CN102686748B - Mdv-1的测定方法 - Google Patents
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Abstract
用于定量禽类样品中马立克氏病病毒血清型-1(MDV-1)的疫苗株和/或强毒株的方法，其包括以下步骤：(i)提供来自禽类的生物学样品且任选地从所述生物学样品分离核酸；(ii)对(i)的生物学样品进行实时定量PCR(qPCR)，其包括：(a)扩增(i)的核酸样品中的pp38基因的区域，所述区域包含在MDV-1疫苗和强毒株之间具有一致性的单核苷酸多态性(SNP)差异；和(b)使(a)的扩增的核酸接触特异于MDV-1疫苗株SNP的可检测的核酸探针和/或特异于MDV-1强毒株SNP的可检测的核酸探针；(iii)测量由(ii)的探针产生的可检测信号的变化。
Description
技术领域
本发明涉及测定方法，特别是用于分析来自禽类样品中病毒(特别是马立克氏病病毒血清型-1(MDV-1))的疫苗株水平和强毒株水平的方法。
背景技术
马立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus(MDV))是引起鸡中淋巴组织增生性疾病的疱疹病毒。即使在接种针对MDV的疫苗后，感染仍会给家禽产业带来巨大损失。MDV分为三种血清型，它们全部会引起潜在的感染。血清型1包括致瘤病毒，血清型-2包括非致瘤病毒，血清型-3包括火鸡疱疹病毒(HVT)(Bülow et al(1976)Zentralblatt für Veterinarmedizin,23B,391-402)。
Handberg et al(2001)Avian Pathology 30:243-249描述了血清型-1和血清型-3特异性PCR在检测鸡中MDV中的应用。组织样品取自血液(软层细胞)、脾、肝、皮肤、羽根(feather tips)和卵巢。
CVI988(Rispens)株(天然的减毒MDV血清型-1(MDV-1))发现于20世纪90年代中期(Rispens et al.,(1972)Avian Diseases,16,108-125；de Boeret al.,(1986)Avian Diseases,30,276-283)且至今是最有效的针对MDV的疫苗。然而，尽管遵循了疫苗接种计划，MDV爆发依旧引起显著损失。这些爆发可能具有若干原因，包括：母体抗体对疫苗病毒复制的抑制(Kinget al.,(1981)Avian Diseases,25,74-81；de Boer et al.,(1986)supra)；环境压力或与免疫抑制性病原体的共感染抑制对疫苗的免疫应答；在建立完全的疫苗免疫力前强毒MDV株的感染；高强毒MDV株对已免疫和具有完全免疫活性的禽类的感染(Witter et al.,(2005)Avian Pathology,34,75-90)；和最后，施用不足以引起保护性免疫力的疫苗剂量。
因此重要的是能够分别地正确测量MDV疫苗和攻击(强毒)病毒，包括出于实验和商业原因在同一鸡个体中测量二种之一或二种一起。在实验上，为了能更好地理解疫苗保护机制和疫苗间效率的差异，能够检验疫苗和攻击病毒间的相互作用十分有用。在商业上，很重要的是辅助确定疫苗失败的原因，如施用亚最佳疫苗剂量(Landman&Verschuren,2003)、母体抗体对疫苗病毒复制的干扰(King et al.,1981；de Boer et al.,1986)和高强毒MDV野生株的干扰(Witter et al.,2005)。
已开发出用于绝对定量鸡组织中MDV-1的高灵敏度实时定量PCR(q-PCR)测定(Baigent et al.,2005a)，并成功地使用其来研究在缺少攻击病毒感染下在实验和商业鸡组织中的CVI988疫苗病毒复制的动力学(Baigent et al.,2005b,2006)。然而，此方法无法区分CVI988和攻击病毒。已开发出其它类型的实时PCR来定量MDV-2(Renz et al.,2006)和MDV-3(火鸡疱疹病毒)(Islam et al.,2006a)。可使用这些血清型特异性测定来定量单个鸡中的疫苗和强毒攻击病毒，其中攻击病毒(总是MDV-1)与疫苗病毒(MDV-2或-3)的血清型不同(Islam et al.,2006b)。
然而，最普遍使用且有效的MDV疫苗是天然减毒的血清型-1株(CVI988,Rispens)(Rispens et al.,1972；de Boer et al.,1986)，且由于攻击病毒和血清型-1疫苗病毒之间序列差异有限，至今无法使用实时PCR来区分攻击病毒和血清型-1疫苗病毒。可使用常规PCR，利用132-bp重复区域中重复的数量差异来区分CVI988和强毒株(Becker et al.,1992；Silva,1992)。然而，此区域的重复性质使其无法用于定量PCR。meq基因和ICP4基因在CVI988和强毒株之间的差异不具有一致性。也已开发出qPCR系统(Baigent，未发表)，其通过靶向BAC克隆的MDV-1的BAC特异性序列和野生型MDV-1的US2基因来区分BAC(细菌人工染色体)克隆的MDV-1和野生型MDV-1，但仅当此疫苗株为BAC克隆的疫苗株时，其才能用于区分BAC克隆的疫苗株和野生型强毒株。重要的是，由于商业上没有BAC克隆的MDV-1疫苗，所以此方法无法在商业上使用。
