JP6025562B2 - Ｍｄｖ−１に関するアッセイ法 - Google Patents

Description

本発明は、アッセイ法に、そして特に、鳥類由来の試料におけるウイルス、特にマレック病ウイルス血清型１型（ＭＤＶ−１）のワクチン株レベルおよび毒性株レベルを分析するための方法に関する。

マレック病ウイルス（ＭＤＶ）は、ニワトリにおいてリンパ増殖性疾患を引き起こすヘルペスウイルスである。ＭＤＶに対するワクチンの導入後であっても、感染はなお、家禽産業にかなりの損失を引き起こす。ＭＤＶは３つの血清型に分けられ、これらはすべて潜在性感染を確立する。血清型１型には、発癌性ウイルスが含まれ、血清型２型には非発癌性ウイルスが含まれ、そして血清型３型には七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）が含まれる（Ｂｕｅｌｏｗら（１９７６） Ｚｅｎｔｒａｌｂｌａｔｔ ｆｕｅｒ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｍｅｄｉｚｉｎ，２３Ｂ，３９１−４０２）。

Ｈａｎｄｂｅｒｇら（２００１） Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３０：２４３−２４９は、ニワトリにおけるＭＤＶ検出のための血清型１型および血清型３型特異的ＰＣＲの使用を記載する。組織試料は、血液（バフィーコート細胞）、脾臓、肝臓、皮膚、羽毛先端および卵巣から採取された。

天然弱毒化ＭＤＶ血清型１型（ＭＤＶ−１）であるＣＶＩ９８８（Ｒｉｓｐｅｎｓ）株が、１９９０年代半ばに紹介され（Ｒｉｓｐｅｎｓら，（１９７２） Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１６，１０８−１２５；ｄｅ Ｂｏｅｒら，（１９８６） Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，３０，２７６−２８３）、そしてこの株は、現在まで、ＭＤＶに対する最も有効なワクチンである。しかし、ワクチン接種プログラムを踏まえてもなお、ＭＤＶ大流行は、かなりの損失を引き起こし続けている。これらの大流行は、母親由来抗体によるワクチンウイルス複製の阻害（Ｋｉｎｇら，（１９８１） Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２５，７４−８１；ｄｅ Ｂｏｅｒら，（１９８６）上記）；環境ストレスによる、ワクチンに対する免疫応答の抑制、または免疫抑制病原体との同時感染；完全なワクチン免疫が確立される前の毒性ＭＤＶ株への感染；ワクチン接種されそして完全に免疫適格性である鳥類の強毒性（hypervirulent）ＭＤＶ株への感染（Ｗｉｔｔｅｒら，（２００５） Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３４，７５−９０）；そして最後に、防御免疫を誘導不能な不十分なワクチン用量の投与を含む、いくつかの原因によって引き起こされている可能性もある。

こうしたものとして、実験的および商業的理由の両方のため、同じニワトリ個体において、一方または両方の測定を含めて、ＭＤＶワクチンウイルスおよび攻撃（毒性）ウイルスを個々に正確に測定可能であることが重要である。実験的には、ワクチン防御の機構およびワクチン間の効率の相違をよりよく理解する目的で、ワクチンウイルスおよび攻撃ウイルス間の相互作用を調べることが可能であることが非常に有用である。商業的には、最適以下のワクチン用量の投与（Ｌａｎｄｍａｎ＆Ｖｅｒｓｃｈｕｒｅｎ，２００３）、母親由来抗体によるワクチンウイルス複製への干渉（Ｋｉｎｇら，１９８１；ｄｅ Ｂｏｅｒら，１９８６）、および強毒性ＭＤＶ野外株への感染（Ｗｉｔｔｅｒら，２００５）など、ワクチンの失敗の原因を同定するのを補助することが重要である。

ニワトリ組織におけるＭＤＶ−１の絶対定量化のための超高感度リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ）アッセイが開発されてきており（Ｂａｉｇｅｎｔら，２００５ａ）、そして攻撃ウイルス感染の非存在下で、実験用ニワトリおよび商業用ニワトリの組織において、ＣＶＩ９８８ワクチンウイルス複製の動力学を調べるために用いられ、非常に成功してきた（Ｂａｉｇｅｎｔら，２００５ｂ，２００６）。しかし、この方法は、ＣＶＩ９８８および攻撃ウイルス間を区別不能である。他のグループが、ＭＤＶ−２（Ｒｅｎｚら，２００６）およびＭＤＶ−３（七面鳥ヘルペスウイルス）（Ｉｓｌａｍら，２００６ａ）を定量化するリアルタイムＰＣＲアッセイを開発してきた。これらの血清型特異的アッセイは、個々のニワトリにおけるワクチンおよび毒性攻撃ウイルスの両方を定量化することも可能であるが（Ｉｓｌａｍら，２００６ｂ）、攻撃ウイルス（常にＭＤＶ−１）は、ワクチンウイルス（ＭＤＶ−２または３）に対して異なる血清型のものである。

しかし、最も広く用いられ、そして有効であるＭＤＶワクチンは、天然弱毒化血清型１型株（ＣＶＩ９８８，Ｒｉｓｐｅｎｓ）（Ｒｉｓｐｅｎｓら，１９７２；ｄｅ Ｂｏｅｒら，１９８６）であり、そして攻撃ウイルスと血清型１型１ワクチンウイルス間の配列相違が非常に限定されているため、今日まで、血清型１型ワクチンウイルスから攻撃ウイルスを区別するリアルタイムＰＣＲは可能とはなっていない。１３２ｂｐ反復領域における反復の数の相違を用い、慣用的なＰＣＲを用いて、毒性株からＣＶＩ９８８を区別することも可能である（Ｂｅｃｋｅｒら，１９９２；Ｓｉｌｖａ，１９９２）。しかし、この領域が反復性であるため、定量的ＰＣＲにおける使用が妨げられる。ｍｅｑ遺伝子およびＩＣＰ４遺伝子における相違は、ＣＶＩ９８８および毒性株間で一定していない。ＢＡＣ（細菌人工染色体）にクローニングされたＭＤＶ−１のＢＡＣ特異的配列、および野生型ＭＤＶ−１のＵＳ２遺伝子をターゲットとすることによって、ＢＡＣにクローニングされたＭＤＶ−１および野生型ＭＤＶ−１間を区別するｑＰＣＲ系もまた開発されてきており（Ｂａｉｇｅｎｔ，未発表）、これを用いてＢＡＣにクローニングされたワクチン株および野生型毒性株間を区別することも可能であるが、こうしたワクチン株がＢＡＣにクローニングされている場合に限られる。重要なことに、商業的ＭＤＶ−１ワクチンでＢＡＣにクローニングされているものはないため、こうした方法は、商業的には使用不能である。

ｐｐ３８遺伝子は、ＭＤＶ−１のＣＶＩ９８８ワクチン株および毒性株間で、一貫した単一ヌクレオチド相違を示すが、こうした小さい相違を区別可能なｑ−ＰＣＲプライマーを設計することは困難である。

Ｂｕｅｌｏｗら（１９７６） Ｚｅｎｔｒａｌｂｌａｔｔ ｆｕｅｒ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｍｅｄｉｚｉｎ，２３Ｂ，３９１−４０２ Ｈａｎｄｂｅｒｇら（２００１） Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ３０：２４３−２４９ Ｒｉｓｐｅｎｓら，（１９７２） Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１６，１０８−１２５ ｄｅ Ｂｏｅｒら，（１９８６） Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，３０，２７６−２８３ Ｋｉｎｇら，（１９８１） Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２５，７４−８１ Ｗｉｔｔｅｒら，（２００５） Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３４，７５−９０ Ｌａｎｄｍａｎ＆Ｖｅｒｓｃｈｕｒｅｎ，２００３ Ｂａｉｇｅｎｔら，２００５ａ Ｂａｉｇｅｎｔら，２００５ｂ Ｂａｉｇｅｎｔら，２００６ Ｒｅｎｚら，２００６ Ｉｓｌａｍら，２００６ａ Ｉｓｌａｍら，２００６ｂ Ｂｅｃｋｅｒら，１９９２ Ｓｉｌｖａ，１９９２

