CN109182277B - 一种黄鳝弹状病毒CrERV及RT-PCR检测引物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于病毒检测领域，具体公开了一种黄鳝弹状病毒CrERV及RT‑PCR检测引物及应用，发明人首次从患病黄鳝幼苗中分离出了一种黄鳝弹状病毒，该病毒为黄鳝弹状病毒（Chinese rice‑field eel rhabdovirus）CrERV，保藏编号为：CCTCC NO：V201819，对于黄鳝弹状病毒的研究具备开拓性的意义。针对该病毒序列设计引物，可对黄鳝弹状病毒进行检测，该引物的特异性好，灵敏度高。

Description

一种黄鳝弹状病毒CrERV及RT-PCR检测引物及应用
技术领域
本发明属于病毒分子检测技术领域，具体涉及一种黄鳝弹状病毒CrERV及RT-PCR检测引物及应用。
技术背景
弹状病毒科(Rhabdoviridae)病毒是一类具有广泛宿主的负链RNA病毒，其颗粒呈现子弹状或棒状。其中狂犬病病毒(Rabies virus)最为人熟知，能引起人或其他温血动物的狂犬病，病死率几乎为100％，引起了世界范围的广泛关注，造成社会对养殖宠物安全度的恐慌。因此，对弹状病毒进行深入研究具有重要意义。此外，弹状病毒还能引起家畜多种急性传染病(如牛流行热，ephemeral fever)，以及鱼类和多种农作物的感染性疾病。国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)于2017年发表了最新的病毒分类第十次报告，将弹状病毒科(Rhabdoviridae)划分为18个属，其中能够感染鱼类的弹状病毒有Perhabdovirus,Sprivivirus和Novirhabdovirus三个属。目前以上三个属能够感染多种养殖鱼类，具有强烈的致病性，死亡率可以达到100％，给全球的海淡水养殖业造成重大的经济损失，尤其根据《进出口活水生动物检验检疫协议》，进出境的养殖鱼类，例如鲈鱼、鲤鱼、虹鳟、鲫鱼、牙鲆等养殖和种苗用鱼种，均要进行弹状病毒(IHNV、SVCV、HIRRV)疫病检测，口岸安全意义重大，影响进出口经济贸易。
目前对感染鱼类弹状病毒科的研究主要集中在Sprivivirus和Novirhabdovirus两个属，而Perhabdovirus属作为2017年弹状病毒科新命名的一个属，对其研究甚少。目前该属中包括鳜鱼弹状病毒，该病毒能够引起鳜鱼大量死亡。目前，黄鳝弹状病毒(Chineserice-field eel rhabdovirus，CrERV)全长序列尚无公开报道，更也无有效的检测方法。
本申请首次从染病的黄鳝中分离得到黄鳝弹状病毒(Chinese rice-field eelrhabdovirus，CrERV)，针对鳜鱼弹状病毒和黄鳝弹状病毒在P基因结构的区别设计特异性引物，建立RT-PCR检测方法不仅用于检测和监测养殖黄鳝的健康状况，而且通过序列比对能够区别黄鳝弹状病毒和鳜鱼弹状病毒。为黄鳝和鳜鱼养殖及早病原检测和监测提供保障。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种黄鳝弹状病毒CrERV，所述的病毒分离自黄鳝病变细胞，该病毒已于2018年4月24日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：黄鳝弹状病毒(Chinese rice-field eel rhabdovirus)CrERV，保藏编号：CCTCC NO：V201819，地址：中国武汉武汉大学。
本发明的另一个目的在于提供了黄鳝弹状病毒CrERV的基因，所述基因为SEQ IDNO.1所示。
本发明还有一个目的在于提供一种黄鳝弹状病毒CrERVRT-PCR检测引物，所述的引物为F1：5'-GAGATGAAGGAAGGACTGAGGAGAA-3'，R1：5'-CCCGACACCACTAAAGTATAAAA-3'；F2：5'–GAGGAGCATTAGTTACTTAAGGGTC-3'，R2：5'-TCACAATTTGAATCGTCATGACATA-3'。
本发明还有一个目的在于提供了黄鳝弹状病毒CrERV的应用，所述的应用包括利用该病毒制备成黄鳝弹状病毒病疫苗，或是制备成黄鳝弹状病毒的实验室对照品。
本发明的最后一个目的在于提供一种黄鳝弹状病毒CrERVRT-PCR检测引物的应用，包括利用所述的引物制备成黄鳝弹状病毒检测试剂盒。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种黄鳝弹状病毒CrERV，所述的病毒分离自黄鳝病变细胞，该病毒已于2018年4月24日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：黄鳝弹状病毒(Chinese rice-field eel rhabdovirus)CrERV，保藏编号：CCTCC NO：V201819，地址：中国武汉武汉大学。
将黄鳝弹状病毒CrERV接种到鲫脑细胞系(GibelCarpBrain,GiCB)单层，25℃培养7天，产生细胞病变效应(CPE)，可见GiCB细胞收缩变圆、折光度增加，部分细胞开始脱落，细胞单层开始破裂。
培养基：M199，10％胎牛血清，pH 7.0～7.2。
黄鳝弹状病毒CrERV的形态特征：病毒呈子弹状或梭形，病毒具有双层脂质囊膜，与典型的弹状病毒形态相符。
黄鳝弹状病毒CrERV的应用，所述的应用包括利用该病毒制备成黄鳝弹状病毒病疫苗，或是制备成黄鳝弹状病毒的实验室对照品。
本发明的保护内容还包括基于黄鳝弹状病毒CrERV的全序列(SEQ ID NO.1所示)与其他病毒的全序列的差异设计的引物，所述的引物可用于检测黄鳝弹状病毒CrERV。
一种黄鳝弹状病毒CrERV RT-PCR检测引物，包括F1：5'-GAGATGAAGGAAGGACTGAGGAGAA-3'，R1：5'-CCCGACACCACTAAAGTATAAAA-3'；F2：5'–GAGGAGCATTAGTTACTTAAGGGTC-3'，R2：5'-TCACAATTTGAATCGTCATGACATA-3'。
一种黄鳝弹状病毒CrERVRT-PCR检测引物的应用，包括利用上述引物制备成用于检测黄鳝弹状病毒检测试剂盒，或直接用于黄鳝弹状病毒的检测。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明首次自黄鳝中分离并克隆了弹状病毒的全长序列，对于黄鳝弹状病毒的研究具备开拓性的意义。
