CN102108414A - 狗鱼幼鱼弹状病毒实时荧光rt-pcr检测法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了狗鱼幼鱼弹状病毒(PFRV)的实时荧光RT-PCR检测方法和试剂盒。本发明的方法和试剂盒利用特异性的引物对和探针，能够特异性地检测出PFRV病毒；重复性好，可稳定地进行检测；灵敏度高，相应的灵敏度为10^1.5TCID₅₀。

Description

狗鱼幼鱼弹状病毒实时荧光RT-PCR检测法和试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒的检测方法和检测试剂盒，特别是涉及狗鱼幼鱼弹状病毒实时荧光RT-PCR检测法和试剂盒。

背景技术

根据国际病毒学分类委员会(International comittee on taxonomy ofviruses，ICTV)第8次报告，弹状病毒科(Rhabdoviridae)分为6个属，包括感染植物的质型弹状病毒属(Cytorhabdovirus)和核型弹状病毒属(Nucleorhabdovirus)，以及感染脊椎动物的水疱性口膜炎病毒属(Vesiculovirus)、狂犬病毒属(Lyssavirus)、短暂热病毒属(Ephemerovirus)和粒外弹状病毒属(也称非毒粒蛋白弹状病毒属)(Novirhabdovirus)，还有部分弹状病毒尚未分类，如Sigma virus，Flanders virus等。迄今报道感染鱼类的弹状病毒已有十几种，包括传染性造血器官坏死病毒(Infetioushematopoietic necrosis virus，IHNV)、病毒性出血性败血症病毒(Viralhaemorrhagic septicemia virus，VHSV)、牙鲆弹状病毒(Hirame rhabdovirus，HRV)、蛇头鱼弹状病毒(Snakehead rhabdovirus，SHRV)、鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus，SVCV)、狗鱼幼鱼弹状病毒(Pike fryrhabdovirus，PFRV)、弹状病毒903/87(Rhabdovirus 903/87，903/87)、鳜鱼弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus，SCRV)、胭脂鱼弹状病毒(Chinesesucker rhabdovirus)及海鲑弹状病毒28/97(Sea trout rhabdovirus 28/97，STRV)等(Granoff and Webster，1999；张奇亚和李正秋，1999；Zhang et al.，2000；Johansson et al.，2001，2002)。在ICTV第6次报告上，SVCV，PFRV被列为水疱性口膜炎病毒属暂定种(Wunner et al.，1995)。在ICTV第7次报告中，正式把IHNV、VHSV、HRV、SHRV列为粒外弹状病毒属，SVCV、PFRV等仍归为水疱性口膜炎病毒属的暂定种(Walker et al.，2000)。其他鱼类弹状病毒的分类地位尚未确定。

随着鱼类养殖业的快速发展，鱼类病毒病已成为养殖鱼类的最大病害。由于缺乏有效的治疗方法，鱼类病毒性疾病的控制以预防为主，因而病毒的诊断与检测技术研究成了鱼类病毒研究中非常活跃的领域。鱼类弹状病毒有很强的致病性，特别是VHSV、IHNV、HRV、SHRV和SVCV在世界各地广泛流行，给水产养殖业造成重大的经济损失。因而这些病毒的流行病学备受科研工作者的关注。

狗鱼幼鱼弹状病毒(PFRV)是一种与鲤春病毒血症病毒(SVCV)同源性很高的病毒，目前还未引起人们高度重视。PFRV主要在欧洲狗鱼幼鱼中流行(Wolf，1988)。1972年该病毒在荷兰感染狗鱼幼鱼，引起大规模死亡，第一株PFRV从此批患病的狗鱼幼鱼中分离出来(De Kinkelin，1973)。PFRV与SVCV亲缘关系最近，G蛋白的同源性＞70％。对PFRV、SVCV及与它们血清学相关的鱼类弹状病毒G蛋白部分核苷酸序列进行系统进化分析，结果显示它们形成4个基因型，PFRV和SVCV分别形成一个基因型，分别为基因型III和I，其他病毒形成基因型II和IV(Stone et al.，2003)。SVC主要感染鲤科鱼类，被世界动物卫生组织列为必须申报的疾病，中国农业部将SVC列为二级动物疫病。随着对SVC的日益重视，对SVCV监控力度的加大，这些与SVCV亲缘关系高的病毒也将会越来越引起人们的重视。因而寻找特异、灵敏快速的检测方法，对于防控疾病的发生和发展十分关键。

