)以下の(e)及び/又は(f)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、(1)記載のプライマーセット。
(e) 5'-GATTAGGCTGAATGGCTGAC-3'(配列番号5)
(f) 5'-CTCAGGCCGGTCCAC-3'(配列番号6)
(3)以下の(g)〜(j)のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含む、SFTSウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(g) 5'-AGGGAAGTCTCATGGATGG-3'(配列番号7)
(h) 5'-ATCCACCACCCCATTG-3'(配列番号8)
(i) 5'-GGAGGCTGGATGTAAAGTGCGGGCGAACTTACATAAAGACAG-3'(配列番号9)
(j) 5'-CTCTTGTGTTCAGAGCTTTTACAAGCTTTCCCCCATGTATCC-3'(配列番号10)
(4)以下の(k)及び/又は(l)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、(3)記載のプライマーセット。
(k) 5'-CCCTGCATCATTCCTGTC-3'(配列番号11)
(l) 5'-CTTATTTCGTCTCAAAGCTTAAGG-3'(配列番号12)
(5)以下の(m)〜(p)のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含む、SFTSウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(m) 5'-GATGGAGATGGGACTAGCAAC-3'(配列番号13)
(n) 5'-CTTGATCTTGAAYCCACTCAG-3'(配列番号14)
(o) 5'-CTYCGGATSGATTCAATGACTGGCTTGAGGAGATCAGG-3'(配列番号15)
(p) 5'-GTGAYGACCTTGGGATCACCTAACCATGCAATGACCTC-3'(配列番号16)
(6)以下の(q)及び/又は(r)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、(5)記載のプライマーセット。
(q) 5'-CATAAAGCCTGGCATCACTAC-3'(配列番号17)
(r) 5'-YAACAGGGTRGCATCTGC-3'(配列番号18)
(7)(1)〜(6)のいずれか1記載のプライマーセットを含む、SFTSウイルス検出又はSFTSウイルス感染症診断用キット。
(8)蛍光標識プローブをさらに含む、(7)記載のキット。
(9)(1)又は(2)記載のプライマーセットを含み、蛍光標識プローブが以下の(aa)及び/又は(bb)のオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブである、(8)記載のキット。
(aa) 5'-GGATTAGGCTGAATGGCTGAGAAGC-3'(配列番号19)
(bb) 5'-GGATTAGGCTGAATGGCTGAGAAIC-3'(配列番号20)
(10)(3)又は(4)記載のプライマーセットを含み、蛍光標識プローブが以下の(cc)のオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブである、(8)記載のキット。
(cc) 5'-CAATATGCCCTGCATCATTCCTGTC-3'(配列番号21)
(11)(5)又は(6)記載のプライマーセットを含み、蛍光標識プローブが以下の(dd)〜(gg)のいずれか1つのオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブである、(8)記載のキット。
(dd) 5'-CATAAAGCCTGGCATCACTACTGAGCC-3'(配列番号22)
(ee) 5'-TAACAGGGTGGCATCTGCATATAGAGGTC-3'(配列番号23)
(ff) 5'-GGATCCAATAACAGGGTGGCATCTGC-3'(配列番号24)
(gg) 5'-GGATCCAATAACAGGGTGGCATCTIC-3'(配列番号25)
(12)(1)〜(6)のいずれか1記載のプライマーセット又は(7)〜(11)のいずれか1記載のキットを用いて、SFTSウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行う工程を含む、SFTSウイルスの検出方法。
(13)SFTSウイルスの標的核酸領域の増幅反応がLAMP法による、(12)記載の方法。
(14)(1)〜(6)のいずれか1記載のプライマーセット又は(7)〜(11)のいずれか1記載のキットを用いて、SFTSウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、SFTSウイルス感染の有無を検査する工程を含む、SFTSウイルス感染症の検査方法。
(1)以下の(a)〜(d)のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含む、SFTSウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(a) 5'-CCTCCTCAGGAAGCATCTG-3'(配列番号1)
(b) 5'-TCCTCTTTGTTCTTGTAGTACCC-3'(配列番号2)
(c) 5'-CATTCTACCCTCCCCTCTCTATGCATGGTGCGAATTG-3'(配列番号3)
(d) 5'-GGGAGGAACATTTCATGCGCAGCTGTTGACCATATTCTC-3'(配列番号4)
(2)以下の(e)及び/又は(f)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、(1)記載のプライマーセット。
(e) 5'-GATTAGGCTGAATGGCTGAC-3'(配列番号5)
(f) 5'-CTCAGGCCGGTCCAC-3'(配列番号6)
