CN111057684B - 一种鲤冠状病毒hl39及rt-pcr检测引物及应用 - Google Patents

一种鲤冠状病毒hl39及rt-pcr检测引物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于病毒检测领域，具体公开了一种鲤冠状病毒HL39及RT‑PCR检测引物及应用，发明人首次从鲤鱼中分离出了一种鲤冠状病毒，该病毒为鲤冠状病毒（Cyprinid Nidovirus,CyNV）HL39，该病毒已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：V201988。针对该病毒序列设计引物，F：5'‑CCTCTTGACCCAAGACGGTT‑3'，R：5'‑CCGGTGGTTGAGAGCTTGTA‑3'，可对鲤冠状病毒进行检测，该引物的特异性好，灵敏度高。

Description

一种鲤冠状病毒HL39及RT-PCR检测引物及应用
技术领域
本发明属于病毒分子检测技术领域，具体涉及一种鲤冠状病毒HL39及RT-PCR检测引物及应用。
背景技术
套式病毒目(Nidovirales)于1996年首次由国际病毒分类委员会(InternationalCommittee on Taxonomy of Viruses,ICTV)提出，该目病毒宿主广泛，可引起哺乳动物、鸟类、爬行动物、鱼虾等水生动物多种重大疾病。套式病毒目冠状病毒科是一类线形单股正链RNA病毒，最早于1937年从鸡身上分离出来，Almeida等对这些病毒进行了形态学研究，电子显微镜观察发现这些病毒的包膜上有形似日冕的棘突，故提出命名这类病毒为冠状病毒[1]。1975年，国际病毒命名和分类委员会正式命名了冠状病毒科。由冠状病毒科的严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)引起的非典型性肺炎，世界上有30多个国家和地区相继报道出现病例，病死率超过10％。2012年，中东地区开始出现新型冠状病毒，病死率超过50％，引起了世界范围的广泛关注，造成社会对冠状病毒的恐慌。因此，对冠状病毒进行深入研究具有重要意义。
2018年ICTV调整了套式病毒目的分类，新增了Abyssoviridae、Medioniviridae、Mononiviridae、Euroniviridae和Tobaniviridae等5个病毒科，其中在Tobaniviridae科下新增Oncotshavirus属。2017年，申请人发表了鲫冠状病毒的相关研究成果，目前鲤冠状病毒(Cyprinid Nidovirus,CyNV)尚无公开报道，更也无有效的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种鲤冠状病毒HL39，所述的病毒分离自鲤鱼病变组织，该病毒已于2019年11月26日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：鲤冠状病毒(Cyprinid Nidovirus)HL39，保藏编号：CCTCC NO：V201988，地址：中国武汉武汉大学。
本发明的另一个目的在于提供了基于鲤冠状病毒HL39的全序列(SEQ ID NO.1所示)与其他病毒的全序列的差异设计的引物，利用该引物可用于检测鲤冠状病毒HL39。
本发明的还有一个目的在于提供一种鲤冠状病毒HL39 RT-PCR检测引物，所述的引物为F：5'-CCTCTTGACCCAAGACGGTT-3'，R：5'-CCGGTGGTTGAGAGCTTGTA-3'。
本发明还有一个目的在于提供了鲤冠状病毒HL39的应用，所述的应用包括利用该病毒制备成鲤冠状病毒病疫苗，或是制备成鲤冠状病毒的实验室对照品。
本发明的最后一个目的在于提供一种鲤冠状病毒HL39 RT-PCR检测引物的应用，包括利用所述的应用制备成鲤冠状病毒检测试剂盒。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种鲤冠状病毒HL39，所述的病毒分离自鲤鱼病变组织，该病毒已于2019年11月26日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：鲤冠状病毒(CyprinidNidovirus)HL39，保藏编号：CCTCC NO：V201988，地址：中国武汉武汉大学。
将鲤冠状病毒HL39(本发明或称为CyNV-HL39)接种到草鱼性腺细胞(Grass carpovary cell line,GCO)单层，25℃培养7天，产生细胞病变效应(CPE)，可见GCO细胞收缩变圆、折光度增加，部分细胞开始脱落，细胞单层开始破裂，培养基：M199，10％胎牛血清，pH7.0～7.2。
鲤冠状病毒HL39的形态特征：病毒呈棒状，四周有明显的日冕状棘突结构，与典型的冠状病毒形态相符。
鲤冠状病毒HL39的应用，所述的应用包括利用该病毒制备成鲤冠状病毒病疫苗，或是制备成鲤冠状病毒的实验室对照品。
本发明的保护内容还包括基于鲤冠状病毒HL39的全序列(SEQ ID NO.1所示)与其他病毒的全序列的差异设计的引物，所述的引物包括基于该差异序列，利用现有技术设计的诸如荧光定量，LAMP，数字PCR等设计的引物，利用该引物可用于检测鲤冠状病毒HL39。
一种鲤冠状病毒HL39 RT-PCR检测引物，所述的引物为F：5'-CCTCTTGACCCAAGACGGTT-3'，R：5'-CCGGTGGTTGAGAGCTTGTA-3'。
一种鲤冠状病毒HL39 RT-PCR检测引物的应用，包括利用上述引物制备成用于检测鲤冠状病毒检测试剂盒，或直接用于鲤冠状病毒的检测。
以上所述的试剂盒中，优选的，所述的试剂盒包括：引物、dNTPs，MgCl2，Taq聚合酶，模板cDNA，10×ThermoPol Reaction Buffer。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明首次自鲤鱼中分离出了冠状病毒，对于鲤冠状病毒的研究具备开拓性的意义。
1.本发明的方法快速简便：本发明所建的RT-PCR方法只需数小时，相比较传统病毒分离方法数天时间，极大的提高了检测效率。
2.本发明的方法特异性强：一对引物对靶序列的特异序列区的识别，保证了PCR方法扩增的高度特异性。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。
实施例1：
一种鲤冠状病毒HL39，其分离过程如下：
1)将携带病毒的鲤鱼肝、脑、脾、肾等组织取出并碾磨后，培养基稀释100倍，2000rpm离心后取上清过滤，接种到草鱼性腺细胞(Grass carp ovary cell line,GCO)单层，25℃培养7天，产生细胞病变效应(CPE)，可见GCO细胞收缩变圆、折光度增加，部分细胞开始脱落，细胞单层开始破裂，培养基：M199，10％胎牛血清，pH 7.0～7.2
2)收集病变细胞，利用透射电镜进行形态学鉴定。
3)收集病毒，对其进行全基因组测序，序列为SEQ ID NO.1所示。
鲤冠状病毒的形态特征：病毒呈棒状，四周有明显的日冕状棘突结构，与典型的冠状病毒形态相符，该病毒已于2019年11月26日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：鲤冠状病毒(Cyprinid Nidovirus)HL39，保藏编号：CCTCC NO：V201988，地址：中国武汉武汉大学，本发明或称该病毒为CyNV-HL39。
实施例2：
