CN112941240A

CN112941240A - 检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN112941240A
Application number: CN202110380659.4A
Authority: CN
Inventors: 王劭; 林甦; 陈仕龙; 江丹丹; 郑敏; 陈少莺
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-04-09
Filing date: 2021-04-09
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2041-04-09
Also published as: CN112941240B

Abstract

本发明涉及检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对、试剂盒及方法。本发明的引物对包括GoAstV上游引物、GoAstV下游引物、GoCV上游引物和GoCV下游引物，分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所述。本发明的试剂盒包括前述的引物对。本发明方法包括步骤：S1、提取样品RNA；S2、采用前述引物对，使用双重一步法RT‑PCR反应程序扩增后检测；若452 bp处出现条带，则鹅星状病毒阳性，若711 bp处出现条带，则鹅嵌杯病毒阳性。本发明方案用于鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的分子流行病学检测，特异性好，结果可靠。

Description

检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对、试剂盒及方法。

背景技术

鹅星状病毒(Goose astrovirus，GoAstV)是一种无囊膜，单股正链RNA病毒。GoAstV粒子呈20面体对称结构，直径在28nm-30nm之间，基因组长度7148-7299bp之间。GoAstV是引起鹅致死性痛风的主要病原之一，临床主要表现为精神沉郁，卧地倦动，采食减少，剖检表现为内脏器官及关节腔的严重尿酸盐沉积，给养殖业带来巨大的经济损失，是目前危害世界养鹅业的重要疫病之一。该病毒广泛存在于我国的养殖鹅群中，严重影响了养鹅业的经济效益。

鹅嵌杯病毒(Goose calicivirus，GoCV)是一种新出现的水禽嵌杯病毒，是嵌杯病毒科成员，病毒粒子呈球形或近球形，直径为28nm-30nm，具有特征性的20面体对称单层衣壳结构，为无囊膜正链RNA病毒，于2012年首次在我国的鹅群中检测发现。GoCV是引起鹅病毒性肠炎与传染性生长阻滞综合征的主要病原之一，临床主要表现为腹泻，生长迟缓、营养不良，与GoAstV混合感染后可加强临床表现，严重威胁着养鹅业的健康发展。由于GoAstV与GoCV感染鹅以后的临床表现、病理变化等非常相似，给临床诊断造成了一定困难。

目前，用于GoAstV与GoCV的检测方法，有电镜观察、宏基因组测序和RT-PCR等，但由电镜操作与宏基因组测序需要一定技能，不易进行大量样本的集中处理，同时仪器费用高，所以电镜检测与宏基因组测序在GoAstV与GoCV监测中存在很大局限性。

RT-PCR(reverse transcription-Polymerase Chain Reaction，中文全称为反转录聚合酶链式反应)这种先进的分子生物学检测手段，不仅可以快速准确的检测病原，而且其检测方法特异性强、敏感性高。RT-PCR的基本原理为：在引物的作用下，先对RNA样品进行cDNA合成，再进行PCR扩增。尽管RT-PCR方法得到了广泛应用，但单重RT-PCR方法一个反应只能检测一种病毒，不能进行多种病毒类型的联合RT-PCR检测。多重PCR(Multiplex PCR)是在同一PCR反应体系中加入两对以上的引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，它具有高效快捷、高度特异敏感、降低实验成本、加速实验进程等优点，更适合在临床中应用。一步法RT-PCR即逆转录和PCR在同一反应体系中连续进行，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖，反应中途不需要添加任何试剂，简化了实验操作步骤，所以一步法RT-PCR在处理大量样品时具有明显的优势；而且一步法RT-PCR逆转录所得的cDNA全部用于PCR扩增，故可以得到更高的灵敏度，基于以上特点，双重一步法RT-PCR在临床检测应用中将有显著的优势。

综上所述，现在亟需研发出一种可以同时检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对、试剂盒及方法，以实现快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好地检测家禽养殖时的鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒，为准确鉴别鹅感染的病因并对症下药，对鹅养殖行业健康发展意义重大，填补国内外相关领域空白。

发明内容：

本发明所要解决的首要技术问题是提供一种同时检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对，该组引物灵敏度好、特异性高，利用该组引物能对能联合检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种同时检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的试剂盒。该试剂盒内的引物对灵敏度好、特异性高，利用该组引物能对雏鹅的鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒进行联合检测、早期预警和防治。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种同时检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的方法，以实现低成本、快速、准确地检测家禽养殖时的鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒，为有效控制家禽养殖业的病毒蔓延以及及时治疗提供检测依据，填补国内外相关领域空白。

