TWI302570B - Canine distemper virus isolated in korea and recombinant vaccine using the same - Google Patents

Description

1302570 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域和先前技術】 - 本發明涉及在韓國發現的新穎韓國犬瘟熱病毒和使用 • 違病毒的用於犬痕熱的重組疫苗。 . 犬瘟熱是在犬類中具有非常高傳染性的、具有代表性 的急性發熱疾病，其不分地區和季節而出現。該疾病是引 起高死亡率的病毒性疾病，其在幼犬（puppy )中發展成 急性或亞急性狀態，並通過胃腸系統、呼吸系統、上皮系 _ 、、先或中樞神經系統而出現，從而導致被感染的免疫力低下 的幼犬或老犬死亡。 犬瘦熱的特徵性臨床症狀是全身粘膜中的急性炎症和 非化膿性腦炎，這些病症在免疫力低下的犬中形成，例如 小於1歲（尤其是3-6個月）的幼犬或老犬。犬瘟熱是由 於屬於副粘病毒（hramyxoWrw )科的犬瘟熱病毒（下文 中簡稱爲‘‘ CDV” ）經口或呼吸道的感染而出現的。從病 毒進入犬身體之時開始直至臨床病徵出現具有3天（平 鲁均4天）的潛伏期，單獨的病毒感染形成弱的臨床症狀。 可是，在CDV感染之後，這些症狀常常由於繼發性細菌 _ 感染而加重，這些繼發性細菌感染包括支氣管敗血性包特 ' 氏 Wi ( Bordetella bronchiseptica )或釀膿鏈球菌 (SirepMcoccws )引起的呼吸系統感染和沙門 氏菌（或大腸桿菌（兄c〇/z·)引起的胃腸感染。 CDV最通常是通過來自感染了 CDV的犬的小滴分泌物直 接傳播的，也是由於通過被從鼻或眼排出物和尿液中分泌 1302570 出的CDV污染的飼養環境的間接感染而傳播的。通過小 滴分泌物的CDV傳播感染上呼吸系統，進入血液流，並 隶後感染全身的免疫系統或器官。大多數感染了 CDV的 個體變得具有低下的免疫力，因此易患繼發性細菌感染， 並在最壞的情況下死亡。 已經作了許多努力來預防具有高傳染性的犬瘟熱，並 口此獲得了來自被醫臨床領域的世界性關注。最初的嘗試 在1960年代之後在美國、歐洲國家和別處進行，以開發 使用病毒的滅活（inactivated)疫苗，該病毒在源自倉鼠肺細 胞的培養細胞中繁殖。近來，在包括韓國在内的許多國家 中已經使用組織培養開發出減毒活疫苗，目此實現了對於 犬疲熱的有效預防。可是，許多近期的研究料了 ：在觸 :代之後，在最鄰近的國家曰本中，“顯示出犬痕熱臨 木病徵的犬中的CDV分離株之中存在新的突變體，立且 有不同於世界性普遍存在的CDV㈣的分子生物學特^ CDV是有包制RNA病毒，它們在外包 類對於其致病性和免疫原性起作用的蛋白質。特別吔义，已 經在麥與最初的病毒侵入宿主細胞過程的 蛋白”中發現了最高的抗原變異: 旋素⑻ 該病毒的基因改變的主要標記。因此，在入貝尹、泛用作Μ

轉錄聚合酶鍵反應（下文中簡稱爲“R:) 曰巾田編碼在每個國家中傳播的CDV Μ ππ , 蛋白的血凝辛（Η ) 土口 ，並通過限制性片段長度多 ” ^RFLP^ ) ^ Φ r ^ ^ …11 (下文中簡稱爲

J疋法（在其中用限制性内切酶消化RT_PCR 6 1302570 CDV分離株的Ή ’發現了許多不同 產物並在瓊脂糖凝膠上進行分離以比較 基因之㈣RFLP B式）來進行分析時 於目前的CDV疫苗的野生CDV株系。