基于鲤冠状病毒HL39的全序列(SEQ ID NO.1所示)与其他病毒的全序列的差异设计的引物：
本发明以普通PCR为例进行说明，基于该差异序列设计的其他引物，荧光定量引物，LAMP引物，数字PCR引物等，也能完成鲤冠状病毒HL39的检测。
一种鲤冠状病毒HL39 RT-PCR检测引物，所述的引物为F：5'-CCTCTTGACCCAAGACGGTT-3'，R：5'-CCGGTGGTTGAGAGCTTGTA-3'。
实施例3：
利用鲤冠状病毒HL39 RT-PCR检测引物对鲤冠状病毒HL39的检测，方法包括：
1.鲤鱼组织或感染细胞总RNA的提取及cDNA的合成：采用
Figure BDA0002353652290000031
提取待测样品的总RNA。配置逆转录反应体系：3μL总RNA，Oligo(dT)18primer 1μL，灭菌双蒸水8μL，混匀65℃5min后立刻冰浴；将5×Reaction Buffer 4μl，RNase抑制剂1μl，5mM dNTPs 2μL，M-MLV逆转录酶1μL加入冰浴的反应液中，混匀后，42℃1h，95℃5min，将获得cDNA模板-20℃保存备用。
2.聚合酶链式反应扩增：
采用25μl反应体系：浓度为40μM的一对引物F、R分别各取0.5μL加入PCR反应管，再分别加入2.5mM dNTPs 2μL，25mM MgCl2 1.5μL，5U Taq聚合酶0.5μL，模板cDNA1μl，10×ThermoPol Reaction Buffer 2.5μl，用灭菌双蒸水将反应体系补齐至25μL。反应条件，95℃预变性5min；95℃30s、48℃30s、72℃30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
F：5'-CCTCTTGACCCAAGACGGTT-3'，R：5'-CCGGTGGTTGAGAGCTTGTA-3'。
3.聚合酶链式反应扩增产物分析：
取聚合酶链式反应扩增的最终反应产物4μL，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭(EB)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察扩增产物的图谱。若F和R能扩增出203bp特征性条带，则该样品为阳性；如无任何条带，则为阴性。
实施例4：
鲤冠状病毒RT-PCR检测引物特异性试验
利用实施例3所述的方法，对表1中的待检病毒样品进行检测，同时设置阴性对照组(双蒸水)和阳性对照组(CyNV-HL39)，待检病毒样品具体为：鲤春病毒血症病毒(SVCV)，草鱼呼肠孤病毒873(GCRV-873)，草鱼呼肠孤病毒9014(GCRV-9014)，传染性造血器官坏死病毒(IHNV)。
表1鲤冠状病毒RT-PCR检测试剂盒特异性试验
试验编号 名称 扩增结果
1 CyNV-HL39 +
2 SVCV －
3 GCRV-873 －
4 GCRV-9014 －
5 IHNV －
结果如表1所示，仅阳性对照组(CyNV-HL39)可检测到203bp特征性条带，其余组均无特征条带，说明鲤冠状病毒HL39 RT-PCR检测引物具备很强的特异性。
实施例5：
鲤冠状病毒RT-PCR检测引物的灵敏度
将浓度为2032ng/μL的CyNV-HL39cDNA模板10倍梯度稀释，利用实施例3的方法，检测利用本发明提供的引物PCR的检测限，在样品模板做105倍稀释时，仍然可检测观察到203bp的扩增条带，也就是最低可检测20.32pg/μL的cDNA模板。
实施例6：
鲤冠状病毒HL39 RT-PCR检测引物在制备鲤冠状病毒检测试剂盒中的应用：
1.鲤鱼组织总RNA的提取及cDNA的合成：采用
Figure BDA0002353652290000051
提取感染鲤冠状病毒HL39的鲤鱼的肝脾肾等内脏组织的总RNA。配置逆转录反应体系：3μL总RNA，Oligo(dT)18primer 1μL，灭菌双蒸水8μL，混匀65℃5min后立刻冰浴；将5×Reaction Buffer 4μl，RNase抑制剂1μl，5mM dNTPs 2μL，M-MLV逆转录酶1μL加入冰浴的反应液中，混匀后，42℃1h，95℃5min，将获得cDNA模板-20℃保存备用。
2.聚合酶链式反应扩增：
采用25μl反应体系：浓度为40μM的一对引物F、R分别各取0.5μL加入PCR反应管，再分别加入2.5mM dNTPs 2μL，25mM MgCl2 1.5μL，5U Taq聚合酶0.5μL，模板cDNA1μl，10×ThermoPol Reaction Buffer 2.5μl，用灭菌双蒸水将反应体系补齐至25μL。反应条件，95℃预变性5min；95℃30s、48℃30s、72℃30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
F：5'-CCTCTTGACCCAAGACGGTT-3'，R：5'-CCGGTGGTTGAGAGCTTGTA-3'。
3.聚合酶链式反应扩增产物分析：
取聚合酶链式反应扩增的最终反应产物4μL，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭(EB)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察扩增产物的图谱。电泳图片显示203bp特征性条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
结果显示，阳性对照(鲤冠状病毒HL39)显示203bp特征性条带，阴性(水)对照无明显条带，感染了鲤冠状病毒HL93的鲤鱼组织样品显示203bp特征性条带，说明样品为鲤冠状病毒阳性，与实际情况相符。
实施例7：
鲤冠状病毒HL39在制备鲤冠状病毒的实验室对照品中的应用：
即将本发明提供的鲤冠状病毒HL39作为对照品，将待确认的其他鲤冠状病毒与本发明的病毒进行生理生化上的比较，并且将待测样品跟SEQ ID NO.1所示序列进行比较。
序列表
<110> 武汉海关技术中心
<120> 一种鲤冠状病毒HL39及RT-PCR检测引物及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25833
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgaattacc aataaactac cacccgctat tatagcacta gacactagcg aactgctagc 60
ttcctccaag ctgcacaacg caaactgtct ttttaactct cctaacctcg aacgcagcgc 120
aggtaccctc acccggacca cgcgtgtgcc cttgactgga aaccctacct tcgatcaggc 180
cttcgaacgc agcaaaggta ccctcacccg gaccacttgt gtgcccctac gcctgctctt 240
acgtagcccc atcctaccca cccgccaact cttaacctat cagctttgcc caccgtgacg 300
actagacgtg atctaactgc tactaccaat cctattacaa ccaacttgcc caccaagacg 360
actagagagt gacgtaactg ctactgccta aggcactacc agcgaaatca taatctgctc 420