2.本发明的方法快速简便：本发明所建的RT-PCR方法只需数小时，相比较传统病毒分离方法数天时间，极大的提高了检测效率。
3.本发明的方法特异性强：两对引物对靶序列的特异序列区的识别，保证了PCR方法扩增的高度特异性。
附图说明
图1为本发明提供的感染黄鳝弹状病毒的黄鳝苗种主要临床症状为头部肿大示意图。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。
实施例1：
一种黄鳝弹状病毒CrERV，其分离过程如下：
1)将携带病毒的黄鳝脾、肾等组织取出并碾磨后，培养基稀释100倍，2000rpm离心后取上清过滤，接种到鲫脑细胞系(GibelCarpBrain,GiCB)单层，25℃培养7天，产生细胞病变效应(CPE)，可见GiCB细胞收缩变圆、折光度增加，部分细胞开始脱落，细胞单层开始破裂。
培养基：M199，10％胎牛血清，pH 7.0～7.2
2)收集病变细胞，利用透射电镜进行形态学鉴定。
3)收集病毒，对其进行全基因组测序，序列为SEQ ID NO.1所示。
黄鳝弹状病毒的形态特征：病毒子弹状或梭形，病毒具有双层脂质囊膜，与典型的弹状病毒形态相符，该病毒已于2018年4月24日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：黄鳝弹状病毒(Chinese rice-field eel rhabdovirus)CrERV，保藏编号：CCTCCNO：V201819，地址：中国武汉武汉大学。
有研究表明鳜鱼弹状病毒可以感染黄鳝，但是通过临床症状特征对比结果显示，感染鳜鱼弹状病毒的黄鳝主要出现出血现象，但是本申请中从患病黄鳝中分离的弹状病毒临床症状主要为头部肿大，两者形成鲜明对比(图1)，全序列分析结果显示，鳜鱼弹状病毒与本申请中分离鉴定的黄鳝弹状病毒同源性最高为92％，但是通过基因结构分析发现本申请中分离鉴定的黄鳝弹状病毒磷酸化蛋白基因(phosphoprotein gene,P)由一个大的开放阅读框(ORF)组成(864bp)，与鳜鱼弹状病毒P基因包含的两个ORF形成明显区别(大的ORF大小为849bp，小的ORF大小为219bp)，而且两株弹状病毒的开放阅读框的大小也不同。两株病毒在宿主感染的倾向性不同，而且感染后表现的临床症状也有明显区别，因此，两株病毒无法归为一株病毒。其中，本申请中涉及到的黄鳝弹状病毒的分类地位属于Perhabdovirus属。
实施例2：
基于黄鳝弹状病毒CrERV的全序列(SEQ ID NO.1所示)与其他病毒的全序列的差异设计的引物：
一种黄鳝弹状病毒CrERV RT-PCR检测引物，包括F1：5'-GAGATGAAGGAAGGACTGAGGAGAA-3'，R1：5'-CCCGACACCACTAAAGTATAAAA-3'；F2：5'–GAGGAGCATTAGTTACTTAAGGGTC-3'，R2：5'-TCACAATTTGAATCGTCATGACATA-3'。
实施例3：
利用黄鳝弹状病毒CrERV RT-PCR检测引物对黄鳝弹状病毒的检测，方法包括：
1.黄鳝组织或感染细胞总RNA的提取及cDNA的合成：采用
Figure BDA0001792230970000041
提取待测样品的总RNA。配置逆转录反应体系：3μL总RNA，Oligo(dT)18primer 1μL，灭菌双蒸水8μL，混匀65℃5min后立刻冰浴；将5×Reaction Buffer 4μl，RNase抑制剂1μl，5mM dNTPs 2μL，M-MLV逆转录酶1μL加入冰浴的反应液中，混匀后，42℃1h，95℃5min，将获得cDNA模板-20℃保存备用。
2.聚合酶链式反应扩增：
采用25μl反应体系：PCR反应管中，加入10μM的引物F1、R1各加1μL，再加入2.5mMdNTPs 2μL，25mM MgCl21.5μL，5U Taq聚合酶0.5μL，模板cDNA 1μl，10×ThermoPolReaction Buffer 2.5μl，用灭菌双蒸水将体系均补齐至25μL，进行PCR反应。
以该反应产物为模板，取1μl，10μM的引物F2、R2各加1μL，再加入2.5mM dNTPs2μL，25mM MgCl21.5μL，5U Taq聚合酶0.5μL，10×ThermoPol Reaction Buffer 2.5μl，用灭菌双蒸水将体系均补齐至25μL，进行PCR反应。
PCR反应条件，95℃预变性5min；95℃30s、48℃30s、72℃30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
F1：5'-GAGATGAAGGAAGGACTGAGGAGAA-3'，
R1：5'-CCCGACACCACTAAAGTATAAAA-3'；
F2：5'–GAGGAGCATTAGTTACTTAAGGGTC-3'，
R2：5'-TCACAATTTGAATCGTCATGACATA-3'3.
聚合酶链式反应扩增产物分析：
取聚合酶链式反应扩增的最终反应产物4μL，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭(EB)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察扩增产物的图谱。若巢式RT-PCR能扩增出972bp(SEQ ID NO.2所示)特征性条带，则该样品为阳性；如无任何条带，则为阴性。
实施例4：
黄鳝弹状病毒RT-PCR检测引物特异性试验
利用实施例3所述的方法，对表1中的待检病毒样品进行检测，同时设置阴性对照组(双蒸水)和阳性对照组(CrERV)，待检病毒样品具体为：鲤春病毒血症病毒(SVCV)，草鱼呼肠孤病毒873(GCRV-873)，鳜鱼弹状病毒(SCRV)，传染性造血器官坏死病毒(IHNV)。
表1黄鳝弹状病毒RT-PCR检测试剂盒特异性试验
试验编号 名称 扩增结果
1 CrERV +
2 SVCV －
3 GCRV-873 －
4 SCRV +
5 IHNV －