pp38基因显示出在CVI988疫苗株和多种MDV-1强毒株之间具有一致性的单核苷酸差异，然而难以设计出能够区分如此小差异的q-PCR引物。
发明内容
本发明提供了在禽类中定量马立克氏病病毒血清型-1的疫苗株和/或强毒MDV-1株的方法，其基于pp38基因的单核苷酸多态性(SNP)。这些方法也包括用于定量疫苗株和强毒株的相对和/或绝对量以及确定每种株拷贝数的方法。
第一方面，本发明提供了用于定量禽类样品中马立克氏病病毒血清型-1(MDV-1)的疫苗株的方法，其包括以下步骤：
(i)提供来自禽类的生物学样品；
(ii)对(i)的生物学样品进行实时定量PCR(qPCR)，其包括：
(a)扩增(i)的核酸样品中的pp38基因的区域，所述区域含有在MDV-1疫苗株和强毒株之间具有一致性的单核苷酸多态性(SNP)差异；和
(b)使(a)的扩增的核酸接触特异于MDV-1强毒株SNP的可检测的核酸探针；
(iii)测量由(ii)的探针产生的可检测信号的变化。
第二方面，本发明提供了用于定量禽类样品中马立克氏病病毒血清型-1(MDV-1)的强毒株的方法，其包括以下步骤：
(i)提供来自禽类的生物学样品；
(ii)对(i)的生物学样品进行实时定量PCR(qPCR)，其包括：
(a)扩增(i)的核酸样品中的pp38基因的区域，所述区域含有在MDV-1疫苗和强毒株之间具有一致性的单核苷酸多态性(SNP)差异；和
(b)使(a)的扩增的核酸接触特异于MDV-1强毒株SNP的可检测的核酸探针；
(iii)测量由(ii)的探针产生的可检测信号的变化。
第三方面，本发明提供了用于定量禽类样品中马立克氏病病毒血清型-1(MDV-1)的疫苗株和强毒株的方法，其包括以下步骤：
(i)提供来自禽类的生物学样品；
(ii)对(i)的生物学样品进行实时定量PCR(qPCR)，其包括：
(a)扩增(i)的核酸样品中的pp38基因的区域，所述区域含有在MDV-1疫苗和强毒株之间具有一致性的单核苷酸多态性(SNP)差异；和
(b)使(a)的扩增的核酸接触特异于MDV-1疫苗株SNP的可检测的核酸探针和特异于MDV-1强毒株SNP的第二核酸探针；
(iii)测量由(ii)的每种探针产生的可检测信号的变化；和任选地
(iv)比较在(iii)中测得的每种特异性探针的可检测信号的变化。
在本发明的一个实施方式中，强毒株和疫苗株的定量可为相对定量。
本发明的方法任选地可以包括从步骤(i)的生物学样品中分离核酸并对所分离的核酸进行步骤(ii)的qPCR的步骤。
来自禽类的生物学样品可以包括禽类核酸或分离自禽类的核酸(即可包括禽类核酸和来自禽类内其它来源如病毒的核酸)。在本发明的一个实施方式中，提供了源自以下组织的生物学样品：禽类个体的血液、脾、肝、皮肤、卵巢、囊、胸腺、肾或羽根(Baigent et al.,(2005a)Journal of VirologicalMethods,23,53-64；Baigent et al.,(2005b)Journal of General Virology,86,2989-2998)。羽根的使用提供了从野外禽类取样的方法且其是最简单和最小侵害性的过程。
pp38基因编码在MDV发病机理中起重要作用的磷蛋白。已显示pp38基因是建立B细胞中细胞溶解感染以产生适量水平的潜在感染的T细胞和保持体内转化状态所必需的(Gimeno et al.2005)。
单核苷酸多态性(SNP)是当基因组(或其它共用序列)中单核苷酸(A、T、C或G)在物种成员之间、或者个体配对染色体之间、或者在这里是在MDV-1疫苗株和强毒株之间存在差异时出现的DNA序列变异。例如，来自不同个体的两个已测序的DNA片段AAGCCTA和AAGCTTA包含单核苷酸差异。在此情况下，我们称存在两个等位基因，即C多态性和T多态性。几乎全部常见SNP仅具有两个等位基因。
实时聚合酶链式反应，也称为定量实时聚合酶链式反应(Q-PCR/qPCR)或动力学聚合酶链式反应，是一种基于聚合酶链式反应(PCR)的技术，其用于扩增并定量靶遗传物质。qPCR能够对DNA样品中的特定序列进行检测和定量(当对DNA加入量或其它标准化基因进行标准化时，能定量拷贝的相对量或绝对量)。qPCR遵循PCR的一般程序，且具有在qPCR每个循环后实时定量正在累积的所扩增DNA的额外特征。此类定量可通过插入正在积累的DNA的荧光物质或者与所扩增DNA序列互补的核酸探针的普通方法来实现，所述核酸探针与正在积累的DNA结合时产生可检测的信号。因此，qPCR是广泛使用且十分有用的检测和定量样品中特定核酸序列的方法。qPCR方法是本领域技术人员已知的，且描述在教科书中，例如Sambrook and Russell,Molecular Cloning:a Laboratory Manual.Volumes 1,2and 3(2001,3rd Edition)。
