CN1679931A - 在韩国分离的犬瘟热病毒和使用该病毒的重组疫苗 - Google Patents

Abstract

公开了一种在韩国发现的新型韩国犬瘟热病毒和使用该病毒的用于犬瘟热的重组疫苗。

Description

在韩国分离的犬瘟热病毒和使用该病毒的重组疫苗

技术领域和现有技术

本发明涉及在韩国发现的新型韩国犬瘟热病毒和使用该病毒的用于犬瘟热的重组疫苗。

犬瘟热是在犬类中具有非常高传染性的、具有代表性的急性发热疾病，其不分地区和季节而出现。该疾病是引起高死亡率的病毒性疾病，其在幼犬(puppy)中发展成急性或亚急性状态，并通过胃肠系统、呼吸系统、上皮系统或中枢神经系统而出现，从而导致被感染的免疫力低下的幼犬或老犬死亡。

犬瘟热的特征性临床症状是全身粘膜中的急性炎症和非化脓性脑炎，这些病症在免疫力低下的犬中形成，例如小于1岁(尤其是3-6个月)的幼犬或老犬。犬瘟热是由于属于副粘病毒(Paramyxovirus)科的犬瘟热病毒(下文中简称为“CDV”)经口或呼吸道的感染而出现的。从病毒进入犬身体之时开始直至临床病征出现具有3-6天(平均4天)的潜伏期，单独的病毒感染形成弱的临床症状。可是，在CDV感染之后，这些症状常常由于继发性细菌感染而加重，这些继发性细菌感染包括支气管败血性包特氏菌(Bordetella bronchiseptica)或酿脓链球菌(Streptococcus hemolyticus)引起的呼吸系统感染和沙门氏菌(Salmonella)或大肠杆菌(E.coli)引起的胃肠感染。CDV最通常是通过来自感染了CDV的犬的小滴分泌物直接传播的，也是由于通过被从鼻或眼排出物和尿液中分泌出的CDV污染的饲养环境的间接感染而传播的。通过小滴分泌物的CDV传播感染上呼吸系统，进入血液流，并最后感染全身的免疫系统或器官。大多数感染了CDV的个体变得具有低下的免疫力，因此易患继发性细菌感染，并在最坏的情况下死亡。

已经作了许多努力来预防具有高传染性的犬瘟热，并因此获得了来自兽医临床领域的世界性关注。最初的尝试在20世纪60年代之后在美国、欧洲国家和别处进行，以开发使用病毒的灭活疫苗，该病毒在源自仓鼠肺细胞的培养细胞中繁殖。近来，在包括韩国在内的许多国家中已经使用组织培养开发出减毒活疫苗，因此实现了对于犬瘟热的有效预防。可是，许多近期的研究报道了：在20世纪90年代之后，在最邻近的国家日本中，来自显示出犬瘟热临床病征的犬中的CDV分离株之中存在新的突变体，其具有不同于世界性普遍存在的CDV株系的分子生物学特性。

CDV是有包膜的RNA病毒，它们在外包膜上表达两类对于其致病性和免疫原性起作用的蛋白质。特别地，已经在参与最初的病毒侵入宿主细胞过程的“血凝素(H)蛋白”中发现了最高的抗原变异，该蛋白质广泛用作检测该病毒的基因改变的主要标记。因此，在全世界的国家中，当通过逆转录聚合酶链反应(下文中简称为“RT-PCR”)扩增编码在每个国家中传播的CDV的H蛋白的血凝素(H)基因，并通过限制性片段长度多态性(下文中简称为“RFLP”)测定法(在其中用限制性内切酶消化RT-PCR产物并在琼脂糖凝胶上进行分离以比较CDV分离株的H基因之间的RFLP图式)来进行分析时，发现了许多不同于目前的CDV疫苗的野生CDV株系。

近来，在日本进行的H基因氨基酸序列的系统发生分析揭示出，至少两种CDV H基因基因型在包括日本在内的亚洲地区的犬类中传播；一种是以前在日本传播的几乎所有日本CDV分离株均属于其的基因型，另一种以前在日本没有描述。这两种CDV H基因基因型包含这样的H基因，即其具有不同于目前可获得的疫苗株系和在美国、欧洲国家和别处流行的CDV株系的其他谱系或基因型的氨基酸序列。