为实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的一种检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对，包括GoAstV上游引物、GoAstV下游引物、GoCV上游引物和GoCV下游引物，所述GoAstV上游引物的核苷酸序列如SEQID NO：1所述，所述GoAstV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所述，所述GoCV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所述，所述GoCV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所述。

本发明还提供一种检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对。

本发明还提供一种检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的方法，具体包括以下步骤：

S1、提取待检测的鹅组织样品，研磨后反复冻融，离心后取上清并提取基因组RNA；

S2、采用如权利要求1中所述的引物对，使用双重一步法RT-PCR反应程序进行扩增，样品的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后采用溴化乙锭染色，并于紫外分析仪器中观察、拍照及记录；若在452bp处出现基因条带，表示该样品含有鹅星状病毒，若在711bp处出现基因条带，表示该样品含有鹅嵌杯病毒。

优选的，所述双重一步法RT-PCR方法的反应体系为：2×FastKing One Step RT-PCR MasterMix 12.5μL，引物GoAstV上游引物、GoAstV下游引物、GoCV上游引物、GoCV下游引物的浓度均为20μmol/L，体积均为0.5μL，GoAstV RNA模板2μL，GoCV RNA模板2μL，25×RT-PCR Enzyme Mix 1μL，加RNase-Free ddH2O补足至25μL。

优选的，所述双重一步法RT-PCR方法的反应程序为：42℃反转录30min；95℃变性3min；然后进入94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。

优选的，所述S2中的琼脂糖凝胶电泳的浓度为1.5％，电泳缓冲液为1×TBE，电压不超过5V/cm，电泳时间40-60min。

本发明的技术方案至少具有以下有益效果：

本发明根据GenBank收录的鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒全基因序列，通过比鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒之间的基因序列差异，自行设计特异性引物GoAstV上游引物、GoAstV下游引物、GoCV上游引物与F4，这两个引物对能够特异性扩增鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒，使用GoAstV上游引物和GoAstV下游引物引物可以扩增鹅星状病毒，使用GoCV上游引物和F4可以扩增鹅嵌杯病毒。RT-PCR产物经测序验证后序列正确且不存在交叉反应，证明该引物具有良好的特异性，检测结果具有可靠性。

本发明通过对反应体系和反应条件的各种优化，在国内外首先建立鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒双重一步法RT-PCR方法，鹅星状病毒预期扩增片段大小为452bp，鹅嵌杯病毒预期扩增片段大小为711bp。在引物设计上利用扩增片段长度的不同直接判定扩增结果，使得该方法在结果判定时更简便、直观和实用。

本发明的方法可用于鹅星状病毒与鹅嵌杯病毒的分子流行病学检测，在国内外首先建立鹅星状病毒与鹅嵌杯病毒的双重一步法RT-PCR方法，该方法灵敏度高，最特异性强、重复性好，结果判定时更简便、直观和实用，为雏鹅病毒性肠炎与传染性生长阻滞综合征的早期预防控制奠定技术基础。

附图说明

图1为本发明检测鹅星状病毒与鹅嵌杯病毒的双重一步法RT-PCR的优化结果，其中各个泳道的标号含义为：M为DL2000 DNA Marker；1为仅使用鹅星状病毒RNA模板；2为仅使用鹅嵌杯病毒RNA模板；3为使用含有鹅星状病毒与鹅嵌杯病毒RNA模板；4为RNase-FreeddH₂O对照。

图2为本发明检测鹅星状病毒与鹅嵌杯病毒的双重一步法RT-PCR检测鹅星状病毒的灵敏性实验结果，其中各个泳道的标号含义为：M：DNA marker 2000bp ladder、1：1.0×10⁶拷贝/μL、2：1.0×10⁵拷贝/μL、3：1.0×10⁴拷贝/μL、4：1.0×10³拷贝/μL、5：1.0×10²拷贝/μL、6：1.0×10¹拷贝/μL、7：1.0×10⁰拷贝/μL、8：RNase-Free ddH₂O对照。

