CN108950070A - 鉴别鸭腺病毒c型和鸭腺病毒b型的pcr引物及其鉴别方法以及应用 - Google Patents

鉴别鸭腺病毒c型和鸭腺病毒b型的pcr引物及其鉴别方法以及应用 Download PDF

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CN108950070A CN201810848554.5A CN201810848554A CN108950070A CN 108950070 A CN108950070 A CN 108950070A CN 201810848554 A CN201810848554 A CN 201810848554A CN 108950070 A CN108950070 A CN 108950070A
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黄瑜
陈珍
朱春华
刘斌琼
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Abstract

本发明涉及一种鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物及其鉴别方法以及应用，所述引物为：上游引物F：5’‑GCTAGACAGATCGAGGGAGG‑3’；下游引物R：5’‑GAAGAAGAGCAGAGTTGGCG‑3’。鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的方法：利用上述引物，以待检病毒样本的DNA为模板，进行PCR扩增，之后利用限制性内切酶SpeⅠ对PCR扩增产物进行酶切，根据酶切产物的片段数，特异性地对鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型进行鉴别。本发明的PCR引物特异性强，能够对鸭腺病毒C型以及鸭腺病毒B型进行有效的扩增，本发明的鉴定方法简单、经济、方便高效、准确率较高。

Description

鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物及其鉴别方法以 及应用
技术领域
本发明涉及一种鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物及其鉴别方法以及应用。
背景技术
根据国际病毒分类委员会(ICTV)分类，腺病毒科(Adenoviridae)下设5个属(Genus)：禽腺病毒属(Aviadenovirus)、富AT腺病毒属(Atadenovirus)、唾液酸酶腺病毒属(Siadenovirus)、哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)和美洲白鲟腺病毒属(Ichtadenovirus)。腺病毒为双链DNA无囊膜病毒，呈二十面体对称，衣壳由252个壳粒组成，其中240个为六邻体(非顶点壳粒)，12个则是五邻体基底(顶点壳粒)，每个五邻体基底结合着1根至2根纤突。不同腺病毒的基因组大小有所差异，一般在26-45kb之间。按照腺病毒DNA复制的起始时间不同，其基因组可以划分为早期转录基因(E)和晚期转录基因(L)。早期转录基因包含有El(E1A和E1B)、E2(E2A和E2B)、E3和E4四个区，主要负责调节控制病毒的增殖复制。晚期转录基因包括Ll、L2、L3、L4和L5共五个区，主要功能为负责编码病毒的结构蛋白。
鸭腺病毒A型(Duck atadenovirus A，DAdV-A)属于腺病毒科(Adenoviridae)、富AT腺病毒属，也称为产蛋下降综合征病毒(Egg drop syndrome virus，EDSV)，其基因组大小约为33.2kb。当鸭群免疫力降低时，感染EDSV，会出现呼吸道症状。鸭腺病毒B型(Duckaviadenovirus B，DAdV-B)属于腺病毒科(Adenoviridae)、禽腺病毒属(Aviadenovirus)，基因组大小约为43.7kb。该病毒于1977年从法国爆发疾病的番鸭中分离得到，发病鸭临床表现为消瘦、跛行。鸭腺病毒C型(Duck aviadenovirus C，DAdV-C)是近年来新发现的鸭源腺病毒，属于腺病毒科(Adenoviridae)、禽腺病毒属(Aviadenovirus)，该病毒感染主要引起鸭出现肝脏肿大、出血及坏死，其基因组大小约为43.8kb。
鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型都属于禽腺病毒属(Aviadenovirus)，而且两者之间全基因组的核苷酸同源性高达91％，常规分子生物学方法(如普通PCR)不容易区分，亟待一种鉴别鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高敏感、高特异性且能快速鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物和应用以及鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：一种鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物，所述引物的序列如下：