(3)以下の(g)〜(j)のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含む、SFTSウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(g) 5'-AGGGAAGTCTCATGGATGG-3'(配列番号7)
(h) 5'-ATCCACCACCCCATTG-3'(配列番号8)
(i) 5'-GGAGGCTGGATGTAAAGTGCGGGCGAACTTACATAAAGACAG-3'(配列番号9)
(j) 5'-CTCTTGTGTTCAGAGCTTTTACAAGCTTTCCCCCATGTATCC-3'(配列番号10)
(4)以下の(k)及び/又は(l)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、(3)記載のプライマーセット。
(k) 5'-CCCTGCATCATTCCTGTC-3'(配列番号11)
(l) 5'-CTTATTTCGTCTCAAAGCTTAAGG-3'(配列番号12)
(5)以下の(m)〜(p)のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含む、SFTSウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(m) 5'-GATGGAGATGGGACTAGCAAC-3'(配列番号13)
(n) 5'-CTTGATCTTGAAYCCACTCAG-3'(配列番号14)
(o) 5'-CTYCGGATSGATTCAATGACTGGCTTGAGGAGATCAGG-3'(配列番号15)
(p) 5'-GTGAYGACCTTGGGATCACCTAACCATGCAATGACCTC-3'(配列番号16)
(6)以下の(q)及び/又は(r)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、(5)記載のプライマーセット。
(q) 5'-CATAAAGCCTGGCATCACTAC-3'(配列番号17)
(r) 5'-YAACAGGGTRGCATCTGC-3'(配列番号18)
(7)(1)〜(6)のいずれか1記載のプライマーセットを含む、SFTSウイルス検出又はSFTSウイルス感染症診断用キット。
(8)蛍光標識プローブをさらに含む、(7)記載のキット。
(9)(1)又は(2)記載のプライマーセットを含み、蛍光標識プローブが以下の(aa)及び/又は(bb)のオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブである、(8)記載のキット。
(aa) 5'-GGATTAGGCTGAATGGCTGAGAAGC-3'(配列番号19)
(bb) 5'-GGATTAGGCTGAATGGCTGAGAAIC-3'(配列番号20)
(10)(3)又は(4)記載のプライマーセットを含み、蛍光標識プローブが以下の(cc)のオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブである、(8)記載のキット。
(cc) 5'-CAATATGCCCTGCATCATTCCTGTC-3'(配列番号21)
(11)(5)又は(6)記載のプライマーセットを含み、蛍光標識プローブが以下の(dd)〜(gg)のいずれか1つのオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブである、(8)記載のキット。
(dd) 5'-CATAAAGCCTGGCATCACTACTGAGCC-3'(配列番号22)
(ee) 5'-TAACAGGGTGGCATCTGCATATAGAGGTC-3'(配列番号23)
(ff) 5'-GGATCCAATAACAGGGTGGCATCTGC-3'(配列番号24)
(gg) 5'-GGATCCAATAACAGGGTGGCATCTIC-3'(配列番号25)
(12)(1)〜(6)のいずれか1記載のプライマーセット又は(7)〜(11)のいずれか1記載のキットを用いて、SFTSウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行う工程を含む、SFTSウイルスの検出方法。
(13)SFTSウイルスの標的核酸領域の増幅反応がLAMP法による、(12)記載の方法。
(14)(1)〜(6)のいずれか1記載のプライマーセット又は(7)〜(11)のいずれか1記載のキットを用いて、SFTSウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、SFTSウイルス感染の有無を検査する工程を含む、SFTSウイルス感染症の検査方法。
本発明によれば、SFTSウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、LAMP法によりSFTSウイルスに特異的な塩基配列を増幅することで、SFTSウイルスを高感度且つ迅速に検出することができる。特に本発明では、他のプライマーセットを組み合わせることなく、Lセグメントの配列を増幅するプライマーセットのみで、高感度で特異性も良好なSFTSウイルス検出を実現した。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るプライマーセットは、SFTSウイルスに特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを含む、LAMP法によりSFTSウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットである。
本発明に係るプライマーセットによれば、被験体由来のサンプル中のSFTSウイルスを高感度且つ迅速に検出することができる。
本発明において使用されるサンプルとしては、SFTSウイルス感染が疑われるヒト又は他の動物の生体由来のサンプル、例えば喀痰、気管支肺胞洗浄液、鼻汁、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、うがい液、唾液、血液、血清、血漿、髄液、尿、精液および羊水等の体液、糞便、組織等が挙げられる。また、感染実験等に用いられた細胞やその培養液、あるいは生体由来の検体や培養細胞等から分離したウイルスを含む検体等もサンプルとなりうる。これらのサンプルは分離、抽出、濃縮、精製等の前処理を行っても良い。
