CN111733297A - 一种马立克氏病病毒血清3型荧光定量pcr试剂盒及其应用 - Google Patents

一种马立克氏病病毒血清3型荧光定量pcr试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测马立克氏病病毒血清3型毒株的荧光定量PCR试剂盒及其在禽用生物制品质量控制中的应用。所述试剂盒含有用于检测马立克氏病病毒血清3型毒株一对特异性引物和相应的Taqman探针。本发明特异性好，马立克氏病病毒血清3型毒株扩增曲线良好，禽用病毒类生物制品及生产原材料未出现特异性扩增曲线；敏感性高，用本发明建立的方法检测不同PFU的Fc126毒株，检出限度为0.06PFU；检测10倍梯度稀释的标准品质粒，检出限度为10copies/μL；可用于禽用生物制品中外源性马立克氏病病毒的检测，对于马立克氏病病毒的检测、禽用生物制品质量控制等具有重要意义。

Description

一种马立克氏病病毒血清3型荧光定量PCR试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种马立克氏病病毒(Marker’s disease virus,MDV)血清3型荧光定量PCR 试剂盒及其在生物制品质量控制中的应用，属于生物技术和动物病毒学领域。
背景技术
马立克氏病(Marker’s disease,MD)是鸡的一种急性或亚急性淋巴细胞增生性疾病，主要表现为外周神经、皮肤、虹膜及其他组织器官出现单核细胞浸润。该病的病原马立克氏病病毒(Marker’s disease virus,MDV)属于α疱疹病毒亚类的Mardivirus属，根据病毒的血清学反应，分为3个血清型，即MDV血清1型(禽疱疹病毒2型)、MDV血清2型(禽疱疹病毒3型)和MDV血清3型(火鸡疱疹病毒1型)。与其它疱疹病毒相比，禽疱疹病毒最显著的特性是细胞结合性，即在细胞培养上不产生游离于细胞培养液中有感染性的病毒粒子(特别是MDV血清1型毒株)。
基于MDV的生物学特性，现有外源性MDV检验方法主要是通过鸡胚法观察尿囊膜病变、细胞法检查细胞病变、鸡检查法通过琼脂扩散实验测定抗体。但随着兽用生物制品品种的不断增加和生物技术的不断进步，现有的外源性MDV检验国家标准已不能完全满足检验、检测的需求。主要表现在两个方面：一是方法敏感性问题，如鸡检查法中MDV采用琼脂扩散实验进行抗体检测，敏感性低、稳定性差、检测时间长、不同来源检测抗原反应性差异较大；二是方法的鉴别性不强，如不同血清型马立克氏病病毒相互污染时，无法进行外源性马立克氏病病毒的鉴别。
荧光定量PCR已作为一种快速、灵敏的诊断方法被广泛使用，特别是在取代传统方法不易或不能检测的病原的检测方面具有重要意义。2019年，在非洲猪瘟肆虐的形势下，对于不易分离鉴定的非洲猪瘟病毒，我国农业农村部及时制定了猪用生物制品及猪源原辅材料中污染非洲猪瘟病毒的PCR和荧光定量PCR检测方法，为严把兽用生物制品质量关，做好非洲猪瘟防控提供了坚实的技术保障。而目前禽用生物制品中，外源性MDV检测国家标准中并无分子生物学相关的检测技术，因此，我们选择编码MDV核衣壳蛋白UL19的基因为靶标，建立MDV血清3型毒株荧光定量PCR检测方法，用于禽用生物制品外源性马立克氏病病毒污染的质量控制。
发明内容
本发明为克服现有外源性马立克氏病病毒检测方法敏感性低、鉴别性不强、检测时间长等的缺点，提供了一种特异、敏感、快速、可定量检测外源性马立克氏病病毒血清3型毒株的荧光定量PCR试剂盒，应用于禽用生物制品质量控制。
为实现上述目标，本发明实施了以下技术方案：
1.一种马立克氏病病毒血清3型荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含两条特异性引物和相应的Taqman探针，qPCR Buffer(2×)、酶、标准品质粒、阳性提取对照品、阴性提取对照品、无酶水；
所述的特异性引物和相应的Taqman探针，其序列分别为：
序列1上游引物(Fc126-UL19-F)：5′-gcgatcactg tcgccttcta-3′20
序列2下游引物(Fc126-UL19-R)：5′-agtaacggct gtggtcatgg-3′20
序列3Taqman探针(Fc126-UL19-P)：5′-FAM-tgtaacgagc gacgtcgtcca-BHQ1-3′21；
