CN101942528A - 一种用于检测鹅圆环病毒的引物和探针 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测鹅圆环病毒的引物和探针，所述引物序列为上游引物：5’-AGGTAATGGTTGCTTCTACTGTTAG-3’，下游引物：5’-GTGGTATTCTACGGAATGGGTATG-3’，所述探针序列为：5’-ACAAGCCGAGGACACAGCAGCACC-3’。本发明根据GenBank登录的所有鹅圆环病毒全基因序列，设计引物和探针，于国内外首先建立鹅圆环病毒的荧光定量PCR方法，该方法灵敏度高，最低可检测453copies，特异性强，重复性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测鹅圆环病毒的引物和探针。
背景技术
圆环病毒为无囊膜、二十面体对称的动物病毒，其结构简单，复制需要依赖于旺盛的宿主细胞活力，增殖速度快的淋巴细胞是圆环病毒侵染的主要宿主。因此，圆环病毒感染往往导致机体免疫混乱、免疫力下降，进而引起多种条件性病原的二次感染。它主要侵害免疫系统，会引起病毒诱导性淋巴组织损伤类似，使动物机体易遭受其它病原并发和继发感染。
鹅圆环病毒(GoCV)最早于1999年由德国学者Soike等从患病鹅病理组织中观察到。病鹅主要表现发育不良、体重下降、羽毛凌乱等，病理组织学检查发现法氏囊、脾脏和胸腺的淋巴细胞减少，其中法氏囊病变最明显，甚至出现整个囊结构的破坏，并可观察到嗜碱性的包涵体。
到目前为止，圆环病毒属除PCV（PCV1和PCV2）可以在PK-15细胞中繁殖外，其余成员均尚未能在细胞中培养成功，大大限制了对其进行深入研究，因而病原诊断方法相对较少。已建立的诊断方法有电镜法、核酸探针技术、聚合酶链式反应法等。荧光PCR是在普通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术，具有特异性强、灵敏度高、定量准确、适用性广等优点。目前，国内外还没有针对鹅圆环病毒检测的荧光定量PCR方法，但该属其他类型病毒如猪圆环病毒和鸽圆环病毒均已经有相应的荧光定量PCR检测方法。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测鹅圆环病毒的引物和探针。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
用于检测鹅圆环病毒的引物和探针包括：
1、一种用于检测鹅圆环病毒的引物，其特征在于，所述引物序列如下：
PCR上游引物：5’-AGGTAATGGTTGCTTCTACTGTTAG -3’，
PCR下游引物：5’-GTGGTATTCTACGGAATGGGTATG -3’。
2、一种用于检测鹅圆环病毒的探针，其特征在于，所述探针序列为：
5’ -ACAAGCCGAGGACACAGCAGCACC-3’。
所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团（R）和荧光淬灭基团（Q）的寡核苷酸。
利用本发明的引物和探针可用于对鹅圆环病毒的相应基因进行检测，尤其适用于基于荧光定量PCR技术的检测。通过对反应体系和反应条件的各种优化，建立一套可用于检测鹅圆环病毒的荧光定量PCR方法。
具体操作方法如下：
1、引物和探针设计：参考GenBank中的鹅圆环病毒的全基因核苷酸序列，利用Lasergene v 7.1 DNAStar软件进行同源性分析比较，利用Oligo6.0软件，设计引物和探针，探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为Eclipse，采用BLAST工具进行检索，初步验证其特异性。
2、反应体系的优化：优化出的20 μL 最佳反应体系为：SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL、上、下游引物（10 μmol/L） 各0.2 μL、荧光探针（10μmol/L）0.4μL、模板2 μL、水补足至20 μL。最佳反应条件为：95 ℃，2 min预变性；95 ℃，15 s，65 ℃，20 s，共40个循环。
3、阳性标准品的制备：以提取的鹅圆环病毒DNA为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，转化，提取质粒，得到阳性标准品。
4、标准曲线的建立：以优化的反应体系进行PCR扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线，判定阳性的标准。
该方法可用于鹅圆环病毒的流行病学检测，为疾病的早期预防控制奠定技术基础。同时，该方法的建立为研究该病原的复制动力学提供检测平台。
本发明的有益效果：
本发明根据GenBank登录的所有鹅圆环病毒全基因序列，设计引物和探针，于国内外首先建立鹅圆环病毒的荧光定量 PCR方法，该方法灵敏度高，最低可检测453copies，特异性强，重复性好。
附图说明