本発明は、ｐｐ３８遺伝子における単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に基づいて、鳥類におけるマレック病ウイルス血清型１型のワクチン株および／または毒性ＭＤＶ−１株を定量化するための方法を提供する。これらの方法にはまた、ワクチン株および毒性株の相対量および／または絶対量の定量化、ならびに各株のコピー数の決定のための方法も含まれる。

本発明の特定の側面を具体化する例を、ここで、以下の図に関連して記載する：

図１は、（ａ）ＣＩＶ９８８（ワクチン株）および（ｂ）Ｍｄ５（代表的な毒性株）に関するｐｐ３８遺伝子中のプライマー（太字下線）およびプローブ（太字囲み）の結合位置を示す。一貫した多型Ｇ／Ａに結合するプローブは特異的プローブであり、もう一方のプローブは総合プローブである。Ｇ／Ａ多型はすべての毒性株においては一貫していない。 図１は、（ａ）ＣＩＶ９８８（ワクチン株）および（ｂ）Ｍｄ５（代表的な毒性株）に関するｐｐ３８遺伝子中のプライマー（太字下線）およびプローブ（太字囲み）の結合位置を示す。一貫した多型Ｇ／Ａに結合するプローブは特異的プローブであり、もう一方のプローブは総合プローブである。Ｇ／Ａ多型はすべての毒性株においては一貫していない。 図２は、ｑＰＣＲの周期数に対して蛍光変化をプロットすることによって、（ａ）ＣＶＩ９８８（ワクチン株）および（ｂ）ＲＢ１Ｂ（代表的な毒性株）に関する２つのミニプローブ各々の特異性を示す。 図３は、以下のｑＰＣＲ反応に関して生成された感染ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）のコピー数に対するＣｔ値のＤＮＡ標準曲線を示す：（ａ）ＣＶＩ９８８（ワクチン株）プローブとＣＶＩ９８８（ワクチン株）感染ＣＥＦ由来の核酸；（ｂ）ＲＢ１Ｂ（代表的な毒性株）プローブとＲＢ１Ｂ（代表的な毒性株）感染ＣＥＦ由来の核酸；（ｃ）二重特異性プローブとＣＶＩ９８８（ワクチン株）感染ＣＥＦ由来の核酸；および（ｂ）二重特異性プローブとＲＢ１Ｂ（代表的な毒性株）感染ＣＥＦ由来の核酸。既知のコピー数のプラスミドＤＮＡから生成された蛍光結果で、生成された蛍光結果を較正することによって、コピー数値を生成した。 図３は、以下のｑＰＣＲ反応に関して生成された感染ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）のコピー数に対するＣｔ値のＤＮＡ標準曲線を示す：（ａ）ＣＶＩ９８８（ワクチン株）プローブとＣＶＩ９８８（ワクチン株）感染ＣＥＦ由来の核酸；（ｂ）ＲＢ１Ｂ（代表的な毒性株）プローブとＲＢ１Ｂ（代表的な毒性株）感染ＣＥＦ由来の核酸；（ｃ）二重特異性プローブとＣＶＩ９８８（ワクチン株）感染ＣＥＦ由来の核酸；および（ｂ）二重特異性プローブとＲＢ１Ｂ（代表的な毒性株）感染ＣＥＦ由来の核酸。既知のコピー数のプラスミドＤＮＡから生成された蛍光結果で、生成された蛍光結果を較正することによって、コピー数値を生成した。 図４は、ＭＤＶ血清型３型ワクチンＨＶＴ、ＭＤＶ血清型２型ワクチンＳＢ−１、３つの異なる供給源のＭＤＶ−１ワクチンＣＶＩ９８８、およびＭＤＶ−１の様々な１２の異なる毒性株にわたる多様な毒性のＭＤＶ−１毒性株、に対する核酸プローブの特異性を示す。ＭＤＶ−１株の各々に関して、血清型（１型、２型または３型）および病原型（ｖ型、ｖｖ型またはｖｖ＋型）を示す（ｖ＝毒性、ｖｖ＝非常に毒性、ｖｖ＋＝非常に毒性＋）。 図５は、ＦＡＭ−ＢＨＱ１で標識したＯｖｏプローブおよび非感染ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）ＤＮＡの較正連続希釈を用いて、Ｏｖｏ ｑＰＣＲ反応に関して生成された標準曲線を示す。 図６は、ＭＤＶ−１の遺伝子マップ、ならびにＣＶＩ９８８ワクチンおよびＲＢ１Ｂ攻撃ウイルス内の重要なｐｐ３８およびＵＳ２遺伝子の位置を示す。 図６は、ＭＤＶ−１の遺伝子マップ、ならびにＣＶＩ９８８ワクチンおよびＲＢ１Ｂ攻撃ウイルス内の重要なｐｐ３８およびＵＳ２遺伝子の位置を示す。 図７は、ＢＡＣ／ＵＳ２ ｑＰＣＲ法における同等の反応から生成されたものと比較した、以下のｑＰＣＲ反応において生成された感染細胞のコピー数に対するＣｔ値の標準曲線の比較を示す：（ａ）ＣＶＩ９８８（ワクチン株）プローブとＣＶＩ９８８（ワクチン株）感染ＣＥＦ由来の核酸；（ｂ）ＲＢ１Ｂ（代表的な毒性株）プローブとＲＢ１Ｂ（代表的な毒性株）感染ＣＥＦ由来の核酸。 図８は、ＢＡＣにクローニングされたワクチンウイルス（第１列）、毒性／攻撃ウイルス（第２列）および総ウイルス（第３列）に特異的なｑＰＣＲ系を用いて、４０羽の鳥類に関して生成されたコピー数を示し、そして各々に関して本発明のｑＰＣＲ発明対ＢＡＣ／ＵＳ２に基づくｑＰＣＲを比較する。鳥類は、これらが以下の４群に属するかどうかに関して示される：１）非ワクチン接種、非攻撃；２）ワクチン接種、非攻撃；３）ワクチン接種、攻撃；および４）非ワクチン接種、攻撃。 図９は、（ａ）ワクチンウイルスおよび（ｂ）毒性ウイルスに関する本発明のｑＰＣＲおよびＢＡＣ／ＵＳ２ ｑＰＣＲ系間で測定されたウイルスレベルの相関を示す。 図１０は、（ａ）本発明の総合（二重特異的）ｑＰＣＲ、ならびにｑＰＣＲに関するワクチン特異的および毒性特異的なものの付加的結果の間での測定されたウイルスレベルの相関；（ｂ）本発明のｑＰＣＲに関するワクチン特異的および毒性特異的なものの付加的結果、ならびにＢＡＣ／ＵＳ２ ｑＰＣＲ系の付加的結果の間での測定されたウイルスレベルの相関；ならびに（ｃ）本発明の総合（二重特異的）ｑＰＣＲおよびＢＡＣ／ＵＳ２ ｑＰＣＲ系の付加的結果の間での測定されたウイルスレベル間の相関を示す。 図１０は、（ａ）本発明の総合（二重特異的）ｑＰＣＲ、ならびにｑＰＣＲに関するワクチン特異的および毒性特異的なものの付加的結果の間での測定されたウイルスレベルの相関；（ｂ）本発明のｑＰＣＲに関するワクチン特異的および毒性特異的なものの付加的結果、ならびにＢＡＣ／ＵＳ２ ｑＰＣＲ系の付加的結果の間での測定されたウイルスレベルの相関；ならびに（ｃ）本発明の総合（二重特異的）ｑＰＣＲおよびＢＡＣ／ＵＳ２ ｑＰＣＲ系の付加的結果の間での測定されたウイルスレベル間の相関を示す。