在中国，鱼类病毒SVCV已经引起人们高度的重视，并于每年春秋两季对全国鲤鱼进行SVCV监测。但是与SVCV亲缘关系很高的鱼类病毒PFRV目前还没有引起人们的重视，没有纳入检测的范围。随着与这2种病毒血清学相关的病毒相继分离(Ahne，1975；Ahne et al.，1982；Fijan et al.，1984；Ahne and Thomsen，1986；Haenen and Davidse，1989；Jorgensen et al.，1989；Rowley et al.，2001；Stone et al.，2003；Way et al.，2003)，人们对这些病毒的关注会越来越多。因而需要建立切实可行的检测方法。

目前，鉴定PFRV及与其血清学相关的病毒一般采取先用敏感细胞分离，然后用血清学方法鉴定的方式(De Kinkelin，1973；Ahne，1975；Ahne etal.，1982；Fijan et al.，1984；Ahne and Thomsen，1986；Haenen and Davidse，1989；Jorgensen et al.，1989；Rowley et al.，2001；Stone et al.，2003；Way et al.，2003)。采用这种检测方式不仅周期长，而且使用免疫学方法，如间接荧光抗体试验或酶联免疫吸附试验，PFRV与SVCV之间存在交叉反应(

et al.，1989；Way，1991)，检测结果不准确。

实时荧光技术，是近年来新问世的一种高敏感性的检测技术，它融合了PCR技术的核酸高效扩增，探针技术的高特异性，光谱技术的高敏感性和高精确定量等优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果，它可以做到每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，做到真正意义上的定量。同时该技术在密闭系统内完成检测，不需要常规PCR的电泳观察环节，减少了对工作环境的污染，降低假阳性结果发生。因此，自从该技术建立以来，迅速、广泛地应用于植物、动物和人类的寄生虫，病毒和细菌等病原的检测研究中。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能够快速、高灵敏度的狗鱼幼鱼弹状病毒实时荧光RT-PCR检测方法。

本发明的另一目的在于提供一种狗鱼幼鱼弹状病毒的检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了狗鱼幼鱼弹状病毒(Pike fry rhabdovirus，PFRV)的实时荧光RT-PCR检测方法，所述方法包括利用特异性探针和引物对，以病毒基因组RNA为模板进行实时荧光RT-PCR反应，

所述引物对为能扩增出狗鱼幼鱼弹状病毒G基因的基因片段的引物对，并且分别含有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的序列；

Seq ID No.1：5’-AGGCAATCATTCAATTTGGCTAAC-3’

Seq ID No.2：5’-CATTTCCATACATGGTCCCTGTTG-3’

所述探针为能与狗鱼幼鱼弹状病毒G基因位于所述引物对之间的序列相同或互补、且长度为20～40bp的寡核苷酸序列，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

在本发明优选的实施方式中，所述探针含有Seq ID No.3所示的序列，

Seq ID No.3：5’-CCTAAAAGAGGAATGCGACCAACACATCG-3’。

优选的，所述探针5’端标记的荧光报告基团为HEX，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。

本发明的检测方法中，RT-PCR反应的引物终浓度优选为0.9～1.1μmol/L，更优选1μmol/L，探针终浓度优选为0.4～0.6μmol/L，更优选0.5μmol/L。

所述RT-PCR的反应的退火温度优选为55℃～60℃，更优选60℃。

本发明具体的实施方式中，所述RT-PCR的反应条件包括：50℃反转录30min，94℃预变性4min，40个循环：94℃变性15s，60℃退火及收集荧光信号1min。