图3为本发明检测鹅星状病毒与鹅嵌杯病毒的双重一步法RT-PCR检测鹅嵌杯病毒的灵敏性实验结果，其中各个泳道的标号含义为：M：DNA marker 2000bp ladder、1：1.0×10⁶拷贝/μL、2：1.0×10⁵拷贝/μL、3：1.0×10⁴拷贝/μL、4：1.0×10³拷贝/μL、5：1.0×10²拷贝/μL、6：1.0×10¹拷贝/μL、7：1.0×10⁰拷贝/μL、8：RNase-Free ddH₂O对照。

图4为本发明检测鹅星状病毒与鹅嵌杯病毒的双重一步法RT-PCR检测病毒的特异性结果，其中各个泳道的标号含义为：M：DNA marker 2000bp ladder；N：RNase-Free ddH₂O对照；泳道1为鹅星状病毒与鹅嵌杯病毒RNA混合阳性结果；泳道2、3、4、5、6、7、8是对照病毒核酸样品，分别为鹅副粘病毒(GPMV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、鸭新型呼肠孤病毒(NDRV)、Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHAV-1)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭腺病毒(DAdV)，以上均为阴性结果。

图5为本发明检测鹅星状病毒与鹅嵌杯病毒的双重一步法RT-PCR检测20个临床样品的结果，其中各个泳道的标号含义为：M：DNA marker 2000bp ladder、泳道P：阳性对照；N：RNase-Free ddH₂O对照；泳道1、2、3、4、5、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20为鹅星状病毒与鹅嵌杯病毒RNA混合阳性结果；泳道6、7为阴性结果；泳道8、10为鹅星状病毒RNA阳性结果。

具体实施方式

以下提供本发明的优选实施例，以助于进一步理解本发明。本领域技术人员应了解到,本发明实施例的说明仅是示例性的，并不是为了限制本发明的方案。

本发明的整体研发思路和技术路线包括：

1、引物设计：参考GenBank中的鹅星状病毒、鹅嵌杯病毒基因组核苷酸序列，利用Lasergene v7.1 DNAStar软件分别进行同源性分析比较，利用Oligo 6.0软件，分别设计针对鹅星状病毒、鹅嵌杯病毒特异性RT-PCR引物，采用BLAST工具进行检索，通过双重一步法RT-PCR验证其特异性。

2、反应体系的优化：优化出的25μL最佳反应体系为：2×FastKing One Step RT-PCR MasterMix 12.5μL，引物GoAstV上游引物、GoAstV下游引物、GoCV上游引物、F4(20μmol/L)各0.5μL，GoAstV RNA模板2μL，GoCV RNA模板2μL，25×RT-PCR Enzyme Mix 1μL，加RNase-Free ddH2O补足至25μL。最佳反应条件为：反应程序为：42℃30min；95℃，3min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃延伸5min。

3、RT-PCR产物电泳检测：双重一步法RT-PCR反应结束后，取3μL扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果：在452bp处未出现特异性基因条带的样品，表示该样品不含有鹅星状病毒；在452bp处出现基因条带的样品，表示该样品含有鹅星状病毒。在711bp处未出现特异性基因条带的样品，表示该样品不含有鹅嵌杯病毒；在711bp处出现基因条带的样品，表示该样品含有鹅嵌杯病毒。

以下从几个实施例具体介绍本申请的方案。

材料来源

鹅副粘病毒(GPMV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、鸭新型呼肠孤病毒(NDRV)、Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHAV-1)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、番鸭细小病毒、鹅细小病毒、鸭腺病毒以及含有鹅星状病毒(GoAstV)的阳性病料与含有鹅嵌杯病毒(GoCV)的阳性病料均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所动物病毒室鉴定并保存。

仪器与试剂

T100型梯度PCR仪购自Bio-Rad伯乐公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度计购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；pMD18-T载体、DL2000 Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司；

Viral DNA/RNA Kit购自北京全式金生物技术有限公司；FastKing一步法RT-PCR试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；质粒快速提取试剂盒E.Z.N.A.TMPlasmid Mini Kit购自Omega公司。试验1至试验例6中未说明的步骤及试剂均为前述试剂盒中公开的说明操作，为避免赘述，在此不进行一一罗列。

实施例1引物的设计与合成

本发明为一种检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对，根据GenBank中鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的全基因组序列，应用Oligo 6.0软件在其相对保守区域设计引物；包括GoAstV上游引物、GoAstV下游引物、GoCV上游引物和GoCV下游引物，所述GoAstV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述，所述GoAstV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所述，所述GoCV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所述，所述GoCV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所述。设计的两对特异性引物(具体序列见下段)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

