CN103074445A - 禽博尔纳病毒检测用引物组、试剂盒及其使用方法 - Google Patents
禽博尔纳病毒检测用引物组、试剂盒及其使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103074445A CN103074445A CN2012103927922A CN201210392792A CN103074445A CN 103074445 A CN103074445 A CN 103074445A CN 2012103927922 A CN2012103927922 A CN 2012103927922A CN 201210392792 A CN201210392792 A CN 201210392792A CN 103074445 A CN103074445 A CN 103074445A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- fowl
- bip
- fip
- inner primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种禽博尔纳病毒检测用引物，所述引物组是以禽博尔纳病毒基质蛋白基因为靶基因，基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本发明还公开了一种禽博尔纳病毒检测试剂盒及其使用方法，采用本发明的技术方案能够高效、准确地对禽博尔纳病毒进行检测，从而广泛地运用于此类病源的检验检疫，也为研究这种RNA病毒在宿主体内致病机制的动物模型打下基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种禽博尔纳病毒检测用的引物、试剂盒及其使用方法。
背景技术
禽博尔纳病毒（Avian Bornavirus，ABV）是从腺胃扩张症（ProventricularDilatation Disease，PDD）患病鹦鹉体内分离的一种新的博尔纳病毒(BDV)。BDV可在宿主中枢神经系统内持续感染，其全部生活史在神经元细胞核内完成，病毒感染后基因与宿主细胞染色体融合，可在宿主基因组内检出病毒DNA序列。禽类是BDV重要自然疫源地，曾在鸟类活动池塘中收集的粪便样品中检出病毒株。据记载，1970年代首次报道发生PDD，最初主要在北美洲笼养鹦鹉中发生。由于广泛的商贸活动，使得PDD在宠物鸟中持续传播，世界各地均有报道，出现50余种鹦鹉感染发病。此外，巨嘴鸟、加拿大鹅、鸵鸟、番鸭、鸽、鹩哥、猫头鹰、游隼、鹫、密雀、织雀及其它雀形目鸟类已经检出病毒。研究显示ABV可侵入禽类神经系统，导致PDD类非化脓性炎症，主要影响胃肠道上部自主神经系统功能，包括食道、嗉囊、腺胃、肌胃、十二指肠等。其中腺胃扩张受到影响，不能正常蠕动，微生物在其中过度繁殖，导致动物出现败血症和死亡。患病禽鸟常见消瘦、食欲减退、异嗜、食物返流、粪内出现未消化食物、腹泻、腹部肿大、肌肉萎缩、多尿等。也可见中枢神经症状，如共济失调、头部运动失常、本体感受不足、运动无力等。总之，目前PDD在世界各国广泛分布，致死率很高，使鹦鹉等各种珍稀禽鸟受到极大威胁。
因此，如果能够有效地对PDD病毒分离鉴定，不仅能够广泛地运用于此类病源的检验检疫，也为研究这种RNA病毒在宿主体内致病机制的动物模型打下基础。
发明内容
本发明的所解决的技术问题在于提供一种用于环介导等温扩增技术检测禽博尔纳病毒，且对禽博尔纳病毒基质蛋白基因具有高特异性的检测用引物组。
本发明的所解决的技术问题还在于提供一种利用环介导等温扩增技术检测禽博尔纳病毒的试剂盒，其检测效果良好、特异性高、漏检率低；同时本发明还提供了所述试剂盒的使用方法。
本发明的目的可以通过以下技术措施实现：一种禽博尔纳病毒检测试剂盒，所述引物组是以禽博尔纳病毒基质蛋白基因为靶基因，基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。
优选地，所述引物组为如下引物组合的其中之一：
外引物F3（ID19）：
GCCGACATTAATGCTTGA，
外引物B3（ID19）：
CCAAGAAGTCATCAATCTGAA，
内引物FIP（ID19）：
GGTTCCTTTACTGAAAGGAAAGGTACTTTGTTGGCGGAACTT，
内引物BIP（ID19）：
CTACAGCTACCAAGAGAAAAACGGGTAAACATTCGCAGGTGAAT；
或
外引物F3（ID30）：
CTAAACATACCTTTCCTTTCAGT，
外引物B3（ID30）：
GGATCCTTGTAGACAGCTAT，
内引物FIP（ID30）：