本发明开公开了一种狗鱼幼鱼弹状病毒(Pike fry rhabdovirus，PFRV)的检测试剂盒，所述试剂盒含有能扩增出狗鱼幼鱼弹状病毒G基因的基因片段的引物对，所述引物对分别含有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的序列。

进一步地，所述检测试剂盒用于实时荧光RT-PCR检测，并且所述试剂盒还含有能与狗鱼幼鱼弹状病毒G基因位于所述引物对之间的序列相同或互补、且长度为20～40bp的寡核苷酸探针，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

优选的，所述探针含有Seq ID No.3所示的序列。

进一步优选的，所述探针5’端标记的荧光报告基团为HEX，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。

由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：

本发明的实时荧光RT-PCR检测方法和试剂盒用于检测PFRV时，比RT-PCR/PCR及细胞培养(TCID₅₀)检测方法的灵敏度高；其中所用的特异性的引物对和探针，能够在PFRV、HRV、IHNV、VHSV、SVCV、IPNV和VNNV病毒中特异性地检测出PFRV病毒；重复性好，可稳定地进行检测；灵敏度高，相应的灵敏度为10^1.5TCID₅₀。

附图说明

图1为不同引物和探针浓度对扩增曲线的影响结果图；

图2为实时荧光RT-PCR检测PFRV的特异性实验结果图；

图3为PFRV实时荧光RT-PCR检测的重复性实验结果图；

图4为PFRV实时荧光RT-PCR检测的灵敏度实验结果图。

具体实施方式

实时荧光技术，是近年来新问世的一种高敏感性的检测技术，它融合了PCR技术的核酸高效扩增，探针技术的高特异性，光谱技术的高敏感性和高精确定量等优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果，它可以做到每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，做到真正意义上的定量。同时该技术在密闭系统内完成检测，不需要常规PCR的电泳观察环节，减少了对工作环境的污染，降低假阳性结果发生。因此，自从该技术建立以来，迅速、广泛地应用于植物、动物和人类的寄生虫，病毒和细菌等病原的检测研究中。目前已经进行该项研究的鱼类病毒有ISAV(Munir and Kibenge，2004)、KHV(Gilad et al.，2004)、Betanodavirus(Valle et al.，2005)、SVCV(张利峰等，2005；Yue et al.，2007)、VHSV(Chico et al.，2006)、IHNV(Dhar et al.，2008)、IPNV(Bowers et al.，2008)和VNNV(罗卫等，2008)。而本发明则建立了实时荧光RT-PCR方法检测PFRV。

实施例1

1材料与方法

1.1病毒及细胞

PFRV为F4株，由中国科学院水生生物研究所赠送，SVCV和IHNV参考株由英国CEFAS的OIE参考实验室B.Hill教授惠赠；VHSV参考株由挪威国家兽医研究所OIE参考实验室Roar Gudding博士惠赠、IPNV、HRV、VNNV由本室分离。

IHNV、SVCV、VHSV、VNNV、IPNV、HRV和PFRV分别用EPC、CO、RTG-2、SSN-1、CHSE-214、FHM和BF-2细胞扩增。SSN-1细胞购自泰国Kasetsart大学水生动物健康研究所，RTG-2细胞由水生生物研究所赠送，BF-2细胞由检疫研究所(布雷西亚)细胞保藏中心赠送，CHSE-214细胞、EPC细胞由英国环境、渔业和水产养殖科学研究中心赠送、FHM细胞由德国慕尼黑大学和中国科学院水生生物研究所赠送，CO细胞由中国科学院水生生物研究所赠送。

EPC、CO、CHSE-214、FHM、BF-2和RTG-2细胞均用含10％胎牛血清的199培养液培养，SSN-1细胞用含10％FBS的L-15培养液培养。接种病毒后，用加抗生素(100IU/mL青霉素；100μg/mL链霉素)的相应培养液培养。

1.2设备与试剂

ABI7500荧光定量PCR仪；试剂盒TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit、TaKaRa One Step RNA PCR Kit均购于大连宝生物工程有限公司。