近來，在日本進行的Η基因胺基酸序列的系統發生八 析揭不出，至少兩種CDV Η基因基因型在包括曰本在二 亞洲地區的犬财傳播；—種是以前在日本傳播的幾乎所 有曰本CDV分離株均屬於其的基因型，另一種以前在日 本沒有描述。這兩種CDVH基因基因型包含這樣的Η基 因’即其具有不同於目前可獲得的疫苗株系和在美國、： 洲國家和別處流行的CDV株系的其他譜系或基因 基酸序列。 在韓國Μ盡管犬類已經用纟4國或㉟洲國家生産的 CDV疫苗進行了免疫接種’它們還是會逐漸增多地再次感 柒CDV基於這一現象，認爲經遺傳修飾的cDv特別在 韓國是存在的。可是，沒有準確的證據表明存在韓國⑽。 在這一點上，本發明人想要找到還未報導過的新穎韓國 CDV株系。 【發明内容】 技術問顥 因此，本發明旨在提供在韓國引起犬瘟熱的新穎韓國 CDV，和使用該病毒的用於犬瘟熱的重組疫苗。 【實施方式】 本發明的構律 本發明的病毒是引起犬瘟熱的CD V，其特徵在於其是 7 1302570 特別在韓國發現的新穎韓國CDV株系。 如上所述’基於編碼CDV的Η蛋白的η基因之間的 系統發生差異，已經發現了多種變異。一個近來的日本報 導描述了對於在亞洲發現的CDV的系統發生分組（Μ.

Hashimoto 等人，Archives of Virology，2001，146:149-

155 )。在該報導中，RFLp分析顯示，將具有與常規cDV 疫田Onderstepoort的Η基因不同的rflP圖式的KDK-1 株系分類爲亞洲/Η1基因型。此外，從來自感染了 CDV的 個體的直腸和口部拭子試樣獲得的98_〇〇2等H基因顯示 出與亞洲/Η1基因型不同的RFLp分佈圖，其中將拭子試 樣中的CDV分離株分類爲亞洲/H2基因型。 可是’分類爲亞洲/H2基因型的98-002等不是指分離 的病毒，而是指從感染了 CDV的個體的直勝和口部拭子 試樣取得的Η基因本身。也就是說，上面的報導表明了存 在亞洲/Η2基因型的CDV的可能性，但是這樣的病毒實質 上逖〉又有分離得到（Μ· M〇chizuki 等人，J〇urnal 〇f Clinicai