本発明における核酸増幅は、納富らが開発した、PCR法で不可欠とされる温度制御が不要な核酸増幅法:LAMP法と呼ばれるループ媒介等温増幅法(国際公開第00/28082号パンフレット)で達成することができる。当該方法は、鋳型となるヌクレオチドに自身の3'末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とすると共に、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。また、LAMP法では、プライマーの3'末端が常にサンプルに由来する領域に対してアニールするために、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能するため、その結果として、高感度に且つ特異性の高い核酸増幅反応を可能としている。
LAMP反応で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の計6領域、すなわち3'末端側からF3c、F2c、F1cという領域と、5'末端側からB3、B2、B1という領域の塩基配列を認識する少なくとも4種類のプライマーであって、各々インナープライマーF(FIP)及びB(BIP)とアウタープライマーF(F3)及びB(B3)と呼ぶ。また、F1c、F2c、F3cの相補配列をそれぞれF1、F2、F3、またB1、B2、B3の相補鎖をB1c、B2c、B3cと呼ぶ。インナープライマーとは、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識し、且つ合成起点を与える塩基配列を3'末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を5'末端に有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「F2より選ばれた塩基配列」及び「F1cより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーF(FIP)、そして「B2より選ばれた塩基配列」と「B1cより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーB(BIP)と呼ぶ。一方、アウタープライマーとは、標的塩基配列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領域」の3'末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』を認識し、且つ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。ここで、「F3より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーF(F3)、「B3より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーB(B3)と呼ぶ。ここで、各プライマーにおけるFとは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示であり、一方、Bとは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示である。ここで、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの長さは、10塩基以上、好ましくは15塩基以上で、化学合成あるいは天然のどちらでも良く、各プライマーは単一のオリゴヌクレオチドであってもよく、複数のオリゴヌクレオチドの混合物であってもよい。
LAMP法においては、インナープライマーとアウタープライマーに加え、さらにこれとは別のプライマー、すなわちループプライマー(Loop Primer)を用いることができる。ループプライマーLF及び/又はLBは、増幅産物におけるダンベル構造の5'末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマーである。このプライマーを用いると、核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる(国際公開第02/24902号パンフレット)。ループプライマーの塩基配列は上述の増幅産物のダンベル構造の5'末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的であれば、標的遺伝子の塩基配列又はその相補鎖から選ばれても良く、他の塩基配列でも良い。また、ループプライマーは1種類でも2種類でも良い。
SFTSウイルスはマイナス鎖一本鎖RNAウイルスである。LAMP法は鋳型がRNAの場合には、鋳型がDNAの場合の反応液に逆転写酵素を添加することで、同様に核酸増幅反応を進めることができる(RT-LAMP法)。
SFTSウイルスに特異的な塩基配列を迅速に増幅できるLAMP法のプライマーの塩基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果、SFTSウイルスのゲノムLセグメントを標的配列として、以下の第1及び第2のプライマーセットを選定した。
第1のプライマーセット(実施例における「PM2119のPrimer set」に相当):
(a) F3:5'-CCTCCTCAGGAAGCATCTG-3'(配列番号1);
(b) B3:5'-TCCTCTTTGTTCTTGTAGTACCC-3'(配列番号2);
(c) FIP:5'-CATTCTACCCTCCCCTCTCTATGCATGGTGCGAATTG-3'(配列番号3);
(d) BIP:5'-GGGAGGAACATTTCATGCGCAGCTGTTGACCATATTCTC-3'(配列番号4);
(e) LF:5'-GATTAGGCTGAATGGCTGAC-3'(配列番号5);
(f) LB:5'-CTCAGGCCGGTCCAC-3'(配列番号6)。
第2のプライマーセット(実施例における「PM3191のPrimer set」に相当):
(g) F3:5'-AGGGAAGTCTCATGGATGG-3'(配列番号7);
(h) B3:5'-ATCCACCACCCCATTG-3'(配列番号8);