TCGACATCAATGGTGAAGTGGTAAGGAACCTCTACAGCTACC，
内引物BIP（ID30）：
GGCATTCACCTGCGAATGTTGAGTTCAGTGTTGAGGCC；
或
外引物F3（ID37）：
TCCTTTCAGTAAAGGAACCTC，
外引物B3（ID37）：
CCTTATCGGATCCTTGTAGAC，
内引物FIP（ID37）：
CGCTAGGCTCGACATCAATGTACAGCTACCAAGAGAAAAACG，
内引物BIP（ID37）：
GGCATTCACCTGCGAATGTTGCTATAGAGTTCAGTGTTGAGG。
本发明的提供的一种禽博尔纳病毒检测试剂盒，所述禽博尔纳病毒检测试剂盒包括以禽博尔纳病毒基质蛋白基因为靶基因，基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。
优选地，所述引物组为如下引物组合的其中之一：
外引物F3（ID19）：
GCCGACATTAATGCTTGA，
外引物B3（ID19）：
CCAAGAAGTCATCAATCTGAA，
内引物FIP（ID19）：
GGTTCCTTTACTGAAAGGAAAGGTACTTTGTTGGCGGAACTT，
内引物BIP（ID19）：
CTACAGCTACCAAGAGAAAAACGGGTAAACATTCGCAGGTGAAT；
或
外引物F3（ID30）：
CTAAACATACCTTTCCTTTCAGT，
外引物B3（ID30）：
GGATCCTTGTAGACAGCTAT，
内引物FIP（ID30）：
TCGACATCAATGGTGAAGTGGTAAGGAACCTCTACAGCTACC，
内引物BIP（ID30）：
GGCATTCACCTGCGAATGTTGAGTTCAGTGTTGAGGCC；
或
外引物F3（ID37）：
TCCTTTCAGTAAAGGAACCTC，
外引物B3（ID37）：
CCTTATCGGATCCTTGTAGAC，
内引物FIP（ID37）：
CGCTAGGCTCGACATCAATGTACAGCTACCAAGAGAAAAACG，
内引物BIP（ID37）：
GGCATTCACCTGCGAATGTTGCTATAGAGTTCAGTGTTGAGG。
作为本发明禽博尔纳病毒检测试剂盒的优选实施方式，所述的禽博尔纳病毒检测试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、逆转录酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液。
作为本发明禽博尔纳病毒检测试剂盒更优选的实施方式，所述引物组中引物与反应体系混合后的浓度为：所述的内引物FIP/BIP各为0.016～0.032μmol/L，外引物F3/B3的浓度各为0.004～0.008μmol/L。
本发明还提供一种禽博尔纳病毒检测试剂盒的使用方法，该方法包括如下步骤：
（1）制备待测样品RNA；
（2）在反应容器中加入Bst DNA聚合酶、逆转录酶、反应液、稳定液、待测样品RNA、内引物FIP/BIP、外引物F3/B3，恒温反应；
（3）在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混匀，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性；
所述步骤（2）中的内引物FIP/BIP和外引物F3/B3为以禽博尔纳病毒的基质蛋白基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物。
优选地，其特征在于，所述引物组中引物与反应体系混合后的浓度为：所述的内引物FIP/BIP各为0.016～0.032μmol/L，外引物F3/B3的浓度各为0.004～0.008μmol/L。
作为本发明使用禽博尔纳病毒检测试剂盒的方法的优选实施方式，所述的两对引物为
所述的两对引物为如下引物组合中的一组：
外引物F3（ID19）：
GCCGACATTAATGCTTGA，
外引物B3（ID19）：
CCAAGAAGTCATCAATCTGAA，
内引物FIP（ID19）：
GGTTCCTTTACTGAAAGGAAAGGTACTTTGTTGGCGGAACTT，
内引物BIP（ID19）：
CTACAGCTACCAAGAGAAAAACGGGTAAACATTCGCAGGTGAAT；
或
外引物F3（ID30）：
CTAAACATACCTTTCCTTTCAGT，
外引物B3（ID30）：
GGATCCTTGTAGACAGCTAT，
内引物FIP（ID30）：