Mlcrobiol〇gy，1999, 37:2936_2942)。 圖2顯不了本發明病毒（泳道4_9) 、Onderstepoort (冰迢1 ) 、KDK-1 (泳道和98-〇〇2 (泳道的每個 Η基因中的一部分的RFLp分析結果，其中η基因在相同 飩件下用RT-PCR進行增幅。發現本發明的病毒具有與分 類爲亞洲/m基因型的常規CDV疫苗〇nderstep〇〇n和 KDK-1株系不同的H基因基因型，但是該η基因基因型 與分類爲亞洲/Η2基因型的9請2類似。此外，如圖3中 1302570 所示，發現本發明的CDV株系爲屬於新基因型的病毒， 該：基因型在系統發生上不同於常規的CDv疫苗株系或 目前在曰本已知的CDV株系。98_〇〇2是從犬的直腸和口 部拭子試樣取得的Η基因，其可以作爲確定—種⑽是 !具有亞洲/H2基因型的標準’但是不能直接影響個體病 毋的分離和鑑定，因爲其不是病毒。 基於這-發現’將根據本發明分離和鑑定的且含有_ IDN〇. 1所示H基因的病毒命名爲“漢城98病毒”，1 保藏於在細3年2月25日加人韓國培養物Μ聯盟的韓 國微生物保藏中心（KCCM) ’並具有編號KCCM】购。 另外，本發明提供了用於犬遮熱的重組疫苗，其使用 本發明的犬盘熱病毒的整體或一部分，並含有醫藥上可接 受的添加劑。醫藥上可接受的添加劑可選自本領域熟習此 項技術者在本領域中通常使用的添加劑。 用於犬瘦熱的重組疫苗可 v , ^ 又田了以使甩本發明的犬瘟熱病毒 以任何本領域中已知的方法進行製備。較佳地，重组疫苗 用^熱病毒的SEQlDNai所示^因的整 分進行製備。 通過下面的實施你| i v舌 一 /貝她例了以更好地理解本發日月，列出這些 貫施例是爲了舉例說明本菸明 明的限制。 Mm不能將其解釋爲對本發 實施例1 ··犬瘟熱病毒的分離 (步驟1)試樣製備 於1998年9月 通過在韓國漢城的一所動物醫院遞交 9 1302570 1個月大的北京哈巴狗幼犬的屍體和血液試樣，該幼犬的 CDV免疫史未知，但診斷爲患有犬瘟熱。 (步驟2) CDV感染的評價 用下列檢查CDV感染，即取自幼犬的器官的上清液， 在用分離的CDV致敏之後形成致細胞病變效應（CPE )的 敏感細胞的上清液，和選殖進質體的Onderstepoort Η基因 DNA。 CDV RNA的分離 • 將250 μΐ每個樣品與750 μΐ RNA結合鹽（商品名； RNaid Kit，ΒΙΟ101)充分混合，並與 10 μΐ RNAMATRIX (商品名；RNaid Kit，BIO 101 )於室溫反應5分鐘，同時 經常進行搖動以防止RNAMATRIX沈澱。將反應混合物於 10,000 rpm離心，1分鐘，從而沈澱出RNA和RNAMATRIX 的結合産物。在棄去上清液之後，再次重複進行離心，並 將上清液完全除去。用微量加液器將粒狀沈澱物懸浮在500 μΐ RNA 洗滌溶液（RNaid Kit，BIO101 )中，並於 10,000 rpm ® 離心1分鐘。在棄去上清液之後，再重複該洗務步驟兩次。 在最後一次洗滌之後，再離心一次，並將上清液完全除去。 . 用微量加液器將粒狀沈澱物懸浮在20 μΐ無RNase的蒸餾 \ 水（RNaid Kit，BIO101 )中，並於50°C培育5分鐘以提 取RNA。在將懸浮的粒狀沈殿物於1 5,000 rpm離心2分鐘 之後，將上清液轉移至新的管中。 逆轉錄 將 9 μΐ RNA樣品與 1 μΐ隨機引子（50 pmol/μΐ， 10 1302570

TaKaRa)混合，並讓其於7(TC反應10分鐘。隨後立即將 樣品置於冰上以終止反應。將初級反應混合物與4 μΐ 5x RT 反應缓衝液（RT AMV XL Kit，TaKaRa )、4 μΐ 10 mM dNTP (RT AMV XL Kit，TaKaRa)和 1 μΐ RNasin ( 20 U/μ卜 Promega)混合，並讓其於25°C反應5分鐘。然後，對結 果所得的反應混合物補充1 μΐ RT AMV XL ( 35 U/μΙ，RT AMV XL Kit，TaKaRa)，並以 25°C 10 分鐘、42°C 50 分鐘和70°C 10分鐘的條件進行逆轉錄，從而合成互補 • DNA (下文中稱爲“cDNA” ）。 使用聚合酶鏈反應（PCR)鑑定CDV 藉由使用獲得的cDNA以PCR來增幅DNA從而確定 CDV感染。在一個PCR管中，將1 μΐ獲得的cDNA溶液 與 5 μΐ 10x PCR 反應缓衝液、3 μΐ 25 mM MgCl2、4 μΐ l〇mM dNTP 、 1 μΐ 弓 I 子 I ( CDV H13 ， CAA/GAC/AAG/GTG/GGT/GCC/TT，Onderstepoort 的 H 基 因的 nt 33-52 ) 、 1 μΐ 弓1 子 II ( CDV H18 ， • CTT/GGT/GAA/ATC/GAA/CTC/CA，Onderstepoort 的 Η 基 因的 nt 207-188 ) 、0.5 μΐ Taq 聚合酶（5 U/μ卜 TaKaRa) 和34.5 μΐ無菌蒸餾水混合。用PCR儀在一定條件下進行 PCR，該條件包括：94°C 1分鐘；55°C 30秒、72°C 30 秒和94°C 30秒，30個循環；和最後72°C延伸5分鐘。 然後將PCR産物（175 bp)在1.2%瓊脂糖凝膠上進行電泳。 結果給出在圖1中。 如圖1中所示，電泳結果在下列樣品中是一致的，即 1302570 顯示出犬痕熱症狀的死亡幼犬的腦（泳道1 )、支氣管（泳 道2)和肺（泳道3 )，以及用從其中分離的CDV致敏的 細胞（泳道4)和Onderstepoort株系（泳道5 )。這些結 果顯示從幼犬分離出其RNA的病毒是CDV。 實施例2 :就本發明的病毒是否具有亞洲/H2基因型進 行評價 (步驟1 ) DNA樣品的製備 cDNA合成