(i) FIP:5'-GGAGGCTGGATGTAAAGTGCGGGCGAACTTACATAAAGACAG-3'(配列番号9);
(j) BIP:5'-CTCTTGTGTTCAGAGCTTTTACAAGCTTTCCCCCATGTATCC-3'(配列番号10);
(k) LF:5'-CCCTGCATCATTCCTGTC-3'(配列番号11);
(l) LB:5'-CTTATTTCGTCTCAAAGCTTAAGG-3'(配列番号12)。
第1のプライマーセット(実施例における「PM2119のPrimer set」に相当):
(a) F3:5'-CCTCCTCAGGAAGCATCTG-3'(配列番号1);
(b) B3:5'-TCCTCTTTGTTCTTGTAGTACCC-3'(配列番号2);
(c) FIP:5'-CATTCTACCCTCCCCTCTCTATGCATGGTGCGAATTG-3'(配列番号3);
(d) BIP:5'-GGGAGGAACATTTCATGCGCAGCTGTTGACCATATTCTC-3'(配列番号4);
(e) LF:5'-GATTAGGCTGAATGGCTGAC-3'(配列番号5);
(f) LB:5'-CTCAGGCCGGTCCAC-3'(配列番号6)。
第2のプライマーセット(実施例における「PM3191のPrimer set」に相当):
(g) F3:5'-AGGGAAGTCTCATGGATGG-3'(配列番号7);
(h) B3:5'-ATCCACCACCCCATTG-3'(配列番号8);
(i) FIP:5'-GGAGGCTGGATGTAAAGTGCGGGCGAACTTACATAAAGACAG-3'(配列番号9);
(j) BIP:5'-CTCTTGTGTTCAGAGCTTTTACAAGCTTTCCCCCATGTATCC-3'(配列番号10);
(k) LF:5'-CCCTGCATCATTCCTGTC-3'(配列番号11);
(l) LB:5'-CTTATTTCGTCTCAAAGCTTAAGG-3'(配列番号12)。
また、図1に示すように、SFTSウイルスのゲノムLセグメントを標的配列として、以下の第3のプライマーセットを選定した。なお、図1において、「003A Ehime L」、「SPL179」、「SPL193」、「SPL230」及び「SPL238」は、各SFTSウイルス株のゲノムLセグメントである。
また、図1において、「Primer 1」は「PM5228のPrimer set 1」であり、「Primer 2」は「PM5228のPrimer set 2」である。
第3のプライマーセット:
(m) F3:5'-GATGGAGATGGGACTAGCAAC-3'(配列番号13);
(n) B3:5'-CTTGATCTTGAAYCCACTCAG-3'(配列番号14);
(o) FIP:5'-CTYCGGATSGATTCAATGACTGGCTTGAGGAGATCAGG-3'(配列番号15);
(p) BIP:5'-GTGAYGACCTTGGGATCACCTAACCATGCAATGACCTC-3'(配列番号16);
(q) LF:5'-CATAAAGCCTGGCATCACTAC-3'(配列番号17);
(r) LB:5'-YAACAGGGTRGCATCTGC-3'(配列番号18)。
第3のプライマーセット:
(m) F3:5'-GATGGAGATGGGACTAGCAAC-3'(配列番号13);
(n) B3:5'-CTTGATCTTGAAYCCACTCAG-3'(配列番号14);
(o) FIP:5'-CTYCGGATSGATTCAATGACTGGCTTGAGGAGATCAGG-3'(配列番号15);
(p) BIP:5'-GTGAYGACCTTGGGATCACCTAACCATGCAATGACCTC-3'(配列番号16);
(q) LF:5'-CATAAAGCCTGGCATCACTAC-3'(配列番号17);
(r) LB:5'-YAACAGGGTRGCATCTGC-3'(配列番号18)。
(n)のB3:オリゴヌクレオチドプライマーとして、例えば以下の(n')及び(n'')のオリゴヌクレオチドプライマーのうち1つ又は両方を使用してもよい:
(n') B3:5'-CTTGATCTTGAACCCACTCAG-3'(配列番号26);
(n'') B3:5'-CTTGATCTTGAATCCACTCAG-3'(配列番号27)。
(n') B3:5'-CTTGATCTTGAACCCACTCAG-3'(配列番号26);
(n'') B3:5'-CTTGATCTTGAATCCACTCAG-3'(配列番号27)。
また、(o)のFIP:オリゴヌクレオチドプライマーとして、例えば以下の(o')及び(o'')のオリゴヌクレオチドプライマーのうち1つ又は両方を使用してもよい:
(o') FIP:5'-CTTCGGATGGATTCAATGACTGGCTTGAGGAGATCAGG-3'(配列番号28);
(o'') FIP:5'-CTCCGGATCGATTCAATGACTGGCTTGAGGAGATCAGG-3'(配列番号29)。
(o') FIP:5'-CTTCGGATGGATTCAATGACTGGCTTGAGGAGATCAGG-3'(配列番号28);
(o'') FIP:5'-CTCCGGATCGATTCAATGACTGGCTTGAGGAGATCAGG-3'(配列番号29)。
さらに、(p)のBIP:オリゴヌクレオチドプライマーとして、例えば以下の(p')及び(p'')のオリゴヌクレオチドプライマーのうち1つ又は両方を使用してもよい:
(p') BIP:5'-GTGACGACCTTGGGATCACCTAACCATGCAATGACCTC-3'(配列番号30);
(p'') BIP:5'-GTGATGACCTTGGGATCACCTAACCATGCAATGACCTC-3'(配列番号31)。
(p') BIP:5'-GTGACGACCTTGGGATCACCTAACCATGCAATGACCTC-3'(配列番号30);
(p'') BIP:5'-GTGATGACCTTGGGATCACCTAACCATGCAATGACCTC-3'(配列番号31)。
また、(r)のLB:オリゴヌクレオチドプライマーとして、例えば以下の(r')及び(r'')のオリゴヌクレオチドプライマーのうち1つ又は両方を使用してもよい:
(r') LB:5'-TAACAGGGTGGCATCTGC-3'(配列番号32);