第一の側面において、本発明は、鳥類由来の試料における、マレック病ウイルス血清型１型（ＭＤＶ−１）のワクチン株定量化のための方法であって：
（ｉ）鳥類由来の生物学的試料を提供し；
（ｉｉ）（ｉ）の生物学的試料を：
（ａ）（ｉ）の核酸試料内の、ＭＤＶ−１のワクチン株および毒性株間の一貫した単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）相違を含有するｐｐ３８遺伝子領域を増幅し；そして
（ｂ）（ａ）の増幅された核酸と、ＭＤＶ−１の毒性株のＳＮＰに特異的な検出可能核酸プローブを接触させる；
工程を含むリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に供し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のプローブによって生成される検出可能シグナルの変化を測定する；
工程を含む、前記方法を提供する。

第二の側面において、本発明は、鳥類由来の試料における、マレック病ウイルス血清型１型（ＭＤＶ−１）の毒性株定量化のための方法であって：
（ｉ）鳥類由来の生物学的試料を提供し；
（ｉｉ）（ｉ）の生物学的試料を：
（ａ）（ｉ）の核酸試料内の、ＭＤＶ−１のワクチン株および毒性株間の一貫した単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）相違を含有するｐｐ３８遺伝子領域を増幅し；そして
（ｂ）（ａ）の増幅された核酸と、ＭＤＶ−１の毒性株のＳＮＰに特異的な検出可能な核酸プローブを接触させる；
工程を含むリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に供し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のプローブによって生成される検出可能シグナルの変化を測定する；
工程を含む、前記方法を提供する。

第三の側面において、本発明は、鳥類由来の試料における、マレック病ウイルス血清型１型（ＭＤＶ−１）のワクチン株および毒性株定量化のための方法であって：
（ｉ）鳥類由来の生物学的試料を提供し；
（ｉｉ）（ｉ）の生物学的試料を：
（ａ）（ｉ）の核酸試料内の、ＭＤＶ−１のワクチン株および毒性株間の一貫した単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）相違を含有するｐｐ３８遺伝子領域を増幅し；そして
（ｂ）（ａ）の増幅された核酸と、ＭＤＶ−１のワクチン株のＳＮＰに特異的な検出可能核酸プローブおよび毒性株のＳＮＰに特異的な第二の核酸プローブを接触させる；
工程を含むリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に供し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の各プローブによって生成される検出可能シグナルの変化を測定し；そして場合によって
（ｉｖ）各特異的プローブに関して（ｉｉｉ）で測定した検出可能シグナルの変化を比較する；
工程を含む、前記方法を提供する。

本発明の１つの態様において、毒性株およびワクチン株の定量化は相対的定量化であってもよい。
本発明の方法には、工程（ｉ）の生物学的試料から核酸を単離し、そして単離された核酸を工程（ｉｉｉ）のｑＰＣＲに供する工程が場合によって含まれてもよい。

鳥類から提供される生物学的試料は、鳥類核酸または鳥類から単離されるような核酸を含みうる（すなわち、鳥類核酸および鳥類内の他の供給源、例えばウイルス由来の核酸の両方を含みうる）。本発明の１つの態様において、提供される生物学的試料は、以下の組織：鳥類個体の血液、脾臓、肝臓、皮膚、卵巣、ブルサ（bursa）、胸腺、腎臓または羽毛先端由来である（Ｂａｉｇｅｎｔら，（２００５ａ） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３，５３−６４；Ｂａｉｇｅｎｔら，（２００５ｂ） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８６，２９８９−２９９８）。羽毛先端の使用は、野外の鳥類からの試料採取手段を提供し、そして最も単純で、そして最も侵襲性でない処置である。

ｐｐ３８遺伝子は、ＭＤＶの発病に重要な役割を果たすリン酸化タンパク質である。ｐｐ３８遺伝子は、Ｂ細胞において細胞溶解性感染を確立して、適切なレベルの潜在感染Ｔ細胞を産生し、そしてｉｎ ｖｉｖｏで形質転換状態を維持するのに必要であることが示されてきている（Ｇｉｍｅｎｏら ２００５）。

単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、ゲノム（または他の共有される配列）中の単一のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）が、種のメンバー間で、または個体における対の染色体間で、またはこの場合、ＭＤＶ−１のワクチン株および毒性株間で異なる場合に生じるＤＮＡ配列変異である。例えば、異なる個体由来の２つの配列決定されたＤＮＡ断片、ＡＡＧＣＣＴＡとＡＡＧＣＴＴＡは、単一のヌクレオチドに相違を含有する。この場合、本発明者らは、２つのアレル、Ｃ多型およびＴ多型があると称する。ほぼすべての一般的なＳＮＰは２つのアレルのみを有する。

リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応はまた、定量的リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ／ｑＰＣＲ）または動態（kinetic）ポリメラーゼ連鎖反応とも呼ばれ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく技術であり、そしてターゲット遺伝物質を増幅しそしてかつ定量化するために用いられる。ｑＰＣＲは、ＤＮＡ試料中の特定の配列の検出および定量化（相対量、あるいはＤＮＡ投入量またはさらなる規準化遺伝子に対して規準化された場合、絶対コピー数）の両方を可能にする。ｑＰＣＲは、ＰＣＲの一般的な方法にしたがうが、ｑＰＣＲの毎周期後に、集積中の増幅されたＤＮＡをリアルタイムで定量化するさらなる特徴を持つ。こうした定量化は、集積中のＤＮＡに挿入される蛍光剤、または集積中のＤＮＡとの結合に際して検出可能なシグナルを生成する、増幅されたＤＮＡ配列に相補的な修飾核酸プローブの一般的な方法によって達成可能である。したがって、ｑＰＣＲは、試料における特定の核酸配列を検出し、そして定量化する、広く用いられ、そして非常に有用な方法である。ｑＰＣＲの方法は、当業者に周知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第１巻、第２巻および第３巻（２００１，第３版）などの教科書に記載されている。

ここで、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の手段を通じて、そしてｑＰＣＲ中に生成される核酸との結合に際して、検出可能なシグナルを生成可能な核酸プローブなどの剤を用いて、核酸試料におけるＭＤＶ−１のワクチン株および／または毒性株を検出するための方法を提供する。ｑＰＣＲ装置のＶＩＣ検出チャネルにおいて検出可能な波長を有するＪＵＰなどの蛍光色素で、プローブを標識することによって、こうした検出可能シグナルを好適に提供可能である。

二重アッセイ（すなわち検出しようとする核酸の２つの型を用いるアッセイ）において特異性を達成するため、特異性は、通常、３つのレベルで必要である：
（１）ＰＣＲ産物特異性：本発明において、ｐｐ３８遺伝子の保存された領域に相補的である普遍的プライマー対を用い、そしてその結果、ＭＤＶ−１のＣＶＩ９８８株および毒性株の両方が等しく増幅されるであろうし、そしてこうしたものとして、このレベルでは特異性はない。
（２）プローブ特異性：本発明において、どちらのプローブも、ミスマッチＰＣＲ産物に最小限に結合し、その代わりにＭＤＶ−１のワクチン株または毒性株いずれかに特異的に結合するため、優れたプローブ特異性がある。
（３）検出装置特異性：本発明において、既知の標準反応およびｐｐ３８反応の検出チャネル間にクロストーキングはなく、そしてこうしたものとして、検出装置特異性が達成される。