所述标准品质粒为所述引物从Fc126毒株血清3型马立克氏病病毒上扩增目的片段连接到pEASY-Blunt载体得到的；
所述阳性提取对照品为10PFU灭活的血清3型Fc126毒株马立克氏病病毒；
所述阴性提取对照品为SPF鸡胚尿囊液。
2.本发明所述的试剂盒，其特征在于荧光定量PCR反应体系为20.0μL，包含：10.0μL qPCR Buffer(2×)、0.4μL酶、0.4μL上游引物、0.4μL下游引物、0.2μL探针、3.0μL模板和5.6μL无酶水；荧光定量PCR反应条件为95℃预变性2min；95℃变性3sec，60℃退火 15sec，72℃延伸20sec，扩增40个循环，收集荧光信号。
3.本发明所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于定量检测马立克氏病病毒血清3 型毒株时，按照以下步骤进行：
(1)提取待检样品、阳性提取对照品及阴性提取对照品的总DNA；
(2)将标准品质粒做1×107copies/μL到1×10-1copies/μL 10倍系列稀释后作为模板，以权利要求1、6、7所述的特异性引物、探针、反应体系和条件进行荧光定量PCR，建立标准曲线；
(3)以步骤(1)提取的总DNA为模板，以所述的特异性引物、探针、反应体系和条件进行荧光定量PCR；
(4)根据标准曲线对待检样品中的病毒拷贝数进行定量；
(5)若用于定性检测，则无需构建标准曲线。
本发明的积极意义
本发明涉及一种马立克氏病病毒血清3型荧光定量PCR检测方法及其在禽用生物制品质量控制中的应用。本发明特异性好，马立克氏病病毒血清3型毒株扩增曲线良好，禽类病毒生物制品及生产原材料未出现特异性扩增曲线；敏感性高，用本发明建立的方法检测不同PFU 的Fc126毒株，检出限度为0.06PFU；检测10倍梯度稀释的标准品质粒，检出限度为 10copies/μL；解决了现有外源性MDV检验方法敏感性低、检测时间长、鉴别性不强的问题，可用于禽用生物制品中外源性马立克氏病病毒的检测，对于马立克氏病病毒的检测、禽用生物制品质量控制等具有重要意义。
附图说明
图1为MDV血清3型荧光定量PCR检测方法敏感性检测及标准曲线的建立；
图1A图中：1、2、3、4、5、6、7、8、9分别代表1×107copies/μL到1×10-1copies/μL 10倍系列稀释标准品质粒的扩增曲线；
图1B为标准曲线绘制结果：扩增效率E＝95.0％，R2＝0.998，标准曲线方程 Y＝-3.447X+36.496。
图2MDV血清3型荧光定量PCR检测方法特异性检测图中：1代表Fc126毒株的扩增曲线；2代表其他禽用病毒类生物制品、毒种及生产原材料的扩增曲线；
图3MDV血清3型荧光定量PCR检测方法敏感性检测图中：1、2、3、4、5、6、7、8 分别代表600、60、6、0.6、0.06、0.006、0.0006、0.00006PFU Fc126毒株的扩增曲线；
图4MDV血清3型荧光定量PCR试剂盒应用于鸡新城疫活疫苗(Clone30株)污染不同PFU MDV血清3型Fc126毒株的检测图中：1、2、3、4、5、6分别代表100羽份NDV中混合60、6、0.6、0.06、0.006、0.0006PFU Fc126毒株的扩增曲线；
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步的说明，以更好的理解本发明，但其不构成对本发明的限制。
实施例1——MDV血清3型荧光定量PCR检测方法的建立与条件优化
1.针对UL19基因保守区域特异性引物和探针的设计
从GenBank上下载收录的所有MDV血清3型毒株的全基因序列，运用MegAlign及MEGA两种生物学软件进行序列比对，分析毒株的保守区域。根据序列比对结果，针对MDV 血清3型Fc126毒株的UL19基因保守区域，设计1对特异性引物(Fc126-UL19-F和 Fc126-UL19-R)和相应的Taqman探针(Fc126-UL19-P)，将探针的5'端以荧光报告基团FAM 标记，3'以荧光淬灭基团BHQ1标记。
序列1上游引物(Fc126-UL19-F)：5′-gcgatcactg tcgccttcta-3′20
序列2下游引物(Fc126-UL19-R)：5′-agtaacggct gtggtcatgg-3 20
序列3Taqman探针(Fc126-UL19-P)：5′-FAM-tgtaacgagc gacgtcgtcca-BHQ1-3′21