在韩国，尽管犬类已经用在美国或欧洲国家生产的CDV疫苗进行了免疫接种，它们还是会逐渐增多地再次感染CDV。基于这一现象，认为经遗传修饰的CDV特别在韩国是存在的。可是，没有准确的证据表明存在韩国CDV。在这一点上，本发明人想要找到还未报道过的新型韩国CDV株系。

技术问题

因此，本发明旨在提供在韩国引起犬瘟热的新型韩国CDV，和使用该病毒的用于犬瘟热的重组疫苗。

附图简述

图1显示了用于确定本发明的病毒是否为CDV(犬瘟热病毒)的电泳分析结果。

图2显示了用于确定本发明的病毒是否为属于亚洲/H2基因型的CDV的RFLP分析结果。

图3显示了本发明的韩国CDV的H基因核苷酸序列在系统树中的位置。

本发明的构建

本发明的病毒是引起犬瘟热的CDV，其特征在于其是特别在韩国发现的新型韩国CDV株系。

如上所述，基于编码CDV的H蛋白的H基因之间的系统发生差异，已经发现了多种变异。一个近来的日本报道描述了对于在亚洲发现的CDV的系统发生分组(M.Hashimoto等人，Archives of Virology，2001，146：149-155)。在该报道中，RFLP分析揭示出，将具有与常规CDV疫苗Onderstepoort的H基因不同的RFLP图式的KDK-1株系分类为亚洲/H1基因型。此外，从来自感染了CDV的个体的直肠和口部拭子试样获得的98-002等H基因显示出与亚洲/H1基因型不同的RFLP分布图，其中将拭子试样中的CDV分离株分类为亚洲/H2基因型。

可是，分类为亚洲/H2基因型的98-002等不是指分离的病毒，而是指从感染了CDV的个体的直肠和口部拭子试样取得的H基因本身。也就是说，上面的报道表明了存在亚洲/H2基因型的CDV的可能性，但是这样的病毒实际上还没有分离得到(M.Mochizuki等人，Journal ofClinical Microbiology，1999，37：2936-2942)。

图2显示了本发明病毒(泳道4-9)、Onderstepoort(泳道1)、KDK-1(泳道2)和98-002(泳道3)的每个H基因中的一部分的RFLP分析结果，其中H基因在相同条件下用RT-PCR进行扩增。发现本发明的病毒具有与分类为亚洲/H1基因型的常规CDV疫苗Onderstepoort和KDK-1株系不同的H基因基因型，但是该H基因基因型与分类为亚洲/H2基因型的98-002类似。此外，如图3中所示，发现本发明的CDV株系为属于新基因型的病毒，该新基因型在系统发生上不同于常规的CDV疫苗株系或目前在日本已知的CDV株系。98-002是从犬的直肠和口部拭子试样取得的H基因，其可以作为确定一种CDV是否具有亚洲/H2基因型的标准，但是不能直接影响个体病毒的分离和鉴定，因为其不是病毒。

基于这一发现，将根据本发明分离和鉴定的且含有SEQ ID NO.1所示H基因的病毒命名为“汉城98病毒”，其保藏于在2003年2月25日加入韩国培养物收集联盟的韩国微生物保藏中心(KCCM)，并具有编号KCCM 10467。

另外，本发明提供了用于犬瘟热的重组疫苗，其使用本发明的犬瘟热病毒的整体或一部分，并含有药物可接受的添加剂。药物可接受的添加剂可选自本领域熟练技术人员在本领域中通常使用的添加剂。

用于犬瘟热的重组疫苗可以使用本发明的犬瘟热病毒通过任何本领域中已知的方法进行制备。优选地，重组疫苗用犬瘟热病毒的SEQ IDNO.1所示H基因的整体或一部分进行制备。

通过下面的实施例可以更好地理解本发明，列出这些实施例是为了举例说明本发明，而不能将其解释为对本发明的限制。

实施例1：犬瘟热病毒的分离

(步骤1)试样制备

于1998年9月，通过在韩国汉城的一所动物医院递交1个月大的北京哈叭狗幼犬的尸体和血液试样，该幼犬的CDV免疫史未知，但诊断为患有犬瘟热。

(步骤2)CDV感染的评价

用下列检查CDV感染，即取自幼犬的器官的上清液，在用分离的CDV致敏之后形成致细胞病变效应(CPE)的敏感细胞的上清液，和克隆进质粒的Onderstepoort H基因DNA。