本文提供了用于检测核酸样品中MDV-1疫苗株和/或强毒株的方法，所述方法是通过实时PCR(qPCR)的手段并使用诸如核酸探针等能够在结合qPCR期间所产生的核酸时产生可检测信号的物质。此类可检测信号可很方便地用诸如JUP等荧光染料标记探针来提供，所述荧光染料具有可在qPCR仪的VIC检测频道内检测的波长。
为了达到双重测定(即测定两种形式的待检测的核酸)中的特异性，通常需要三个水平的特异性：
(1)PCR产物特异性：在本发明中，使用与pp38基因保守区互补的通用引物对，因此CVI988和MDV-1强毒株将被相等地扩增，因而在此水平上无特异性。
(2)探针特异性：在本发明中，有良好的探针特异性，因为两种探针均最小程度地结合错配的PCR产物，而特异性结合MDV-1疫苗株或强毒株。
(3)检测器特异性：在本发明中，已知标准反应和pp38反应的检测通道之间没有交叉影响(cross talking)，因而实现检测器特异性。
在qPCR期间产生的可检测信号可通过用能够产生可检测信号的任何物质标记探针来提供，例如荧光物质，如荧光染料，如MAR、JUP、NEP、SAT、URA、FAM、HEX、TET、VIC、JOE、TAMRA、溴化乙锭、LC Green、SYBR Green I、YO-PRO-1、BEBO和SYTO9；发色团，如发色团染料，如Cy3、Cy5、Pyr(10)PC；或适用于FRET分析的发色团染料对，如染料对TOTO1和TOTO3。
在本发明的另一实施方式中，株的定量是绝对定量。在本发明的一个实施方式中，步骤(ii)的qPCR进一步包括同时进行的已知标准qPCR(标准化反应)，其使用以不同可检测信号标记的探针以使得绝对定量减毒株和/或强毒株。不同的可检测信号能够使产生的信号在qPCR仪单独的检测通道中被检测。在一个实施方式中，此标准qPCR系统为Ovo反应，其使用鸡DNA中存在的Ovo宿主基因，且可便利地使用可检测信号FAM-BHQ1(可获自诸如Eurogentec等提供商)。此标准化反应通过考虑反应中所用DNA的量而能够正确比较样品。Ovo是鸡DNA中存在的基因，且2拷贝Ovo基因相当于1个细胞，因此可使用Ovo标准曲线来计算相当于10000个细胞的Ovo Ct值。对于测试样品，使用CVI988DNA产生的标准曲线和CVI988特异性反应来计算样品中CVI988的拷贝数(来自CVI988特异性Ct值)，而使用RB-1B DNA产生的标准曲线和强毒特异性反应来计算样品中强毒MDV的拷贝数(来自强毒特异性Ct值)。使用Ovo标准曲线来计算样品中Ovo拷贝数(来自Ovo Ct值)。不同样品中Ovo拷贝数会不同(即细胞数)，因此为了能够正确地比较样品A和样品B，计算在如果样品具有10000个细胞时每个样品会有多少MDV拷贝。
使用上述核酸探针提供的信号，通过与已知标准比较能够定量出每个循环扩增的DNA的量。产生循环域值(Ct)以比较不同样品产生的DNA相对量。此Ct值是qRT-PCR循环的有效量度，其中产生的信号超过背景域值。
通过PCR反应指数期间存在的DNA相对浓度(以荧光来测量)相对于循环数绘制在对数刻度上(指数增加量将为直线)来确定此测量。确定用于检测高于背景的荧光的域值，且来自样品的荧光与域值交叉处的循环为循环域值Ct。
换句话说，Ct值定义为基于对数的荧光域值水平(观察到的高于背景水平的最低荧光)处的循环数。这是实时PCR实验(qPCR)中观察且测量的值。
在qPCR中使用每种特异性探针(一种特异于减毒疫苗株，一种特异于MDV-1强毒株)产生的可检测信号能够相对地测定来自特定禽类核酸样品中疫苗株和MDV-1强毒株的各自的量。这是可能的，因为所述核酸探针具有与特异于MDV-1疫苗株或强毒株的序列互补的序列，因此其将仅结合特异株之一。在包括已知标准的本发明实施方式中，Ct值可按上述来计算，并用于绝对定量qPCR反应中产生的特定病毒株，因此比较每种株的量是可能的。
在本发明的一个实施方式中，MDV-1疫苗株是减毒疫苗，且在另一实施方式中，疫苗株是减毒疫苗CVI988。
病毒疫苗是病毒的死亡、灭活或减毒形式或者是源自它们的纯化产物，且被施用至对象以诱导对此病毒的免疫应答，而此对象不经历由病毒强毒形式通常引起的负面作用或疾病。在此免疫应答后，对象中产生抵抗强毒形式病原的免疫力。
可使用若干类型的疫苗，它们代表用于尝试降低疾病风险，同时保持诱导有利的免疫应答的能力的不同策略。常用的病毒疫苗分为灭活菌苗、减毒疫苗、类毒素疫苗、亚单位疫苗和缀合疫苗。
减毒疫苗包含活的减毒病毒，这些是可复制的活病毒。它们以非强毒形式天然存在，或者在使它们强毒性质丧失的条件下培养，或者使用密切相关但危险性较低的生物体以产生宽的免疫应答。它们通常引起比其它疫苗形式更持久的免疫学应答。
在本发明的一个实施方式中，探针与包含SNP周围多至30个碱基对的区域的pp38序列互补。