具体的，GoAstV上游引物(SEQ ID NO.1)：5ˊ-garayggayt ggacvmghtw tga-3ˊ；

GoAstV下游引物(SEQ ID NO.2)：5ˊ-ttytcwkbyt tvacccacat dcctt-3ˊ；

GoCV上游引物(SEQ ID NO.3)：5ˊ-ctyggaccmc tccskaargg cac-3ˊ；

GoCV下游引物(SEQ ID NO.4)：5ˊcatrgtkgag tcccayttyk wrtagtc-3ˊ。

利用本发明的两个引物对可用于检测鹅星状病毒与鹅嵌杯病毒的相应基因，尤其适用于基层科研实验室的检测。通过对反应体系和反应条件的各种优化，可以建立一套可用于检测鹅星状病毒与鹅嵌杯病毒的双重一步法RT-PCR方法，而且在引物设计上利用扩增片段长度的不同直接判定扩增结果，使得该方法在结果判定时更简便、直观和实用。

实施例2

本实施例为一种检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的试剂盒，该试剂盒包含80μL的实施例1中所述的检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对(各引物浓度均为10μmol/L)以及用于双重一步法RT-PCR的反应试剂，具体为100μLDL2000、200μL RT-PCR一步法酶、250μL酶缓冲液、300μL RNase Free dH₂O、20μL阳性对照及20μL阴性对照。

实施例3双重一步法RT-PCR检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒

一、待测样品的制备

参照

Viral DNA/RNA Kit试剂盒的使用说明书操作，分别抽提鹅副粘病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭新型呼肠孤病毒、Ⅰ型鸭肝炎病毒、鸭坦布苏病毒、鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒RNA，番鸭细小病毒、鹅细小病毒、鸭腺病毒的DNA，并使用SmartSpec^TM Plus核酸蛋白检测仪测定它们的核酸浓度和纯度后，-70℃保存备用。

二、双重一步法RT-PCR反应的建立

使用FastKing一步法RT-PCR试剂盒进行双重一步法RT-PCR，通过对反应液中引物对GoAstV上游引物/GoAstV下游引物、引物对GoCV上游引物/F4的使用量及双重RT-PCR的退火温度、时间以及循环次数等的优化，最后确定双重RT-PCR中最佳引物浓度：引物GoAstV上游引物在反应液中的终浓度具体为20μmol/L；引物GoAstV下游引物在反应液中的终浓度具体为20μmol/L；引物GoCV上游引物在反应液中的终浓度具体为20μmol/L；引物GoCV下游引物在反应液中的终浓度具体为20μmol/L。

表2双重一步法RT-PCR反应体系(25μL)

2×FastKing One Step RT-PCR MasterMix	12.5μL
		引物GoAstV上游引物(20μmol/L)	0.5μL
引物GoAstV下游引物(20μmol/L)	0.5μL
		引物GoCV上游引物(20μmol/L)	0.5μL
引物F4(20μmol/L)	0.5μL
		RNA模板	4μL
25×RT-PCR Enzyme Mix	1μL
		RNase-Free ddH<sub>2</sub>O	5.5μL

RNA模板分别为鹅星状病毒RNA、鹅嵌杯病毒RNA以及鹅星状病毒与鹅嵌杯病毒混合RNA(体积比是1:1)。

双重一步法RT-PCR的最佳反应程序为：42℃反转录30min；95℃变性3min；然后进入94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。

按照表1在PCR反应管中配制RT-PCR反应液25μL，高速离心10s后，将反应管放入T100型梯度PCR(Bio-Rad)中，按照最佳反应模式设定的程序开始工作。

反应结束后，取扩增产物5μL在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，然后利用凝胶成像系统扫描进行初步鉴定，结果参见附图1的示意，其中：M为DL2000 DNA Marker；1为仅使用含有鹅星状病毒RNA模板，扩增得到大小约为452bp的条带；2为仅使用含有鹅嵌杯病毒RNA模板，扩增得到大小约为711bp的条带；3为使用含有鹅星状病毒与鹅嵌杯病毒RNA模板，扩增得到大小约为452bp与711bp的条带，与实验设计大小相符；4为RNase-Free ddH₂O对照。