CDV RNA的分离

将250μl每个样品与750μl RNA结合盐(商品名；RNaid Kit，BI0101)充分混合，并与10μl RNAMATRIX(商品名；RNaid Kit，BI0101)于室温反应5分钟，同时经常进行摇动以防止RNAMATRIX沉淀。将反应混合物于10,000rpm离心1分钟，从而沉淀出RNA和RNAMATRIX的结合产物。在弃去上清液之后，再次重复进行离心，并将上清液完全除去。用微量加液器将粒状沉淀物悬浮在500μl RNA洗涤溶液(RNaid Kit，BI0101)中，并于10,000rpm离心1分钟。在弃去上清液之后，再重复该洗涤步骤两次。在最后一次洗涤之后，再离心一次，并将上清液完全除去。用微量加液器将粒状沉淀物悬浮在20μl无RNase的蒸馏水(RNaid Kit，BI0101)中，并于50℃温育5分钟以提取RNA。在将悬浮的粒状沉淀物于15,000rpm离心2分钟之后，将上清液转移至新的管中。

逆转录

将9μl RNA样品与1μl随机引物(50pmol/μl，TaKaRa)混合，并让其于70℃反应10分钟。随后立即将样品置于冰上以终止反应。将初级反应混合物与4μl 5×RT反应缓冲液(RT AMV XL Kit，TaKaRa)、4μl 10mM dNTP(RT AMV XL Kit，TaKaRa)和1μl RNasin(20U/μl，Promega)混合，并让其于25℃反应5分钟。然后，向结果所得的反应混合物补充1μl RT AMV XL(35U/μl，RT AMV XL Kit，TaKaRa)，并以25℃10分钟、42℃50分钟和70℃10分钟的条件进行逆转录，从而合成互补DNA(下文中称为“cDNA”)。

使用聚合酶链反应(PCR)鉴定CDV

通过使用获得的cDNA以PCR来扩增DNA从而确定CDV感染。在一个PCR管中，将1μl获得的cDNA溶液与5μl 10×PCR反应缓冲液、3μl 25mM MgCl₂、4μl 10mM dNTP、1μl引物I(CDV H13，CAA/GAC/AAG/GTG/GGT/GCC/TT，Onderstepoort的H基因的nt33-52)、1μl引物II(CDV H18，CTT/GGT/GAA/ATC/GAA/CTC/CA，Onderstepoort的H基因的nt207-188)、0.5μl Taq聚合酶(5U/μl，TaKaRa)和34.5μl无菌蒸馏水混合。用PCR仪在一定条件下进行PCR，该条件为：94℃ 1分钟；55℃ 30秒、72℃30秒和94℃ 30秒，30个循环；和最后72℃延伸5分钟。然后将PCR产物(175bp)在1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果给出在图1中。

如图1中所示，电泳结果在下列样品中是一致的，即显示出犬瘟热症状的死亡幼犬的脑(泳道1)、支气管(泳道2)和肺(泳道3)，以及用从其中分离的CDV致敏的细胞(泳道4)和Onderstepoort株系(泳道5)。这些结果表明从幼犬分离出其RNA的病毒是CDV。

实施例2：就本发明的病毒是否具有亚洲/H2基因型进行评价

(步骤1)DNA样品的制备

cDNA合成

将在实施例1中制备的病毒和器官乳浊液根据与实施例1同样的方法进行RT-PCR，以合成cDNA。对于KDK-1、98-002和Onderstepoort，将事先克隆进质粒的H基因用作DNA模板。