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tgtaaccttg ccaaagatca agttgtcatt ttaacaccaa atcatgataa acttaaagct 4020
cttcacgata gtaacacaac catcacaaat tacaaaattg aacttgctaa taacaaattt 4080
acattcacaa tcggccaaaa cacctacagc gaaaactact tctcacttca ggatttcatg 4140
attggaatgc atgccagcaa cttcatgctt tcttcccgct cttgtactct gcttgaacat 4200
gttaacacct ttaatgccca cctcttaatt gacgccacaa cagaaacaac caccctgcta 4260
gacgcctatg aagtactcgt cttcataaaa tttagaccac tgctcctcac ctactccaac 4320
accgctcttg caactaacaa ctcaagaaca atccgcagtg cactctcacg tcttattaac 4380
ttccgtgtcg caccttctaa aacaatatca caggtacatg ttcacatcct cacccgcaac 4440
gaccacgcag ccacagaaca agaacatcta gacttagcaa atattgaaat tgcccacatg 4500
aacccaaaac cagcaattat ctttgtaact tcttcccgat ccaaacataa ctacaccacc 4560
ccaactgtct tcttcgactt tgctaaacta tcagccccca ccctcccaga acagcttaaa 4620
ccactcactg atctagccct cgcaatccaa cacactgcta ccaaaactcc aacaacagta 4680
cttacaactg ccccagagga cccaaaaacc ctcccaacag cacccacctc ctttacaaaa 4740
ccttcccgta aacgctacca ctgcttccac gatttaacca ccctaccagt taacaaaaat 4800
ttcatcttag ttaacgcagg taacccccac ttaaaatcag gtggtggaat aactaaagcc 4860
gtctataatc gctacggcca aggattcatg caaactaaca acagcatgca tgctacacaa 4920
ttacctcttg aagttggtga cgtcttggaa tacccctctg accgtaacaa cctgattaac 4980
gtgacagccc cctgcatcaa catcaaacac gcagattaca aaggcccaca accagcccac 5040
gcactactag caacatataa cgcaattatc aactacgttg aacgtaagta cgataatggc 5100
gacgagaaac acgtcttcat tcctctactt ggtgctggat actacggttg gtcacagatc 5160
caaagccttc aagcttttct atccgcgact gataatagtt tccgcaacac atatgttcta 5220
ctcctacacc catcatctgt agatgttgaa acagctgaag tatttgcaaa aatgctcgcc 5280
actactaacc cacactacta ccatgttgag ggcatagcta aagttaatgc caactcttgc 5340
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ttaatcggcg cttactggat gtacacctgc cccaccctgg ccgccccatt gatacaagct 5460
ggcatgcacg gtcccaacac ctggactcct ggcagcttta ttgacactag tattgctgaa 5520
atgactgctc gcgcttacaa aataaatctt gtttgcgacg gttgcttcac tgatatcatc 5580
aatttcaatc ccgaccaagg tttaatctgc aatacctgca agacacctgt cactctccgg 5640
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cctaacatta ttctggatgg aatctaccac atggccacgc accaattgtt cctaaattcg 5760
gtactcttta aaaattcaca tgctttcaca attaacaacc taagtgaatg tgatctccca 5820
actactatag cagtagcaac ctacttttac aaaccttcag atgctttaaa cttcttcctg 5880
aactttaact ctgctatttc tgctaacgta acttatacat cagaacagat aacacaagct 5940
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aaccctacac ctactacttt accacgcgcc ccaacaccgc tttcaattag tgatagtagc 6060
gaagatattt cactctccga cgacacccac accgtagcat cccatcacgc ttcacaaatg 6120
tccataacag ctgacacaac tagtgataga tatagctcta caaactctct agctatctca 6180
gaagatataa catttcaaac aggtgacggt gaaacaacaa cttcacttct gactgattcg 6240
gtcctatact actctgtcgt tacagtctta caactacgta aagcagagga ttgtgtagaa 6300
cctgctgtag aaactattaa cctaagaccc aactcatcac ttcatacctt gacacatgat 6360
acaaacgcca ccgaccaact ttacatccaa gtggcttctg atgcttcaaa tcacactgta 6420
atcaataaca ccacacttga atctatttct aaaacgatgt gtgtgaaaaa ctccttgtac 6480
accctactta ccaactcaaa gtgtataagt caccacatca tagttacagg atatgaccaa 6540
catgctcatg aaacacatac tatcaaaagc gtcacgcgcc aagccatgct cgccatccaa 6600
cccctttcac aacttacgcc cacacacgtt tacagcacac ttcaagaaga tatttccacc 6660
atcttccaaa ctgtcgtcct agaacacgtc aaccacacca agctttccac ttacaacacc 6720