1.3引物和探针的设计与合成

根据Genbank中PFRV G基因(AJ538069)，使用Primer Express 3.0(Applied Biosystems，Foster City，CA)和Primer Premier 5.0软件设计引物和Taqman荧光探针。并通过NCBI数据库进行BLAST验证特异性后，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物和探针序列见表1。

表1PFRV实时荧光RT-PCR检测的引物和探针

引物Primer	序列Sequence 5’--3’	Seq IDNo.	位置aPosition
				正向引物F	AGGCAATCATTCAATTTGGCTAAC	1	133-156
反向引物R	CATTTCCATACATGGTCCCTGTTG	2	201-224
				探针Probe	HEX-CCTAAAAGAGGAATGCGACCAACACATCG-TAMRA	3	166-194

^a序列位置参考Genbank No.AJ538069中的序列。

扩增目的片断长度为92bp，探针5’端标记的荧光报告基团为HEX，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。

1.4病毒核酸的提取

参照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit的说明书进行操作。

1.5病毒滴度的测定

病毒滴度测定采用终点稀释法，参考Reed和Muench(1938)的方法。具体方法如下：

1)传BF-2细胞入96孔板，置于25℃培养箱培养(＜24h)；

2)10倍系列稀释待测病毒；

3)将各稀释度的病毒悬液接种到细胞长成单成的96孔板中，每稀释度加3孔，每孔加100μL，对照组加100μL培养液；

4)将96孔板置于适宜温度培养箱中培养，直至CPE完全；

5)倒置显微镜下观察，计算病毒滴度(TCID₅₀/0.1mL)。

1.6实时荧光RT-PCR条件优化

荧光RT-PCR的反应体系参照TaKaRa One Step RNA PCR Kit说明书配制，采用25μL反应体系，反应体系组分如下：

10×Buffer                     2.5μL

MgCl₂                          5.0μL

dNTP(10mM/L each)              2.5μL

PFRV F(25pmol/μL)             1μL

PFRV R(25pmol/μL)             1μL

PFRV Probe(10pmol/μL)         1.5μL

RNasin 40U/μL                 0.5μL

AMV RTase XL 5U/μL            0.5μL

Taq DNA Polymerase 5U/μL      0.5μL

RNA                            10μL

                                          

Total                          25μL

将上述反应中加入的引物和探针浓度进行优化，实验选用0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L、1.0μmol/L的引物终浓度和0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L、0.5μmol/L的探针终浓度，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，使获得的Ct值最小而荧光增加值(ΔRn)较大。

参照ABI推荐的扩增程序：50℃反转录30min，94℃预变性4min，40个循环：94℃变性15s，适宜温度退火1min及收集荧光信号，选取退火温度55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃进行优化。

1.7数据分析

Real-time RT-PCR反应过程中，ABI7500仪器自动收集荧光信号，反应结束后，利用SDS(Sequence Detection System)2.1软件进行数据分析，查看扩增曲线、Ct(Threshold cycle)值。Ct值指扩增过程中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段对应的循环次数。在结果判定时，以扩增曲线是否为“S”型和荧光信号值的大小为主，HEX、TAMRA的荧光原始数据为辅。

1.8实时荧光RT-PCR的特异性试验

提取鱼类弹状病毒PFRV、HRV、IHNV、VHSV、SVCV、IPNV和VNNV核酸作为模板进行PFRV实时荧光RT-PCR检测，观察结果确定其特异性。

1.9实时荧光RT-PCR的重复性试验

通过组内(同一样品30个平行)和组间(5个稀释度6次检测)实时荧光RT-PCR检测，计算CT值的变异系数(标准偏差/重复值平均数)来初步评估该套引物和探针的稳定性。

1.10实时荧光RT-PCR的灵敏度试验

取PFRV病毒液250μL，对提取的病毒RNA作10倍系列稀释，取每个梯度稀释液10μL作为模板进行实时荧光RT-PCR。

2结果

2.1病毒滴度测定结果

10倍系列稀释PFRV病毒悬液，接种96孔板BF-2单层细胞，采用Reed-Muench氏方法计算PFRV的病毒滴度为10^5.5TCID₅₀/0.1mL。

2.2实时荧光RT-PCR反应条件优化

(1)引物和探针浓度的优化  矩阵法优选引物和探针浓度的试验结果见图1，26个不同引物和探针浓度的组合，获得Ct值的变易系数为1.93％。相对而言，采用1.0μmol/L的引物终浓度和0.5μmol/L的探针终浓度的组合，获得的CT值最小且荧光增加值(ΔRn)较大，从而确定该引物与探针的组合为最佳使用浓度的组合。