TCGACATCAATGGTGAAGTGGTAAGGAACCTCTACAGCTACC，
内引物BIP（ID30）：
GGCATTCACCTGCGAATGTTGAGTTCAGTGTTGAGGCC；
或
外引物F3（ID37）：
TCCTTTCAGTAAAGGAACCTC，
外引物B3（ID37）：
CCTTATCGGATCCTTGTAGAC，
内引物FIP（ID37）：
CGCTAGGCTCGACATCAATGTACAGCTACCAAGAGAAAAACG，
内引物BIP（ID37）：
GGCATTCACCTGCGAATGTTGCTATAGAGTTCAGTGTTGAGG。
作为本发明使用禽博尔纳病毒检测试剂盒的方法的优选实施方式，步骤（3）中，步骤（2）中，恒温反应的反应条件为温度62～64℃，反应时间80～100min。
本发明所说的基于环介导恒温扩增技术（loop-mediated isothermalamplication of DNA,简称LAMP）快速检测禽博尔纳病毒的方法，是利用BstDNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物（即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3），特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温（63～65℃）条件下45～90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术（包括荧光实时定量PCR技术）进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2～3天，完成鉴定报告需10～15天；采用本发明的检测试剂盒仅需2小时。并且，本发明的反应体系中加入了显色液，鉴定结果更为直观清晰。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明的检测试剂盒只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性；3.本发明的检测试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率高；4.本发明的检测试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；5.本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠；6.由于选择了禽博尔纳病毒基质蛋白基因作为靶基因设计引物，使得本发明的检测试剂盒检测禽博尔纳病毒的准确率更高；7.在本发明检测试剂盒中采用特制的反应管，减少了气溶胶污染的可能性，同时方便操作。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。
在本发明的各实施例中采用下列实验材料进行实验：
仪器：
等温扩增荧光检测系统ESEQuant TS95（德国QIAGEN公司）、Loopamp浊度仪LA-100和LA-320（日本荣研化学株式会社）、倒置显微镜Axio Observer Z1（德国卡尔.蔡司公司）、PCR仪StepOnePlus(美国应用生物系统公司)、核酸自动纯化仪Maxwell 16 MDX（美国Promega公司）、凝胶成像系统Bio-Vision++1000（法国VILBER LOURMAT公司）、电泳仪DYY-TC（北京六一仪器厂）。
试剂：
RNA提取试剂盒D9108A（日本TaKaRa公司）、病毒总核酸纯化试剂盒Maxwell 16 AS1150（美国Promega公司）、RT-PCR试剂盒DRR055A（日本TaKaRa公司）、PCR产物DNA回收试剂盒D823A（日本TaKaRa公司）、RNA扩增（恒温扩增法）试剂盒（广州迪澳生物科技有限公司）、钙黄绿素（日本EIKEN公司）、电泳缓冲液TAE 10x（美国Promega公司）。
病毒样品：
患病金刚鹦鹉“色彩”和“琉璃363”大肠、小肠、十二指肠、心、肝、脾、肺、肾、肌胃、腺胃、腺胃内容物、胰腺、素囊、脑、肌肉等各一份，由广东出入境检验检疫检局检验检疫技术中心(IQTC)动检实验室保存和无害化处理。新城疫病毒I系、禽流感病毒H5Re-5株、法氏囊病病毒B87株、白血病病毒J亚群和脑脊髓炎病毒Van Roekel株样品均由本室保存。
实施例1样品的制备及引物的选择
1、样品的制备
1.1、样品的制备细胞培养
对生长良好的单层猪睾丸（ST）细胞接种禽博尔纳病毒检测阳性样品，37℃培养传代，观察细胞病变。
胞培养传代和病毒检测