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gttcaaggta agctgcgcga agttgatctt ggcattgttg ttccttacca gtgtgaagtt 6840
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cactcaccac tagtgacctt tgtttctatc gacaaatctt ttactaaacg tatttttaat 6960
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ttcacagtta aaggaattgg cttcggcttc agctcaacgg aaccaaacac acaactcatg 7080
aacggtctct ggatacaata cggcatcttc tacttccaag tacacctcca aaccctcatc 7140
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ggcaaaagat tcaccgaacg ttcagtccaa acaatgacgg gagaaatcgt taacacacga 7260
aaaccctcgt tatcaaacgc tgtacaaaaa tacggcatta acactcgact tgaatacgtt 7320
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tatctctttg ctggtaatgg ctatataaca ttcttagcct acatcatcca atttttcacc 7440
gctcgcgata tctacagact ctctaaacac ctctacacag tctcaaaact caccaccttc 7500
ctcgcgaaat ttaaaacagc aaccacccgt cacgtcttgt acgccaccaa ccaagtaaac 7560
aaccgttccc ttcatctcac cctcggatcc acgacaattg acttactcag ctttacaagc 7620
aaagcagctt tccttgccct gtgctcctcc ttcatctcat ggcatttcgg attagctctc 7680
gccggtggtc actctggtga agactactct caaccaccct accacgcagt atttcaacat 7740
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gcttcagcct gcgcagactc atcagcccct ctctgcttcc tcggaacacc atttaacttc 7860
cacttcccat catcctacac acaagcagca tccatgacta cagaacacgt agtaccattc 7920
tggatccaac taatcatcct agccccacca tcgctttttt tagttgtcat tccgtggctg 7980
atcacaatgt tcatctcacc agtattaaca tttaaccaac ttttgctccc tgcactcgcc 8040
gtacatttct tagctatcta tgtaatctac ctttactatt tcaagaaatc gtgctgccat 8100
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gatttatcca tgtacttcaa tcacaataaa ctttgccccc gccataactt ttactgtaat 8220
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tatcatctta aacctggcac tattaagccc gatgtcgccc tagtacacac agaacaccac 8340
gcttccctga gtcgcaaaga attgaagaaa cacgacgacc caaccgattg tgtctggacc 8400
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gccaaaacaa catcttctcc agctacaggt gtcatcaaca caaaagttct cggccatctt 8580
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gacgaatacc acattaaact tcatgatata acacctcaat ttcacgaagt tattgcttca 8940
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gttcatctcg gtggtgtgaa aatcgcttac cttagagccg gtgttgctta caacatgcca 9360
acatactcag agacaccaca aactagcaaa ctctgtgttc tcactgcact ctcaaagacg 9420
aaatgcttta acatcctacc aggtggcttt catactccag tactagccat cctcgtctca 9480
acttgtgcac ttctggcaac ggtccttttc tacctctacc tactccagat ctttaaattc 9540
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tggatggtcg ccatgattaa catcgcaaac ctcgctgttc tagcccacac aacatttggc 9720
atggtactca tcttcatcta cgcgctctac agactctaca aagtctacca agttacatca 9780
accgctgcag ttacaattaa cgcaactggt gaaatgcgct tccacggaac tcttgatgaa 9840
gttgctctct gcacctttcc aattagctct gcaagtgttt accaaatcat gtctgacctc 9900
agcttagatt acattaaact ggccagttac aaaacatctt ataaccgtgc tacccgcaac 9960
ctggttaaca tgatgcaaag atacattctc gacacctcca tcccagctat actctatgac 10020
ggctcagtaa caactggcat catgcaacaa tccctagtta gacttaaatc cctagttaca 10080
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atcttagcaa actctactat caccgtttcc cacaagtcaa ctatctatga agcaacaatt 10260
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cacaccatcg agtgccactc accaactgcc actgacctcg aaagcatgca agttaattac 10380
acccaatttg ttactttcgc tgataaagat cactcagatg ccatagccat gaataacaca 10440