(2)扩增程序优化  对退火温度进行优化的试验表明，退火温度为55℃-60℃时，均获得相似的扩增曲线，考虑到退火温度降低，非特异性扩增会增强，因而选用60℃为反应的退火温度。优化后的扩增程序为：50℃反转录30min，94℃预变性4min，40个循环：94℃15s，60℃1min退火及收集荧光信号。

2.3实时荧光RT-PCR的特异性试验

为验证建立的实时荧光RT-PCR能否特异的检测PFRV，我们提取了PFRV、HRV、IHNV、VHSV、SVCV、IPNV和VNNV核酸作为模板进行Real-time RT-PCR检测。如图2所示，只有PFRV出现典型的“S”型扩增曲线，CT值读数为18.89，判为阳性，其他6株鱼类RNA病毒和阴性对照均为平直的线，即随时间推移，荧光值没有增加，判为阴性。

2.4实时荧光RT-PCR的重复性试验

为评估应用该套引物和探针进行实时荧光RT-PCR检测PFRV的重复性，对同一阳性样品在同次试验内设30个平行进行检测，发现扩增曲线在阈值线附近基本上是重合的，如图3所示，CT值读数范围为20.65-21.37，标准偏差为0.17，变异系数为0.8％；按1.10提取PFRV病毒核酸，10倍系列稀释(10⁰-10^-4)，每稀释度取10μL为模板同时进行实时荧光RT-PCR反应，并重复反应6次，结果表明各稀释度的样品在不同次试验内所获的CT值也比较接近，变异系数为0.89％-1.50％，平均变易系数为1.29％，如表2所示。

以上统计表明本发明所建立的PFRV实时荧光RT-PCR检测方法重复性好，可稳定地进行检测。

表25个稀释度样品的6次组间重复检测结果

2.5实时荧光RT-PCR的灵敏度试验

取滴度为10^5.5TCID₅₀/0.1mL的PFRV病毒悬液250μL抽提核酸，加25μL DEPC水溶解，将10μL核酸10倍系列稀释，每稀释度取10μL采用优化后的反应条件进行实时荧光RT-PCR，检测结果为阳性的最大稀释度为10^-4(图4)，相应的灵敏度为10^1.5TCID₅₀。

3讨论

鱼类中分离的10多种弹状病毒中，感染鲤科鱼类的为SVCV及与SVCV(I型)和PFRV(III)同源的II型和IV型弹状病毒(Ahne，1975；Ahneet al.，1982；Fijan et al.，1984；Ahne and Thomsen，1986；Haenen and Davidse，1989；Jorgensen et al.，1989；Rowley et al.，2001；Stone et al.，2003；Way et al.，2003；OIE，2006)。目前尚没有PFRV感染鲤科鱼类引发疾病的报道。

G蛋白是一种糖基化蛋白，主要编码膜相关蛋白(McAllister andWagner，1975)，在成熟的病毒粒子表面形成胞膜蛋白突起，构成抗原决定簇(Huang et al.，1996；徐耀先等，2000)。所有弹状病毒G蛋白都属于单一的I型跨膜糖蛋白。每个病毒粒子包含约1200个糖蛋白分子，以400个三聚体的形式通过其C末端的跨膜结构域附着于病毒粒子表面(Gaudin etal.，1992)。G蛋白由500个左右的氨基酸组成，不同属的弹状病毒G蛋白同源性很低(Walker and Kongsuwan，1999)，但弹状病毒拥有共同的特征，包括2个-6个潜在的糖基化位点、12个-16个保守的半胱氨酸残基，2-3段疏水的7氨基酸重复，N端有1个可被移除的疏水信号肽，C端有1个疏水的跨膜序列和1个疏水的细胞质尾(Coll，1995)。