利用鹦鹉“琉璃363”和“色彩”腺胃病料（其中，鹦鹉“琉璃363”和“色彩”为取样禽类的名称）无菌处理后接种ST细胞单层，置37℃培养5～7天，连续传5代，出现细胞圆缩、脱落（图1），经RT-PCR检测为阳性（图3B）。
1.2、总RNA抽提：
各种ABV检测样品按照总RNA抽提试剂盒RNAiso Plus/MiniBEST（Takara）和病毒总核酸纯化试剂盒Maxwell 16AS1150说明书进行，制备的总RNA置-80℃保存备用。
2、引物的选择
2.1、按照文献方法进行ABV基质蛋白(M)基因RT-PCR扩增，引物序列如下：
上游引物为5’-CAAGGTAATYGTYCCTGGATGG-3’。
下游引物为5’-ACCAATGTTCCGAAGMCGAWAY-3’。
2.2、利用DNAStar和PrimerExplorer V5.0（网络版）软件进行禽博尔纳病毒M基因序列分析和LAMP扩增的引物设计，共获得ID1，6，19，30和37共5组引物，序列（5’→3’）如下：
引物组1
外引物F3（ID1）：
TAATCGTCCCTGGATGGC，
外引物B3（ID1）：
GAGTTCAGTGTTGAGGCC，
内引物FIP（ID1）：
GGTTCCTTTACTGAAAGGAAAGGTACGACATTAATGCTTGAAATAGACTT，
内引物BIP（ID1）：
CTACAGCTACCAAGAGAAAAACGGGTAAACATTCGCAGGTGAAT。
引物组2
外引物F3（ID6）：
TAATCGTCCCTGGATGGC，
外引物B3（ID6）：
CCAAGAAGTCATCAATCTGAA，
内引物FIP（ID6）：
GGTTCCTTTACTGAAAGGAAAGGTACTTGAAATAGACTTTGTTGGCG，
内引物BIP（ID6）：
CTACAGCTACCAAGAGAAAAACGGGTAAACATTCGCAGGTGAAT。
引物组3
外引物F3（ID19）：
GCCGACATTAATGCTTGA，
外引物B3（ID19）：
CCAAGAAGTCATCAATCTGAA，
内引物FIP（ID19）：
GGTTCCTTTACTGAAAGGAAAGGTACTTTGTTGGCGGAACTT，
内引物BIP（ID19）：
CTACAGCTACCAAGAGAAAAACGGGTAAACATTCGCAGGTGAAT；
引物组4
外引物F3（ID30）：
CTAAACATACCTTTCCTTTCAGT，
外引物B3（ID30）：
GGATCCTTGTAGACAGCTAT，
内引物FIP（ID30）：
TCGACATCAATGGTGAAGTGGTAAGGAACCTCTACAGCTACC，
内引物BIP（ID30）：
GGCATTCACCTGCGAATGTTGAGTTCAGTGTTGAGGCC；
引物组5
外引物F3（ID37）：
TCCTTTCAGTAAAGGAACCTC，
外引物B3（ID37）：
CCTTATCGGATCCTTGTAGAC，
内引物FIP（ID37）：
CGCTAGGCTCGACATCAATGTACAGCTACCAAGAGAAAAACG，
内引物BIP（ID37）：
GGCATTCACCTGCGAATGTTGCTATAGAGTTCAGTGTTGAGG。
实施例2样品检测试验
1、RT-LAMP（逆转录-环介导恒温扩增）实验
制备RT-LAMP反应体系，含反应缓冲液（2×）12.5μl、内引物（FIP/BIP）（终浓度0.4～0.8μM）1μl、外引物（F3/B3）（终浓度0.1～0.2μM）1μl、Bst聚合酶0.8μl、逆转录酶0.2μl、RNA模板（1～100ng）2.0μl、DEPC水7.5μl，总体积25μl。将上述试剂混匀，加入20μl密封液，点1μl显色液在反应管盖中间，盖紧，注意显色液不能掉入反应液中。然后，将反应管放入Loopamp浊度仪LA-100内取出反应管将染料弹入反应液中，混匀后观察颜色变化。呈现绿色为有核酸扩增（阳性+），橙色为无核酸扩增（阴性-）。
首先采用选择RT-LAMP引物
利用实施例1中五组引物ID37、ID30、ID19、ID6和ID1建立RT-LAMP反应体系，前三种引物呈现阳性显色反应（图2），反应产物电泳出现特异条带（图3A）。后两种未见颜色反应和条带。ID37、ID30、ID19为本发明方案中的有效引物。
2、RT-PCR及产物分析
RT-PCR反应体系为PrimeScript一步法酶混合液2μl、2×一步法缓冲液25μl、上游引物（20μM）1μl、下游引物（20μM）1μl、待检总RNA 10μl、无RNase蒸馏水11μl，总体积50μl。RT-PCR反应条件为50℃30min、95℃2min；94℃30sec、50℃30sec、72℃1min，45个循环；72℃10min。按照pMD18-T Vector试剂盒说明书进行PCR产物克隆并测序，利用NCBI在线进行BLAST序列比对和树视图（Tree View）分析。