结果如表1所示，仅阳性对照组(CrERV)和鳜鱼弹状病毒(SCRV)可检测到972bp特征性条带，其余组均无特征条带，说明黄鳝弹状病毒CrERVRT-PCR检测引物具备很强的特异性。通过DNAStar序列分析结果，可将鳜鱼弹状病毒和黄鳝弹状病毒区分开来，其中黄鳝弹状病毒在扩增的产物序列中能够分析出一个大的ORF(864bp)；而在扩增鳜鱼弹状病毒的产物中能够获得两个小的ORF，其中较大的ORF为849bp，较小的ORF为219bp，为了使比对序列过程中操作简单，在使用DNAStar软件比对中仅需区分两株弹状病毒P基因中ORF大小即可，如PCR产物测序结果中出现864bp大小的ORF为黄鳝弹状病毒，当阳性结果序列中出现849bp则划分为鳜鱼弹状病毒。
实施例5：
黄鳝弹状病毒RT-PCR检测引物的灵敏度
将浓度为1500ng/μL的CrERVcDNA模板10倍梯度稀释，利用实施例3的方法，检测利用本发明提供的引物PCR的检测限，结果显示105倍稀释还可检测到目的条带，也就是最低可检测15.00pg/μL的cDNA模板。
实施例6：
黄鳝弹状病毒RT-PCR检测引物在制备黄鳝弹状病毒检测试剂盒中的应用：
1.黄鳝组织总RNA的提取及cDNA的合成：采用
Figure BDA0001792230970000061
提取感染黄鳝弹状病毒的黄鳝的脾肾等内脏组织的总RNA。配置逆转录反应体系：3μL总RNA，Oligo(dT)18primer 1μL，灭菌双蒸水8μL，混匀65℃5min后立刻冰浴；将5×Reaction Buffer 4μl，RNase抑制剂1μl，5mM dNTPs 2μL，M-MLV逆转录酶1μL加入冰浴的反应液中，混匀后，42℃1h，95℃5min，将获得cDNA模板-20℃保存备用。
2.聚合酶链式反应扩增：
采用25μl反应体系：PCR反应管中，加入10μM的引物F1、R1各加1μL，再加入2.5mMdNTPs 2μL，25mM MgCl21.5μL，5U Taq聚合酶0.5μL，模板cDNA 1μl，10×ThermoPolReaction Buffer 2.5μl，用灭菌双蒸水将体系均补齐至25μL，进行PCR反应。
以该反应产物为模板，取1μl，10μM的引物F2、R2各加1μL，再加入2.5mM dNTPs 2μL，25mM MgCl21.5μL，5U Taq聚合酶0.5μL，10×ThermoPol Reaction Buffer2.5μl，用灭菌双蒸水将体系均补齐至25μL，进行PCR反应。PCR反应条件，95℃预变性5min；95℃30s、48℃30s、72℃30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
F1：5'-GAGATGAAGGAAGGACTGAGGAGAA-3'，R1：5'-CCCGACACCACTAAAGTATAAAA-3'；
F2：5'–GAGGAGCATTAGTTACTTAAGGGTC-3'，R2：5'-TCACAATTTGAATCGTCATGACATA-3'
3.聚合酶链式反应扩增产物分析：
取聚合酶链式反应扩增的最终反应产物4μL，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭(EB)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察扩增产物的图谱。电泳图片显示972bp特征性条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
结果显示，阳性对照(黄鳝弹状病毒CrERV)显示972bp特征性条带，阴性(水)对照无明显条带，1-5号感染了黄鳝弹状病毒CrERV的黄鳝组织样品显示972bp特征性条带，说明样品1-5为黄鳝弹状病毒阳性，与实际情况相符。
实施例7：
黄鳝弹状病毒CrERV在制备黄鳝弹状病毒的实验室对照品中的应用：
即将本发明提供的黄鳝弹状病毒CrERV作为对照品，将待确认的其他黄鳝弹状病毒与本发明的病毒进行生理生化上的比较，并且将待测样品跟SEQ ID NO.1所示序列进行比较。
序列表
<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所
<120> 一种黄鳝弹状病毒CrERV及RT-PCR检测引物及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11545
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgagaaaaa agaaaccaat atacagaata tcaagattat tggatttctt tttctcgaca 60
ttaaaaatgt caacagacat catatctgaa cctccaagaa tggaaaacca aatcatcaag 120
agagtgtcta ctggagctga agtcaaggca gttctgcctg caactgaagc tcaggccact 180
tatccagcag atgggatggc agatggggcg atgccactca tcattattga attcaaagat 240
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aacctcaagc tcaatgctga aatcatggcg ttcgccctgg gaacatctgc agagctggta 1140
aaggcttttg acatcggagg caacactgat gaccaagatg acggaggagc ttttgagggt 1200
gagctgaatc taacagaaga tgctggaatg cccaaaaaga gagatgccat ggagtggttc 1260
atgtacatgg aaggcagaga cttcaagctg acagaggaga tgaaggaagg actgaggaga 1320
atggccggaa atatcaagaa cccaaggcct ggaaccatcg gtgatctgct gaagcaccaa 1380
actttgtgag caatcctcga gtcaagagaa atgaaattat atgttattgt gccacatgaa 1440
tatggtctca agtgaccgct ttattgtgag aatgtggagg agcattagtt acttaagggt 1500
caataaggtg atgggatatg aaaaaaactt taacagagat catggcaaaa ccagttttcc 1560
agatatctta tgatcttgag aagttggcta ccaacttcga ggaactcaat ttggctgaat 1620