(步骤2)RFLP分析

使用制备的cDNA样品和参考DNA样品(Onderstepoort、KDK-1和98-002)施行RFLP分析以测定本发明病毒和常规CDV株系的H基因基因型。

分析PCR扩增的基因

将DNA用实施例2的步骤1中制备的cDNA进行扩增。在一个管中，将1μl cDNA溶液与5μl 10×PCR反应缓冲液、3μl 25mM MgCl₂、4μl 10mM dNTP、1μl引物I(CDV F10B，TAT/CAT/GAC/RGY/ART/GGT/TC)、1μl引物II(CDV R10，CTT/GGT/GAA/ATC/GAA/CTC/CA)、0.5μl Taq聚合酶(5U/μl，TaKaRa)和34.5μl无菌蒸馏水混合。用PCR仪在一定条件下进行PCR，该条件为：94℃ 1分钟；55℃ 2分钟、72℃ 2分钟和94℃ 1分钟，35个循环；和最后72℃延伸5分钟。然后将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳。发现扩增出的DNA具有871bp的大小，这相当于Onderstepoort的H基因的nt7,991-8,861。

从琼脂糖凝胶中选择有效基因

从琼脂糖凝胶中选择出有效基因，进行纯化，并通过限制性内切酶消化而就RFLP图式进行评估。用外科手术刀从琼脂糖凝胶中切割出有效基因条带，同时尽可能地除去凝胶成分，并用电子称量仪进行称重。然后，将凝胶块与200μl NaI溶液(GENECLEAN II Kit，BI0101)混合，于50℃温育5分钟以溶解凝胶成分，并与10μl GLASSMILK(商品名；GENECLEAN II Kit，BI0101)混合。将反应混合物于室温温育5分钟，以使得DNA与GLASSMILK的二氧化硅组分结合，同时经常用手指轻敲管以悬浮二氧化硅。然后，将反应混合物于10,000rpm离心5秒以沉淀出与DNA结合的二氧化硅。使用微量加液器将粒状沉淀物用1mlNEW WASH(商品名；GENECLEAN II Kit，BI0101)进行洗涤，并再重复两次该洗涤。将管置于真空中5分钟以完全除去上清液，并将粒状沉淀物再次悬浮在15μl无菌水中，并于15,000rpm离心30秒。将含有有效基因的上清液转移至新的无菌管中。再重复该步骤一次，并将次级上清液和初级上清液合并，于-20℃储存。

每个病毒DNA的RFLP分析

将从琼脂糖凝胶中分离的有效基因用限制性内切酶进行消化，并进行电泳以测定每个病毒DNA的RFLP图式。将26μl从琼脂糖凝胶中分离的有效基因与3μl 10×限制性内切酶缓冲液(NEBuffer 4，NEB)和1μl NdeI(20U/μl，NEB)混合，并在培养箱中于37℃温育8小时30分钟。然后将反应混合物在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果给出在图2中。

如图2中所示，发现已知具有亚洲/H1基因型的KDK-1株系(泳道2)具有不同于已知具有亚洲/H2基因型的98-002 DNA(泳道3)的RFLP图式。发现从感染了本发明的CDV的幼犬中取得的器官悬浮液(泳道5-9)和病毒致敏的细胞(泳道4)具有与98-002 DNA同样的RFLP图式。这些结果表明，不同于以前分离的CDV株系，本发明的CDV株系属于亚洲/H2基因型。

实施例3：H基因的核苷酸序列分析

在通过使用实施例1(步骤2)中制备的cDNA以PCR扩增出编码H基因的DNA之后，对于本发明的犬瘟热病毒(亚洲/H2基因型)的H基因核苷酸序列进行分析。在一个PCR管中，将1μl cDNA溶液与5μl 10×PCR反应缓冲液、3μl 25mM MgCl₂、4μl 10mM dNTP、1μl引物I(CDV F8，GTT/GTT/GCT/GAT/TTA/CTG/TT，Onderstepoort的H基因的nt6800-6819)、1μl引物II(CDV R8，CCC/CGT/CTG/TTA/TTT/TGC/TA，Onderstepoort的H基因的nt9399-9380)、0.5μl EX Taq聚合酶(5U/μl，TaKaRa)和34.5μl无菌蒸馏水混合。用PCR仪在一定条件下进行PCR，该条件为：94℃ 1分钟30秒；52℃ 1分钟30秒、72℃ 2分钟和94℃ 1分钟30秒，35个循环；和最后72℃延伸20分钟。然后将PCR产物插入克隆载体(pTZ57R，MBI Fermentas)中。然后，测定本发明的犬瘟热病毒(亚洲/H2基因型)的H基因核苷酸序列，该序列如SED ID NO.1所示。

有利的效果

如前所述，本发明提供了新型韩国犬瘟热病毒，该病毒特别是在韩国于引起犬瘟热的犬瘟热病毒之中发现的，也提供了使用该病毒的用于犬瘟热的重组疫苗。

                              序列表

<110>Korea Microbiological Laboratories，LTD.