3、电泳检测
LAMP和PCR反应产物使用10×TAE缓冲液配制1.5～3.0%琼脂胶，添加核酸染料GoldViewTM（5μL/100mL），电泳（37V/25mA）观察，拍照记录结果。
M基因扩增、序列分析和基因分型结果
鹦鹉“琉璃363”和“色彩”腺胃均扩增出预计大小351bp的PCR产物（图3B）。结合步骤二中RT-PCR及产物分析，产物序列（NCBI BankIt1518174）进行进化树分析（NCBI Blast Tree View）（图4），显示为ABV5基因型。
4、实时RT-LAMP将上述RT-LAMP反应体系置Loopamp浊度仪LA-320，63℃反应90min，记录实时浊度数据。在反应体系中添加钙黄绿素1μl，置等温扩增荧光检测系统ESEQuant TS95仪器中，63℃反应90min，记录荧光（FAM）数据。
荧光和浊度检测比较结果
以钙黄绿素为荧光指示剂，实时RT-LAMP分别在36min（ID30）、38min（ID37）和49min（ID19）出现扩增反应曲线，60min内扩增达到峰值（图5）；浊度测定时三者出现扩增曲线的时间分别为56min、58min和65min（图6）。引物ID6和ID1进行荧光和浊度测定时均未出现扩增反应曲线。
临床及有关样品检测
经RT-LAMP和RT-PCR检测腺胃禽博尔纳病毒呈阳性（见表一），病毒ST细胞培养物RT-LAMP检测10-1～10-5为阳性，RT-PCR检测10-3以后为阴性。新城疫病毒等有关病毒未见阳性反应。
表一30个样品禽博尔纳病毒RT-LAMP和RT-PCR检测结果
从上述实验结果可以看出，本发明的方案在准确性、特异性、灵敏度以及重现性方面均表现出其优良特性，不仅能够广泛地运用于此类病源的检验检疫，也为研究这种RNA病毒在宿主体内致病机制的动物模型打下基础。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种禽博尔纳病毒检测用引物组，其特征在于，所述引物组是以禽博尔纳病毒基质蛋白基因为靶基因，基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。
2.根据权利要求1所述的禽博尔纳病毒用引物组，其特征在于，所述引物组为如下引物组合的其中之一：
外引物F3（ID19）：
GCCGACATTAATGCTTGA，
外引物B3（ID19）：
CCAAGAAGTCATCAATCTGAA，
内引物FIP（ID19）：
GGTTCCTTTACTGAAAGGAAAGGTACTTTGTTGGCGGAACTT，
内引物BIP（ID19）：
CTACAGCTACCAAGAGAAAAACGGGTAAACATTCGCAGGTGAAT；
或
外引物F3（ID30）：
CTAAACATACCTTTCCTTTCAGT，
外引物B3（ID30）：
GGATCCTTGTAGACAGCTAT，
内引物FIP（ID30）：
TCGACATCAATGGTGAAGTGGTAAGGAACCTCTACAGCTACC，
内引物BIP（ID30）：
GGCATTCACCTGCGAATGTTGAGTTCAGTGTTGAGGCC；
或
外引物F3（ID37）：
TCCTTTCAGTAAAGGAACCTC，
外引物B3（ID37）：
CCTTATCGGATCCTTGTAGAC，
内引物FIP（ID37）：
CGCTAGGCTCGACATCAATGTACAGCTACCAAGAGAAAAACG，
内引物BIP（ID37）：
GGCATTCACCTGCGAATGTTGCTATAGAGTTCAGTGTTGAGG。
3.一种禽博尔纳病毒检测试剂盒，其特征在于，所述禽博尔纳病毒检测试剂盒包括以禽博尔纳病毒基质蛋白基因为靶基因，基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。
4.根据权利要求3所述的禽博尔纳病毒检测试剂盒，其特征在于，所述引物组为如下引物组合的其中之一：
外引物F3（ID19）：
GCCGACATTAATGCTTGA，
外引物B3（ID19）：
CCAAGAAGTCATCAATCTGAA，
内引物FIP（ID19）：
GGTTCCTTTACTGAAAGGAAAGGTACTTTGTTGGCGGAACTT，
内引物BIP（ID19）：
CTACAGCTACCAAGAGAAAAACGGGTAAACATTCGCAGGTGAAT；
或
外引物F3（ID30）：