將在實施例1中製備的病毒和器官乳液根據與實施例 1同樣的方法進行RT-PCR，以合成cDNA。對於KDK-1、 98-002和Onderstepoort，將事先選殖進質體的Η基因用作 DNA模板。 (步驟2) RFLP分析 使用製備的 cDNA 樣品和參考 DNA 樣品 (Onderstepoort、KDK-1 和 98-002 )進行 RFLP 分析以測 定本發明病毒和常规CDV株系的Η基因基因型。 分析PCR增幅的基因 將DNA用實施例2的步驟1中製備的cDNA進行增 幅。在一個管中，將1 μΐ cDNA溶液與5 μΐ 10x PCR反應 緩衝液、3 μΐ 25 mM MgCl2、4 μΐ 10 mM dNTP、1 μΐ 引子 I ( CDV F10B，TAT/CAT/GAC/RGY/ART/GGT/TC)、1 μΐ 引子 II ( CDV R10，CTT/GGT/GAA/ATC/GAA/CTC/CA)、 0.5 μΐ Taq 聚合酶（5 U/μΙ，TaKaRa)和 34·5 μΐ 無菌蒸餾 水混合。用PCR儀在一定條件下進行PCR，該條件包括： 12 1302570 94〇C 1分鐘；55°C 2分鐘、72°C 2分鐘和94°C 1分鐘， 35個循環；和最後72°C延伸5分鐘。然後將PCR産物在 • 1 %瓊脂糖凝膠上進行電泳。發現增幅出的DNA具有87 1 bp 的大小，這相當於Onderstepoort的Η基因的nt 7,991-8,861。 ‘ 從瓊脂糖凝膠中選擇有效基因 從瓊脂糖凝膠中選擇出有效基因，進行純化，並通過 限制性内切酶消化而就RFLP圖式進行評估。用外科手術

