CN108913813B - 用于鉴别DAdV-2和DAdV-3的引物组 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于鉴别DAdV‑2和DAdV‑3的引物组,属于禽病学研究领域。采用了如SEQ ID NO.1‑2所示的引物组(2条引物),对鸭群中的属于腺病毒科禽腺病毒属的两种鸭源禽腺病毒(DAdV‑2和DAdV‑3)的鉴别诊断方法,本发明基于DAdV‑2和DAdV‑3的pVⅢ基因特点,建立一种仅需一套引物组(2条引物)的检测方法,即可科学对DAdV‑2和DAdV‑3进行鉴别,为在鸭群中开展DAdV‑2和DAdV‑3分子流行病毒学调查和科学防控相关疫病提供技术支撑,具有十分重要的研究意义。
Description
技术领域
本发明属于禽病学研究领域,具体涉及用于鉴别DAdV-2和DAdV-3的引物组。
背景技术
根据国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy ofViruses,ICTV)的最新分类(https://talk.ictvonline.org/),腺病毒科(Family:Adenoviridae)下设5个属(Genera),分别为富AT腺病毒属(Genus: Atadenovirus)、禽腺病毒属(Genus: Aviadenovirus)、鱼腺病毒属(Genus: Ichtadenovirus)、哺乳动物腺病毒属(Genus: Mastadenovirus)和唾液酸酶病毒属(Genus: Siadenovirus)。
研究发现,禽类中存在多种腺病毒感染,其中感染鸡的腺病毒有5种:禽腺病毒A型(Fowl aviadenovirus A,FAdV-A)、禽腺病毒B型(Fowl aviadenovirus B,FAdV-B)、禽腺病毒C型(Fowl aviadenovirus C,FAdV-C)、禽腺病毒D型(Fowl aviadenovirus D,FAdV-D)、禽腺病毒E型(Fowl aviadenovirus E,FAdV-E),均属于禽腺病毒属。感染火鸡(Turkey)的腺病毒有4种,分别属于腺病毒科的两个属,其中火鸡腺病毒B型(Turkey aviadenovirusB)、火鸡腺病毒C型(Turkey aviadenovirus C)和火鸡腺病毒D型(Turkey aviadenovirusD)属于禽腺病毒属;而火鸡唾液酸酶病毒A型(Turkey siadenovirus A)属于唾液酸酶病毒属。感染鹦鹉(Psittacine)的腺病毒有2种,分别属于腺病毒科的两个属,其中鹦鹉富AT腺病毒属A型(Psittacine atadenovirus A)属于富AT腺病毒属;而鹦鹉腺病毒B型(Psittacine aviadenovirus B)属于禽腺病毒属。
当前研究表明,鸭群中已报道的腺病毒有属于富AT腺病毒属的鸭腺病毒A型(duckadenovirus A,缩写为DAdV-A)。2014年,随着高通量技术的发展,Marek A等测定了1株鸭源腺病毒(GR株,GenBank登录号NC024486)全基因组序列,并将其命名为鸭腺病毒2型(duckadenovirus 2,DAdV-2),属于禽腺病毒属新成员(Marek A, Kaján GL, Kosiol C, et al.Complete genome sequences of pigeon adenovirus 1 and duck adenovirus 2 extendthe number of species within the genus Aviadenovirus[J]. Virology, 2014, 462-463: 107-114.),随后ICTV将其科学命名为鸭腺病毒B型(duck aviadenovirus B,用来区别鸭腺病毒A型,为了便于研究的一致性,本发明还是将其写为DAdV-2)。随后2014年以来,在我国番鸭中出现一种新的鸭腺病毒(CH-GD-2014株,GenBank登录号KR135164),该病毒和鸭腺病毒2型(duck adenovirus 2)GR株存在以下明显区别:①其全基因组序列和GR株的核苷酸同源性仅为92.3%;②CH-GD-2014株和GR株的Hexon基因的核苷酸同源性仅为76.6%,低于80.0%;③CH-GD-2014株有2个纤突蛋白(Fiber 1、Fiber 2),而GR株只有1个纤突蛋白(Fiber)。基于上述特征表明在我国鸭群中流行一种新的鸭腺病毒,并将其命名为鸭腺病毒3型(duck adenovirus 3,DAdV-3)(周镇海.鸭腺病毒3型基因组序列分析及致病性研究[D].华南农业大学硕士论文,2016.)。上述研究表明,当前在鸭群中已发现3种腺病毒:属于富AT腺病毒属的DAdV-A、属于禽腺病毒属的DAdV-2和DAdV-3。
腺病毒颗粒为无囊膜、核衣壳呈二十面体对称、线性、双链DNA病毒,其基因组全长约为33kd左右。pVⅢ蛋白是腺病毒的主要结构蛋白,位于衣壳的内面,与六邻体紧密相连,属六邻体相关蛋白,内有3个蛋白酶切位点,其对完整病毒粒子的形成是必不可少的,且与其他腺病毒和哺乳动物腺病毒的同源性差别很大。利用分子生物学软件对DAdV-2和DAdV-3的pVⅢ基因分析比对发现,DAdV-2代表株(GR株)的pVⅢ基因全长为786bp,编码261个aa残基的pVⅢ蛋白;DAdV-3代表株(CH-GD-2014株)的pVⅢ基因全长为732bp,编码243个aa残基的pVⅢ蛋白,其核苷酸同源性为97.3%。