2.MDV血清3型荧光定量PCR检测方法的建立与条件优化
按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，Cat#：DP315) 说明书提取Fc126毒株的基因组作为模板，固定模板浓度，综合考虑样品Ct值、荧光强度，采用棋盘法确定最适引物、探针浓度和反应条件。
反应体系：
Figure BDA0002625298170000041
反应条件：
95℃预变性2min；95℃变性3sec，60℃退火15sec，72℃延伸20sec，扩增40个循环，收集荧光信号。
3.MDV血清3型荧光定量PCR检测方法标准曲线的建立
以Fc126毒株的基因组作为模板，用本发明所述引物进行普通PCR扩增目的片段，扩增体系及反应条件如下：
Figure BDA0002625298170000042
Figure BDA0002625298170000051
反应条件：
94℃预变性5min；94℃变性3sec，60℃退火30sec，72℃延伸20sec，扩增35个循环；72℃终末延伸10min。
用E.Z.N.A胶回收试剂盒(OMEGA，Cat#：D2500-02)进行PCR扩增产物的回收与纯化，将回收产物连接至pEASY-blunt载体(北京全式金生物技术有限公司，Cat#：CB101-01)，转化Trans1-T1感受态(北京全式金生物技术有限公司，Cat#：CD501-02)，通过氨苄青霉素抗性筛选及菌液PCR鉴定，获得阳性单菌落，按照质粒提取试剂盒(Promega，Cat#：A2492)提取质粒用作阳性标准品。
根据公式N＝(质粒浓度(ng/μL)×10-9×6.03×1023)/(重组质粒碱基数×660)计算重组质粒拷贝数。将重组质粒从1×107copies/μL到1×10-1copies/μL 10倍系列稀释后作为标准阳性模板，建立荧光定量PCR检测方法的标准曲线。标准曲线如图1A，1B所示：扩增效率E＝95.0％， R2＝0.998，标准曲线方程Y＝-3.447X+36.496。
实施例2——MDV血清3型荧光定量PCR检测方法特异性检测
1.样品处理(样品信息详见表1)
尿囊液、细胞、胚体、尿囊膜生产毒：用一定体积的生理盐水将样品溶解至100羽份/200μL， 12000r/min 4℃离心10min，取上清备用；
SPF鸡胚尿囊液：12000r/min 4℃离心10min，取上清备用；
鸡胚成纤维细胞：取生长7天以上、面积75cm2以上的鸡胚成纤维细胞，反复冻融3次后，12000r/min 4℃离心10min，取上清备用；
SPF鸡胚胚体、SPF鸡胚尿囊膜：剪取一定体积SPF鸡胚胚体或SPF鸡胚尿囊膜，加入5倍体积的生理盐水，在生物安全柜中研磨，将获得的匀浆反复冻融3次后，12000r/min 4℃离心10min，取上清备用；
2.分别取200μL处理好的样品，按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，Cat#：DP315)说明书提取病毒基因组作为模板(针对RNA病毒，将其基因组反转录成cDNA后作为模板)，用建立的MDV血清3型荧光定量PCR检测方法进行检测，除血清3型MDV毒株外，其他样品均未检测到特异性扩增信号(图2)，所建立的检测方法的特异性良好。
表1 MDV血清3型荧光定量PCR检测方法特异性的评价研究样品信息
Figure BDA0002625298170000061
实施例3——MDV血清3型荧光定量PCR检测方法敏感性检测
1.将标准品质粒从1×107copies/μL到1×10-1copies/μL 10倍系列稀释后作为模板，用建立的MDV血清3型荧光定量PCR检测方法进行检测，所建立的检测方法其敏感度可达到10 copies/μL(结果见图1A)，敏感性良好。
2.分别取600、60、6、0.6、0.06、0.006、0.0006、0.00006PFU的MDV血清3型FC126 毒株，按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，Cat#：DP315) 说明书提取病毒基因组作为模板，用建立的MDV血清3型荧光定量PCR检测方法进行检测，所建立的检测方法的最低可以检测到0.06PFU(图3)，敏感性良好。
实施例4——MDV血清3型荧光定量PCR检测方法重复性检测
