JP7048819B2 - 一本鎖rnaウイルスを検出する方法 - Google Patents
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Description
[1]
試料中の一本鎖RNAウイルスを検出する方法であって、
プライマーセットを試料に接触させて、逆転写ループ媒介等温増幅反応を行う工程を含み、
プライマーセットは、一本鎖RNAウイルスの標的RNAの塩基配列と、該標的RNAに相補的な核酸の塩基配列と、に基づいて設計され、
一本鎖RNAウイルスがプラス鎖型一本鎖RNAウイルスの場合、標的RNAは、5’末端から3’末端の方向に、任意の領域F3、F2、F1、B1c、B2c及びB3cをこの順に備え、標的RNAに相補的な核酸は、3’末端から5’末端の方向に、任意の領域F3c、F2c、F1c、B1、B2、及びB3をこの順に備え、
一本鎖RNAウイルスがマイナス鎖型一本鎖RNAウイルスの場合、標的RNAは、3’末端から5’末端の方向に、任意の領域F3c、F2c、F1c、B1、B2、及びB3をこの順に備え、標的RNAに相補的な核酸は、5’末端から3’末端の方向に任意の領域F3、F2、F1、B1c、B2c及びB3cをこの順に備え、
プライマーセットは、以下の(i)~(v):
(i)領域F1cと同じ塩基配列を5’末端に有し、領域F2と同じ塩基配列を3’末端に有する、FIPプライマー、
(ii)領域B1cと同じ塩基配列を5’末端に有し、領域B2と同じ塩基配列を3’末端に有する、BIPプライマー、
(iii)領域F3と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるF3プライマー、
(iv)領域B3と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるB3プライマー、及び
(v)1以上のさらなるアウタープライマーであって、各さらなるアウタープライマーは、標的RNAに相補的な核酸において領域B3又は領域F3よりも5’末端側に存在する任意の領域と同じ塩基配列を有する、アウタープライマー
を含み、ただし、FIPプライマー、BIPプライマー、F3プライマー、B3プライマー、及び1以上のさらなるアウタープライマーの塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい、方法。
[2]
試料中のプラス鎖型一本鎖RNAウイルスを検出する方法であって、
プライマーセットを試料に接触させて、逆転写ループ媒介等温増幅反応を行う工程を含み、
プライマーセットは、
5’末端から3’末端の方向に任意の領域F3、F2、F1、B1c、B2c及びB3cをこの順に備える標的RNAの塩基配列と、
3’末端から5’末端の方向に任意の領域F3c、F2c、F1c、B1、B2、及びB3をこの順に備える、標的RNAに相補的な核酸の塩基配列と、に基づいて設計され、以下の(i)~(v):
(i)領域F1cと同じ塩基配列を5’末端に有し、領域F2と同じ塩基配列を3’末端に有する、FIPプライマー、
(ii)領域B1cと同じ塩基配列を5’末端に有し、領域B2と同じ塩基配列を3’末端に有する、BIPプライマー、
(iii)領域F3と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるF3プライマー、
(iv)領域B3と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるB3プライマー、及び
(v)1以上のさらなるアウタープライマーであって、各さらなるアウタープライマーは、標的RNAに相補的な核酸において領域B3よりも5’末端側に存在する任意の領域と同じ塩基配列を有する、アウタープライマー
を含み、ただし、FIPプライマー、BIPプライマー、F3プライマー、B3プライマー、及び1以上のさらなるアウタープライマーの塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい、方法。
[3]
試料中のマイナス鎖型一本鎖RNAウイルスを検出する方法であって、
プライマーセットを試料に接触させて、逆転写ループ媒介等温増幅反応を行う工程を含み、
プライマーセットは、
3’末端から5’末端の方向に任意の領域F3c、F2c、F1c、B1、B2、及びB3をこの順に備える標的RNAの塩基配列と、