上游引物F：5’-GCTAGACAGATCGAGGGAGG-3’
下游引物R：5’-GAAGAAGAGCAGAGTTGGCG-3’。
一种鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的方法：
利用上游引物F：5’-GCTAGACAGATCGAGGGAGG-3’和下游引物R：5’-GAAGAAGAGCAGAGTTGGCG-3’，以待检病毒样本的DNA为模板，进行PCR扩增，之后利用限制性内切酶SpeⅠ对PCR扩增产物进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物的片段数，特异性地对鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型进行鉴别诊断。
所述的鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物的应用，在制备区分鸭腺病毒C型与鸭腺病毒B型试剂盒上的应用。
所述的鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物的应用，在检测鸭腺病毒C型与鸭腺病毒B型感染情况方面的应用。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
1.本发明的PCR引物特异性强，能够对鸭腺病毒B型以及鸭腺病毒C型进行有效的扩增，而对其他如鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅细小病毒等家禽常见病原并不能扩增出DNA片段。
2.本发明根据鸭腺病毒B型和C型22K基因序列在342-347位的酶切位点不同，来设计特异性的引物和选取酶切位点。可达到仅需一组引物，并结合两种鸭腺病毒22K基因核苷酸序列特征，利用SpeⅠ限制性内切酶进行酶切分析，即可特异性地对鸭腺病毒B型和C型进行鉴别诊断，当前国内外未见相关研究报道，本发明可填补相关领域空白。
3.本发明的鉴定方法简单、经济、方便高效、准确率较高，可用于鉴别鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型。
附图说明
图1是鸭腺病毒B型和C型酶切位点的比较图。
图2是本发明对鸭腺病毒B型和C型PCR扩增和酶切的电泳图。
图3是目的片段测序结果分析图。
图4是利用另一引物对鸭腺病毒B型和C型PCR扩增和酶切的电泳图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
一种鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物，所述引物的序列如下：
上游引物F：5’-GCTAGACAGATCGAGGGAGG-3’
下游引物R：5’-GAAGAAGAGCAGAGTTGGCG-3’。
经分子生物学软件分析鸭腺病毒B型和C型22K基因的核苷酸序列发现，在342-347位这两种鸭腺病毒的酶切位点不同，鸭腺病毒B型的酶切位点为ACTAGT，能被SpeⅠ限制性内切酶所识别，而鸭腺病毒C型该位点的序列为CCTCGT(如图1所示)，不能被SpeⅠ限制性内切酶所识别。本发明就是根据鸭腺病毒B型和C型22K基因序列在342-347位的酶切位点不同，来设计特异性的引物和选取酶切位点。
本发明的PCR引物对鸭腺病毒B型和C型均可扩增，扩增条带大小均为459bp。鸭腺病毒B型扩增的PCR产物经SpeⅠ限制性内切酶酶切后，可切成2条片段，1条大小为286bp，另1条大小为173bp，而鸭腺病毒C型扩增的PCR产物经限制性内切酶SpeⅠ酶切后没有变化，还是原来PCR产物的片段。鸭腺病毒B型和C型混合扩增的PCR产物经限制性内切酶SpeⅠ酶切后，经琼脂糖凝胶电泳可显示3条带，其中1条大小为459bp的条带是鸭腺病毒C型PCR扩增后未被SpeⅠ酶切开的产物，另外2条片段(1条大小为286bp，另1条大小为173bp)是鸭腺病毒B型扩增的PCR产物经SpeⅠ酶酶切后的产物。根据琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物有1条带(459bp)、2条带(286bp和173bp)还是3条带(459bp、286bp和173bp)即可特异性地对鸭腺病毒B型和C型进行鉴别诊断。