三、引物的敏感性试验

分别提取鹅星状病毒与鹅嵌杯病毒基因组RNA后，用分光光度计(NanoDrop2000C，Thermo)进行定量，并通过(拷贝/μL＝(6.02×10²³)×(ng/μL×10^-9)/(目的片段碱基数×660))公式计算出每微升的拷贝数。测定起始浓度后，用RNA-Free Water连续10倍倍比稀释，使其分别相当于含有1.0×10⁶拷贝/μL、1.0×10⁵拷贝/μL、1.0×10⁴拷贝/μL、1.0×10³拷贝/μL、1.0×10²拷贝/μL、1.0×10¹拷贝/μL、1.0×10⁰拷贝/μL的鹅星状病毒RNA；以及含有1.0×10⁶拷贝/μL、1.0×10⁵拷贝/μL、1.0×10⁴拷贝/μL、1.0×10³拷贝/μL、1.0×10²拷贝/μL、1.0×10¹拷贝/μL、1.0×10⁰拷贝/μL的鹅嵌杯病毒RNA，采用优化的反应条件分别进行一步法RT-PCR，测定其敏感性。

反应结束后，取扩增产物5μL在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，然后利用凝胶成像系统扫描进行初步鉴定，最后将RT-PCR反应液送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序后对测序结果进行Blast比对分析。

琼脂糖凝胶电泳结果如附图2所示，M为DL2000 DNA Marker，1—7号泳道分别为使用1.0×10⁶-1.0×10⁰拷贝/μL鹅星状病毒RNA模板的实验结果，该双重RT-PCR最低能检出1.0×10⁴拷贝/μL鹅星状病毒RNA；如图3所示，M为DL2000 DNA Marker，1—7号泳道分别为使用1.0×10⁶-1.0×10⁰拷贝/μL鹅嵌杯病毒RNA模板的实验结果，该双重RT-PCR最低能检出1.0×10³拷贝/μL鹅嵌杯病毒RNA；最低检测值以上各浓度的模板中鹅星状病毒均扩增得到大小约为452bp的条带，鹅嵌杯病毒病毒均扩增得到大小约为711bp的条带，与实验设计大小相符，且测序结果进一步证实PCR产物的核酸序列与引物设计模板的基因对应片段的同源性一致，它们是鹅星状病毒与鹅嵌杯病毒RT-PCR的扩增产物。利用该双重RT-PCR检测具有较强的敏感性。

四、双重一步法RT-PCR的特异性试验

按照步骤二中得到的优化后的PCR反应体系与条件进行扩增，分别加入以下对照模板：鹅副粘病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭新型呼肠孤病毒、Ⅰ型鸭肝炎病毒、鸭坦布苏病毒的RNA；番鸭细小病毒、鹅细小病毒、鸭腺病毒的DNA；阴性对照为RNase-Free ddH₂O对照。

反应结束后，取扩增产物5μL在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，利用凝胶成像系统扫描进行初步鉴定。

琼脂糖凝胶电泳结果参见附图4所示：Y为未加入模板的阴性对照，M为DL 2000DNAMarker，1-10号泳道分别是以鹅星状病毒与鹅嵌杯病毒RNA、RNase-Free ddH₂O、鹅副粘病毒RNA、番鸭呼肠孤病毒RNA、鸭新型呼肠孤病毒RNA、Ⅰ型鸭肝炎病毒RNA、鸭坦布苏病毒的RNA以及番鸭细小病毒DNA、鹅细小病毒DNA、鸭腺病毒DNA为模板的实验结果。含有鹅星状病毒与鹅嵌杯病毒RNA混合液模板的样品能扩增出与试验设计大小相符的扩增条带，而其它对照病毒在相同位置却无任何扩增条带。测序结果进一步证实了鹅星状病毒与鹅嵌杯病毒双重一步法RT-PCR扩增产物与实验设计大小相符，利用该双重一步法RT-PCR检测具有较强的特异性。

实施例4双重一步法PCR检测待测样本

一、样品的制备

将采集的20份(编号为1-20)疑似传染性生长阻滞综合征或病毒性痛风鹅组织样品(肾脏)磨成悬液，反复冻融3次后高速离心，然后取上清液，得到20份待测样品。

二、双重一步法RT-PCR检测

1、模板的制备：按照实施例2的步骤一抽提出20份待测样品中的总RNA。具体参照

Viral DNA/RNA Kit试剂盒的使用说明书操作，并使用分光光度计(NanoDrop2000C，Thermo)测定其核酸浓度和纯度后，-70℃保存备用。

2、双重一步法RT-PCR检测：按照实施例2的表1在PCR反应管中配制RT-PCR反应液25μL。

高速离心10s后，将反应管放入T100型梯度PCR(Bio-Rad)中，按照实施例2的步骤二中得到的优化后的RT-PCR反应条件进行扩增：42℃反转录30min；95℃变性3min；然后进入94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。