5’末端から3’末端の方向に任意の領域F3、F2、F1、B1c、B2c及びB3cをこの順に備える、標的RNAに相補的な核酸の塩基配列と、に基づいて設計され、以下の(i)~(v):
(i)領域F1cと同じ塩基配列を5’末端に有し、領域F2と同じ塩基配列を3’末端に有する、FIPプライマー、
(ii)領域B1cと同じ塩基配列を5’末端に有し、領域B2と同じ塩基配列を3’末端に有する、BIPプライマー、
(iii)領域F3と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるF3プライマー、
(iv)領域B3と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるB3プライマー、及び
(v)1以上のさらなるアウタープライマーであって、各さらなるアウタープライマーは、標的RNAに相補的な核酸において領域F3よりも5’末端側に存在する任意の領域と同じ塩基配列を有する、アウタープライマー
を含み、ただし、FIPプライマー、BIPプライマー、F3プライマー、B3プライマー、及び1以上のさらなるアウタープライマーの塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい、方法。
[4]
プライマーセットが、
(vi)領域F1cと領域F2cとの間の任意の領域と同じ塩基配列を有するループプライマーF、及び
(vii)領域B1cと領域B2cとの間の任意の領域と同じ塩基配列を有するループプライマーB
をさらに含み、ただし、ループプライマーF及びループプライマーBの塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい、[1]~[3]のいずれかに記載の方法。
[5]
(v)の1以上のさらなるアウタープライマーの融解温度が30~55℃である、[1]~[4]のいずれかに記載の方法。
[6]
プライマーセットが(v)のさらなるアウタープライマーを一つ含む、[1]~[5]のいずれかに記載の方法。
[7]
逆転写ループ媒介等温増幅反応の増幅産物を検出する工程をさらに含む、[1]~[6]のいずれかに記載の方法。
[8]
一本鎖RNAウイルスを検出するためのキットであって、
プライマーセットを含み、
プライマーセットは、一本鎖RNAウイルスの標的RNAの塩基配列と、該標的RNAに相補的な核酸の塩基配列と、に基づいて設計され、
一本鎖RNAウイルスがプラス鎖型一本鎖RNAウイルスの場合、標的RNAは、5’末端から3’末端の方向に、任意の領域F3、F2、F1、B1c、B2c及びB3cをこの順に備え、標的RNAに相補的な核酸は、3’末端から5’末端の方向に、任意の領域F3c、F2c、F1c、B1、B2、及びB3をこの順に備え、
一本鎖RNAウイルスがマイナス鎖型一本鎖RNAウイルスの場合、標的RNAは、3’末端から5’末端の方向に、任意の領域F3c、F2c、F1c、B1、B2、及びB3をこの順に備え、標的RNAに相補的な核酸は、5’末端から3’末端の方向に、任意の領域F3、F2、F1、B1c、B2c及びB3cをこの順に備え、
プライマーセットは、以下の(i)~(v):
(i)領域F1cと同じ塩基配列を5’末端に有し、領域F2と同じ塩基配列を3’末端に有する、FIPプライマー、
(ii)領域B1cと同じ塩基配列を5’末端に有し、領域B2と同じ塩基配列を3’末端に有する、BIPプライマー、
(iii)領域F3と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるF3プライマー、
(iv)領域B3と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるB3プライマー、及び
(v)1以上のさらなるアウタープライマーであって、各さらなるアウタープライマーは、標的RNAに相補的な核酸において領域B3又は領域F3よりも5’末端側に存在する任意の領域と同じ塩基配列を有する、アウタープライマー
を含み、ただし、FIPプライマー、BIPプライマー、F3プライマー、B3プライマー、及び1以上のさらなるアウタープライマーの塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい、キット。
<参考例1>
0.2mLの試薬チューブに、次の組成を有する反応液25μLを調製した:
20mM トリシン(pH8.6)、
30mM KCl、
8mM MgSO4、
1.4mM dNTPs、
0.5% Tween20、
1.6mM DTT、