PCR技术因其具有高效性、系统性和经济简便性被广泛应用于多种病原微生物的检测。一般而言,对两个病原进行鉴别诊断,需要针对2个病原分别设计引物(即共需要4条引物),来建立鉴别诊断方法。本发明的目的是建立针对禽腺病毒属的2中鸭源腺病毒(DAdV-2和DAdV-3)得鉴别诊断PCR方法,为解决上述问题,本发明基于DAdV-2和DAdV-3的pVⅢ基因特点,建立一种仅需一套引物组(2条引物)的检测方法,即可科学对DAdV-2和DAdV-3进行鉴别,为鸭群中开展属于禽腺病毒属的DAdV-2和DAdV-3的2种病原的流行病学调查奠定基础,具有十分重要的研究意义。
发明内容
本发明的目的在于提供用于鉴别DAdV-2和DAdV-3的引物组,建立一种仅需一套引物组(2条引物)的检测方法,即可科学对DAdV-2和DAdV-3进行鉴别,为鸭群中开展属于禽腺病毒属的DAdV-2和DAdV-3的2种病原的流行病学调查奠定基础。
为实现上述目的采用以下技术方案:
用于鉴别DAdV-2和DAdV-3的引物组,所述引物组如下:
DAdV-23-F:5’- CGATCAACAACCCTACGCCAAC -3’,
DAdV-23-R:5’- CTGAGCTGTACGCGACCTT -3’ 。
按照DreamTaq Green PCR Master Mix(2×)试剂盒推荐的的50μL体系进行扩增,其中2×PCR Master Mix扩增反应液25 μL、引物组(DAdV-23-F和DAdV-23-R,10μM)分别为1.0 μL、提取的核酸模板1.0 μL、补充灭菌去离子水至终体积50μL,混匀后进行PCR扩增。
扩增条件为95 ℃预变性3 min后进入循环,95 ℃变性30 s 、△T(52 ℃-62 ℃)退火30 s、72 ℃延伸50s,35个循环结束后,72℃终延伸10 min,反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。△T(52 ℃-62 ℃)表示退火温度在此区间进行优化,经优化后的最佳退火温度为54 ℃。
本发明的另一目的是提供所述的引物组在制备检测DAdV-2和DAdV-3试剂盒中的应用。
本发明的优点在于:
本发明基于DAdV-2和DAdV-3的pVⅢ基因特点,建立一种仅需一套引物组(2条引物)的PCR方法,结果判定如下:当目的条带约213bp时判为DAdV-2阳性;当目的条带约159bp时判为DAdV-3阳性;当目的条带约213bp和159bp时判为DAdV-2和DAdV-3混合感染阳性;本发明方法简单实用、方便快捷,即可科学对DAdV-2和DAdV-3进行鉴别,具有十分重要的研究意义。
附图说明
图1 DAdV-3与DAdV-2的基因缺失区。
图2 PCR产物电泳分析,其中M:DL500分子量标准;1:DAdV-2;2:DAdV-3;3:DAdV-2和DAdV-3混合感染;4:DEV;5:MDPV;6:DuCV;7:GPV;8:E. coli;9:R.A.;10:S.S.;11:P.M.。
具体实施方式
实施例1
1、材料
1.1 毒株和菌株
试验用病原DAdV-3、DAdV-2、鸭肠炎病毒(DEV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鸭圆环病毒(DuCV)、鸭源鹅细小病毒(GPV);试验用对照菌株鸭大肠杆菌(E. coli)、鸭疫里氏杆菌(R.A.)、沙门氏菌(S.S.)和鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.),均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。
引物设计
根据美国国家生物技术信息中心(National Center of BiotechnologyInformation,NCBI)数据库GenBank上腺病毒科DAdV-2代表株GR株(NC024486)、 DAdV-3代表株(CH-GD-2014株)的pVⅢ基因,利用Lasergene DNAStar MegAlign进行核苷酸系列分析比对,确定DAdV-2和DAdV-3的pVⅢ基因核苷酸同源性为97.3%,但DAdV-3比DAdV-2存在一个54bp连续核苷酸序列(GCGGGTGGGGCGATTCCGCTCTACACGAGCGGATCGGAAGGTGACGTGCAATTA)缺失(图1)。
针对此基因缺失区,利用引物设计软件Oligo 7.0设计一套引物组(2条),跨过该基因缺失区,设计的特异性引物序列为:
DAdV-23-F:5’- CGATCAACAACCCTACGCCAAC -3’,
DAdV-23-R:5’- CTGAGCTGTACGCGACCTT -3’ 。
主要试剂
DreamTaq Green PCR Master Mix(2×)购自Thermo Scientific公司,EasyPureGenomic DNA Kit、EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit均购自北京全式金生物技术有限公司。
试验方法的建立
2.1 基因组DNA的提取