ｑＰＣＲ中に生成される検出可能シグナルは、蛍光剤、例えば蛍光色素、例えばＭＡＲ、ＪＵＰ、ＮＥＰ、ＳＡＴ、ＵＲＡ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、エチジウムブロミド、ＬＣグリーン、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＢＥＢＯおよびＳＹＴＯ９；発色団、例えば発色団色素、例えばＣｙ３、Ｃｙ５、Ｐｙｒ（１０）ＰＣ；またはＦＲＥＴ分析で使用するのに適した発色団色素対、例えば色素対ＴＯＴＯ１およびＴＯＴＯ３、などの検出可能シグナルを生成可能な任意の剤でプローブを標識することによって、提供可能である。

本発明のさらなる態様において、株（単数または複数）の定量化は絶対定量化である。本発明の１つの態様において、工程（ｉｉ）のｑＰＣＲは、弱毒化株および／または毒性株の絶対定量化を可能にする異なる検出可能シグナルで標識されたプローブを利用して、同時に行う（concomitant）既知の標準ｑＰＣＲ（規準化反応）をさらに含む。異なる検出可能シグナルは、生成されるシグナルが、ｑＰＣＲ装置の別個の検出チャネルにおいて検出されることを可能にする。１つの態様において、この標準ｑＰＣＲ系は、ニワトリＤＮＡ中に存在するＯｖｏ宿主遺伝子を用いるＯｖｏ反応であり、そして好適に、検出可能シグナルＦＡＭ−ＢＨＱ１（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃなどの供給業者より入手可能）を用いてもよい。こうした標準化反応は、反応中で用いられるＤＮＡ量を考慮することによって、試料の正確な比較を可能にする。Ｏｖｏは、ニワトリＤＮＡ中に存在する遺伝子であり、そして２コピーのＯｖｏ遺伝子は１細胞に同等であり、したがって、Ｏｖｏ標準曲線を用いて、１００００細胞に同等であるＯｖｏ Ｃｔ値を計算することも可能である。試験試料に関して、ＣＶＩ９８８ ＤＮＡおよびＣＶＩ９８８特異的反応を用いて生成される標準曲線を用いて、試料中のＣＶＩ９８８のコピー数を計算し（ＣＶＩ９８８特異的Ｃｔ値から）、一方、ＲＢ−１Ｂ ＤＮＡおよび毒性特異的反応を用いて生成される標準曲線を用いて、試料中の毒性ＭＤＶのコピー数を計算する（毒性特異的Ｃｔ値から）。Ｏｖｏ標準曲線を用いて、試料中のＯｖｏコピー数を算定する（Ｏｖｏ Ｃｔ値から）。Ｏｖｏコピー数（すなわち細胞数）は、異なる試料において異なるであろうし、したがって、試料Ａと試料Ｂを正確に比較可能にするためには、これらの試料が１０００細胞を有していたならば、各試料におけるＭＤＶコピー数はどの程度になるかを計算する。

前述の核酸プローブによって提供されるシグナルを用いて、既知の標準と比較することによって、各周期によって増幅されるＤＮＡの量を定量化可能である。周期閾値（Ｃｔ）は、異なる試料に関して生成されるＤＮＡの相対量の比較を可能にするために生成される。このＣｔ値は、生成されるシグナルがバックグラウンド閾値を越える場合、ｑＲＴ−ＰＣＲの周期の有効な測定値である。

対数スケール（したがって指数関数的に増加する量が直線を生じるであろう）で、周期数に対してＰＣＲ反応（蛍光として測定）の対数期中に存在するＤＮＡの相対濃度をプロットすることによって、測定を行う。バックグラウンドを越える蛍光検出のための閾値を決定し、そして試料由来の蛍光が閾値を超える周期が周期閾値、Ｃｔである。

言い換えると、Ｃｔ値は、対数に基づく蛍光の閾値レベル（すなわちバックグラウンドレベルを超えて観察される最低の蛍光）での周期数と定義される。これは、リアルタイムＰＣＲ実験（ｑＰＣＲ）において観察されそして測定される値である。

特異的プローブ各々（一方は弱毒化ワクチン株に特異的であり、そして一方はＭＤＶ−１の毒性株に特異的である）を用いたｑＰＣＲにおける検出可能シグナルの生成によって、特定の鳥類から提供される核酸試料におけるワクチン株およびＭＤＶ−１毒性株各々の量の相対的決定が可能になる。これは、核酸プローブが、ＭＤＶ−１のワクチン株または毒性株のいずれかに特異的な配列に相補的な配列を有し、そしてしたがって、特定の株の一方のみに結合するであろう際に可能である。既知の標準を含む本発明の態様において、Ｃｔ値を、記載するように計算し、そしてｑＰＣＲ反応において生成されるウイルスの特異的株の絶対定量化に用いることも可能であり、そしてこうしたものとして、各株の量の比較が可能である。

本発明の１つの態様において、ＭＤＶ−１のワクチン株は弱毒化ワクチンであり、そしてさらなる態様において、ワクチン株は弱毒化ワクチンＣＶＩ９８８である。
ウイルスワクチンは、ウイルスの死んだ型、不活性型、または弱毒化型、あるいはこれら由来の精製産物であり、そして被験体が毒性型のウイルスによって引き起こされる一般的な負の影響または疾病を経験することなく、こうしたウイルスに対する免疫応答を誘導するため、被験体に投与される。こうした免疫応答後、毒性型の病原体への曝露に対して、被験体において免疫が生成される。

いくつかのタイプのワクチンを用いてもよく、そしてこれらは、疾病のリスクを減少させるよう試みつつ、有益な免疫応答を誘導する能力を保持するために用いられる異なる戦略に相当する。一般的に用いられるウイルスワクチンは、死菌ワクチン、弱毒化ワクチン、トキソイド・ワクチン、サブユニット・ワクチンおよびコンジュゲート・ワクチンのカテゴリーに属する。

弱毒化ワクチンは、生きた弱毒化されたウイルスを含有する。これらは複製可能な生存ウイルスである。これらは、非毒性型で天然に存在するか、または毒性特性を不能にする条件下で培養されているか、または広い免疫応答を産生する、緊密に関連するがより危険性が低い生物である。これらは典型的には、ワクチンの他の型よりもより耐久性がある免疫学的応答を誘発する。

本発明の１つの態様において、プローブは、ＳＮＰ周囲の最大３０塩基対の領域を取り込むｐｐ３８の配列に相補的である。
本発明の特定の態様において、プローブは、以下の配列またはその断片：
ワクチン株特異的プローブ：５’ ＣＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＡＧＣＣ ３’
毒性株特異的プローブ：５’ ＣＣＣＡＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣ ３’；または
第二の毒性株特異的プローブ：５’ ＣＴＣＣＣＡＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣ ３
を、より長い配列内に含有してもよく、あるいは該配列またはその断片のみを含んでもよい。

本発明のさらなる側面において、工程（ｉｉ）のｑＰＣＲが、工程（ｉｉ）において、ワクチン株および毒性株両方を検出可能な「総合」核酸プローブの使用をさらに含む方法を提供する。こうした総合プローブは対照として有用であり、これは総合プローブによって検出されるウイルスの量が、特異的ｑＰＣＲにおいて、ワクチン特異的および毒性特異的プローブの両方によって検出されるウイルスの総量に等しいはずであるためである。