1.6μM FIPプライマー及びBIPプライマー、
0.2μM F3プライマー及びB3プライマー、
0.8μM ループプライマーF及びループプライマーB、
AMV Reverse Transcriptase 1.0U(20U/μL、Roche社製)、
Bst DNApolymerase 22.8U(New England Biolabs社製)、
RNase阻害剤(40U/μL、プロメガ社製)1μL、
鋳型RNA(100コピー)5μL、
PPase 20mU(New England Biolabs社製)、及び
0.04μM QProbe(登録商標)。
反応溶液に終濃度で0.2μMのB4プライマーを追加した以外は参考例1と同様にしてRT-LAMP反応を行った(N=2)。B4プライマーとしては、表3に示すプライマーを用いた。比較のため、同様の反応をB4プライマーなしでも行った。結果を表4に示す。また、参考までに、鋳型RNAの量を10000コピーに上げた場合の検出結果を表4に併せて示す。
測定回数を増やして(N=6)実施例1と同様のRT-LAMP反応を行った。B4プライマーとしてはB3-m27を用いた。比較のため、同様の反応をB4プライマーなしでも行った。結果を表5に示す。また、参考までに、鋳型RNAの量を10000コピーに上げた場合の検出結果を表5に併せて示す。
B4プライマーの代わりに表6に示すF4プライマーを用いて、実施例1と同様のRT-LAMP反応を行った。比較のため、同様の反応をF4プライマーなしでも行った。結果を表7に示す。また、参考までに、鋳型RNAの量を10000コピーに上げた場合の検出結果を表7に併せて示す。
<参考例2>
0.2mLの試薬チューブに、次の組成を有する反応液25μLを調製した:
20mM トリシン(pH8.6)、
30mM KCl、
8mM MgSO4、
1.4mM dNTPs、
0.5% Tween20、
1.6mM DTT、
1.6μM FIPプライマー及びBIPプライマー、
0.2μM F3プライマー及びB3プライマー、
0.8μM ループプライマーF及びループプライマーB、
AMV Reverse Transcriptase 1.0U(20U/μL、Roche社製)、
Bst DNApolymerase 22.8U(New England Biolabs社製)、
RNase阻害剤(40U/μL、プロメガ社製)1μL、
鋳型RNA(200コピー)5μL、
PPase 20mU(New England Biolabs社製)、及び
0.1μM SYTO 63 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)。
反応溶液に終濃度で0.2μMのF4プライマーを追加した以外は参考例2と同様にしてRT-LAMP反応を行った(N=6)。F4プライマーとしては、表10に示すプライマーを用いた。比較のため、同様の反応をF4プライマーなしでも行った。結果を表11に示す。また、参考までに、鋳型RNAの量を10000コピーに上げた場合の検出結果を表11に併せて示す。
F4プライマーの代わりに表12に示すB4プライマーを用いて、実施例3と同様のRT-LAMP反応を行った。比較のため、同様の反応をB4プライマーなしでも行った。結果を表13に示す。また、参考までに、鋳型RNAの量を10000コピーに上げた場合の検出結果を表13に併せて示す。
<参考例3>
鋳型RNAとプライマーセットを次のように変更した以外は、試験例1の参考例1と同様のRT-LAMP反応を行った。FIPプライマー、BIPプライマー、F3プライマー、B3プライマー、ループプライマーF、ループプライマーB、及びQProbeとしては、それぞれ表14に示すZIKV FIP、ZIKV BIP、ZIKV F3、ZIKV B3、ZIKV LF、ZIKV LB、及びZIKV Qpを用いた。鋳型RNA(配列番号41)は、ZIKVのNS5遺伝子からRT-PCRにより作製したcDNAをプラスミドに組み込み、該プラスミドDNAからRNAを転写及び精製することにより作製した。転写には、Script Max Thermo T7 Transcription Kitを用い、RNA精製にはRNeasy Mini Kitを用いた。QProbeの3’末端はBODIPYで標識した。結果を表15に示す。
反応溶液に終濃度で0.2μMのB4プライマーを追加した以外は参考例3と同様にしてRT-LAMP反応を行った(N=6)。B4プライマーとしては、表16に示すプライマーを用いた。比較のため、同様の反応をB4プライマーなしでも行った。結果を表17に示す。また、参考までに、鋳型RNAの量を10000コピーに上げた場合の検出結果を表17に併せて示す。