acctacctac catctggtca cttctttgct atcggaaccg aatctggcga atctggcagc 10500
ccctacttct ttaacaacaa acttgtagga attcactacg gagttaacac ctgtgatcaa 10560
tttatgctcg cctctaaacc tgatggcagt tactacatcc cagaaatcca acacaacatc 10620
tccacacaac catcttttag ccttagttgc atagcccatg gtcgaaaatc ggtaaccgaa 10680
aaaaacaccc ccacacttca cgatgctatc accaaagccc ttgcccaaac aacacgctca 10740
gcttacacta acgatttaac aacagaacac acacctgaac aactccaggc tgtccttgat 10800
tttctgacag accctctgaa taaatctggc cctaagacac tccataacta catggcaaca 10860
tccatccaag ttcaatccac caccacagcc caatccgccc acattgacgt ccacaaacca 10920
attagacaag cagcaactct ctactaccta atggttatca tctttgacat catcgcattc 10980
ttcttaaccc ccggtgctga cttttccaac caacttgtat ccatgactgc ctacctagct 11040
gcctggttcc ttaataaaac atgcttctac aacacccatg tcctctacac agtaaccaca 11100
tgcttccaac tttgcaaata cttcaacatt gtctacctct tcacaatcat tcaatcctac 11160
aaaccaattg aaatgtcaat gatggataaa caatatgact tcctctgcgc catcattgta 11220
gccctcctac tctctccaat cctggtcctc atctggaaac gcctctgcaa cttcacctgg 11280
cattacctcg ttgctcacct agttgttggc tgtgtgcttt gcatccacgt cttcttcagc 11340
tacagatcct tcacatcttc aacaggcggt ctcttaacat tctcagaatt cgcctttaac 11400
tcaccattaa cagcagtcat aacagctaca gttgatgaaa gtcctgtttc tgttattgtc 11460
tacccactct tgcagcatgt catcagcgca accctgatct tagcaatcgt gccatctccc 11520
ctcctcgcag caacagtcta ctctttctat ctcattgacc aagacgtcct ctgcctccta 11580
atcttcctcc tgcttacatc caaactgaca ccacttttcc tccgcccact cacaacattc 11640
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tccgaaggta aagaatacgg tctctttttc gctgtcattc aatcagtctt tgactttaca 11760
tctcaacacg aagttgaatt gacacttgaa gcacaagaga ttacacagca agtccgtgtt 11820
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actattatta acccaactct aattagaacc gacaattact tctacaccaa caccaagaaa 11940
gtaatctgcg aagctcccat tgaactatca gataaggcta aagaaatcgt cgctaaacaa 12000
ctcgacgcta ttccacaccc tgatgcagaa acagctgatc tagaagttgc cacacttatt 12060
gactgcacaa ctacaaccaa gcaatcagaa gttaaagaaa ttgaagtaga cgatttaaca 12120
catgcctacc tactcgctct tatcaaagca acttgcatag aatctggcct ccccattcca 12180
gtgatgaact acatctcatc ccagacccaa attgactcag tgatgatcca ttactttgtc 12240
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cgacagctat ccatggaacg gaaactcaac gctttcctag acacaatgca ccaacgtgct 12480
gtggctgaaa agaatagatc agaagttcac agcaaagtgt cagctgcttt acgcatgcac 12540
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ctatgctctg ctttttctat ccgctcagtc tgcattactc aaaatactgc agatgtctct 12660
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gccactggta cagttctcat gattgacaac attacatctg tcatccacgc cactaaaacc 12960
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cacaaccaat ttgaatgcac cacatgccaa ccagacttaa ttacaaaagc ccccggacaa 13380
gtactggtat acttcacagc ccacgcccaa acccactaca aacaaatagt tactcaaatc 13440
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cactctacac tcgctacaac aaaattcgca gagttcagca caaaccttca atagtcccta 16980
gatcaaccct agcctacttt aacaacgcac aattcataat tggaccacca ggaacaggaa 17040
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ctggttgcac catgatcttt gacgagatgt cacttgtaca gttgaatact gctatgactg 17340
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ccctcactct ccccaaacca acaccaaagg gagattggga ttacatgaaa cctcaccgtg 18240