本発明の特定の側面において、両方の株に特異的な総合プローブは、以下の配列またはその断片：
５’ ＧＣＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＣ ３’
を、より長い配列内に含有してもよく、あるいは該配列またはその断片のみを含んでもよい。

ｑＰＣＲ内で用いられるプライマーは、単一ヌクレオチド多型を取り込む領域を増幅するであろうし、そしてこうしたものとして、上述の核酸プローブのいずれと組み合わせて用いてもよい。本発明の好ましい態様において、核酸試料の増幅に用いられる順方向および逆方向プライマーは、以下の配列またはその断片：
順方向プライマー：５’ ＧＡＧＣＴＡＡＣＣＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＡ ３’
逆方向プライマー：５’ ＣＧＣＡＴＡＣＣＧＡＣＴＴＴＣＧＴＣＡＡ ３’
を、より長い配列内に含有してもよく、あるいは該配列またはその断片のみを含んでもよい。

本発明のポリヌクレオチドはまた、上に列挙するポリヌクレオチドに実質的に同等であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも提供する。本発明記載のポリヌクレオチドは、上に列挙するポリヌクレオチドに対して、例えば少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、より典型的には、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、より典型的には、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、そしてさらにより典型的には、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有しうる。

本発明のポリヌクレオチドは、上に列挙するポリヌクレオチドのいずれかの相補体をさらに含む。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、増幅、または合成）またはＲＮＡであってもよい。こうしたポリヌクレオチドを得るための方法およびアルゴリズムは、当業者に周知であり、そして例えば、望ましい配列同一性のポリヌクレオチドをルーチンに単離可能なハイブリダイゼーション条件を決定するための方法を含みうる。

本発明で用いられるようなオリゴヌクレオチドは、当業者にとってルーチンであり、そして第１０章、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ ２００１）などの教科書に論じられる方法によって産生可能である。

論じるように、用いるプローブの特異性は、ＭＤＶ−１の弱毒化株および毒性株間のｐｐ３８遺伝子における一貫した単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）による。本発明の態様において、このＳＮＰを検出するために用いるプローブは、互いに消光可能であり、そしてプローブが切断されると脱消光（dequench）される、２つの同一レポーター色素を含む、同種標識（homolabelled）蛍光発生プローブである。好ましくは、こうしたプローブはＡｌｌＧｌｏミニプローブ（AlleLogic Biosciences Corp、カリフォルニア州ヘイワード）である。

ＡｌｌＧｌｏミニプローブは、新規の同種標識蛍光発生プローブである。慣用的な二重標識Ｔａｑｍａｎプローブとは異なり、ＡｌｌＧｌｏミニプローブは、互いに消光可能であり、そしてプローブが切断されると脱消光される、２つの同一のレポーター色素で構成される。したがって、プローブ切断は、プローブあたり、２つのシグナル生成色素の放出を生じ、Ｔａｑｍａｎプローブに比較して、検出感度が増加する。

ＡｌｌＧｌｏミニプローブは、慣用的な二重標識プローブより有意により短い（例えば１５〜１６ヌクレオチド）。長さが短くなることで、消光がより効率的になり、そしてその結果、蛍光ベースラインが低くなる。特異性はＴａｑｍａｎプローブのものより高く、したがってＡｌｌＧｌｏミニプローブは、単一点突然変異を検出可能である。ＡｌｌＧｌｏミニプローブは、好ましくは、Allelogic Biosciencesより入手可能な蛍光色素、ＭＡＲ、ＪＵＰ、ＮＥＰ、ＳＡＴまたはＵＲＡとともに使用される。

本発明の１つの態様において、毒性ＭＤＶ−１株は、ＲＢ１Ｂ ＭＤＶ、５８４Ａ ＭＤＶ、５９５ ＭＤＶ、６８４Ａ ＭＤＶ、Ｍｄ５ ＭＤＶ、ＨＰＲＳ−Ｂ１４ ＭＤＶ、ＪＭ１０２ ＭＤＶ、６６０Ａ ＭＤＶ、６７５Ａ ＭＤＶ、５４９ ＭＤＶ、５７１ ＭＤＶ、またはＣ１２−１３０ ＭＤＶより選択される。

１つの側面において、例えば弱毒化ワクチン株で以前ワクチン接種されているかまたはされていない鳥類における、毒性ＭＤＶ−１への感染の診断において、本発明の方法を用いてもよい。該方法は、ワクチン株および毒性株の振る舞いを同時に監視可能であるため、ワクチンが失敗した原因を同定するなどの状況において、最適な診断法であろうし、そしてさらなる側面において、該方法を、ＭＤＶ−１ワクチンの開発および／または試験における研究ツールとして用いてもよい。該方法は、鳥類が、いずれかの株に関する試験の前に、ワクチン株および毒性株の両方に感染したかどうかが知られていない一般的な状況において特に有用でありうる。

１つの態様において、本発明は：
（ｉ）ＭＤＶ−１のワクチン株および毒性株間の一貫した単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を取り込むｐｐ３８遺伝子領域を増幅するであろうプライマー；および
（ｉｉ）ＭＤＶ−１のワクチン株に特異的なｐｐ３８多型に関する標識核酸プローブ；
を含む、部品のキット（kit of parts）として提供可能である。

さらなる態様において、本発明は：
（ｉ）ＭＤＶ−１のワクチン株および毒性株間の一貫した単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を取り込むｐｐ３８遺伝子領域を増幅するであろうプライマー；および
（ｉｉ）ＭＤＶ−１の毒性株に特異的なｐｐ３８多型に関する標識核酸プローブ；
を含む、部品のキットとして提供可能である。

さらなる態様において、本発明は：
（ｉ）ＭＤＶ−１のワクチン株および毒性株間の一貫した単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を取り込むｐｐ３８遺伝子領域を増幅するであろうプライマー；
（ｉｉ）ワクチン株に特異的なｐｐ３８多型に関する標識核酸プローブ；および
（ｉｉｉ）ＭＤＶ−１の毒性株に特異的なｐｐ３８多型に関する標識核酸プローブ；
を含む、部品のキットとして提供可能である。

さらなる態様において、部品のキットには、標準ｑＰＣＲ試薬および／または異なる検出可能シグナルで標識されたプローブを利用する既知の標準ｑＰＣＲに必要な試薬が場合によって含まれてもよい。１つの態様において、部品のキットによって定量化されるワクチン株は、ＣＶＩ９８８ワクチンである。

さらなる態様において、部品のキットの核酸プローブ（単数または複数）は、以下の配列またはその断片：
ワクチン株特異的プローブ：５’ ＣＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＡＧＣＣ ３’；および／または
毒性株特異的プローブ：５’ ＣＣＣＡＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣ ３’
を、より長い配列内に含有してもよく、あるいは該配列またはその断片のみを含んでもよい。

部品のキットは、ワクチン株および毒性株両方に結合する総合プローブをさらに含んでもよく、これは１つの態様において、以下の配列：
５’ ＧＣＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＣ ３’
を有する。