G蛋白是编码抗原决定簇的重要蛋白，PFRV G蛋白与SVCV G蛋白的同源性＞70％，它们是否会编码相同的抗原决定簇，感染相同的宿主——鲤科鱼类需要进一步的研究。因而寻找有效的检测手段，了解该病毒在自然界的地理分布及宿主范围，防止病毒传播还是相当有意义的。

前面已经讨论过细胞培养和免疫学方法在确切诊断一种病毒过程中的一些缺点，而分子生物学技术在这方面有独特的优势。在鱼类病毒的检验检疫中，一般将细胞培养和分子生物学手段结合使用。在分子生物学方法中PCR是最简单的一种，LAMP是引物设计最复杂的一种，前面一种技术已经广泛的应用于水生动物病毒的检疫检验工作中，后面一种还在试验阶段。观察PCR扩增产物时，需要跑电泳，观察LAMP扩增产物的3种方法中有2种需要打开试管盖，因而这两种技术容易对工作环境造成污染，容易使此后的检测出现假阳性。在这一点上，实时荧光RT-PCR有相当的优势。同时，实时荧光RT-PCR反应过程＜2h，与RT-PCR相比，大大提高了检测效率；无需电泳检测，保障了试验人员的安全。

与SVCV和PFRV同源的II型和IV型弹状病毒G基因上的一段序列已经测序(Rowley et al.，2001；Stone et al.，2003)，我们选择PFRV G基因上相应的一段序列作为设计TaqMan实时荧光引物和探针的模板。引物设计时尽量选择与同源病毒变易大的序列，特别是引物的3’端序列避免互补，同时遵循引物和探针设计的基本原则。

应用本发明设计的引物和探针进行实时荧光RT-PCR，具有很好的重复性，组内的变易系数为0.8％，组间的变易系数为1.29％；特异性高，检测6种感染鱼类的其他RNA病毒(其中4种为弹状病毒科)的结果均为阴性；高灵敏度，为10^1.5TCID₅₀。因此本发明建立的实时荧光RT-PCR可以用于PFRV的检测。

4小结

根据PFRV G基因保守序列，设计了1条特异性的Taqman荧光探针和1对特异性的引物；对实时荧光RT-PCR的引物和探针浓度及反应的退火温度进行优化；按照优化好的实时荧光RT-PCR条件进行特异性试验和灵敏度试验，结果显示：检测IHNV、SVCV、VHSV、VNNV、IPNV、HRV和PFRV时，只有PFRV样品检测结果为阳性；对病毒悬液抽提核酸的检测灵敏度为10^1.5TCID₅₀。

实施例2

一种的检测试剂盒，用于狗鱼幼鱼弹状病毒(Pike fry rhabdovirus，PFRV)的实时荧光RT-PCR检测。所述试剂盒含有以下引物和探针：

引物	序列5’--3’	Seq ID No.
			正向引物F	AGGCAATCATTCAATTTGGCTAAC	1
反向引物R	CATTTCCATACATGGTCCCTGTTG	2
			探针Probe	HEX-CCTAAAAGAGGAATGCGACCAACACATCG-TAMRA	3

其中，探针5’端标记的HEX为荧光报告基团，3’端标记的TAMRA为荧光淬灭基团。

所述试剂盒还包括使用说明书。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

附1病毒缩略语表

缩略词	英文名	中文名
			PFRV	Pike fry rhabdovirus	狗鱼幼鱼弹状病毒
IHNV	Infetious hematopoietic necrosis	传染性造血器官坏死病毒

IPNV	Infectious pancreatic necrosis virus	传染性胰脏坏死病毒
			SVCV	Spring viraemia of carp virus	鲤春病毒血症病毒
VHSV	Viral haemorrhagic septicemia virus	病毒性出血败血症病毒
			VNNV	Viral nervous necrosis virus	病毒性神经坏死病毒
HRV	Hirame rhabdovirus	牙鲆弹状病毒