CTAAACATACCTTTCCTTTCAGT，
外引物B3（ID30）：
GGATCCTTGTAGACAGCTAT，
内引物FIP（ID30）：
TCGACATCAATGGTGAAGTGGTAAGGAACCTCTACAGCTACC，
内引物BIP（ID30）：
GGCATTCACCTGCGAATGTTGAGTTCAGTGTTGAGGCC；
或
外引物F3（ID37）：
TCCTTTCAGTAAAGGAACCTC，
外引物B3（ID37）：
CCTTATCGGATCCTTGTAGAC，
内引物FIP（ID37）：
CGCTAGGCTCGACATCAATGTACAGCTACCAAGAGAAAAACG，
内引物BIP（ID37）：
GGCATTCACCTGCGAATGTTGCTATAGAGTTCAGTGTTGAGG。
5.根据权利要求1所述的禽博尔纳病毒检测试剂盒，其特征在于，所述的禽博尔纳病毒检测试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、逆转录酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液。
6.根据权利要求5所述的禽博尔纳病毒检测试剂盒，其特征在于，所述引物组中引物与反应体系混合后的浓度为：所述的内引物FIP/BIP各为0.016～0.032μmol/L，外引物F3/B3的浓度各为0.004～0.008μmol/L。
7.一种使用如权利要求5所述的禽博尔纳病毒检测试剂盒的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）制备待测样品RNA；
（2）在反应容器中加入BstDNA聚合酶、逆转录酶、反应液、稳定液、待测样品RNA、内引物FIP/BIP、外引物F3/B3，恒温反应；
（3）在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混匀，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性；
所述步骤（2）中的内引物FIP/BIP和外引物F3/B3为以禽博尔纳病毒的基质蛋白基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物。
8.根据权利要求7所述的使用禽博尔纳病毒检测试剂盒的方法，其特征在于，所述引物组中引物与反应体系混合后的浓度为：所述的内引物FIP/BIP各为0.016～0.032μmol/L，外引物F3/B3的浓度各为0.004～0.008μmol/L。
9.根据权利要求7所述的使用禽博尔纳病毒检测试剂盒的方法，其特征在于，所述的两对引物为如下引物组合中的一组：
外引物F3（ID19）：
GCCGACATTAATGCTTGA，
外引物B3（ID19）：
CCAAGAAGTCATCAATCTGAA，
内引物FIP（ID19）：
GGTTCCTTTACTGAAAGGAAAGGTACTTTGTTGGCGGAACTT，
内引物BIP（ID19）：
CTACAGCTACCAAGAGAAAAACGGGTAAACATTCGCAGGTGAAT；
或
外引物F3（ID30）：
CTAAACATACCTTTCCTTTCAGT，
外引物B3（ID30）：
GGATCCTTGTAGACAGCTAT，
内引物FIP（ID30）：
TCGACATCAATGGTGAAGTGGTAAGGAACCTCTACAGCTACC，
内引物BIP（ID30）：
GGCATTCACCTGCGAATGTTGAGTTCAGTGTTGAGGCC；
或
外引物F3（ID37）：
TCCTTTCAGTAAAGGAACCTC，
外引物B3（ID37）：
CCTTATCGGATCCTTGTAGAC，
内引物FIP（ID37）：
CGCTAGGCTCGACATCAATGTACAGCTACCAAGAGAAAAACG，
内引物BIP（ID37）：
GGCATTCACCTGCGAATGTTGCTATAGAGTTCAGTGTTGAGG。
10.根据权利要求7、8、或9所述的使用禽博尔纳病毒检测试剂盒的方法，其特征在于，
步骤（2）中，恒温反应的反应条件为温度62～64℃，反应时间80～100min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012103927922A CN103074445A (zh) | 2012-10-16 | 2012-10-16 | 禽博尔纳病毒检测用引物组、试剂盒及其使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012103927922A CN103074445A (zh) | 2012-10-16 | 2012-10-16 | 禽博尔纳病毒检测用引物组、试剂盒及其使用方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103074445A true CN103074445A (zh) | 2013-05-01 |