tgaagcgaaa tggagaggac ccagatgatc ccttggaatg gaaatcatcc cctgacttct 1680
tgccttacgc agcatctcag gaagcagagg agtatgaaca gggagagcaa gaaatggagt 1740
gtattgatga atatactcct gctgactctt cctggacagc agaagtctca ggaccaccaa 1800
tcctcccagg atatacgacc caatctagat ggtttggacc tggagtgaca gcagagacca 1860
agccaatcat attggaagag ttggctagtg tcttgcagca gatcggaatc aagctgattt 1920
cagctgctcc ttctgcggat gccaattatt acttgttata ccccaatgta cacatgaatc 1980
tgatggcccc aggagtcctt gagagtggaa gaccactacc cccctgtcta gctccagccg 2040
aagcacccaa accacccgcc gcgccagccc caggcctgct caaagagtta cctcctgctc 2100
caaggcagcc catccctgcc ctgttggggc aaagtttgac cgggccgatc ccaaatgatg 2160
atgatgtcag agctgtgctc tgggcttctg gaataagggt agttgaaaag aagaccaaca 2220
aaacagctat cctcaagcca tgtgccttag gctggatgat agacgactgg ctgcaagtag 2280
acatcggggc ggaaacagac attgctgaaa tctttaaaaa gatgttggcg aaaactccca 2340
gccgaaaatt gatgatgtac aagtacatcc ctctcgaggt aattcagcaa atggtgctgt 2400
tctaataatc caaattaaat aagtatgtca tgacgattca aattgtgatc ttaattctaa 2460
tttcttttat actttagtgg tgtcggggag atatgaaaaa aactttaaca gatatcatag 2520
aatatccacg aaagatgcct ctgttcaaga agagcaacaa gaagttggct attaagccgt 2580
atcaagcacc tccgccgtac tcggcgactg cactcactcc gagtgctcct atggccctgc 2640
ctgacagtga ctatggaatc aaaacaatga tggtggagtt ggacttcaaa atcatatcca 2700
gcatcgagct gaaaacgatt ggcaagattt accaaattgc gcaatacatg ctggatgatt 2760
atactggtcc aattcggagt aagcctctgt atatgggcct gttcctcgca tcatgccaca 2820
atgccattaa tccatcaatg gtccatggaa agtggcatta tgagatacag tttaggggcc 2880
caataggatt caatctggca aacaacacac ccctggactg ggtctgtaac catgttgcca 2940
gatcttatga gtgttactct cgagatcaat cactggtcag ctacacctgc aatatgcgcg 3000
ccacatagat gagaggatca tctcgtgagt agatgttcca cgctgtgttg gtgcagcgct 3060
cagctgagtc tgtgttcgga attatccaga tggcagaagc agaggtccga ggagacgaca 3120
tgctgtatgt cctgagtgat cgtggtcgta gctggcatta ataagatcgg aacgaattga 3180
ctctgaatct acaaatgacc gacaccacga ggctcactct ctgaagaagg ctcatgacgt 3240
gaatcacctg cagaccatga gccaatcaga tccgactaca ttaatgcaac attcactttc 3300
tcttatatat ggggcacgtc ttacgttttt aaatgtataa ggtcacaatt atgtcatccg 3360
ccaatgcggc gtattagctg atacgcatat cgataattat atatgtatcc ttaactatta 3420
atcagtctga ttggtggtcg ttatgaaaaa aacttaacag atttcatcat gaaattaatc 3480
attgcactca cgttgatctc ccaggcgatt ggctatccac tgtttgttcc gatcagactt 3540
caaggatggc atgatgttaa actagatact ttgatgtgtc ccagttatgc atctgagctg 3600
aataaggagg ccgcttggcc acagattgga ttgagacatc tcgctgcgac agattattat 3660
ggagcaaaag ggacaatctg ccataagacc atctgggtga aaacttgtga tttcagatgg 3720
tatggaccta ggtatattac gaccaagatt tcgtacgcac ctataaccgg actagaatgt 3780
caacaggcag tagtcaaggc atccaaagat gagctagaga caccatacat gccagaagct 3840
aactgcaatt gggctacagt cagtgataat gaaaagacat ttatcacagt ccaaaagagc 3900
aacatcttca tggaccctta taacatggtc tatgtaagcg caatcttaaa aggaggaaaa 3960