(r'') LB:5'-CAACAGGGTAGCATCTGC-3'(配列番号33)。
(r') LB:5'-TAACAGGGTGGCATCTGC-3'(配列番号32);
(r'') LB:5'-CAACAGGGTAGCATCTGC-3'(配列番号33)。
好ましくは、第3のプライマーセットとしては、
上述の(m)、(n')、(o')及び(p')のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含むか又はから成るプライマーセット;
上述の(m)、(n'')、(o'')及び(p'')のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含むか又はから成るプライマーセット;又は、
上述の(m)、(n')、(n'')、(o')、(o'')、(p')及び(p'')のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含むか又はから成るプライマーセット、
が挙げられる。
上述の(m)、(n')、(o')及び(p')のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含むか又はから成るプライマーセット;
上述の(m)、(n'')、(o'')及び(p'')のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含むか又はから成るプライマーセット;又は、
上述の(m)、(n')、(n'')、(o')、(o'')、(p')及び(p'')のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含むか又はから成るプライマーセット、
が挙げられる。
さらに好ましくは、第3のプライマーセットとしては、
上述の(m)、(n')、(o')、(p')、(q)及び(r')のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含むか又はから成るプライマーセット(実施例における「PM5228のPrimer set 1」に相当);
上述の(m)、(n'')、(o'')、(p'')、(q)及び(r'')のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含むか又はから成るプライマーセット(「PM5228のPrimer set 2」に相当);又は
上述の(m)、(n')、(n'')、(o')、(o'')、(p')、(p'')、(q)、(r')及び(r'')のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含むか又はから成るプライマーセット(「PM5228のPrimer set 1及び2の組合せ」に相当)、
が挙げられる。
上述の(m)、(n')、(o')、(p')、(q)及び(r')のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含むか又はから成るプライマーセット(実施例における「PM5228のPrimer set 1」に相当);
上述の(m)、(n'')、(o'')、(p'')、(q)及び(r'')のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含むか又はから成るプライマーセット(「PM5228のPrimer set 2」に相当);又は
上述の(m)、(n')、(n'')、(o')、(o'')、(p')、(p'')、(q)、(r')及び(r'')のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含むか又はから成るプライマーセット(「PM5228のPrimer set 1及び2の組合せ」に相当)、
が挙げられる。
核酸合成で使用する酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、例えばBst DNAポリメラーゼ(ラージフラグメント)、Bca(exo-)DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、Csa DNAポリメラーゼ等が挙げられ、好ましくはBst DNAポリメラーゼ(ラージフラグメント)が挙げられる。
RT-LAMP法に用いる逆転写酵素としては、RNAを鋳型としてDNAを合成する活性を有する酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、例えばAMV、Cloned AMV、MMLV、Recombinant HIVの逆転写酵素、SuperscriptII/III/IV、ReverTraAce、Thermoscript、Ominiscript、Sensiscript等が挙げられ、好ましくは、AMV又はCloned AMV逆転写酵素が挙げられる。またBca DNAポリメラーゼのように、逆転写酵素活性とDNAポリメラーゼ活性の両活性を有する酵素を用いると、RT-LAMP反応を1つの酵素で行うことができる。
核酸合成で使用する酵素や逆転写酵素は、ウイルスや細菌等から精製されたものでも良く、遺伝子組み換え技術によって作製されたものでも良い。またこれらの酵素はフラグメント化やアミノ酸の置換等の改変をされたものでも良い。
LAMP反応後の核酸増幅産物の検出には公知の技術が適用できる。例えば、増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドや蛍光性インターカレーター法(特開2001-242169号公報)を用いたり、あるいは反応終了後の反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にかけたりしても容易に検出できる。アガロースゲル電気泳動では、LAMP増幅産物は、塩基長の異なる多数のバンドがラダー(はしご)状に検出される。また、LAMP法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸が、共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、反応液が肉眼でも確認できる程に白濁する。従って、この白濁を、反応終了後あるいは反応中の濁度上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器、例えば400nmの吸光度変化を通常の分光光度計を用いて確認することで、核酸増幅反応を検出することも可能である(国際公開第01/83817号パンフレット)。