在本发明的具体实施方式中，探针在较长的序列内可含有以下序列或其片段，或者仅包含以下序列或其片段：
疫苗株特异性探针：5’CCCACCGTGACAGCC3’；
强毒株特异性探针：5’CCCACTGTGACAGCC3’；或
第二强毒株特异性探针：5’CTCCCACTGTGACAGCC3。
在本发明的另一方面，提供了一种方法，其中步骤(ii)的qPCR进一步包括在步骤(ii)中使用能够检测疫苗株和强毒株的“总”核酸探针。此总探针可用作对照，由总探针检测的病毒量应等于疫苗特异性探针和强毒特异性探针在它们特异性qPCR中所检测的病毒总和。
在本发明的具体方面中，特异于两种株的总探针在较长的序列内可含有以下序列或其片段，或者仅包含以下序列或其片段：
5’GCTACCGCCTGAGCC3’。
qPCR中所用的引物会扩增包含所述单核苷酸多态性的区域，因此可与上述任一核酸探针联用。在本发明的优选实施方式中，核酸样品扩增中所用的正向和反向引物在较长的序列内可含有以下序列或其片段，或者仅包含以下序列或其片段：
正向引物：5’GAGCTAACCGGAGAGGGAGA3’；
反向引物：5’CGCATACCGACTTTCGTCAA3’。
本发明的多核苷酸也提供多核苷酸，其包括基本等同于上述多核苷酸的核苷酸序列。根据本发明的多核苷酸可具有与上述多核苷酸例如至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、81％、82％、83％、84％，更特别地至少约85％、86％、87％、88％、89％，更特别地至少约90％、91％、92％、93％、94％，且甚至更特别地至少约95％、96％、97％、98％、99％的序列相同性。
本发明的多核苷酸另外包括上述任一多核苷酸的互补序列(complement)。所述多核苷酸可为DNA(基因组DNA、cDNA、扩增或合成的DNA)或RNA。用于获得这样的多核苷酸的方法和算法是本领域技术人员已知的，且可包括例如用于确定能够常规分离具有所需序列相同性的多核苷酸的杂交条件的方法。
本发明所用的寡核苷酸可通过本领域技术人员已知的方法制备，且描述在教科书中，例如Ch10Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook and Russell 2001)。
如所讨论的，所用探针的特异性是由于pp38基因中在MDV-1减毒株和强毒株之间具有一致性的单核苷酸多态性(SNP)。在本发明的实施方式中，用于检测此SNP的探针为包含两种相同报告染料的同标记(homolabelled)荧光探针，所述染料能够彼此淬灭而在探针裂解时变为去淬灭。优选地，此类探针为AllGlo小型探针(AlleLogic Biosciences Corp,Hayward,CA)。
AllGlo小型探针是新型同标记荧光探针。与常规双标记的Taqman探针不同，AllGlo小型探针包括两个相同的报告染料，所述染料能够彼此淬灭且在探针裂解时变为去淬灭。因此，探针裂解导致每个探针释放出两个产生信号的染料，与Taqman探针相比增加了检测灵敏度。
AllGlo小型探针显著短于常规双标记探针(如15-16个核苷酸)。缩短的长度使得更有效淬灭且导致低荧光基线。特异性高于Taqman探针的特异性，使得AllGlo小型探针可检测单点突变。AllGlo小型探针优选与可获得自Allelogic Biosciences的染料MAR、JUP、NEP、SAT或URA联用。
在本发明一个实施方式中，强毒MDV-1株选自RB1B MDV、584AMDV、595MDV、684A MDV、Md5MDV、HPRS-B14MDV、JM102MDV、660A MDV、675A MDV、549MDV、571MDV或C12-130MDV。
一方面，本发明的方法可用于诊断禽类中强毒MDV-1的感染，无论所述禽类之前是否已经接种过例如减毒疫苗株。因为本发明的方法能够同时监测疫苗株和强毒株的情况，所以其在诸如鉴定疫苗失效原因的情况下可作为所选的诊断方法，且另一方面，此方法可用作开发和/或测试MDV-1疫苗中的研究工具。此方法尤其可用于下述普通情况，即在对各种株进行测试前，尚不知道是否禽类被疫苗和强毒株两者均感染。
在一个实施方式中，本发明可作为试剂盒提供，所述试剂盒包括：
(i)引物，其扩增包含在MDV-1疫苗株和强毒株之间具有一致性的单核苷酸多态性(SNP)的pp38基因区域；和
(ii)针对特异于MDV-1疫苗株的pp38多态性的标记的核酸探针。
在另一个实施方式中，本发明可作为试剂盒提供，所述试剂盒包括：
(i)引物，其扩增包含在MDV-1疫苗株和强毒株之间具有一致性的单核苷酸多态性(SNP)的pp38基因区域；和
(ii)针对特异于MDV-1强毒株的pp38多态性的标记的核酸探针。
在另一个实施方式中，本发明可作为试剂盒提供，所述试剂盒包括：
(i)引物，其扩增包含在MDV-1疫苗株和强毒株之间具有一致性的单核苷酸多态性(SNP)的pp38基因区域；
(ii)针对特异于疫苗株的pp38多态性的标记的核酸探针；和