Family
ID=48151138
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2012103927922A Pending CN103074445A (zh) | 2012-10-16 | 2012-10-16 | 禽博尔纳病毒检测用引物组、试剂盒及其使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103074445A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111733294A (zh) * | 2020-07-27 | 2020-10-02 | 广州动物园 | 鹦鹉博尔纳病毒4型的鉴定引物、鉴定方法和试剂盒 |
| WO2021172370A1 (ja) * | 2020-02-27 | 2021-09-02 | 栄研化学株式会社 | 一本鎖ｒｎａウイルスを検出する方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101660005A (zh) * | 2009-07-24 | 2010-03-03 | 广州华峰生物科技有限公司 | 基于环介导等温扩增技术的甲型肝炎病毒基因快速诊断试剂盒及其检测方法 |
-
2012
- 2012-10-16 CN CN2012103927922A patent/CN103074445A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101660005A (zh) * | 2009-07-24 | 2010-03-03 | 广州华峰生物科技有限公司 | 基于环介导等温扩增技术的甲型肝炎病毒基因快速诊断试剂盒及其检测方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 《中国畜牧兽医学会-第三届中国兽医临床大会论文集》 20120819 田纯见 等 禽博尔纳病毒分离鉴定及其恒温扩增检测分析 527-530 1-6 , * |
| BOB DAHLHAUSEN 等: "Future Veterinary Diagnostics", 《JOURNAL OF EXOTIC PET MEDICINE》, vol. 19, no. 2, 30 April 2010 (2010-04-30), pages 117 - 132 * |
| TIAN,C.等: "JQ726708", 《GENBANK》, 11 June 2012 (2012-06-11) * |
| 田纯见 等: "禽博尔纳病毒分离鉴定及其恒温扩增检测分析", 《中国畜牧兽医学会—第三届中国兽医临床大会论文集》, 19 August 2012 (2012-08-19), pages 527 - 530 * |
| 田纯见 等: "禽波纳病毒分离鉴定及其恒温扩增检测分析", 《畜牧兽医学报》, vol. 43, no. 11, 30 November 2012 (2012-11-30), pages 1847 - 1854 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021172370A1 (ja) * | 2020-02-27 | 2021-09-02 | 栄研化学株式会社 | 一本鎖ｒｎａウイルスを検出する方法 |
| JPWO2021172370A1 (zh) * | 2020-02-27 | 2021-09-02 | ||
| JP7048819B2 (ja) | 2020-02-27 | 2022-04-05 | 栄研化学株式会社 | 一本鎖ｒｎａウイルスを検出する方法 |
| CN111733294A (zh) * | 2020-07-27 | 2020-10-02 | 广州动物园 | 鹦鹉博尔纳病毒4型的鉴定引物、鉴定方法和试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Weinbauer et al. | Synergistic and antagonistic effects of viral lysis and protistan grazing on bacterial biomass, production and diversity | |