LAMP反応の核酸増幅産物の検出の一態様としては、蛍光標識プローブを用いる方法が挙げられる。例えば、蛍光消光プローブ(Quenching Probe:QProbe(登録商標))と称される3'末端または5'末端に蛍光標識されたプローブは、標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素がその発光を減少させることで、増幅産物を検出又は定量することができる(特開2001-286300号公報)。また末端部分において、ハイブリダイゼーションの塩基対がG(グアニン)とC(シトシン)のペアを形成するように設計されることを特徴としている。ここで使用される蛍光標識としては、例えば、BODIPY-FL、カルボキシローダミン6G(CR6G)、カルボキシテトラメチルローダミン(TAMRA)、Pacific Blue、フルオレセイン-4-イソチオシアネート(FITC)等が挙げられる。
本発明においては、上記3組のプライマーセットに合わせて、以下のQProbeを使用することができる。なお、各QProbeは、3'末端にBODIPY-FLで標識されている。
第1のプライマーセットに対するQProbe(実施例におけるPM2119に対するQPに相当):
以下の(aa)又は(bb)のオリゴヌクレオチドを有するQProbe:
(aa) 5'-GGATTAGGCTGAATGGCTGAGAAGC-3'(配列番号19);
(bb) 5'-GGATTAGGCTGAATGGCTGAGAAIC-3'(配列番号20)。
第2のプライマーセットに対するQProbe(実施例におけるPM3191に対するQPに相当):
以下の(cc)のオリゴヌクレオチドを有するQProbe:
(cc) 5'-CAATATGCCCTGCATCATTCCTGTC-3'(配列番号21)。
第3のプライマーセットに対するQProbe(実施例におけるPM5228に対するQPに相当):
以下の(dd)〜(gg)のいずれか1つのオリゴヌクレオチドを有するQProbe:
(dd) 5'-CATAAAGCCTGGCATCACTACTGAGCC-3'(配列番号22);
(ee) 5'-TAACAGGGTGGCATCTGCATATAGAGGTC-3'(配列番号23);
(ff) 5'-GGATCCAATAACAGGGTGGCATCTGC-3'(配列番号24);
(gg) 5'-GGATCCAATAACAGGGTGGCATCTIC-3'(配列番号25)。
第1のプライマーセットに対するQProbe(実施例におけるPM2119に対するQPに相当):
以下の(aa)又は(bb)のオリゴヌクレオチドを有するQProbe:
(aa) 5'-GGATTAGGCTGAATGGCTGAGAAGC-3'(配列番号19);
(bb) 5'-GGATTAGGCTGAATGGCTGAGAAIC-3'(配列番号20)。
第2のプライマーセットに対するQProbe(実施例におけるPM3191に対するQPに相当):
以下の(cc)のオリゴヌクレオチドを有するQProbe:
(cc) 5'-CAATATGCCCTGCATCATTCCTGTC-3'(配列番号21)。
第3のプライマーセットに対するQProbe(実施例におけるPM5228に対するQPに相当):
以下の(dd)〜(gg)のいずれか1つのオリゴヌクレオチドを有するQProbe:
(dd) 5'-CATAAAGCCTGGCATCACTACTGAGCC-3'(配列番号22);
(ee) 5'-TAACAGGGTGGCATCTGCATATAGAGGTC-3'(配列番号23);
(ff) 5'-GGATCCAATAACAGGGTGGCATCTGC-3'(配列番号24);
(gg) 5'-GGATCCAATAACAGGGTGGCATCTIC-3'(配列番号25)。
本発明に係るプライマーセットを用いて核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、予めパッケージングしてSFTSウイルス検出又はSFTSウイルス感染症診断用にキット化することができる。具体的には、本発明に係るプライマーセット、蛍光標識プローブ、核酸合成の基質となる4種類のdNTP、核酸合成を行うDNAポリメラーゼ、逆転写活性を持つ酵素、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液や塩類、酵素や鋳型を安定化する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類がキットとして提供される。
以上に説明した本発明に係るプライマーセット又はキットを用いて、SFTSウイルスの標的核酸領域の増幅反応(好ましくはLAMP法)を行い、SFTSウイルスを検出又は定量することができる。換言すれば、当該検出又は定量により、SFTSウイルス感染の有無を検査し、SFTSウイルス感染症を検査又は評価することができる。本発明に係るプライマーセットを用いたLAMPの反応液には、例えば、反応液25μl当たり、本発明に係るプライマーセットに含まれる各プライマー2.5〜80pmol(好ましくは5〜40pmol)、検体用核酸0.02fg〜4μg(好ましくは8fg〜0.0004μg)、鎖置換型DNA合成酵素4〜64U(好ましくは8〜32U)、逆転写酵素0.1〜10U(好ましくは0.5〜4U)、最終濃度0.8〜2.4mM(好ましくは1.2〜1.8mM)のdNTPが含まれる。また、QProbeを使用する場合には、例えば、LAMPの反応液25μl当たり0.5〜20pmol(好ましくは1〜5pmol)のQProbeを含む。さらに、LAMPの増幅反応条件としては、例えば、温度60℃〜65℃(好ましくは63℃)で10〜60分(好ましくは15〜30分)が挙げられる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
以下の実施例において使用するプライマーセット及びQProbe(QP)を以下の表1に示す。