実施例１：ｑＰＣＲプライマーおよびプローブの設計
ＭＤＶ ｐｐ３８遺伝子配列は、弱毒化ワクチンＣＶＩ９８８およびＭｄ５（毒性株）の間の２つの単一ヌクレオチド相違を示す（図１）。大文字太字下線（Ｇ／Ａ）で強調した多型は、本発明者らが配列を有するすべてのＭＤＶ−１ワクチンウイルスおよびＭＤＶ−１毒性ウイルス（ＲＢ１Ｂ ＭＤＶ、５８４Ａ ＭＤＶ、５９５ ＭＤＶ、６８４Ａ ＭＤＶ、Ｍｄ５ ＭＤＶ、ＨＰＲＳ−Ｂ１４ ＭＤＶ、ＪＭ１０２ ＭＤＶ、６６０Ａ ＭＤＶ、６７５Ａ ＭＤＶ、５４９ ＭＤＶ、５７１ ＭＤＶ、Ｃ１２−１３０ ＭＤＶ）間で一貫した相違に相当し、そしてこれは、特定のプローブ内に取り込まれた多型であった。太字下線斜字（Ｇ／Ａ）で強調した多型は、毒性ウイルスのすべての株に一貫しては存在しない。表１は、多型領域を含むように設計された２つのプローブ（弱毒化ワクチンＣＶＩ９８８に特異的なｐｐ３８Ｖａｃｃ Ｇ ＪＵＰ；および毒性ウイルスに特異的なｐｐ３８Ｖｉｒ Ａ ＪＵＰ（１））とともに、プライマー配列を列挙する。すべてのＭＤＶ−１株に共通のｐｐ３８領域をターゲットとする第三のプローブｐｐ３８−ｔｏｔａｌ ＪＵＰもまた設計した。３つのプローブはすべて、同じプライマー対と組み合わせて使用可能である（表１を参照されたい）。

表１はまた、ワクチン特異的、毒性特異的および総合ｐｐ３８プローブのすべてが同様の融点を有するように設計された、毒性ウイルスを特異的にターゲットとする第二のプローブ（ｐｐ３８Ｖｉｒ Ａ ＪＵＰ（３））も示す。ｐｐ３８Ｖｉｒ Ａ ＪＵＰ（３）の成績は、ｐｐ３８Ｖｉｒ Ａ ＪＵＰ（１）（もう一方の毒性株特異的プローブ）のものと非常によく似ている；しかし、該プローブは、第二の「一貫性がない」多型部位を含むため、いくつかの野外株に対するアフィニティが減少している可能性がある（図１および表１を参照されたい）。プローブを色素ＪＵＰ（AlleLogic Biosciences）で標識し、これをリアルタイムＰＣＲ装置のＶＩＣ検出チャネル中で検出する。

表１

プライマーおよびプローブは、AlleLogic Biosciences、米国カリフォルニア州ヘイワードによって設計され、そして製造された。
実施例２：ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の感染
ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）を、ＭＤＶ−１のＣＶＩ９８８ワクチン株またはＲＢ１Ｂ毒性株のいずれかに感染させた。感染５日後、一重（ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ）ｑＰＣＲで使用するため、これらの細胞から連続希釈を調製した。

ＣＥＦ（ニワトリ胚線維芽細胞）細胞単層を培養７５ｃｍ^２フラスコ中で確立し、そしておよそ１０００プラーク形成単位（ｐｆｕ）の細胞関連ウイルスに感染させた。３８℃で５日間培養した後、細胞を採取し、そしてフェノール−クロロホルム抽出法を用いて、ＤＮＡを調製した。反応は２５μｌ体積であり、そして：Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｂｌｕｅ ｑＰＣＲマスターミックス（ＡＢｇｅｎｅ）、４００ｎＭの各プライマー（すなわちＯｖｏプライマー＋ウイルス特異的プライマー）、２００ｎＭの各プローブ（すなわちＯｖｏプローブ＋ウイルス特異的プローブ）、およそ１００ｎｇのＤＮＡ試料を含有する。サイクリングパラメーター：５０℃２分間、９５℃１５分間、その後、４０周期の９５℃（１５秒間）および６０℃（１分間）を用いて、ＡＢＩ７５００リアルタイムＰＣＲ装置上で反応を行う。

実施例３：ｑＰＣＲの特異性：一重反応
本質的に先に記載されるように（Ｂａｉｇｅｎｔら，２００５ａ）反応を設定し、各々、「ＡＢｓｏｌｕｔｅ ｑＰＣＲマスターミックス」（ＡＢｇｅｎｅ、英国エプソム）、順方向および逆方向プライマー、ならびにプローブの１つを含有した。以下の条件下：５０℃２分間、９５℃１５分間、その後、４０周期の９５℃（１５秒間）および６０℃（１分間）で、ＡＢＩ ７５００ＦＡＳＴ（登録商標）ｑ−ＰＣＲ系（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて増幅し、そして反応産物を検出した。各一重ｑＰＣＲに関するプライマーおよびプローブの組み合わせを表２に示す。

表２

ＣＶＩ９８８またはＲＢ１Ｂ（ＭＤＶ−１の毒性株）のいずれかに感染させた５日後、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）から調製したＤＮＡの連続１０倍希釈を用いることによって、プローブの特異性をまず評価した。

図２は、ＣＶＩ９８８またはＲＢ１Ｂ（毒性株）のいずれか由来の核酸テンプレートあるいはテンプレート不含対照を用いた、（ａ）ＣＶＩ９８８特異的プローブおよび（ｂ）毒性特異的プローブによって生成される蛍光の変化を示す。該データは、ｑＰＣＲにおいて核酸に特異的なプローブが用いられ、そしてこうしたものとしてプローブの特異性が明らかに立証された場合にのみ、シグナルが有意なレベルで生成されることを明らかに示す。

実施例４：ｑＰＣＲの標準曲線
ＣＶＩ９８８感染ＣＥＦ細胞から、そしてＲＢ−１Ｂ感染ＣＥＦ細胞からＤＮＡ標準を調製し、そして既知のコピー数のプラスミドＤＮＡに対して較正することによって、正確に定量化した。１０倍連続希釈を調製した。図３（ａ）は、ＣＶＩ９８８ ＤＮＡに対して、ＣＶＩ９８８特異的ｑＰＣＲを用いて生成される標準曲線を示す。図３（ｂ）は、ＲＢ−１Ｂ ＤＮＡに対して、毒性特異的ｑＰＣＲを用いて生成される標準曲線を示す。図３（ｃ）は、ＣＶＩ９８８ ＤＮＡに対して、総合ｐｐ３８ ｑＰＣＲを用いて生成される標準曲線を示す。図３（ｄ）は、ＲＢ−１Ｂ ＤＮＡに対して、総合ｐｐ３８ ｑＰＣＲを用いて生成される標準曲線を示す。

各反応の効率は優れており、そして各反応は優れた標準曲線を生成した。ｐｐ３８総合プローブは、予測されるように、ＣＶＩ９８８（ワクチン）ＤＮＡおよびＲＢ−１Ｂ（毒性）ＤＮＡを、そして類似の効率で検出した。テンプレート不含対照ウェルは、すべてのプローブに関して陰性であった。

実施例５：様々なＭＤＶ−１株に対するｐｐ３８核酸プローブの特異性
ｐｐ３８Ｖｉｒ Ａ ＪＵＰ（毒性特異的）プローブおよびｐｐ３８Ｖａｃｃ Ｇ ＪＵＰ（ＣＶＩ９８８ワクチン特異的）プローブの特異性を、多様な毒性の様々な１２のＭＤＶ−１株、ＭＤＶ−１ワクチン株ＣＶＩ９８８の様々な３つの異なる供給源および２つの非血清型１型ワクチン株に対して試験した（図４）。