tgtgcaagca aagtctgccc actcgagatg catggaggaa tttggatacc cagcgaagca 4020
cccaaagaga gttgcaaact gagcagcagc accactagcc acatcaatcc caacagtgcc 4080
tccaggttag taacagatgc aagttatttg gttacggagt atcatcgaca actgccgttc 4140
ttaggagctt gtaagatgtc aatgtgcgga gaggtaggaa tgaggtttaa gtctggagaa 4200
tggtacaaga ttgagtcaag cgacggacgg gtgctgtcct ttctcgatag tgttccaatg 4260
tgtgatggag agctgactgt ctccatccat gacagctcag ctacgtatca caaattgagc 4320
caggaaatcc ttgatctgtc cgcacaaatt gcttgcatat ccgaattgcg aagagccaga 4380
gagaagggag cagttagcaa ctacctcttg agtttcctaa caccaaacca tggagggttt 4440
gggacggcat accgggtgtt caacggacag ttgcaagctt ccaaggccac ttatgcaaga 4500
gtgagactcg gtgctctctc cactgcaaca aattggggac aattagataa tggcagtgca 4560
tactcttcag aagatgtcac aggcgagata atcgatggac ccctattcaa tgggaatcgg 4620
atggacaatg ggactcttag gatcgttcag aatgcaatat tgggccagac actagaagat 4680
gaagatttat atgaacattc agcaaaagag attctccatc cgcatctgac aatcctaagc 4740
aataatgaat cggacgtgct gtctgcattt cgtcctgtag gtgcccaagg cgatatcata 4800
catgcagtgg gtgagtgggt aggaactgga gtgagtggat ttatccatac tattgtctat 4860
ctggtggtct tctgtggcat cattcttctc ctttacagat gtttgccata tttcctgaaa 4920
aaacgaaaat cacagtcggc gggtcgggtg actcctcaaa tgatcccttt gcagcaatat 4980
caatttgttc cctaaatgac ttgtattgat tgaaccattg ttatactctt tattacaagc 5040
tcttgaatgg gtgattcttc ttcttcatga tatattatct agatgatggg ttaataaagt 5100
gggtatgaaa aaaactttaa cagtgatcat ggattattct caggaatatg tcgatgatta 5160
cgatgatcca tttgcggaat acgaggcttt ctcaaatttt caagattttt ttgaaaaagg 5220
gagaccactg aatcagaaag attacaacct gaattctccg ttgatcggag atgagattga 5280
tgcattcctc acatacctca aaacacacag tatctctgca agatttgtga gagacaaaaa 5340
aagatgggag ctttacaaag agcatgtact gtatcctcac ttgatgatcc aagaccacac 5400
tgtcatacat aaatggttag ggaatcattt gctgaatatg caacaaacac aagaatataa 5460
aactttggtg agtcgtgtaa atgaaatgac aagatcggca gatgagatac ttcaaccttt 5520
tctaaaggga tggaaaggtg agtccacatc accaactaga aaagacccaa atttgttaca 5580
acatacaggt ctggaatatg gatcaggatt tctcggctgg cacaaagtta cactattgat 5640
gaatagtcag acaagattag aaagagaaaa tctgataaca tctgagttcc aaggcctgga 5700
gtctgttcta gaatcagatg acttatggat agggagaatc aaagatccat gtattggtac 5760
ttggatcatc actgataatc tagtctggag caacaaaagt ggaattctac tagacaaaaa 5820
tacagttatg atgatcaaag acaccttgat aggccgcatt cagacgctat tgagcttaat 5880
aaatcgagaa gacaaaaaat ttgatgacca aacacccaag aaactctaca atctatacag 5940
attgggagac aaaatgctca agaacaaggg ggatgacgcc tatgaggcta ttaagatgct 6000
ggaaccaatg tgtaatcttc agctatctaa actggcacat gaatatcgtc ctctcatccc 6060
tgatttccct cactttgaaa accatgtgag gaaaacatgc ggcgacctat cacaagagca 6120
cccagaagtc ttagaaatac tagagctagt gttgtcatta agaaacgtcg aagaggcact 6180
tctcttcttc ggatctttca gacactgggg gcatccattc attgattact ttgagggcct 6240
taaaaaactg aacaaacaag tcacattgca aaaggagata gatgacaaat atgcgaatgc 6300