反应结束后，取扩增产物5ul在15g/L琼脂糖凝胶上电泳，然后利用凝胶成像系统扫描进行初步鉴定。

若得到452bp的片段，则待测样本中含有鹅星状病毒，反之则没有；

若得到711bp的片段，则待测样本中含有鹅嵌杯病毒，反之则没有；

若得到452bp与711bp的片段，则待测样本中含有鹅星状病毒与鹅嵌杯病毒，反之则没有。

最后将RT-PCR反应液送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，对测序结果进行Blast比对分析。

参见附图5的琼脂糖凝胶电泳结果，显示20份待测样品中检出鹅星状病毒18份(目的条带约为452bp，阳性率为90％)，检出鹅嵌杯病毒16份(目的条带约为711bp，阳性率为80％)。其中，鹅星状病毒与鹅嵌杯病毒混合感染16份(目的条带分别约为452bp和711bp，阳性率为80％)。RT-PCR产物经测序分析后同源性在96％-99％之间，进一步证实了上述结果的准确性。通过该实施例4证明了该鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的RT-PCR扩增引物对将可用于调查清楚不同地区的鹅星状病毒与鹅嵌杯病毒的流行情况，进行疫源追踪从而对其进行有效的防控，同时也有可对鹅病毒性疾病及时做出正确的诊断，有效治疗和控制，从而避免造成巨大的经济损失。

最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本申请的技术方案而非对其保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本申请进行了详细的说明，所述领域的普通技术人员应当理解：本领域技术人员阅读本申请后依然可对申请的具体实施方式进行种种变更、修改或等同替换，但以上变更、修改或等同替换，均在本申请的待授权或待批准之权利要求保护范围之内。

序列表

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对、试剂盒及方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 鹅星状病毒(Goose astrovirus)

<400> 1

garayggayt ggacvmghtw tga 23

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 鹅星状病毒(Goose astrovirus)

<400> 2

ttytcwkbyt tvacccacat dcctt 25

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 鹅嵌杯病毒(Goose calicivirus)

<400> 3

ctyggaccmc tccskaargg cac 23

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 鹅嵌杯病毒(Goose calicivirus)

<400> 4

catrgtkgag tcccayttyk wrtagtc 27

Claims

1.一种检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对，其特征在于，包括GoAstV上游引物、GoAstV下游引物、GoCV上游引物和GoCV下游引物，所述GoAstV上游引物的核苷酸序列如SEQID NO：1所述，所述GoAstV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所述，所述GoCV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所述，所述GoCV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所述。

2.一种检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求1所述的检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对。

3.一种检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

S2、采用如权利要求1中所述的引物对，使用双重一步法RT-PCR反应程序进行扩增，样品的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后采用溴化乙锭染色，并于紫外分析仪器中观察、拍照及记录；判断检测结果：若在452bp处出现基因条带，表示该样品含有鹅星状病毒，若在711bp处出现基因条带，表示该样品含有鹅嵌杯病毒。

4.根据权利要求3所述的检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的方法，其特征在于，所述双重一步法RT-PCR方法的反应体系为：2×FastKing One Step RT-PCR MasterMix 12.5μL，引物GoAstV上游引物、GoAstV下游引物、GoCV上游引物和GoCV下游引物的浓度均为20μmol/L，体积均为0.5μL，GoAstV RNA模板2μL，GoCV RNA模板2μL，25×RT-PCR Enzyme Mix 1μL，加RNase-Free ddH₂O补足至25μL。

5.根据权利要求4所述的检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的方法，其特征在于，所述双重一步法RT-PCR方法的反应程序为：42℃反转录30min；95℃变性3min；然后进入94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。

6.根据权利要求5所述的检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的方法，其特征在于，所述S2中的琼脂糖凝胶电泳的浓度为1.5％，电泳缓冲液为1×TBE，电压不超过5V/cm，电泳时间40-60min。