(iii)针对特异于MDV-1强毒株的pp38多态性的标记的核酸探针。
在另一个实施方式中，试剂盒可以任选地包括标准qPCR试剂和/或使用以不同可检测信号标记的探针的已知标准qPCR。在一个实施方式中，由所述试剂盒定量的疫苗株为CVI988疫苗。
在另一实施方式中，试剂盒的核酸探针在较长的序列内可含有以下序列或其片段，或者仅包含以下序列或其片段：
疫苗株特异性探针：5’CCCACCGTGACAGCC3’；和/或
强毒株特异性探针：5’CCCACTGTGACAGCC3’。
试剂盒可进一步包括与疫苗株和强毒株均结合的总探针，在一个实施方式中，所述总探针具有以下序列：
5’GCTACCGCCTGAGCC3’。
附图说明
现将参照以下附图描述体现本发明某些方面的实施例，其中：
图1：(a)CVI988(疫苗株)和(b)Md5(代表性强毒株)的pp38基因中引物(黑体下划线)和探针(黑体加框)的结合位置。结合具有一致性的多态性G/A的探针为特异性探针，其它探针为总探针。G/A多态性在全部强毒株中不具有一致性。
图2：通过绘制荧光相对qPCR循环数的变化，显示两种小型探针各自对(a)CVI988(疫苗株)和(b)RB1B(代表性强毒株)的特异性。
图3：显示以下qPCR反应中产生的Ct值相对受感染鸡胚成纤维细胞(CEF)拷贝数的DNA标准曲线：(a)CVI988(疫苗株)探针和来自CVI988(疫苗株)感染CEF的核酸；(b)RB1B(代表性强毒株)探针和来自RB1B(代表性强毒株)感染CEF的核酸；(c)双重特异性探针和来自CVI988(疫苗株)感染CEF的核酸；和(d)双重特异性探针和来自RB1B(代表性强毒株)感染CEF的核酸。通过利用已知拷贝数的质粒DNA产生的荧光结果校准所产生的荧光结果来得到拷贝数值。
图4：显示核酸探针的特异性，所述探针针对MDV-血清型-3疫苗HVT、MDV-血清型-2疫苗SB-1、3种不同来源的MDV-1疫苗CVI988、和针对在MDV-1的12种不同强毒株内具有不同毒力的MDV-1强毒株。显示了每种MDV-1株的血清型(1、2或3)和致病型(v、vv或vv+)。(v＝毒力，vv＝高毒力，vv+＝非常高毒力+)。
图5：标准曲线，其由使用FAM-BHQ1标记的Ovo探针和校准的连续稀释的未感染鸡胚成纤维细胞(CEF)DNA进行的Ovo qPCR反应产生。
图6：MDV-1的基因图，和CVI988疫苗和RB1B攻击病毒内关键pp38和US2基因的位置。
图7：在以下qPCR反应中产生的感染细胞拷贝数的Ct值标准曲线与来自BAC/US2qPCR方法中的等价反应的Ct值标准曲线比较：(a)CVI988(疫苗株)探针和来自CVI988(疫苗株)感染CEF的核酸；(b)RB1B(代表性强毒株)探针和来自RB1B(代表性强毒株)感染CEF的核酸。
图8：使用特异于以下病毒的qPCR系统产生的40只禽的拷贝数：BAC克隆的疫苗病毒(柱1)、强毒/攻击病毒(柱2)和总病毒(柱3)，且对于每种病毒，将本发明qPCR与基于BAC/US2的qPCR比较。标明禽类是否属于以下4组：1)未接种，未攻击；2)接种，未攻击；3)接种，攻击；和4)未接种，攻击。
图9：对于(a)疫苗病毒和(b)强毒病毒，本发明qPCR和BAC/US2 qPCR系统之间测量的病毒水平相关性。
图10：(a)总(双重特异性)qPCR测量的病毒水平和本发明疫苗特异性和强毒特异性qPCR测量的病毒水平加和结果之间的相关性；(b)本发明疫苗特异性和强毒特异性qPCR测量的病毒水平的加和结果和BAC/US2qPCR系统测量的病毒水平的加和结果之间相关性，和(c)本发明总(双重特异性)qPCR测量的病毒水平和BAC/US2 qPCR系统测量的病毒水平的加和结果之间的相关性。
具体实施方式
实施例1：qPCR引物和探针的设计
MDV pp38基因序列在减毒疫苗CVI988和Md5(强毒株)之间显示出两个单核苷酸差异(图1)。多态性(G/A)(大黑体下划线)代表MDV-1疫苗病毒和我们拥有序列的所有MDV-1强毒病毒(RB1B MDV、584A MDV、595MDV、684A MDV、Md5MDV、HPRS-B14MDV、JM102MDV、660AMDV、675A MDV、549MDV、571MDV、C12-130MDV)之间的一致性的差异，此为包含于所述特异性探针的多态性。多态性(G/A)(黑斜体下划线)不是一致性地在全部强毒病毒株中存在。表1列出了为覆盖多态性区域设计出的引物序列以及两种探针(pp38Vacc_G_JUP，特异于减毒疫苗CVI988；和pp38Vir_A_JUP(1)，特异于强毒病毒)。也设计了第三探针pp38-total_JUP，其靶向全部MDV-1株的pp38的共有区域。全部三种探针可与相同引物对组合使用(见表1)。
表1还显示了所设计出的特异性靶向强毒病毒的第二探针(pp38Vir_A_JUP(3))，其使得疫苗特异性探针、强毒特异性探针和总pp38探针均具有类似的解链温度。pp38Vir_A_JUP(3)的性能十分类似于pp38Vir_A_JUP(1)(另一强毒株特异性探针)的性能；然而由于其涵盖第二“非一致性”多态性位点，有可能对一些野生株的亲和性会降低(见图1和表1)。探针用染料JUP(AlleLogic Biosciences)标记，其在实时PCR仪的VIC检测通道中检测。