attagcaagt gatctggcct atatagtcct taagaaggaa tttgacaaga agaagcactg 6360
ggcagtcaac aaagaagcga tgagtgagaa acatccattc taccagcatg tctctgaaca 6420
cacctggcca acaccaaaac aagtagacga ctttggagac aattggcata aactgccact 6480
tataaaagtg ttcgaaatcc cggacgtcat tgatccgtcc atcatatact cagacaagag 6540
ccattccatg caaaaatcag aggtgctaga tagtatcatg aaccatccca atactcccat 6600
cccaactagg aaagtattgt cctctctctt agagaaacca gcaacagatt ggccgaaatt 6660
tctagagtca gtagatctaa atgggttaga tgaagaagat ctggttatcg gattgaaagg 6720
gaaagaaaga gaattaaaga aagcaggacg tttcttctcc ctaatgtcat ggaaattacg 6780
agagtatttc gtcatgacag aatatctgat caaacacaac tttgtcccac tatttcatgg 6840
attgactatg gcagatgaca tgactcaagt tatgaagaaa atgttagaca gaagccaagg 6900
gcaaggagag aatgactacc agagagtcag tattgcaaac catattgact atgaaaagtg 6960
gaacaatcac caaaggaaag aatcaaatgg accaacattt cgagtgatgg gacaattctt 7020
gggctatcca tctttgatcg aaaggacgca tgagttcttc gagaaaagcc tgatatacta 7080
caatggtagg ccggatttga tgcaagtgac cggaaaccag gtgattaact ccactgataa 7140
acttgtttgc tggcaaggac aaaagggagg gctagaggga ctaagacaga aaggatggag 7200
cattttaaat ctgttaatca tcaggagaga atctaaaatt cggaacactc gggtccagac 7260
cctggcgcaa ggagacaatc aagtcatttg cacccaatac atgctcagcc ccagcagaga 7320
tgagaaagag ctgaaagaga agctgaaaca catagcagaa aacaatgggg ttattatgga 7380
cgccatcgag aggggcacaa ataaactggg tttgattatc aacaacgatg agactatcca 7440
gtcagcagat ttcctgacat atgggaaaat accaatcttc cgcggaaaca ttcgttgtct 7500
agaagggaaa agatggtcca gggtgacatg tgtgaccaat gatcaacttc caaatttatc 7560
taatgttttg tcatcagtct caacaaatgc tctaaccgtc tctcactttg acatttcacc 7620
attgaatgct atgcgacagt attgtttctt cggatgcttt gctcttaaac tggtctccat 7680
gcacaatccc gctctgcgag gatcccacga gtcacgctta ggatttgata tatcaaccga 7740
ttctacaatc gcagctactt tgtttcttga tccatcattg ggaggagcca gtgggatgtc 7800
cctgacacga ttcttaatga gaatgtttcc agatccagtc accgaggggc tagcgttttg 7860
gaaggtggtc tacaacaaca cagatttagg ttgggtgaag aaattgtgta caaaggctgg 7920
tcatcccaaa ttagctaaag gagagatgaa caacatcggg aagctgatag agaatccatc 7980
tgctctcaat ttaaagaaag agacatcagc aatcagtatc ataaaaaacg aagtgaaaag 8040
attcttatac gacaaatgca ttgatttcgg gaatagagtt atatcagccg caatcgaaga 8100
aaccagagag gaagagccat acctggacaa cttcctcgca tccatctatc ctctatttcc 8160
aagattcttg gccgaattca aagctgcatc gttccttgga atcacagatt ccctggtcag 8220
cctgttccag aactccaaga ctatcagagg tgtgttcaaa aacaagtatg caaaagaaat 8280
agagttaaag gtcctgactt gcgagatcaa cttactgaaa ttaatacatg actttgaaaa 8340
ggcagaaatt ttcccgatgt gggattgctc ctccttacat gctaagattt tgagacaaga 8400
atcctgggga atgccagtgc atggagctac cattccgcac cctttagaga tgttatctct 8460
gaaagatttt catcatagat gtgagataat ggattatatc acagtctctg taattgagcc 8520
attaaacaaa tgcttagaat ccaagggcag attgccagct tacttgggat caaagacatc 8580
ggagaccaca agcatcatcc aaccatggga cagagaaaca aacatcccaa tgatcaaaag 8640