<120>在韩国分离的犬瘟热病毒和使用该病毒的重组疫苗

<150>KR1020030015282

<151>2003-03-12

<160>1

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>1824

<212>DNA

<213>犬瘟热病毒

<400>1

atgctctcct accaagacaa ggtgggtgcc ttctataagg ataatgcaag agctaattca    60

tccaagccgt ccttagtgac agaagaacaa gggggcagga gaccacccta cttgctgttt    120

gtccttctca tcctactggt tggaatcctg gccttgcttg ctatcgctgg agttcgattt    180

cgccaggtgt caactagcaa tgtggaattt ggcagattgc tgaaggatga tttggagaaa    240

tcggaggccg tgcatcacca agtcatggat gtcttgacac cactcttcaa aattattgga    300

gatgggattg ggttacggtt gccacaaaaa ctaaacgaga tcaaacaatt tatccttcaa    360

aagacaaact tcttcaatcc gaacagagaa ttcgacttcc gcgatctcca ctggtgcatt    420

aacccgccta gtaagatcaa ggtgaatttt accaattact gtgatgcaat tggggtcaga    480

aaatccattg catcggcagc aaatcccatc cttttatcag cactctccgg aggcagaggt    540

gacatattcc caccatacag atgcagtgga gctactactt cagtaggcag agttttcccc    600

ctatcagtat cattatccat gtctttgatc tcaaaaacat cagagataat caatatgctg    660

accgccatct cagacggagt gtatggtaaa acttacttgt tagtgcctga ttatattgaa    720

agggagttcg acacacaaaa aattcgagtc tttgagatag ggttcatcaa acggtggctg    780

aatgacatgc cattactcca gacaaccaac tatatggtcc tcccggagaa ttccaaagct    840

aaggtgtgta ctatagcggt gggcgagctg acactggctt ccttgtgtgt agatgagagc    900

accgtattat tatatcatga cagcaatggt tcacaagaca gtattctagt agtgacgctg    960

ggaatatttg gggcaacacc gatgaatcaa gtagaagagg tgatacctgt cgctcatcca    1020

tcagtagaaa ggatacatat cacaaatcac cgtggtttca taaaagattc agtagcaacc    1080

tggatggtgc ctgcattggt ctctgagcaa caagaaggac aaaaaaattg tctggagtcg    1140

gcttgtcaaa gaaaatccta ccctatgtgc aaccaaacat catgggaacc cttcggagga    1200

gtacagttgc catcttacgg gcggttgaca ttacctctag atgcaagcat tgaccttcaa    1260

cttaacatat cgtttacata cggtcctgtg atactgaatg gagatggtat ggattattat    1320

gaaaacccac ttttggactc cggatggctt accattcctc ccaagaacgg aacaatactt    1380

ggattaataa ataaagcaag tagaggagac cagttcactg taacccccca tgtattgaca    1440

tttgcgccca gggagtcgag tggaaattgt tatctaccta ttcaaacatc ccagattatg    1500

gataaagatg tccttactga gtccaattta gtggtgttgc ctacacagaa ttttggatat    1560

gtcgtagcaa catatgatat atcccggaaa aatcatgcga ttgtttatta tgtttatgac    1620

ccaatccgga cgatttctta tacgtaccca tttagactaa ctaccaaggg tagacctgat    1680

ttcctaagga ttgaatgttt tgtgtgggat gacgatttgt ggtgtcacca attttacaga    1740

tttgagtctg atatcaccaa ctctacaacc agtgtcgaag atttagtccg tataagattc    1800

tcatgtaatc gttcaaaacc ttga                                           1824

Claims (3)

1.一种亚洲/H2基因型的犬瘟热病毒，其用于制备用于犬瘟热的疫苗，并具有编号KCCM 10467。

2.根据权利要求1所述的犬瘟热病毒，其含有SED ID NO.1所示的H基因。

3.用于犬瘟热的重组疫苗，其是使用权利要求1或2的犬瘟热病毒的整体或一部分而制备的。

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