gaatttctcg ccgcattaac atcgacagaa ctcacaaact cttctcccat atggcttgca 18300
caacaaatgg aactcccatc tatgttcttt acggtgcccg caacgatatc ctagcccttt 18360
ccaaattaaa tatcgttggt gactataaat gtttctgcaa tctaccagct aactacttca 18420
ccctagatgc ccaagataac atcaaatact actgcaccca acacgccaaa ccagcagcac 18480
ctctcgctgg aaccattaat gctaaataca ttgacatcca aacagaaaag atcactcttg 18540
ccaaacgcca tgctgaaatt tgtgatcacc accatggtgc agcacataca tctgatgtcg 18600
acaccatcat gaccggatgc atcttaggca atgaattgac actagcaact caacatctca 18660
gccaacttct cttcacggaa cccttcagcc actactcaag tgtaatttct ccagatatgc 18720
accttacagt ttcaacccgc ccttgcagga cactcggaca acttatcata actaacatca 18780
atggtaagaa ctacagattt tcaatccaac cacacctgga ccttaaaaca cactttttca 18840
acatcgttgc taaacaaggc cactcctctg ttttagtcaa cgttccagaa acagttccga 18900
cctgtactaa aattcgcggt gaaacctgcg ctacatgcta caacacctgg cttatcctcc 18960
aagaacttca cgctgaacta gctaacacag gtctcgccct ggttaaccca ctccaacgcc 19020
aatacactca acgagaaaca caaattttaa ccaaggtaat gtctgtcact ccaacatcta 19080
caggcaaaat catggtccat ctcgacaaca cactctcctt ccccttccta atcgatttac 19140
caacaagtat ccaaacatac tgcaacaaaa ttgataaacc aatccctaac cctgcaattt 19200
tcacttccct aaaaattaca cacacctacg gatttggaac accatttgtc cctatgacaa 19260
acaacccact cattccatct atcctcagta accaaaaact tgctgacaac ccggactact 19320
actacatcac acatcaacca tcaaacagcg aactttcttt catgactttt tcgccaactg 19380
ctggcttcta ctgctacgac acccctctga tcaacttctc ggaacgtacc atcaataaac 19440
caccctacta tatcacacga attgtccgtg gccaactaca aaaacctgat attggcctct 19500
tctccactaa tagacttttc accaaccaat acgtaccttt acctaatgaa caacaagcgt 19560
acgaagactt tggtaaacat gtctcacttg gcgaaacaac atcaacatcc tggacaatcg 19620
gtggcatgca tctactccca gccttccaaa ccacaaccaa ttggcagatc acatcagaac 19680
atacaccaat tctctcaatt accatagctc gcgatcgcgg ggtcaaacta ggaacaacag 19740
ccttagatgt acctgctgac caactacttg aattgattga ctataaaaac atcacagtct 19800
caaaagtaat agctattaag atcgacggcc aaaaagtaaa catgatggtt ttcactcaaa 19860
acggtaaaat ccaaacagcc tacccagtac aacaagcaaa gattcacgat gtgacaaaac 19920
accacgtcac tcctgactac ataatctggc ctaaaatttt cagcgactca cctgtcgaaa 19980
aatgggatct tcctaattac aaccaaccac ctaaaggtct cacatcaaac gtcaacatcc 20040
ataaatacga tcaaatgtgt gcattctttg acaaacacct aaccattcca acaaatggcc 20100
acgtacacca tcttggtcat gccggacaag tttacagccc tggtgatata gttttaaaaa 20160
gctacttcac aaaagctcgt ttaacatcat acgacttgcg tgattgcata tcaaccagcg 20220
aaacagctca ccctgatgac aactggcgtg cacacttcat cctgtcagat gcatactgtc 20280
ctaacaccga ttttacatct ctctgcaaag actacatgac taaacaccta cgtcttggcg 20340
gaagcatgct ctggaaaatg acagaaacct gcaacatcga cgctgaatcc attctaccat 20400
acttcggatc tttcaccttt gttactttcg ccgttaacta ctcatcctct gaaacttacg 20460
ctttccttaa ggggtacatg ggtgaaccta attacaatac tacactccca gctaacatca 20520
tgggtcaact cggcgcgtac agacaaaacc tattgtacgt cccctatgct agtgagtata 20580
caggtaccag agtttataaa gattctggtg ctgtgaaagt tattccggcc atgtatgcag 20640
atcgtctgaa tacttcccac tatgctctcg gctgcatcta cagcacttag acatggcaaa 20700
cttgctatgg ctgactcttc tcatcactct cagtctcgtg tccgctcaaa ttaacacgac 20760
acttccagac tgtcctaccc caacctgcac ctacacacca ccaacaacga ccccatttga 20820
ccacacatca ctacactctt ttttcacaca cgacacaaac tatgctttcc ttcttgctct 20880
taagtataat ggtactttca ttcctgccac tatggctatg cctgctaaca acctttcgcg 20940