表1
引物和探针由AlleLogic Biosciences,Hayward,CA,USA设计并制造。
实施例2：鸡胚成纤维细胞(CEF)的感染
鸡胚成纤维细胞(CEF)用MDV-1的CVI988疫苗株或RB1B强毒株感染。感染后5天，从这些细胞中制备连续稀释以用于单一(singleplex)qPCR。
在75cm2培养烧瓶中建立CEF(鸡胚成纤维细胞)细胞单层，并用约1000个菌斑形成单位(pfu)的细胞相关病毒感染。在38℃培养5天后，收集细胞，并使用酚-氯仿抽提法制备DNA。反应为25ul体积且包含：Absolute Blue qPCR mastermix(ABgene)、每种引物400nM(即Ovo引物+病毒特异性引物)、每种探针200nM(即Ovo探针+病毒特异性探针)、约100ng DNA样品。反应在ABI7500实时PCR仪中进行，循环参数如下：50℃持续2min，95℃持续15min，随后在95℃(15sec)和60℃(1min)下进行40个循环。
实施例3：qPCR的特异性：单一反应
基本上如前所述建立反应(Baigent et al.,2005a)，每个反应包含‘ABsolute q-PCR master mix’(ABgene,Epsom,UK)、正向和反向引物以及所述探针之一。使用ABIq-PCR系统(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)扩增并检测反应产物，条件如下：50℃持续2min，95℃持续15min，随后在95℃(15sec)和60℃(1min)下进行40个循环。表2显示了对于每个单一qPCR的引物和探针的组合。
表2
使用由CVI988或RB1B(MDV-1强毒株)感染后5天的鸡胚成纤维细胞(CEF)制备的10倍连续稀释的DNA来首先评价探针的特异性。
图2说明了使用来自CVI988或RBIB(强毒株)的核酸模板或者无模板的对照，由(a)CVI988特异性探针和(b)强毒特异性探针产生的荧光变化。数据清楚表明仅当qPCR中使用核酸特异性探针时，信号以显著水平产生，因此清楚说明了探针的特异性。
实施例4：用于qPCR的标准曲线
DNA标准物从CVI988感染的CEF细胞和RB-1B感染的CEF细胞制备，且通过针对已知拷贝数的质粒DNA校准来正确定量。制备10倍连续稀释。图3(a)显示对CVI988DNA进行CVI988特异性qPCR产生的标准曲线。图3(b)显示对RB-1B DNA进行强毒特异性qPCR产生的标准曲线。图3(c)显示对CVI988DNA进行总pp38qPCR产生的标准曲线。图3(d)显示对RB-1B DNA进行总pp38qPCR产生的标准曲线。
每个反应效率很高且产生很好的标准曲线。pp38总探针检测CVI988(疫苗)DNA和RB-1B(强毒)DNA，且具有与预期类似的效率。无模板的对照孔对全部探针均为阴性。
实施例5：pp38核酸探针对一系列MDV-1株的特异性
在12种不同毒力的MDV-1株、3种不同来源MDV-1疫苗株CVI988和2种非血清型-1疫苗株上检测pp38Vir_A_JUP(强毒特异性)探针和pp38Vacc_G_JUP(CVI988疫苗特异性)探针的特异性。
阈值(ΔRn)设定为：Ovo反应(0.2)、强毒特异性pp38反应(0.6)、CVI988特异性pp38反应(0.35)、总pp38反应(0.1)。强毒特异性探针检测MDV1全部强毒株(但未检测CVI988)，而疫苗特异性探针仅检测全部3种来源的CVI988。探针均不检测MDV-2和MDV-3疫苗株SB-1和HVT。数据验证pp38Vacc_G_JUP对不同来源MDV-1疫苗CVI988株的一致特异性和pp38Vir_A_JUP对不同毒力的MDV-1强毒株的特异性。数据还显示两种探针相对于MDV-2或MDV-3株的对MDV-1株的特异性。
实施例6：绝对定量测定的调整
为了使用MiniProbe q-PCR反应来绝对定量组织样品中的疫苗和攻击病毒(表示为每104个细胞的病毒基因组)，需要最佳化双重的pp38反应和Ovo反应。Ovo探针用FAM-BHQ1标记，以在不同通道内检测pp38探针荧光。Ovo qPCR目标扩增子为71个碱基对，所用的引物和探针序列如下表3所示。引物和探针由Sigma Aldrich和Eurogentec生产。
表3
2拷贝Ovo基因相当于1个细胞，因此可使用Ovo标准曲线来计算相当于10000个细胞的Ovo Ct值。使用CVI988DNA和CVI988特异性反应来计算样品中CVI988的拷贝数(来自CVI988特异性Ct值)，同时使用RB-1B DNA和强毒特异性反应产生的标准曲线来计算样品中强毒MDV的拷贝数(来自强毒特异性Ct值)。使用Ovo标准曲线来计算样品中Ovo拷贝数(来自Ovo Ct值)。不同样品中Ovo拷贝数不同(即细胞数)，因此为了能够正确地比较样品A和样品B，计算在每个样品10000个细胞将有多少MDV拷贝。