B4プライマーの代わりに表18に示すF4プライマーを用いて、実施例4と同様のRT-LAMP反応を行った。比較のため、同様の反応をF4プライマーなしでも行った。結果を表19に示す。また、参考までに、鋳型RNAの量を10000コピーに上げた場合の検出結果を表19に併せて示す。
<参考例4>
0.2mLの試薬チューブに、次の組成を有する反応液25μLを調製した:
20mM トリシン(pH8.6)、
30mM KCl、
8mM MgSO4、
1.4mM dNTPs、
0.5% Tween20、
1.6mM DTT、
1.6μM FIPプライマー及びBIPプライマー、
0.2μM F3プライマー及びB3プライマー、
0.8μM ループプライマーB、
AMV Reverse Transcriptase 1.0U(20U/μL、Roche社製)、
Bst DNApolymerase 22.8U(New England Biolabs社製)、
RNase阻害剤(40U/μL、プロメガ社製)1μL、
鋳型RNA(10000コピー)5μL、
PPase 20mU(New England Biolabs社製)、及び
0.1μM SYTO 63 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)。
反応溶液に終濃度で0.2μMのF4プライマーを追加した以外は参考例4と同様にしてRT-LAMP反応を行った(N=6)。F4プライマーとしては、表22に示すプライマーを用いた。比較のため、同様の反応をF4プライマーなしでも行った。結果を表23に示す。また、参考までに、鋳型RNAの量を1×106コピーに上げた場合の検出結果を表23に併せて示す。
F4プライマーの代わりに表24に示すB4プライマーを用いて、実施例5と同様のRT-LAMP反応を行った。比較のため、同様の反応をB4プライマーなしでも行った。結果を表25に示す。また、参考までに、鋳型RNAの量を1×106に上げた場合の検出結果を表25に併せて示す。
Claims (8)
- 試料中の一本鎖RNAウイルスを検出する方法であって、
プライマーセットを試料に接触させて、逆転写ループ媒介等温増幅反応を行う工程を含み、
プライマーセットは、一本鎖RNAウイルスの標的RNAの塩基配列と、該標的RNAに相補的な核酸の塩基配列と、に基づいて設計され、
一本鎖RNAウイルスがプラス鎖型一本鎖RNAウイルスの場合、標的RNAは、5’末端から3’末端の方向に、任意の領域F3、F2、F1、B1c、B2c及びB3cをこの順に備え、標的RNAに相補的な核酸は、3’末端から5’末端の方向に、任意の領域F3c、F2c、F1c、B1、B2、及びB3をこの順に備え、
一本鎖RNAウイルスがマイナス鎖型一本鎖RNAウイルスの場合、標的RNAは、3’末端から5’末端の方向に、任意の領域F3c、F2c、F1c、B1、B2、及びB3をこの順に備え、標的RNAに相補的な核酸は、5’末端から3’末端の方向に任意の領域F3、F2、F1、B1c、B2c及びB3cをこの順に備え、
領域F3、F2、F1、B1c、B2c、及びB3cは、それぞれ領域F3c、F2c、F1c、B1、B2、及びB3に相補的であり、
プライマーセットは、以下の(i)~(v):
(i)領域F1cと同じ塩基配列を5’末端に有し、領域F2と同じ塩基配列を3’末端に有する、FIPプライマー、
(ii)領域B1cと同じ塩基配列を5’末端に有し、領域B2と同じ塩基配列を3’末端に有する、BIPプライマー、
(iii)領域F3と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるF3プライマー、
(iv)領域B3と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるB3プライマー、及び
(v)1以上のさらなるアウタープライマーであって、各さらなるアウタープライマーは、標的RNAに相補的な核酸において領域B3又は領域F3よりも5’末端側に存在する任意の領域と同じ塩基配列を有する、アウタープライマー
を含み、ただし、FIPプライマー、BIPプライマー、F3プライマー、B3プライマー、及び1以上のさらなるアウタープライマーの塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい、方法。 - 一本鎖RNAウイルスがプラス鎖型一本鎖RNAウイルスであり、