agcagccaag ctaaggaatg ccatatcatg gtttgtgaac cctgactcca atctagcaaa 8700
aagcataatg aacaatttag aaggactcac tggcgaaaaa tgggatggtg cattggaggg 8760
attcaaacga accgggtccg ctctgcaccg tttctctagc gctcgagtca gctcaggtgg 8820
cttttccgca cagagtcctg caaaattgac aaggatgatg tccacaactg atacctttag 8880
ggatataggg accgacaatt acgacttcat gtttcagtcc ttgctaatcc attcacagat 8940
cacagcaggc gaagtcctcg gagattctga tgcaacagga acattgcatt ttcatttgga 9000
ttgcaaaagt tgcctgtcta gaatagaaga ggtagtcctg gaatcaagag tcacctacag 9060
tccagaagac agatctggat tacttaacag gtggaagcca gagggatcaa catggtcaac 9120
agaaagaacc agaccggaga tccagagtac cgccatagag aggttaaata aatcatccat 9180
tcattataac atgggaaggg ctcaaggatt tatttacgga gatcagaaga tgaccggaag 9240
aggaggagac gagtcatcat tgttccctct ctccatccag tacaaagtaa aggctgatct 9300
gtttttgaaa ggactgatgg acggtttggt ttatgcatca tctctcgcaa caatccacag 9360
gaggaatttt gaccatccga ccaaattcca agcaacacag tatgggacat tggagtactt 9420
ggtagaagag ctgacaagtc atccgccatt tctcaatctt ttgagatcag gtcctttatc 9480
agaaatattg agaagtgtcc ctcacagagt ccctccatct tacccattga cgaacaggga 9540
tttgggggca ttggcacgaa attacttgag atacatgcta caaactttga aacagagcca 9600
ccaaagaaag gactacgatg caaatttgat aatttttgct gacatgatgt ccccagacgt 9660
catataccct tacgccctag cgcaaaagtg tgcaagatta gcatttaagc ctaagtggac 9720
accaaaggac acagaaactt tgagacaact gagagaaact gcatccagca tgagagcgaa 9780
tcctgacttc aagatgtatc tgtcaaacaa gatagtcgca gtagaccatg agattcgcca 9840
tgcatccaaa accatacaag agaaaacctc cttcaaagaa gaaaagctcg actgggggaa 9900
ggaattgtct gggaaagtga caatctcaga tgttgtagtc agtaatgaga agcaggcagt 9960
cccttcagaa acagtcaagc agcggaaaga tccattaata tctggattgc gacatttcca 10020
gatggccaca ggagcacatt ataaattgag atcaatcttg gatgctaaaa agatcactta 10080
ccgtgatttc atctgtggtg gagatggatc aggggggttg acatcatgtc tcttaagaca 10140
atctccagct agtcgaggac tcttcaacag tttgttggag ataaaggaaa cagatctgag 10200
gggcagttct ccgagtccac catctgctgt gttccatttg ggaccagaga gtcagagatg 10260
ctgcaatcta ctgtctgcat gggaaaatcc cagtgatcta agtcaggcac ttacttggga 10320
ctactttcgc tcagaaatga caaagaataa ccttaaagtg gatctcatga catttgacat 10380
ggaagtgcgg gatgtagaaa tgtctgtaaa aatagaaacc atgattgaag agaacttaga 10440
cctgttgtct gagaaaggaa cattgatcta caagacttac ttgagccgat ttgcatccgt 10500
ggatgtttgt gcaccagaga ggttcagcaa gtacttttca aaagctgagt tgatttcaac 10560
tcaattcact agcagtcata gctcagaagt ttatcttgtg tgcactggga aacgaagaaa 10620
tccaaaaaat ttgaaatttg tcaattggaa aacgacttgg gcactcgcaa aagttcacaa 10680
gtgttggaat gacacggaaa ccgagttgaa acgggctttc gagctgcagc agatggacat 10740
gtatcaggga gtgccgaaga agttgatatc tgattgggaa aacgatcttc tggctttgac 10800
tctggggctc cgagtagaga gtgggatagc ctcagtattg tgctcatttc tgagtaccca 10860
tcgacgaatc ttgtccggga cgacactcct tgccatctgg gctcatgtgg cactctacca 10920