使用已校准的非感染CEF DNA的连续稀释来制备用于Ovo反应的标准曲线，其显示在图5中。
实施例7：在鸡DNA样品上双重qPCR的测试和验证
因为引物对将扩增CVI988和强毒MDV-1DNA，所以当存在两种靶序列时，这两种靶序列将与相同引物竞争。来自实验室实验和现场的样品将包含不同比例的CVI988和强毒MDV-1。当一种病毒以高水平存在且其它病毒仅以低水平存在时，为了验证与引物的竞争不阻碍较少量病毒的扩增(和由此的检测)，检验了所述反应正确定量混合样品中CVI988和强毒MDV-1的能力。
鸡组织DNA样品取自实验，其中鸡已接种过BAC克隆的CVI988病毒(pCVI988)并用RB-1B攻击。四组鸡为(1)未接种，未攻击；(2)接种，未攻击；(3)接种，攻击；(4)未接种，攻击。在接种和攻击后的各个时间点收集脾样品。疫苗病毒为pCVI988和攻击(强毒)病毒WT RB-1B，两种病毒能通过CVI988pp38/强毒pp38系统和第二qPCR系统来区分，所述第二qPCR系统由我方开发，以区分BAC克隆的MDV(使用BAC特异性序列)和野生型MDV(通过靶向US2基因)。因此可使用后一种qPCR系统来验证CVI988pp38/强毒pp38qPCR系统。也使用pp38总反应来测量总病毒。用于验证qPCR系统的方案如表4所示且在图6的病毒基因谱上说明。
表4
表4中所示的5种病毒特异性qPCR反应分别使用Ovo qPCR一式两份进行，以绝对定量每10000个细胞中的病毒。图7(a)和7(b)显示用于两种qPCR系统来定量疫苗和强毒病毒的标准曲线。
图8显示在来自以下4组的40只禽类中测量的疫苗、攻击和总MDV的水平：1)未接种，未攻击；2)接种，未攻击；3)接种，攻击；和4)未接种，攻击。具有基线值(0.6)的样品为阴性。
前两栏显示由CVI特异性pp38qPCR(栏1)和BAC特异性qPCR(栏2)得到的疫苗病毒测量值。在两种系统中，疫苗病毒仅在两个接种组中检测到。使用两种系统获得的拷贝数值之间的一致性良好(也参见图9(a))。
栏3和栏4显示由强毒特异性pp38qPCR(栏3)和US2特异性qPCR(栏4)得到的攻击病毒测量值。在两种系统中，攻击病毒仅在两个攻击组中检测到。使用两种系统获得的拷贝数值之间的一致性良好(也参见图9(b))。
栏5、栏6和栏7显示由测量两种病毒的pp38qPCR得到的总MDV测量值(栏5)、来自CVI特异性pp38qPCR和强毒特异性pp38qPCR的加和结果(栏6)、和来自BAC特异性qPCR和US2特异性qPCR的加和结果(栏7)。使用这三种系统获得的拷贝数值之间的一致性良好(也参见图10(a)、(b)和(c))。
这些数据验证CVI-pp38qPCR和强毒MDV1-pp38qPCR显示出优异的特异性，且可用于正确地定量包含生物学相关量的两种病毒的组织样品中的CVI988疫苗和强毒MDV-1株。
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Claims (30)
1.特异于马立克氏病病毒血清型-1(MDV-1)的疫苗株的单核苷酸多态性(SNP)的可检测的核酸探针在制备用于通过以下方法定量禽类样品中MDV-1的疫苗株的试剂盒中的用途，所述方法包括以下步骤：
(i)提供来自禽类的生物学样品；
(ii)对(i)的生物学样品进行实时定量PCR(qPCR)，其包括：
a)扩增(i)的核酸样品中的pp38基因的区域，所述区域含有在MDV-1疫苗株和强毒株之间具有一致性的SNP差异，所述SNP为位于图1(a)和1(b)中第320位的G/A多态性；和
b)使(a)的扩增的核酸接触特异于MDV-1疫苗株SNP的可检测的核酸探针；
(iii)测量由(ii)的探针产生的可检测信号的变化。
2.特异于马立克氏病病毒血清型-1(MDV-1)的强毒株的单核苷酸多态性(SNP)的可检测的核酸探针在制备用于通过以下方法定量禽类样品中MDV-1的强毒株的试剂盒中的用途，所述方法包括以下步骤：
(i)提供来自禽类的生物学样品；
(ii)对(i)的生物学样品进行实时定量PCR(qPCR)，其包括：
a)扩增(i)的核酸样品中的pp38基因的区域，所述区域含有在MDV-1疫苗株和强毒株之间具有一致性的SNP差异，所述SNP为位于图1(a)和1(b)中第320位的G/A多态性；和
b)使(a)的扩增的核酸接触特异于MDV-1强毒株SNP的可检测的核酸探针；
(iii)测量由(ii)的探针产生的可检测信号的变化。
3.特异于马立克氏病病毒血清型-1(MDV-1)的疫苗株的单核苷酸多态性(SNP)的可检测的核酸探针和特异于MDV-1的强毒株的SNP的第二核酸探针在制备用于定量禽类样品中MDV-1的疫苗株和强毒株的试剂盒中的用途，所述方法包括以下步骤：
(i)提供来自禽类的生物学样品；