標的RNAが、5’末端から3’末端の方向に任意の領域F3、F2、F1、B1c、B2c及びB3cをこの順に備え、
標的RNAに相補的な核酸が、3’末端から5’末端の方向に任意の領域F3c、F2c、F1c、B1、B2、及びB3をこの順に備え、
各前記さらなるアウタープライマーは、標的RNAに相補的な核酸において領域B3よりも5’末端側に存在する任意の領域と同じ塩基配列を有する、請求項1に記載の方法。 - 一本鎖RNAウイルスがマイナス鎖型一本鎖RNAウイルスであり、
標的RNAが、3’末端から5’末端の方向に任意の領域F3c、F2c、F1c、B1、B2、及びB3をこの順に備え、
標的RNAに相補的な核酸が、5’末端から3’末端の方向に任意の領域F3、F2、F1、B1c、B2c及びB3cをこの順に備え、
各前記さらなるアウタープライマーは、標的RNAに相補的な核酸において領域F3よりも5’末端側に存在する任意の領域と同じ塩基配列を有する、請求項1に記載の方法。 - プライマーセットが、
(vi)領域F1cと領域F2cとの間の任意の領域と同じ塩基配列を有するループプライマーF、及び
(vii)領域B1cと領域B2cとの間の任意の領域と同じ塩基配列を有するループプライマーB
をさらに含み、ただし、ループプライマーF及びループプライマーBの塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。 - (v)の1以上のさらなるアウタープライマーの融解温度が30~55℃である、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- プライマーセットが(v)のさらなるアウタープライマーを一つ含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 逆転写ループ媒介等温増幅反応の増幅産物を検出する工程をさらに含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 一本鎖RNAウイルスを検出するためのキットであって、
プライマーセットを含み、
プライマーセットは、一本鎖RNAウイルスの標的RNAの塩基配列と、該標的RNAに相補的な核酸の塩基配列と、に基づいて設計され、
一本鎖RNAウイルスがプラス鎖型一本鎖RNAウイルスの場合、標的RNAは、5’末端から3’末端の方向に、任意の領域F3、F2、F1、B1c、B2c及びB3cをこの順に備え、標的RNAに相補的な核酸は、3’末端から5’末端の方向に、任意の領域F3c、F2c、F1c、B1、B2、及びB3をこの順に備え、
一本鎖RNAウイルスがマイナス鎖型一本鎖RNAウイルスの場合、標的RNAは、3’末端から5’末端の方向に、任意の領域F3c、F2c、F1c、B1、B2、及びB3をこの順に備え、標的RNAに相補的な核酸は、5’末端から3’末端の方向に、任意の領域F3、F2、F1、B1c、B2c及びB3cをこの順に備え、
領域F3、F2、F1、B1c、B2c、及びB3cは、それぞれ領域F3c、F2c、F1c、B1、B2、及びB3に相補的であり、
プライマーセットは、以下の(i)~(v):
(i)領域F1cと同じ塩基配列を5’末端に有し、領域F2と同じ塩基配列を3’末端に有する、FIPプライマー、
(ii)領域B1cと同じ塩基配列を5’末端に有し、領域B2と同じ塩基配列を3’末端に有する、BIPプライマー、
(iii)領域F3と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるF3プライマー、
(iv)領域B3と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるB3プライマー、及び
(v)1以上のさらなるアウタープライマーであって、各さらなるアウタープライマーは、標的RNAに相補的な核酸において領域B3又は領域F3よりも5’末端側に存在する任意の領域と同じ塩基配列を有する、アウタープライマー
を含み、ただし、FIPプライマー、BIPプライマー、F3プライマー、B3プライマー、及び1以上のさらなるアウタープライマーの塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい、キット。
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