aacatatata ctcaactata aaaatgtctt tgtcaacgta cctgattctc aactcccccc 21000
tcctcaaaga agtaatactc agttggctgt tgttgcaact acagcttcct gtctcactgc 21060
aacgtatact gcgattcctg gtactattcc tggcctttca accaatcaaa tgtattgtgt 21120
gaaatttact cagtcgtcca actttgtgta cttgtacgat accactgtga acacccctgt 21180
tggcgtactt ttaaaaaacc caactgcccc agtagttaca actatcctat ccactatcat 21240
ggttaaccgc cctacaacag tttcaacctc acagctgcta gctaatatct actcccttat 21300
gagaacgaga agcaacgtga ttcaacaaca attcacttgc acatcttgcc tctttgccat 21360
cgacgcatct acaggaagag cagctacctc accaactact tacctcctaa acaactggtc 21420
cccatccttc tttgaaacta aaacagctat gttggaccac gtctctatga acaccatcta 21480
ccaaacagca cgtggtgtta ctcgtgaaac cttcactggt tacatcctta acgcagctaa 21540
aaccgctgcc tacgctcgtg gttctcccgc ctattacatc ttttcattcg cagccattgc 21600
acgctaccat caagcaatgg ttactcctta taactataac atcggaaaac tttgtgaagc 21660
aacagctgct tgctgcttat caaatggcat tgaacatttt gacatctata cctggctatt 21720
tcactactac ggctttatga aatccaaagt ctacagtgaa acttttacaa caaacccagt 21780
actaacatca gttattaact tagccacatc aattaaaggt aaacattctg tgtactgtga 21840
cctaacacct tacagttcat ttactgccta taatttgatc atgcttcaag atgttgtcga 21900
acaataccaa gggacacgta caacatccac atacgctaac aattttctca acctcactga 21960
tattaacgga tacctaccct attccaccga tacccccctc ccacaaaact accaaaacta 22020
catgcctttt gcaacctacc tacttgcaac attttactct tctttcactt tacaacagaa 22080
atttgacttt cacagattcc tccaatctgt ctgttattat gactctggtt tcatttctcg 22140
taaccaagcc taccattcga tctgtcacat aatcactctg aaaacatcat cttcagtgcc 22200
ttaccccgca gaactccaat ggccctttac tgctctccct tcctctggtt atgactctta 22260
tccagtttct acagatttag gcacagtagc tgttggcaac acaaatccac ttgattaccc 22320
tggaatttgt taccaatcag tttgcttgac tcatcctact attaacttca gacttttgtt 22380
atcagaatta ccaattaaat gggaagtccg acctgaaggt atctatgtaa catctagaaa 22440
cgatcctaca tgcctgaatt tcaaaacatc acagttggga acagttttca ttaccctcta 22500
cgattctacc gctacatgca cactccaaca gactacttac tctcgctctg ctgtcctgcg 22560
ccaagtcaac acgtttacac caaatgctac tgatttagtc gtgccttacg gcaaaacacc 22620
aatatacaat ggagcctata atattaattc cactgcatct ggtgctgtct ctctctctac 22680
caacacacac tacattccac gtctcctcac ttcagtttta acaccgcaaa gtgactacaa 22740
gattacacct acaaccacta atcttgaacc attcgtggaa attaatggca caacctttta 22800
ctacgatgct aatcaagcct acgtcaacac atcggacgtt tatcaagcta acgttgattt 22860
tggactcccc caaacatttt ctcttgatac cagctttctt aattgcacag ctttcctctg 22920
cgcttctgac tacaaatgta tcgccgactt ttcaccaatc tgctcagcta cacaaccact 22980
aatcgacgcc ctactccaaa cctacacact gtacaatcaa caacttacac tgtacaattc 23040
ttccctgctc acaattcaag ccgctgcaaa ctacctctac gacacaagaa cacgtactag 23100
acgatcactc ctatctactg ttaaccttgg ctacggtgac gtttttcaac aaccagcctg 23160
ggtctacgaa ataggtgcaa cagctgcaat tcctatgatc ggccctgcaa tctcagtcgg 23220
tttgttagcc agtagagtag catctattga atcaaccctc taccaaatta cccaaggagt 23280
gaaggagtct attatggcta tgaacaccaa gcttgataag attgccaaca ttttacactc 23340
agacattgaa agattaggat taacagttaa cacattagcc tcttcattca acacattcac 23400
taaacaagta acagataaat ttgcctctgt tgatgttgca tttaacgact tatcaacatc 23460
actgaacaca ctcaccacaa caacaactgt tggtgcctct tatgcagctc aaattaactt 23520
cgcaacaacc acgctaacca atttagaagt tcaaatctct caaacaacag atcacgctct 23580
atcttgcatc gctgcgctta atgaacatgt tctttctcca cactgcattt ccgtttcaca 23640
acttagcgct tacacaccta atgctctctc taacatcggt gaaaaactag tactaactca 23700