〔実施例1〕 SFTS virus検出用Primerの反応性確認
SFTS virus検出用Primerを用いてLAMP反応を行った。
SFTS virus検出用Primerを用いてLAMP反応を行った。
1.試料及び試薬の調製
1)試料
SFTSウイルス HB29株のRNAを、10mM Tris buffer(WAKO製) pH8.0に溶解し、1テスト当たり100、1,000、10,000コピーとなるよう試料溶液を調製した。また同Tris bufferを0コピーの試料溶液とした。
1)試料
SFTSウイルス HB29株のRNAを、10mM Tris buffer(WAKO製) pH8.0に溶解し、1テスト当たり100、1,000、10,000コピーとなるよう試料溶液を調製した。また同Tris bufferを0コピーの試料溶液とした。
2)LAMP法に用いる試薬組成及び濃度
LAMP法で使用するSFTSウイルス検出用プライマーとして、
プライマーセット(1):PM2119
プライマーセット(2):PM3191
プライマーセット(3):PM5228(Primer set 1)
を使用した。
LAMP法で使用するSFTSウイルス検出用プライマーとして、
プライマーセット(1):PM2119
プライマーセット(2):PM3191
プライマーセット(3):PM5228(Primer set 1)
を使用した。
最終反応溶液25μL中の各試薬濃度が下記になるよう調製した。
反応溶液組成(濁度検出系):
・20mM Tricine pH8.6
・30mM KCl
・8mM MgSO4
・1.4mM dNTPs
・0.5%Tween20
・1.6mM DTT
・1.6μM FIP及びBIP
・0.2μM F3及びB3
・0.8μM LF及びLB
・AMV Reverse Transcriptase 1.0U(20U/μl、Roche)
・Bst DNApolymerase 16U(New England Biolabs)
・RNase Inhibitor(40U/μl) 1μL
・RNA Template 5μL
反応溶液組成(濁度検出系):
・20mM Tricine pH8.6
・30mM KCl
・8mM MgSO4
・1.4mM dNTPs
・0.5%Tween20
・1.6mM DTT
・1.6μM FIP及びBIP
・0.2μM F3及びB3
・0.8μM LF及びLB
・AMV Reverse Transcriptase 1.0U(20U/μl、Roche)
・Bst DNApolymerase 16U(New England Biolabs)
・RNase Inhibitor(40U/μl) 1μL
・RNA Template 5μL
反応溶液組成(インターカレーター系):
上記検出系の反応溶液組成に、更に以下の試薬を添加して調製した。
・PPase 20mU(New England Biolabs)
・YO-PRO-1 160nM(Thermo Fisher Scientific)
上記検出系の反応溶液組成に、更に以下の試薬を添加して調製した。
・PPase 20mU(New England Biolabs)
・YO-PRO-1 160nM(Thermo Fisher Scientific)
反応溶液組成(probe系):
上記検出系の反応溶液組成に、更に以下の試薬を添加して調製した。
・PPase 20mU(New England Biolabs)
・QProbe 0.04μM(日鉄住金環境株式会社)
上記検出系の反応溶液組成に、更に以下の試薬を添加して調製した。
・PPase 20mU(New England Biolabs)
・QProbe 0.04μM(日鉄住金環境株式会社)
表1に示す各QProbe(QP)を、各LAMPプライマーセット(1)-(3)と組み合わせて使用した。
2.LAMP法による反応
LAMP反応は、LAMP用試薬にRNA溶液5μLを加え、最終反応溶液25μLとし、0.2mLの専用チューブ内でリアルタイム定量PCRシステムMx3005P(Agilent Technologies)を用い、63℃で30分LAMP反応を行った。
LAMP反応は、LAMP用試薬にRNA溶液5μLを加え、最終反応溶液25μLとし、0.2mLの専用チューブ内でリアルタイム定量PCRシステムMx3005P(Agilent Technologies)を用い、63℃で30分LAMP反応を行った。
3.リアルタイム蛍光(インターカレーター系)測定による検出感度の比較結果
プライマーセット(1)-(3)を用いたLAMP法のリアルタイム蛍光測定の反応時間の結果を表2に示す。各コピー数について、2重測定を実施した。表の上から、10000c/t(コピー/テスト)、1000コピー/テスト、100コピー/テスト、鋳型なし(0コピー/テスト)を示す。また、増幅曲線の結果を図2に示す。
プライマーセット(1)-(3)を用いたLAMP法のリアルタイム蛍光測定の反応時間の結果を表2に示す。各コピー数について、2重測定を実施した。表の上から、10000c/t(コピー/テスト)、1000コピー/テスト、100コピー/テスト、鋳型なし(0コピー/テスト)を示す。また、増幅曲線の結果を図2に示す。
<結果・考察>
プライマーセット(1)-(3)は、100コピー以上が測定開始後20分までに蛍光の増加を確認し、0コピーは測定時間中の増加が確認されなかった。
プライマーセット(1)-(3)は、100コピー以上が測定開始後20分までに蛍光の増加を確認し、0コピーは測定時間中の増加が確認されなかった。
4.リアルタイム蛍光(probe系)測定による検出感度の比較結果
プライマーセット(1)-(3)を用いたLAMP法のリアルタイム蛍光測定の反応時間の結果を表3に示す。各コピー数について、2重測定を実施した。表の上から、10000c/t(コピー/テスト)、1000コピー/テスト、100コピー/テスト、鋳型なし(0コピー/テスト)を示す。また、増幅曲線の結果を図3に示す。
プライマーセット(1)-(3)を用いたLAMP法のリアルタイム蛍光測定の反応時間の結果を表3に示す。各コピー数について、2重測定を実施した。表の上から、10000c/t(コピー/テスト)、1000コピー/テスト、100コピー/テスト、鋳型なし(0コピー/テスト)を示す。また、増幅曲線の結果を図3に示す。
<結果・考察>