| Mayali et al. | Cultivation and ecosystem role of a marine Roseobacter clade-affiliated cluster bacterium | |
| Blakemore et al. | Neotypification of Drawida hattamimizu Hatai, 1930 (Annelida, Oligochaeta, Megadrili, Moniligastridae) as a model linking mtDNA (COI) sequences to an earthworm type, with a response to the ‘Can of Worms’ theory of cryptic species | |
| CN108384899B (zh) | 一种检测新型鹅星状病毒的荧光定量pcr试剂盒及应用 | |
| Jiang et al. | Transcriptomic responses of Perna viridis embryo to Benzo (a) pyrene exposure elucidated by RNA sequencing | |
| CN101899501B (zh) | 一种食品过敏原甲壳类基因的恒温扩增检测试剂盒及检测方法 | |
| CN101381771B (zh) | 产黄曲霉毒素真菌环介导等温扩增快速检测方法 | |
| CN107201405A (zh) | 一种硅藻upa基因分析方法及其在法医检测中的应用 | |
| CN104513857A (zh) | 副溶血性弧菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒 | |
| CN103074445A (zh) | 禽博尔纳病毒检测用引物组、试剂盒及其使用方法 | |
| Knüsel et al. | Virus isolation vs RT‐PCR: which method is more successful in detecting VHSV and IHNV in fish tissue sampled under field conditions? | |
| CN102108414A (zh) | 狗鱼幼鱼弹状病毒实时荧光rt-pcr检测法和试剂盒 | |
| Glotova et al. | High Genetic Diversity of Amoebae Belonging to the Genus Mayorella (Amoebozoa, Discosea, Dermamoebida) in Natural Habitats. | |
| CN104962660B (zh) | 一种杂色蛤物种实时荧光pcr特异性检测体系及应用 | |
| Kaganer et al. | Aquatic eDNA can advance monitoring of a small‐bodied terrestrial salamander and amphibian pathogen | |
| CN112662677B (zh) | 一组红裸须摇蚊Hb基因及其在水质生物监测中的应用 | |
| CN108913670A (zh) | 厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶--一种新型的海洋污染检测标记物 | |
| CN114470209A (zh) | Trim2在防治猪流行性腹泻病毒感染中的应用 | |
| CN111172244B (zh) | 一种快速鉴定感染日本血吸虫钉螺的方法 | |
| CN107190010A (zh) | 一组与创伤弧菌特异性结合的高亲和力适配体及其应用 | |
| CN104975086A (zh) | 一种水产品细菌性疾病的快速检测试剂盒及应用 | |
| CN108384868A (zh) | 用于同时检测四种致病弧菌的多重pcr引物组及检测方法和试剂盒 | |
| CN102108415B (zh) | 狗鱼幼鱼弹状病毒反转录环酶恒温扩增检测方法和试剂盒 | |
| CN113337626B (zh) | 检测对虾vpahpnd急性菌株和亚急性菌株的方法 | |
| CN108384869A (zh) | 同时检测四种致病弧菌的多重pcr引物组及检测方法和试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130501 |