图1 鹅圆环病毒的荧光定量PCR方法的扩增曲线；
图2为鹅圆环病毒的荧光定量PCR方法的标准曲线。
具体实施方式
实施例1 鹅圆环病毒的荧光定量PCR方法的建立
一、材料：
鹅圆环病毒（GenBank登录号：GU320569）
GPV、APMV-1、GRV病毒保存于福建省农业科学院畜牧兽医研究所。
二、步骤
1、仪器与试剂：Mastercycler ep realplex荧光定量PCR仪，购自eppendorf公司； PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)购自宝生物工程（大连）有限公司、PrimeScriptTMRT reagent Kit、pMD18-T载体、DL2000 Marker均购自宝生物工程（大连）有限公司；胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购自Omega Bio-Tek；GoTaq Master Green Mix购自Promega；荧光定量PCR管购自Axygen。
2. 引物和探针的特异性
引物和探针的特异性是本实验所建立方法的最重要因素。根据GenBank登录所有鹅圆环病毒全基因序列，通过比对分析，设计引物和探针。
3、阳性标准品的制备
以常规方法提取鹅圆环病毒基因组DNA。用所设计的特异性引物（上游：5'-GGCAGGATGTGGTTGTGATGG-3'；下游:5'-TCAGGAATCCCTGCA GGTGA-3'，扩增片段大小约1400 nt，进行PCR扩增后，扩增体系为50μL，其中2×GoTaq Master Green Mix 25μL、上下游引物（20μM/mL）各1μL、cDNA1μL、灭菌去离子水22 μL。反应条件为94℃预变性5min，随后进行94℃ 50s、54℃ 35s、72℃ 2min循环30个循环后， 72℃延伸10min。反应结束后，取PCR产物5μL，在1.0%琼脂糖凝胶上电泳。将PCR产物经胶回收试剂盒纯化后与pMD18-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，用PCR和双酶切方法鉴定重组质粒。阳性重组质粒进行序列测定。测序结果表明，阳性重组质粒符合预期，即做为阳性标准品。
4. 反应条件的优化
采用20 μL反应体系［Premix Ex Taq2×) 10 μL，PCR上游引物（10μmol/L）0.2μL， PCR下游引物（10μmol/L）0.2μL，荧光探针（10μmol/L）0.4μL，倍比稀释后的阳性标准品2μL，补水至终体积20μL，以出现最高的荧光值（△Rn）、最小的Ct值以及在熔解曲线分析中不出现非特异性峰为指标，分别对退火温度（55～68℃）和引物浓度（0.2～1.0 μmol/L）进行优化。
5、建立的标准曲线
用紫外分光光度计测定阳性标准品260 nm处光吸收值（A260），计算DNA拷贝数，随后将阳性标准品进行连续10倍系列稀释（10-1～10-7），以优化的条件进行扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线。
对阳性标准品的扩增曲线和标准曲线显示，荧光定量PCR方法对鹅圆环病毒的最低检测限为453拷贝数/反应，并且CT与拷贝数在4.53×102～4.53×107拷贝/反应范围内有很好的线性关系，相关系数为0.993，扩增效率为106%。扩增曲线见图1，标准曲线见图2。
6特异性检测
6.1 特异性检测
用优化的条件分别检测GPV、APMV-1、GRV病毒核酸样品，进行检测，对其特异性进行评价。结果检测均为阴性，荧光定量PCR产物也未见条带。
6.2 可重复性及再现性评估
对同一阳性标准品设4个重复管，用实时荧光定量RT-PCR进行检测，评价其重复性，计算组内变异系数；将阳性标准品置于－20℃冰箱保存，分别于第7、14、21d 重检，评价其再现性，计算其组间变异系数。计算得组内变异系数为0.56%～1.68%，组间变异系数为0.91%～2.53%，可重复性好。
<110>福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120>一种用于检测鹅圆环病毒的引物和探针
<160>3
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
aggtaatggttgcttctactgttag25
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
gtggtattctacggaatgggtatg24
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
acaagccgaggacacagcagcacc24
Claims (2)
1.一种用于检测鹅圆环病毒的引物，其特征在于，所述引物序列如下：
上游引物：5’-AGGTAATGGTTGCTTCTACTGTTAG -3’，
下游引物：5’-GTGGTATTCTACGGAATGGGTATG -3’。