• 刀從瓊脂糖凝膠中切割出有效基因條帶，同時盡可能地除 去凝膠成分，並用電子稱量儀進行稱重。然後，將凝膠塊 與 200 μΐ Nal 溶液（GENECLEAN II Kit，BIO101 )混合， 於50°C培育5分鐘以溶解凝膠成分，並與10 μΐ GLASSMILK (商品名；GENECLEAN II Kit，ΒΙΟ101 )混合。將反應 混合物於室溫培育5分鐘，以使得DNA與GLASSMILK 的二氧化矽組分結合，同時經常用手指輕敲管以懸浮二氧 、 化石夕。然後，將反應混合物於10,000 rpm離心5秒以沈殿 ® 出與DNA結合的二氧化矽。使用微量加液器將粒狀沈澱 物用 1 ml NEW WASH (商品名；GENECLEAN II Kit， • BIO101 )進行洗滌，並再重複兩次該洗滌。將管置於真空 中5分鐘以完全除去上清液，並將粒狀沈澱物再次懸浮在 1 5 μΐ無菌水中，並於15,000 rpm離心30秒。將含有有效 基因的上清液轉移至新的無菌管中。再重複該步驟一次， 並將次級上清液和初級上清液合併，於-20°C儲存。 每個病毒DNA的RFLP分析 13 1302570 將從瓊脂糖凝膠中分離的有效基因用限制性内切酶進 行消化，並進行電泳以測定每個病毒DNA的RFLP圖式。 將2 6 μ 1從瓊脂糖凝膠中分離的有效基因與3 μ 1 10 X限制性 内切酶緩衝液（NEBuffer 4，ΝΕΒ )和 1 μΐ Ndel ( 20 U/μΙ， NEB)混合，並在培養箱中於37°C培育8小時30分鐘。 • 然後將反應混合物在0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳。結果給 出在圖2中。 如圖2中所示，發現已知具有亞洲/H1基因型的KDK-Φ 1株系（泳道2 )具有不同於已知具有亞洲/H2基因型的 98-002 DNA (泳道3)的RFLP圖式。發現從感染了本發 明的CDV的幼犬中取得的器官懸浮液（泳道5-9 )和病毒 致敏的細胞（泳道4)具有與98-002 DNA同樣的RFLP圖 式。這些結果顯示，不同於以前分離的CDV株系，本發 明的CDV株系屬於亞洲/H2基因型。 實施例3 : Η基因的核苷酸序列分析 在藉由使用實施例1 (步驟2 )中製備的cDNA以PCR w 增幅出編碼Η基因的DNA之後，對於本發明的犬瘟熱病 毒（亞洲/H2基因型）的Η基因核苦酸序列進行分析。在 一個PCR管中，將1 μΐ cDNA溶液與5 μΐ 10x PCR反應 緩衝液、3 μΐ 25 mM MgCl2、4 μΐ 1〇 mM dNTP、1 μΐ 引子 I( CDV F8, GTT/GTT/GCT/GAT/TTA/CTG/TT，Onderstepoort 的 H 基因的 nt 6800-6819 ) 、1 μΐ 引子 II ( CDV R8， CCC/CGT/CTG/TTA/TTT/TGC/TA，Onderstepoort 的 H 基 因白勺 lit 9 399-93 80 )、0.5 μΐ EX Taq 聚合酶（5 U/μΙ，TaKaRa) 14 1302570 和34.5 μΐ無菌蒸餾水混合。用pCR儀在一定條件下進行 pCR，该條件包括：94°C 1分鐘30秒；52°C 1分鐘30 私、72 C 2分鐘和94°C 1分鐘30秒，35個循環；和最 後72 °C延伸20分鐘。然後將PCR産物插入選殖載體 (PTZ57R，MBI Fermentas )中。然後，測定本發明的犬 瘟熱病毒（亞洲/H2基因型）的η基因核苷酸序列，該序 列如SED ID NO· 1所示。 直利的效果 主如前所述，本發明提供了新穎韓國犬瘟熱病毒，該病 母特別是在韓國於引起犬瘟熱的犬瘟熱病毒之中發現的， 也提供了使用該病毒的用於犬瘟熱的重組疫苗。 【圖式簡單說明】 圖1顯示了用於確定本發明的病毒是否爲CDV (犬盘 熱病毒）的電泳分析結果。 圖2顯不了用於確定本發明的病毒是否爲屬於亞洲 基因型的CDV的RFLP分析結果。 圖3顯示了本發明的韓國CDV的Η基因核苦酸序列 在系統樹中的位置。 【主要元件符號說明】 (無） 15 1302570 靜j表 <110> Korea Microbiological Laboratories，LTD, <120> CANINE DISTEMPER VIRUS ISOLATED IN KOREA 纖國分酗勺犬；ίϋί病毒 <150 KR1020030015282 <151> 2003-03-12 10