附2细胞及其他缩略语表

缩略词	英文名	中文名
			BF-2	Blue gill fry	铜吻磷鳃太阳鱼成纤维细胞
CO	Overy of grass carp	草鱼性腺细胞
			CHSE-214	Chinook salmon embryo	大鳞大麻哈鱼胚胎细胞
EPC	Epithelioma papulosum cyprini	鲤鱼上皮瘤细胞
			FHM	Fathead minnow	海水鲤科鱼类细胞
GCF	Grass carp fin	草鱼鳍条细胞
			PG	Pike gonad	狗鱼性腺细胞
SSN-1	Stripped snakehead	纹醴细胞
			N	Nucleoprotein	核蛋白
P	Phosphoprotein	磷酸化蛋白
			M	Matrix protein	基质蛋白
G	Glycoprotein	糖蛋白
			L	RNA-dependent RNA polymerase	RNA依赖的RNA聚合酶
NV	Non-virion	非毒粒蛋白
			ELISA	Enzyme-linked immunosorbent assay	酶联免疫吸附试验
RT-PCR	Reverse transcription polymerase chain	反转录聚合酶链式反应

LAMP	Loop-mediated isothermal amplification	环媒恒温扩增
			FIP	Forward inner primer	前内引物
BIP	Backward inner primer	后内引物
			RACE	Rapid-amplification of cDNA ends	cDNA末端快速扩增
IUdR	5-iodo-2’-deoxyuridine	5’-碘-2’-去氧尿嘧啶

序列表

<110>深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心

<120>狗鱼幼鱼弹状病毒实时荧光RT-PCR检测法和试剂盒

<130>DHC0910505

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

aggcaatcat tcaatttggc taac     24

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

catttccata catggtccct gttg     24

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cctaaaagag gaatgcgacc aacacatcg    29

Claims (10)

1.狗鱼幼鱼弹状病毒(Pike fry rhabdovirus，PFRV)的实时荧光RT-PCR检测方法，所述方法包括利用特异性探针和引物对，以病毒基因组RNA为模板进行实时荧光RT-PCR反应，其特征在于：所述引物对为能扩增出狗鱼幼鱼弹状病毒G基因的基因片段的引物对，并且分别含有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的序列；

Seq ID No.1：5’-AGGCAATCATTCAATTTGGCTAAC-3’

Seq ID No.2：5’-CATTTCCATACATGGTCCCTGTTG-3’

所述探针为能与狗鱼幼鱼弹状病毒G基因位于所述引物对之间的序列相同或互补、且长度为20～40bp的寡核苷酸序列，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述探针含有SeqID No.3所示的序列，

Seq ID No.3：5’-CCTAAAAGAGGAATGCGACCAACACATCG-3’。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述探针5’端标记的荧光报告基团为HEX，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的检测方法，其特征在于：所述RT-PCR反应的引物终浓度为0.9～1.1μmol/L，探针终浓度为0.4～0.6μmol/L。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的检测方法，其特征在于：所述RT-PCR的反应的退火温度为55℃～60℃。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述RT-PCR的反应条件包括：50℃反转录30min，94℃预变性4min，40个循环：94℃变性15s，60℃退火及收集荧光信号1min。

7.狗鱼幼鱼弹状病毒(Pike fry rhabdovirus，PFRV)的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有能扩增出狗鱼幼鱼弹状病毒G基因的基因片段的引物对，所述引物对分别含有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的序列，

Seq ID No.1：5’-AGGCAATCATTCAATTTGGCTAAC-3’

Seq ID No.2：5’-CATTTCCATACATGGTCCCTGTTG-3’。

8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒用于实时荧光RT-PCR检测，并且所述试剂盒还含有能与狗鱼幼鱼弹状病毒G基因位于所述引物对之间的序列相同或互补、且长度为20～40bp的寡核苷酸探针，并且所述探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于：所述探针含有Seq ID No.3所示的序列，

Seq ID No.3：5’-CCTAAAAGAGGAATGCGACCAACACATCG-3’。

10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于：所述探针5’端标记的荧光报告基团为HEX，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。

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