ctacatcaac ggatcactca tcacattcta ccatctcatt gctagcaagg gagtttacag 23760
acccctgccc aaaatgtata actctacaca ccatttagtt gcaacaactg gcttttataa 23820
cggccattgt atcttctgtg gtgaacatta ttgtgatatc agcgtttctg taccatgtga 23880
ttatgcgtac gaaccactta aatccactgt actagcagct tacccactaa caactggtgt 23940
agcccttctt actcttgact ctacagctac taacttcgtt attaactata ataatgcccc 24000
tctcatttca tcaagcgttc cacaaccacc tatcatcaat aacaccgatg gtacagttat 24060
tacgctccaa caacaactaa tccagctcca aactcaattc gatcacttta acatctcgtc 24120
gaattttcac gtttcagaaa tccaaccagt catagactac tacaatgcac aaatcaactc 24180
atctctaaac cagatagttg atttcggaaa tggctcaaca tctaatgtag gaacaatcat 24240
cctcattgta actatagttg cctttgctct tgcatcagct attgccatta tctgtggatt 24300
aaagcactaa agaccaacaa gttgcaatgg tttccaccgg tacaaacacc accgcaggag 24360
atcccaacct tgggtttcac ttacaactta atgatgtcct taacaccctg gacatctccg 24420
gcttcagcat ctcaaattct catttgatga gtgcgatgct gaccctcaac cttctctgga 24480
gcgctatctt tctagtctcc ttttatctaa tcttggacat ggttatgtac tacgttcccc 24540
tgctcaataa gattccactg ctgccaacaa tcaaaaacct ttgttggttt atctcgactc 24600
tgcttgttgc tgtttccatt tacgcttcag gaactctgct gatcatcaaa atcttcggag 24660
gcgtagtctt gctccttgct tttctcggca tggtgaagac tttctatatg ctcattgcaa 24720
tggcgctgtc ctactaccga caccgtaaca tcgcagtggc attgaacggc cctaatgtcg 24780
ttatggttaa tggcacagca gtccactctg atttcatccc cacgtctgtg acactggtga 24840
agaaagatgg tgaactctat tttcaaggaa caaaggtccc cggaaacaac ttgattgatg 24900
caaccgtgaa gatcttcact ttcaacgaat cgtttgaatg cctccccatc gcactctcac 24960
gttacactaa aggttcctac gctagatttg agctcaagtc gaccaacacc cactatgaac 25020
tccaaacttt ctatccttcg caaacagaaa ctaaatctgt ttgaaacact agcgaaaaca 25080
aattacaatg gcattctacg gacaaccaat gatgcctatg cctatgcctg cttcctttcc 25140
tcctcgtcgc cgcgccccta aaaagcgccc gccacagaag aaacaagcca agccccaacc 25200
taaacctctt aatgaccaac agaaaacagc tgttgcaaaa gaggctattg ccaaaaccaa 25260
tactgtgcca atgccaccca tggccacagt agtgaagaca aacctgcgcg ttcaggttgt 25320
aaaaagcaaa cgcggtgacc tcctagatgc tcgagggcgt cttacacaat cagagatcaa 25380
ccagctgtat ttccaaatcg ccactgccct caacaacggc ctcggagaaa ttggaataca 25440
caatgcttca acacaggacg gcgttcgtct catcgtgcgc ctcaatttag cccctcctac 25500
ccctattgct gagaaactct acaaatctca cgcggcggct aatctcaact cagaaattct 25560
ggtttctaaa caaaaggaac tggagcgaga ccccattttt catgtttcct cgactgagta 25620
aactgacttc acctcaaaac tgaagtatat ataatcacat ctatcacact atcctttata 25680
aactatatat tggggtggca ttaggccatt ccaaagaatt ctttaagatc acactcctcg 25740
atacctgact agtcatcacg tttcctgggg tctgctcttt aacattctac tatcctataa 25800
gatctaaaac tatccaaaaa aaaaaaaaaa aaa 25833
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctcttgacc caagacggtt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccggtggttg agagcttgta 20

Claims (7)

1.一种分离的鲤冠状病毒（Cyprinid Nidovirus），所述的鲤冠状病毒为鲤冠状病毒HL39，保藏编号为CCTCC NO：V201988。
2.权利要求1所述的鲤冠状病毒的全序列，其特征在于：该全序列为SEQ ID NO.1所示。
3.基于权利要求2所述的全序列与其他病毒序列的差异序列设计的检测引物，所述的检测引物为F：5'-CCTCTTGACCCAAGACGGTT-3'，R：5'- CCGGTGGTTGAGAGCTTGTA -3'。
4.权利要求1所述的鲤冠状病毒在制备鲤冠状病毒病疫苗中的应用。
5.权利要求1所述的鲤冠状病毒在制备鲤冠状病毒对照品中的应用。
6.权利要求3所述的检测引物在制备鲤冠状病毒检测试剂盒中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，所述的试剂盒包括：权利要求3所述的检测引物，dNTPs，MgCl2，Taq聚合酶，模板cDNA，10×ThermoPol Reaction Buffer。
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