15 20 <160> 1 <170> Kopatentln 1.71 <210> 1 <211> 1824 <212> DNA <213〉 canine distemper virus 犬瘤繫病毒 <400> 1 atgctctcct acx^aagacaa ggtgggtgcc ttctataagg ataatgcaag agctaattca 60 tccaagccgt ccttagtgac agaagaacaa gggggcagga gaccacccta cttgctgttt 120 gtccttctca tcctactggt tggaatcctg gccttgcttg ctatcgctgg agttcgattt 180 •5 •30 35 cgccaggtgt caactagcaa tgtggaattt ggcagattgc tgaaggatga tttggagaaa 240 tcggaggccg tgcatcacca agtcatggat gtcttgacac cactcttcaa aattattgga 300 gatgggattg ggttacggtt gccacaaaaa ctaaacgaga tcaaacaatt tatccttcaa 360 aagacaaact tcttcaatcc gaacagagaa ttcgacttcx: gcgatctcca ctggtgcatt 420 aacccgccta gtaagatcaa ggtgaatttt ac^aattact gtgatgcaat tggggtcaga 480 aaatccattg catcggcagc aaatcccatc cttttatcag cactctccgg aggcagaggt 540 1 1302570 10

15 20 罾 30 gacatattcc caccatacag atgcagtgga gctactactt cagtaggcag agttttcccc 600 ctatcagtat cattatccat gtctttgatc tcaaaaacat cagagataat caatatgctg 660 acx^gccatct cagacggagt gtatggtaaa acttacttgt tagtgcctga ttatattgaa 720 agggagttcg acacacaaaa aattcgagc tttgagatag ggttcatcaa acggtggctg 780 aatgacatgc cattactcca gacaaccaac tatatggtcc tcccggagaa ttccaaagct 840 aaggtgtgta ctatagcggt gggcgagctg acactggctt ccttgtgtgt agatgagagc 900 acx^gtattat tatatcatga cagcaatggt tcacaagaca gtattctagt agtgacgctg 960 ggaatatttg gggcaacacc gatgaatcaa gtagaagagg tgatacctgt cgctcatcca 1020 tcagtagaaa ggatacatat cacaaatcac cgtggtttca taaaagattc agtagcaacc 1080 tggatggtgc ctgcattggt ctctgagcaa caagaaggac aaaaaaattg tctggagtcg 1140 gcttgtcaaa gaaaatccta ccctatgtgc aaccaaacat catgggaacc cttcggagga 1200 gtacagttgc catcttacgg gcggttgaca ttacctctag atgcaagcat tgaccttcaa 1260 cttaacatat cgtttacata cggtcctgtg atactgaatg gagatggtat ggattattat 1320 gaaaacx:cac ttttggactc cggatggctt accattcctc ccaagaacgg aacaatactt 1380 ggattaataa ataaagcaag tagaggagac cagttcactg taacccccca tgtattgaca 1440 tttgcgccca gggagtcgag tggaaattgt tatctaccta ttcaaacatc <xagattatg 1500 gataaagatg tccttactga gtccaattta gtggtgttgc ctacacagaa ttttggatat 1560 2 35 1302570 gtcgtagcaa catatgatat atcccggaaa aatcatgcga ttgtttatta tgtttatgac 1620 ccaatccgga cgatttctta lacgtaccca tttagaciaa ciaccaaggg tagacctgat 1680 5 ttcctaagga ttgaatgttt tgtgtgggat gacgatttgt ggtgtcacca attttacaga 1740 tttgagtctg atatcaccaa ctctacaacx: agtgtcgaag atltagtccg tataagattc ] 800 1824 tcatgiaatc gttcaaaacc ttga 10

Claims (1)

1. 1302570 I 仝告/ 十、申請專利範圍： 1. 一種亞洲/H2基因型的犬瘟熱病毒，其用於製備用 於犬瘟熱的疫苗，並具有編號KCCM 10467。 2. 根據申請專利範圍第1項的犬瘟熱病毒，其含有SEQ ID NO. 1所示的Η基因。 十一、圖式： 如次頁 1