閾値（デルタＲｎ）を：Ｏｖｏ反応（０．２）、毒性特異的ｐｐ３８反応（０．６）、ＣＶＩ９８８特異的ｐｐ３８反応（０．３５）、総合ｐｐ３８反応（０．１）に設定した。毒性特異的プローブは、ＭＤＶ１のすべての毒性株を検出し（しかし、ＣＶＩ９８８は検出しない）、そしてワクチン特異的プローブは、ＣＶＩ９８８のみを、しかし３つの供給源由来のものすべてを検出した。どちらのプローブも、ＭＤＶ−２およびＭＤＶ−３ワクチン株ＳＢ−１およびＨＶＴを検出しなかった。データは、多様な供給源のＭＤＶ−１ワクチンＣＶＩ９８８株に対するｐｐ３８Ｖａｃｃ Ｇ ＪＵＰの一貫した特異性、および多様な毒性の毒性ＭＤＶ−１株に対するｐｐ３８Ｖｉｒ Ａ ＪＵＰの特異性を確認する。データはまた、ＭＤＶ−２またはＭＤＶ−３株を超える、ＭＤＶ−１株に対する両プローブの特異性も示す。

実施例６：絶対定量化のためのアッセイ適応
組織試料におけるワクチンウイルスおよび攻撃ウイルスの絶対定量化（１０^４細胞あたりのウイルスゲノムとして示される）のために、ミニプローブ（MiniProbe）ｑＰＣＲ反応を用いるためには、Ｏｖｏ反応とｐｐ３８反応の二重化（duplexing）を最適化する必要があった。ｐｐ３８プローブ蛍光とは異なるチャネルにおいて検出されるように、ＯｖｏプローブをＦＡＭ−ＢＨＱ１で標識した。Ｏｖｏ ｑＰＣＲのターゲット単位複製配列は７１塩基対であり、そして用いるプライマー配列およびプローブ配列を以下の表３に示す。プライマーおよびプローブは、Sigma AldrichおよびEurogentecによって、生成された。

表３

２コピーのＯｖｏ遺伝子は１つの細胞と同等であり、したがってＯｖｏ標準曲線を用いて、１００００細胞に同等であるＯｖｏ Ｃｔ値を計算することも可能である。ＣＶＩ９８８ ＤＮＡおよびＣＶＩ９８８特異的反応を用いて、試料中のＣＶＩ９８８のコピー数を計算し（ＣＶＩ９８８特異的Ｃｔ値から）、一方、ＲＢ−１Ｂ ＤＮＡおよび毒性特異的反応を用いて生成される標準曲線を用いて、試料中の毒性ＭＤＶのコピー数を計算する（毒性特異的Ｃｔ値から）。Ｏｖｏ標準曲線を用いて、試料中のＯｖｏコピー数を算定する（Ｏｖｏ Ｃｔ値から）。Ｏｖｏコピー数（すなわち細胞数）は、異なる試料において異なるであろうし、したがって、試料Ａと試料Ｂを正確に比較可能にするためには、これらの試料が１００００細胞を有していたならば、各試料におけるＭＤＶコピー数はどの程度になるかを計算する。

非感染ＣＥＦ ＤＮＡの較正連続希釈を用いてＯｖｏ反応に関する標準曲線を調製し、そして図５に示す。
実施例７：ニワトリＤＮＡ試料に対する二重ｑＰＣＲの試験および検証
プライマー対は、ＣＶＩ９８８および毒性ＭＤＶ−１ ＤＮＡの両方を増幅するであろうため、これらの２つのターゲット配列は、両方のターゲット配列が存在する場合、同じプライマーに関して競合するであろう。実験室実験由来の、そして野外由来の試料は、ＣＶＩ９８８および毒性ＭＤＶ−１を多様な比で含有するであろう。一方のウイルスが高レベルで存在し、そしてもう一方が低レベルでしか存在しない場合、プライマーに関する競合が、存在量のより少ないウイルスの増幅（そしてしたがって検出）を防止しないことを確認するため、反応がＣＶＩ９８８および毒性ＭＤＶ−１の両方を正確に定量化する能力を調べた。

ＢＡＣにクローニングされたＣＶＩ９８８ウイルス（ｐＣＶＩ９８８）でニワトリにワクチン接種し、そしてニワトリをＲＢ−１Ｂで攻撃する実験から、ニワトリ組織ＤＮＡ試料を採取した。４群のニワトリは、（１）非ワクチン接種、非攻撃；（２）ワクチン接種、非攻撃；（３）ワクチン接種および攻撃；（４）非ワクチン接種、攻撃であった。ワクチン接種および攻撃後の多様な時点で、脾臓試料を収集した。ワクチンウイルスはｐＣＶＩ９８８であり、そして攻撃（毒性）ウイルスはＷＴ ＲＢ−１Ｂであり、これによって、ＣＶＩ９８８ ｐｐ３８／毒性ｐｐ３８系の両方によって、そしてＢＡＣにクローニングされたＭＤＶ（ＢＡＣ特異的配列を用いる）および野生型ＭＤＶ（ＵＳ２遺伝子をターゲットとすることによる）の間を区別するために本発明者らが開発した第二のｑＰＣＲ系によって、２つのウイルス間の区別が可能になるはずである。したがって、この後者のｑＰＣＲ系を用いて、ＣＶＩ９８８ ｐｐ３８／毒性ｐｐ３８ ｑＰＣＲ系を検証することも可能である。ｐｐ３８−総合反応を用いてもまた、総ウイルスを測定した。ｑＰＣＲ系の検証に関する計画を表４に示し、そして図６のウイルス遺伝子マップ上に示す。

表４

表４に示す５つのウイルス特異的ｑＰＣＲ反応各々をＯｖｏ ｑＰＣＲと二重で行って、１００００細胞あたりのウイルスの絶対定量化を可能にした。図７（ａ）および７（ｂ）は、両方のｑＰＣＲ系を用いて、ワクチンウイルスおよび毒性ウイルスを定量化するのに用いられる標準曲線を示す。

図８は、４群、１）非ワクチン接種、非攻撃；２）ワクチン接種、非攻撃；３）ワクチン接種、攻撃；および４）非ワクチン接種、攻撃；由来の、４０羽の鳥類で測定されたワクチン、攻撃および総ＭＤＶのレベルを示す。ベースライン値（０．６）を有する試料は陰性である。

最初の２つの列は、ＣＶＩ特異的ｐｐ３８ ｑＰＣＲ（第１列）およびＢＡＣ特異的ｑＰＣＲ（第２列）によるワクチンウイルス測定を示す。どちらの系においても、ワクチンウイルスは、２つのワクチン接種群においてのみ検出された。２つの系で得られたコピー数値間の合致は優れていた（図９（ａ）も参照されたい）。

第３列および第４列は、毒性特異的ｐｐ３８ ｑＰＣＲ（第３列）およびＵＳ２特異的ｑＰＣＲ（第４列）による攻撃ウイルスの測定を示す。どちらの系においても、攻撃ウイルスは、２つの攻撃群のみで検出された。２つの系で得られたコピー数値間の合致は優れていた（図９（ｂ）も参照されたい）。

第５列、第６列、および第７列は、両ウイルスを測定するｐｐ３８ ｑＰＣＲによる総ＭＤＶの測定（第５列）、ＣＶＩ特異的ｐｐ ３８ ｑＰＣＲおよび毒性特異的ｐｐ３８ ｑＰＣＲに由来する付加的結果（第６列）、ならびにＢＡＣ特異的ｑＰＣＲおよびＵＳ２特異的ｑＰＣＲに由来する付加的結果（第７列）を示す。これらの３つの系で得られたコピー数値間の合致は非常に優れていた（図１０（ａ）、（ｂ）および（ｃ））。

これらのデータは、ＣＶＩ−ｐｐ３８ ｑＰＣＲおよび毒性ＭＤＶ１−ｐｐ３８ ｑＰＣＲが優れた特異性を示し、そしてこれを用いて、生物学的に関連する量で、両方のウイルスを含有するものを含めて、組織試料中のＣＶＩ９８８ワクチンおよび毒性ＭＤＶ−１株を正確に定量化することも可能であることを確認する。
参考文献