2.一种用于检测鹅圆环病毒的探针，其特征在于，所述探针序列为：
5’-ACAAGCCGAGGACACAGCAGCACC-3’。
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| CN (1) | CN101942528B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102716476A (zh) * | 2012-05-31 | 2012-10-10 | 郑州后羿制药有限公司 | 一种细胞灭活疫苗和卵黄抗体注射液及其制备方法 |
| CN102861327A (zh) * | 2012-09-27 | 2013-01-09 | 郑州后羿制药有限公司 | 一种细胞灭活疫苗、卵黄抗体及卵黄抗体的注射液和冻干粉 |
| CN103882152A (zh) * | 2014-04-04 | 2014-06-25 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一组用于水禽圆环病毒可视化鉴别诊断的荧光定量引物 |
| CN107630110A (zh) * | 2017-11-14 | 2018-01-26 | 林裕胜 | 一种用于检测羊口疮病毒orfv020基因的引物和探针 |
| CN112941240A (zh) * | 2021-04-09 | 2021-06-11 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对、试剂盒及方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101294223A (zh) * | 2007-05-08 | 2008-10-29 | 深圳太太基因工程有限公司 | 一种用于检测ⅱ型猪圆环病毒核苷酸片段的引物和探针序列 |
| CN101776687A (zh) * | 2010-03-02 | 2010-07-14 | 浙江大学 | 一种采用间接elisa方法检测鹅圆环病毒抗体的方法 |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101294223A (zh) * | 2007-05-08 | 2008-10-29 | 深圳太太基因工程有限公司 | 一种用于检测ⅱ型猪圆环病毒核苷酸片段的引物和探针序列 |
| CN101776687A (zh) * | 2010-03-02 | 2010-07-14 | 浙江大学 | 一种采用间接elisa方法检测鹅圆环病毒抗体的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 《上海畜牧兽医通讯》 20071231 竺春 等 鹅圆环病毒研究进展 第6-7页 1-2 , 第4期 2 * |
| 《中国兽医学报》 20060531 张福良 等 猪圆环病毒2 型荧光定量PCR 检测方法的建立 摘要，材料与方法，表1 1-2 第26卷, 第3期 2 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102716476A (zh) * | 2012-05-31 | 2012-10-10 | 郑州后羿制药有限公司 | 一种细胞灭活疫苗和卵黄抗体注射液及其制备方法 |
| CN102861327A (zh) * | 2012-09-27 | 2013-01-09 | 郑州后羿制药有限公司 | 一种细胞灭活疫苗、卵黄抗体及卵黄抗体的注射液和冻干粉 |
| CN103882152A (zh) * | 2014-04-04 | 2014-06-25 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一组用于水禽圆环病毒可视化鉴别诊断的荧光定量引物 |
| CN103882152B (zh) * | 2014-04-04 | 2016-10-26 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一组用于水禽圆环病毒可视化鉴别诊断的荧光定量引物 |
| CN107630110A (zh) * | 2017-11-14 | 2018-01-26 | 林裕胜 | 一种用于检测羊口疮病毒orfv020基因的引物和探针 |
| CN112941240A (zh) * | 2021-04-09 | 2021-06-11 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对、试剂盒及方法 |
| CN112941240B (zh) * | 2021-04-09 | 2022-06-21 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对、试剂盒及方法 |
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