aagaagaccc ggaaccagtc ctccttctat cagacactgc caggaaattg gtatcatttc 10980
tattggattt ctctactgct tagctcttgc tagagctgat gtctcattgt atagcaagat 11040
gaaaatgatg acggacaatg cctttccctt tcattaccaa aaatccagat ggaacacagc 11100
cactggattg aatcaaaccg tcaggctgga caataaaatg gcaagtcttg gaagtgtgat 11160
cagattgttt tccagacttg gtttacaggg ggatgcagac tggaggaaag tggatgaatc 11220
atgccgactg attgtaccgc agtgcacaat gaaatggata ttggcacaca ctgggctggc 11280
aggattgaca aaaggtgagt ggtcattggg ggaagtgatt gctcaggaag agtgggagga 11340
gagagaggct gcgtggacgg aataagcctt aaatgtattg tatttttgtg atggtttgct 11400
tttgggatat tttgaaaact taggcttact ttcatgtgtt taatcattag agtaataagg 11460
gatgtttttt tgatatgaaa aaaactcaca attactgaga aaccgaaccg gtttgctaat 11520
cagagactgt gtttgttttt ctcgt 11545
<210> 2
<211> 972
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaggagcatt agttacttaa gggtcaataa ggtgatggga tatgaaaaaa actttaacag 60
agatcatggc aaaaccagtt ttccagatat cttatgatct tgagaagttg gctaccaact 120
tcgaggaact caatttggct gaattgaagc gaaatggaga ggacccagat gatcccttgg 180
aatggaaatc atcccctgac ttcttgcctt acgcagcatc tcaggaagca gaggagtatg 240
aacagggaga gcaagaaatg gagtgtattg atgaatatac tcctgctgac tcttcctgga 300
cagcagaagt ctcaggacca ccaatcctcc caggatatac gacccaatct agatggtttg 360
gacctggagt gacagcagag accaagccaa tcatattgga agagttggct agtgtcttgc 420
agcagatcgg aatcaagctg atttcagctg ctccttctgc ggatgccaat tattacttgt 480
tataccccaa tgtacacatg aatctgatgg ccccaggagt ccttgagagt ggaagaccac 540
tacccccctg tctagctcca gccgaagcac ccaaaccacc cgccgcgcca gccccaggcc 600
tgctcaaaga gttacctcct gctccaaggc agcccatccc tgccctgttg gggcaaagtt 660
tgaccgggcc gatcccaaat gatgatgatg tcagagctgt gctctgggct tctggaataa 720
gggtagttga aaagaagacc aacaaaacag ctatcctcaa gccatgtgcc ttaggctgga 780
tgatagacga ctggctgcaa gtagacatcg gggcggaaac agacattgct gaaatcttta 840
aaaagatgtt ggcgaaaact cccagccgaa aattgatgat gtacaagtac atccctctcg 900
aggtaattca gcaaatggtg ctgttctaat aatccaaatt aaataagtat gtcatgacga 960
ttcaaattgt ga 972
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagatgaagg aaggactgag gagaa 25
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccgacacca ctaaagtata aaa 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaggagcatt agttacttaa gggtc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcacaatttg aatcgtcatg acata 25

Claims (6)

1.一种分离自黄鳝的弹状病毒，所述的弹状病毒为黄鳝弹状病毒（Chinese rice- field eel rhabdovirus）CrERV，保藏编号为：CCTCC NO：V201819。
2.权利要求1所述的弹状病毒的基因，所述的基因为SEQ ID NO.1所示的多核苷酸。
3.权利要求1所述弹状病毒的检测引物，所述的引物为：F1：5'-GAGATGAAGGAAGGACTGAGGAGAA-3'，R1：5'-CCCGACACCACTAAAGTATAAAA-3'；F2：5'–GAGGAGCATTAGTTACTTAAGGGTC-3'，R2：5'-TCACAATTTGAATCGTCATGACATA-3'。
4.权利要求1所述的黄鳝弹状病毒CrERV在制备黄鳝弹状病毒病疫苗中的应用。
5.权利要求1所述的黄鳝弹状病毒CrERV或权利要求2所述的基因在制备黄鳝弹状病毒对照品中的应用。
6.权利要求2所述的基因或权利要求3所述的引物在制备黄鳝弹状病毒检测试剂盒中的应用。
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