プライマーセット(1)-(3)は、100コピー以上が測定開始後30分までに蛍光の増加を確認し、0コピーは測定時間中の増加が確認されなかった。
プライマーセット(1)-(3)は、100コピー以上が測定開始後30分までに蛍光の増加を確認し、0コピーは測定時間中の増加が確認されなかった。
本発明によれば、SFTSウイルスを高感度且つ迅速に検出することができ、SFTSウイルス感染症を効率的に診断することができる。
Claims (14)
- 以下の(a)〜(d)のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含む、重症熱性血小板減少症候群(SFTS)ウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(a) 5'-CCTCCTCAGGAAGCATCTG-3'(配列番号1)
(b) 5'-TCCTCTTTGTTCTTGTAGTACCC-3'(配列番号2)
(c) 5'-CATTCTACCCTCCCCTCTCTATGCATGGTGCGAATTG-3'(配列番号3)
(d) 5'-GGGAGGAACATTTCATGCGCAGCTGTTGACCATATTCTC-3'(配列番号4) - 以下の(e)及び/又は(f)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項1記載のプライマーセット。
(e) 5'-GATTAGGCTGAATGGCTGAC-3'(配列番号5)
(f) 5'-CTCAGGCCGGTCCAC-3'(配列番号6) - 以下の(g)〜(j)のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含む、SFTSウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(g) 5'-AGGGAAGTCTCATGGATGG-3'(配列番号7)
(h) 5'-ATCCACCACCCCATTG-3'(配列番号8)
(i) 5'-GGAGGCTGGATGTAAAGTGCGGGCGAACTTACATAAAGACAG-3'(配列番号9)
(j) 5'-CTCTTGTGTTCAGAGCTTTTACAAGCTTTCCCCCATGTATCC-3'(配列番号10) - 以下の(k)及び/又は(l)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項3記載のプライマーセット。
(k) 5'-CCCTGCATCATTCCTGTC-3'(配列番号11)
(l) 5'-CTTATTTCGTCTCAAAGCTTAAGG-3'(配列番号12) - 以下の(m)〜(p)のオリゴヌクレオチドプライマー全てを含む、SFTSウイルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセット。
(m) 5'-GATGGAGATGGGACTAGCAAC-3'(配列番号13)
(n) 5'-CTTGATCTTGAAYCCACTCAG-3'(配列番号14)
(o) 5'-CTYCGGATSGATTCAATGACTGGCTTGAGGAGATCAGG-3'(配列番号15)
(p) 5'-GTGAYGACCTTGGGATCACCTAACCATGCAATGACCTC-3'(配列番号16) - 以下の(q)及び/又は(r)のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項5記載のプライマーセット。
(q) 5'-CATAAAGCCTGGCATCACTAC-3'(配列番号17)
(r) 5'-YAACAGGGTRGCATCTGC-3'(配列番号18) - 請求項1〜6のいずれか1項記載のプライマーセットを含む、SFTSウイルス検出又はSFTSウイルス感染症診断用キット。
- 蛍光標識プローブをさらに含む、請求項7記載のキット。
- 請求項1又は2記載のプライマーセットを含み、蛍光標識プローブが以下の(aa)及び/又は(bb)のオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブである、請求項8記載のキット。
(aa) 5'-GGATTAGGCTGAATGGCTGAGAAGC-3'(配列番号19)
(bb) 5'-GGATTAGGCTGAATGGCTGAGAAIC-3'(配列番号20) - 請求項3又は4記載のプライマーセットを含み、蛍光標識プローブが以下の(cc)のオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブである、請求項8記載のキット。
(cc) 5'-CAATATGCCCTGCATCATTCCTGTC-3'(配列番号21) - 請求項5又は6記載のプライマーセットを含み、蛍光標識プローブが以下の(dd)〜(gg)のいずれか1つのオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブである、請求項8記載のキット。
(dd) 5'-CATAAAGCCTGGCATCACTACTGAGCC-3'(配列番号22)
(ee) 5'-TAACAGGGTGGCATCTGCATATAGAGGTC-3'(配列番号23)
(ff) 5'-GGATCCAATAACAGGGTGGCATCTGC-3'(配列番号24)
(gg) 5'-GGATCCAATAACAGGGTGGCATCTIC-3'(配列番号25) - 請求項1〜6のいずれか1項記載のプライマーセット又は請求項7〜11のいずれか1項記載のキットを用いて、SFTSウイルスの標的核酸領域の増幅反応を行う工程を含む、SFTSウイルスの検出方法。
- SFTSウイルスの標的核酸領域の増幅反応がLAMP法による請求項12記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項記載のプライマーセット又は請求項7〜11のいずれか1項記載のキットを用いて、SFTSウイルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより、SFTSウイルス感染の有無を検査する工程を含む、SFTSウイルス感染症の検査方法。
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