(ii)对(i)的生物学样品进行实时定量PCR(qPCR)，其包括：
a)扩增(i)的核酸样品中的pp38基因的区域，所述区域含有在MDV-1疫苗株和强毒株之间具有一致性的SNP差异，所述SNP为位于图1(a)和1(b)中第320位的G/A多态性；和
b)使(a)的扩增的核酸接触特异于MDV-1疫苗株SNP的可检测的核酸探针和特异于MDV-1强毒株SNP的第二核酸探针；
(iii)测量由(ii)的每种探针产生的可检测信号的变化。
4.权利要求3的用途，其中所述方法在步骤(iii)后任选地包括以下步骤：
(iv)比较在(iii)中测得的每种特异性探针的可检测信号的变化。
5.权利要求3的用途，其中所述株的定量为相对定量。
6.前述权利要求中任一项的用途，其中所述方法任选地包括从步骤(i)的生物学样品中分离核酸并对所分离的核酸进行步骤(ii)的qPCR的步骤。
7.前述权利要求中任一项的用途，其中所述株的定量为绝对定量。
8.前述权利要求中任一项的用途，其中步骤(ii)的qPCR进一步包括同时进行已知标准qPCR，所述标准qPCR使用以不同可检测信号标记的探针以使得绝对定量所述疫苗株和/或强毒株。
9.权利要求8的用途，其中所述标准qPCR系统为使用存在于鸡DNA中的Ovo宿主基因的Ovo反应。
10.前述权利要求中任一项的用途，其中所述疫苗株为减毒疫苗株。
11.权利要求10的用途，其中所述疫苗株为CVI988疫苗。
12.前述权利要求中任一项的用途，其中所述探针与包含所述SNP周围多至30个碱基对的区域的pp38序列互补。
13.前述权利要求中任一项的用途，其中所述探针包含以下序列：
疫苗株特异性探针：5’CCCACCGTGACAGCC 3’；
强毒株特异性探针：5’CCCACTGTGACAGCC 3’；或者
第二强毒株特异性探针：5’CTCCCACTGTGACAGCC 3’。
14.前述权利要求中任一项的用途，其中步骤(ii)的qPCR进一步包括在步骤(ii)中使用能够检测疫苗株和强毒株的“总”核酸探针。
15.权利要求14的用途，其中特异于两种株的所述总探针包含以下序列：
5’GCTACCGCCTGAGCC 3’。
16.前述权利要求中任一项的用途，其中所使用的探针为包含两种相同报告染料的同标记荧光探针，所述染料能够彼此淬灭而在探针被裂解时变为去淬灭。
17.权利要求16的用途，其中所述探针为AllGlo小型探针。
18.前述权利要求中任一项的用途，其中在所述核酸样品的扩增中所使用的引物包含以下序列：
正向引物：5’GAGCTAACCGGAGAGGGAGA 3’
反向引物：5’CGCATACCGACTTTCGTCAA 3’。
19.前述权利要求中任一项的用途，其中所述MDV强毒株选自RB1B MDV、584A MDV、595 MDV、684A MDV、Md5 MDV、HPRS-B14 MDV、JM102 MDV、660A MDV、675A MDV、549 MDV、571 MDV或C12-130 MDV。
20.前述权利要求中任一项的用途，其中所提供的核酸样品源自以下组织：血液、脾、肝、皮肤、卵巢、囊、胸腺、肾或羽根。
21.前述权利要求中任一项的用途，其中所述可检测的信号包括荧光物质，如荧光染料或发色团。
22.权利要求21的用途，其中所述荧光物质包括选自MAR、JUP、NEP、SAT、URA的染料。
23.权利要求22的用途，其中所述可检测的信号为染料JUP。
24.前述权利要求中任一项的用途，其包括在鉴定MDV-1疫苗防止MDV-1强毒株感染失败原因、在研发或测试来自禽类样品中包含MDV-1强毒株和疫苗株的量的MDV-1疫苗中的应用。
25.试剂盒，包括：
(i)引物，所述引物扩增包含在MDV-1疫苗株和强毒株之间具有一致性的单核苷酸多态性(SNP)的pp38基因差异的区域，所述SNP为位于图1(a)和1(b)中第320位的G/A多态性；
(ii)针对特异于疫苗株的pp38多态性的标记的核酸探针；和
(iii)针对特异于MDV-1强毒株的pp38多态性的标记的核酸探针，
其中所述核酸探针包含以下序列：
疫苗株特异性探针：5’CCCACCGTGACAGCC 3’；和/或
强毒株特异性探针：5’CCCACTGTGACAGCC 3’。
26.权利要求25的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括标准qPCR试剂。
27.权利要求25或26的试剂盒，其进一步包括已知标准qPCR所需的试剂，所述标准qPCR使用以不同可检测信号标记的探针。
28.权利要求25-27中任一项的试剂盒，其中所述疫苗株为CVI988疫苗。
29.权利要求25-28中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括结合疫苗株和强毒株的总探针。
30.权利要求29的试剂盒，其中所述总探针包含以下序列：
5’GCTACCGCCTGAGCC 3’。
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