DAdV-2、DAdV-3、DEV、MDPV、DuCV、GPV按照EasyPure Genomic DNA Kit试剂盒的方法提取相应的基因组DNA,-80℃冻存备用。
E. coli、R.A.、S.S.和P.M.按照 EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit试剂盒的方法提取相应的基因组DNA,-80℃冻存备用。
2.2 反应液的配置和退火温度的优化
按照DreamTaq Green PCR Master Mix(2×)试剂盒推荐的的50μL体系进行扩增,其中2×PCR Master Mix扩增反应液25 μL、引物DAdV-23-F(10μM)2.0 μL、引物DAdV-23-R(10μM)1.0 μL、提取的核酸模板(DAdV-3、DAdV-2、DAdV-3和DAdV-2混合)各1.0 μL、补充灭菌去离子水至终体积50μL,混匀后进行PCR扩增。
扩增条件为95 ℃预变性3 min后进入循环,95 ℃变性30 s 、△T(52 ℃-62 ℃)退火30 s、72 ℃延伸50s,35个循环结束后,72℃终延伸10 min,反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。△T(52 ℃-62 ℃)表示退火温度在此区间进行优化。经优化后的最佳退火温度为54 ℃。
结果可见(图2),当模板仅加入DAdV-2时,出现大小为213bp的条带(第1泳道);当模板仅加入DAdV-3时,出现大小为159bp的条带(第2泳道);当模板加入DAdV-2和DAdV-3混合时,出现大小为213bp和159bp的两条带(第3泳道)。
2.3 特异性试验
将优化后的PCR体系和条件,对DEV、MDPV、DuCV、GPV、E. coli、R.A.、S.S.和P.M.进行扩增,均未见扩增条带。结果见图2,DEV(第4泳道)、MDPV(第5泳道)、DuCV(第6泳道)、GPV(第7泳道)、E. coli(第8泳道)、R.A.(第9泳道)S.S.(第10泳道)和P.M.(第11泳道),表明建立的方法特异性强,对常见水禽病原均无交叉反应。
临床试验
对179份送检鸭源病料按照常规方法研磨处理后,利用EasyPure Genomic DNAKit提取相应的核酸DNA,利用优化后的PCR方法进行DAdV-2和DAdV-3感染的检测。结果可见,检测到3份DAdV-2感染阳性,阳性率为1.68%;检测到15份DAdV-3感染阳性,阳性率为8.38%;检测到2份DAdV-2和DAdV-3共感染阳性,阳性率为1.12%。
将PCR反应结束后的阳性目的片段利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(DP209,天根生化科技(北京)有限公司)分别进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒(CT111-01,北京全式金生物技术有限公司)说明书将PCR扩增基因片段克隆到pEASY-T1载体上,随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素(含量为100 μg/mL)抗性的LB液体培养基培养14 h后,利用快速质粒小提试剂盒(DP105,天根生化科技(北京)有限公司)提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物和条件对提取的质粒分别进行PCR鉴定,将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术(北京)有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证,均为相应的DAdV-2和DAdV-3的pVⅢ片段,其中DAdV-2阳性片段和DAdV-2(GR株)的pVⅢ基因同源性在99.1%以上;DAdV-3阳性片段和DAdV-3(CH-GD-2014株)的pVⅢ基因同源性在99.3%以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 用于鉴别DAdV-2和DAdV-3的引物组
<130> 2
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgatcaacaa ccctacgcca ac 22
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctgagctgta cgcgacctt 19
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcgggtgggg cgattccgct ctacacgagc ggatcggaag gtgacgtgca atta 54
Claims (2)
1.用于鉴别DAdV-2和DAdV-3的引物组,其特征在于:所述引物组如下:
DAdV-23-F:5’- CGATCAACAACCCTACGCCAAC -3’,
DAdV-23-R:5’- CTGAGCTGTACGCGACCTT -3’ 。
2.权利要求1所述的引物组在制备检测DAdV-2和DAdV-3试剂盒中的应用。
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