以1×107copies/μL到1×101copies/μL 10倍系列稀释的标准品质粒为模板，每个浓度的样品做3次重复性检测，计算变异系数，分析所建立的荧光定量PCR检测方法的可重复性。结果如表2所示，不同模板浓度其变异系数均低于1.5％，表明所建立的荧光定量PCR检测方法有较好的稳定性。
表2 MDV血清3型荧光定量PCR检测方法重复性检测
Figure BDA0002625298170000071
实施例5——MDV血清3型荧光定量PCR试剂盒在禽用生物制品质量控制中的应用
以鸡新城疫活疫苗(Clone30株)为例。取1000羽份鸡新城疫活疫苗(Clone30株)，用 1ml生理盐水溶解，稀释为1000羽份/1ml，取100μl与等体积含60、6、0.6、0.06、0.006、0.0006PFU的MDV血清3型FC126毒株混合，按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，Cat#：DP315)说明书提取病毒基因组作为模板，用建立的 MDV血清3型毒株荧光定量PCR检测方法检测Fc126毒株污染，其最低检出限为0.06PFU (图4)。
序列表
<110> 中国兽医药品监察所
<120> 一种马立克氏病病毒血清3型荧光定量PCR试剂盒及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 上游引物(Fc126-UL19-F)
<400> 1
gcgatcactg tcgccttcta 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 下游引物(Fc126-UL19-R)
<400> 2
agtaacggct gtggtcatgg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Taqman探针(Fc126-UL19-P)
<400> 3
tgtaacgagc gacgtcgtcc a 21

Claims (3)

1.一种马立克氏病病毒血清3型荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含两条特异性引物和相应的Taqman探针，qPCR Buffer(2×)、酶、标准品质粒、阳性提取对照品、阴性提取对照品、无酶水；
所述的特异性引物和相应的Taqman探针，其序列分别为：
序列1上游引物(Fc126-UL19-F)：5′-gcgatcactg tcgccttcta-3′20
序列2下游引物(Fc126-UL19-R)：5′-agtaacggct gtggtcatgg-3′20
序列3Taqman探针(Fc126-UL19-P)：5′-FAM-tgtaacgagc gacgtcgtcca-BHQ1-3′21；
所述标准品质粒为所述引物从Fc126毒株血清3型马立克氏病病毒上扩增目的片段连接到pEASY-Blunt载体得到的；
所述阳性提取对照品为10PFU灭活的血清3型Fc126毒株马立克氏病病毒；
所述阴性提取对照品为SPF鸡胚尿囊液。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于荧光定量PCR反应体系为20.0μL，包含：10.0μL qPCR Buffer(2×)、0.4μL酶、0.4μL上游引物、0.4μL下游引物、0.2μL探针、3.0μL模板和5.6μL无酶水；荧光定量PCR反应条件为95℃预变性2min；95℃变性3sec，60℃退火15sec，72℃延伸20sec，扩增40个循环，收集荧光信号。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于定量检测马立克氏病病毒血清3型毒株时，按照以下步骤进行：
(1)提取待检样品、阳性提取对照品及阴性提取对照品的总DNA；
(2)将标准品质粒做1×107copies/μL到1×10-1copies/μL 10倍系列稀释后作为模板，以权利要求1、6、7所述的特异性引物、探针、反应体系和条件进行荧光定量PCR，建立标准曲线；
(3)以步骤(1)提取的总DNA为模板，以所述的特异性引物、探针、反应体系和条件进行荧光定量PCR；
(4)根据标准曲线对待检样品中的病毒拷贝数进行定量；
(5)若用于定性检测，则无需构建标准曲线。
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