Claims (28)

1. 鳥類由来の試料における、マレック病ウイルス血清型１型（ＭＤＶ−１）のワクチン株および毒性株定量化のための方法であって：
   （ｉ）鳥類由来の生物学的試料を提供し；
   （ｉｉ）（ｉ）の生物学的試料を：
   （ａ）（ｉ）の核酸試料内の、ＭＤＶ−１のワクチン株および毒性株間の一貫した単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）相違を含有するｐｐ３８遺伝子領域を増幅し、ここにおいて該ＳＮＰは、図１（ａ）及び１（ｂ）の３２０位に位置するＧ／Ａ多型である；そして
   （ｂ）（ａ）の増幅された核酸と、ＭＤＶ−１のワクチン株のＳＮＰに特異的な検出可能核酸プローブおよび毒性株のＳＮＰに特異的な第二の核酸プローブを接触させる；
   工程を含むリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に供し；
   （ｉｉｉ）（ｉｉ）の各プローブによって生成される検出可能シグナルの変化を測定する；
   工程を含み、
   ここにおいて、前記プローブが、以下の配列またはその断片：
   ワクチン株特異的プローブ：５’ ＣＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＡＧＣＣ ３’；および
   毒性株特異的プローブ：５’ ＣＣＣＡＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣ ３’；または
   第二の毒性株特異的プローブ：５’ ＣＴＣＣＣＡＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣ ３’
   を、より長い配列内に含有してもよく、あるいは該配列またはその断片のみを含んでもよい、
   前記方法。
2. 工程（ｉｉｉ）の後に：
   （ｉｖ）各特異的プローブに関して（ｉｉｉ）で測定した検出可能シグナルの変化を比較する
   工程を場合によって含む、請求項１の方法。
3. 株（単数または複数）の定量化が相対的定量化である、請求項１の方法。
4. 工程（ｉ）の生物学的試料から核酸を単離し、そして単離された核酸を工程（ｉｉ）のｑＰＣＲに供する工程を場合によって含む、請求項１−３のいずれか１項の方法。
5. 株（単数または複数）の定量化が絶対定量化である、請求項１−４のいずれか１項の方法。
6. 工程（ｉｉ）のｑＰＣＲが、ワクチン株および／または毒性株の絶対定量化を可能にする異なる検出可能シグナルで標識されたプローブを利用して、同時に行う既知の標準ｑＰＣＲをさらに含む、請求項１−５のいずれか１項の方法。
7. 標準ｑＰＣＲ系が、ニワトリＤＮＡ中に存在するＯｖｏ宿主遺伝子を用いるＯｖｏ反応である、請求項６の方法。
8. ワクチン株が弱毒化ワクチン株である、請求項１−７のいずれか１項の方法。
9. ワクチン株がＣＶＩ９８８ワクチンである、請求項８の方法。
10. プローブが、ＳＮＰ周囲の最大３０塩基対の領域を取り込むｐｐ３８の配列に相補的である、請求項１−９のいずれか１項の方法。
11. 工程（ｉｉ）のｑＰＣＲが、工程（ｉｉ）において、ワクチン株および毒性株両方を検出可能な「総合」核酸プローブの使用をさらに含む、請求項１−１０のいずれか１項の方法。
12. 両方の株に特異的な総合プローブが、以下の配列またはその断片：
    ５’ ＧＣＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＣ ３’
    を、より長い配列内に含有してもよく、あるいは該配列またはその断片のみを含んでもよい、請求項１１の方法。
13. 用いるプローブが、互いに消光可能であり、そしてプローブが切断されると脱消光（dequench）される、２つの同一レポーター色素を含む、同種標識（homolabelled）蛍光発生プローブである、請求項１−１２のいずれか１項の方法。
14. プローブがＡｌｌＧｌｏミニプローブである、請求項１３の方法。
15. 核酸試料の増幅において用いるプライマーが、以下の配列またはその断片：
    順方向プライマー：５’ ＧＡＧＣＴＡＡＣＣＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＡ ３’
    逆方向プライマー：５’ ＣＧＣＡＴＡＣＣＧＡＣＴＴＴＣＧＴＣＡＡ ３’
    を、より長い配列内に含有してもよく、あるいは該配列またはその断片のみを含んでもよい、請求項１−１４のいずれか１項の方法。
16. 毒性ＭＤＶ株が、ＲＢ１Ｂ ＭＤＶ、５８４Ａ ＭＤＶ、５９５ ＭＤＶ、６８４Ａ ＭＤＶ、Ｍｄ５ ＭＤＶ、ＨＰＲＳ−Ｂ１４ ＭＤＶ、ＪＭ１０２ ＭＤＶ、６６０Ａ ＭＤＶ、６７５Ａ ＭＤＶ、５４９ ＭＤＶ、５７１ ＭＤＶ、またはＣ１２−１３ ０ ＭＤＶより選択される、請求項１−１５のいずれか１項の方法。
17. 提供される核酸試料が、以下の組織：血液、脾臓、肝臓、皮膚、卵巣、ブルサ（bursa）、胸腺、腎臓または羽毛先端由来である、請求項１−１６のいずれか１項の方法。
18. 検出可能シグナルが、蛍光色素または発色団などの蛍光剤を含む、請求項１−１７のいずれか１項の方法。
19. 蛍光剤が、ＭＡＲ、ＪＵＰ、ＮＥＰ、ＳＡＴ、ＵＲＡより選択される色素を含む、請求項１８の方法。
20. 検出可能シグナルが色素ＪＵＰである、請求項１９の方法。
21. 鳥類における毒性ＭＤＶ−１への感染の診断における、請求項１−２０のいずれか１項の方法の使用。
22. ＭＤＶ−１ワクチンの開発および／または試験における研究ツールとしての請求項１−２０のいずれか１項の方法の使用。
23. （ｉ）ＭＤＶ−１のワクチン株および毒性株間の一貫した単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を取り込むｐｐ３８遺伝子領域を増幅するプライマー、ここにおいて該ＳＮＰは、図１（ａ）及び１（ｂ）の３２０位に位置するＧ／Ａ多型である；
    （ｉｉ）ワクチン株に特異的なｐｐ３８多型に関する標識核酸プローブ；および
    （ｉｉｉ）ＭＤＶ−１の毒性株に特異的なｐｐ３８多型に関する標識核酸プローブ；
    を含む、部品のキットであって、
    ここにおいて、前記核酸プローブが、以下の配列またはその断片：
    ワクチン株特異的プローブ：５’ ＣＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＡＧＣＣ ３’；および
    毒性株特異的プローブ：５’ ＣＣＣＡＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣ ３’；または
    第二の毒性株特異的プローブ：５’ ＣＴＣＣＣＡＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣ ３’
    を、より長い配列内に含有してもよく、あるいは該配列またはその断片のみを含んでもよい、
    前記部品のキット。
24. 標準ｑＰＣＲ試薬をさらに含む、請求項２３のキット。
25. 異なる検出可能シグナルで標識されたプローブを利用する既知の標準ｑＰＣＲに必要な試薬をさらに含む、請求項２３または２４のキット。
26. ワクチン株がＣＶＩ９８８ワクチンである、請求項２３−２５のいずれか１項のキット。
27. ワクチン株および毒性株両方に結合する総合プローブをさらに含む、請求項２３−２６のいずれか１項のキット。
28. 総合プローブが、以下の配列またはその断片：
    ５’ ＧＣＴＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＣ ３’
    を、より長い配列内に含有してもよく、あるいは該配列またはその断片のみを含んでもよい、請求項２７のキット。

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