为了对鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型进行准确的区分，本发明的发明人设计了多组引物，但经实验发现该组引物(上游引物F以及下游引物R)的特异性最好，能够有效地对鸭腺病毒B型的DNA以及鸭腺病毒C型的DNA进行扩增，而对其他如鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅细小病毒等家禽常见病原并不能扩增出DNA片段；之后结合SpeⅠ限制性内切酶酶切分析，能够清楚、快速、便捷的对鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型进行鉴别。
例如：本发明的发明人还设计了如下引物：
F1:ATGACCCAAAAGCAAGTGGA
R1:CCCTTGAGAATTTTRCACGC，
以该组引物对制备的鸭腺病毒B型的DNA以及鸭腺病毒C型的DNA，利用优化的条件进行PCR检测，反应结束后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4中的1、2、3所示，图4中M为DL2000分子量标准；1为鸭腺病毒B型PCR扩增；2为鸭腺病毒C型PCR扩增；3为鸭腺病毒B型和C型混合PCR扩增；7为阴性对照，从图4大致可知：鸭腺病毒B型和C型均可扩增，扩增条带大小均为443bp。
对鸭腺病毒B型的PCR扩增产物、鸭腺病毒C型的PCR扩增产物以及鸭腺病毒B型和C型混合PCR扩增产物按酶切反应体系及反应条件进行SpeⅠ酶切，并将酶切后的产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4中的4、5以及6所示，图4中，4为鸭腺病毒B型PCR扩增产物的酶切产物；5为鸭腺病毒C型PCR扩增产物的酶切产物；6为鸭腺病毒B型和C型混合PCR扩增产物的酶切产物；从图4大致可知，鸭腺病毒B型扩增的PCR产物经SpeⅠ限制性内切酶酶切后，可切成2条片段，1条大小为342bp，另1条大小为101bp；而鸭腺病毒C型扩增的PCR产物经限制性内切酶SpeⅠ酶切后没有变化，还是原来PCR产物的片段；鸭腺病毒B型和C型混合扩增的PCR产物经限制性内切酶SpeⅠ酶切后，电泳可显示3条带，其中1条大小为443bp的条带是鸭腺病毒C型PCR扩增后未被SpeⅠ酶切开的产物，另外2条片段(1条大小为342bp，另1条大小为101bp)是鸭腺病毒B型扩增的PCR产物经SpeⅠ酶酶切后的产物。
虽然利用引物F1、R1与SpeⅠ限制性内切酶相配合可以勉强将鸭腺病毒B型和C型进行区分鉴别，但是深入研究图4，可以看出PCR扩增后有引物二聚体产生，PCR产物经酶切后电泳，鸭腺病毒B型的PCR产物酶切成的较大片段与鸭腺病毒C型未切开的PCR产物条带大小较接近，不好区分，而且鸭腺病毒B型的PCR产物酶切成的较小片段与PCR生成的引物二聚体条带相似，不易区分。所以引物的设计很关键，引物不仅需要能同时扩增鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型，而且要保证酶切后的条带大小容易区分，还要尽量不产生引物二聚体，以免影响后面酶切结果的分析。
一种鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的方法，
利用上游引物F：5’-GCTAGACAGATCGAGGGAGG-3’和下游引物R：5’-GAAGAAGAGCAGAGTTGGCG-3’，以待检病毒样本的DNA为模板，进行PCR扩增，之后利用限制性内切酶SpeⅠ对PCR扩增产物进行酶切，建立PCR-RFLP检测方法；
所述引物对鸭腺病毒B型的DNA以及鸭腺病毒C型的DNA均可扩增，扩增条带大小均为459bp，对鸭腺病毒B型的DNA以及鸭腺病毒C型的DNA扩增的PCR产物进行SpeⅠ限制性内切酶酶切，根据琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物的片段数，特异性地对鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型进行鉴别诊断。
所述的鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的方法，它包括以下步骤：
(1)核酸的制备：制备病毒样本的DNA；
(2)PCR扩增反应：
利用上游引物F：5’-GCTAGACAGATCGAGGGAGG-3’和下游引物R：5’-GAAGAAGAGCAGAGTTGGCG-3’，以步骤(1)得到的DNA作为模板，进行PCR扩增反应；
(3)PCR产物的酶切：
将步骤(2)扩增的PCR产物进行SpeⅠ酶切反应；
(4)琼脂糖凝胶电泳：
对步骤(3)酶切所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳；观察琼脂糖凝胶电泳，鸭腺病毒B型的DNA扩增的PCR产物经SpeⅠ限制性内切酶酶切后，可切成2条片段，1条大小为286bp，另1条大小为173bp；鸭腺病毒C型的DNA扩增的PCR产物经限制性内切酶SpeⅠ酶切后没有变化，还是原来PCR产物的片段，即大小为459bp的片段；对于鸭腺病毒B型的DNA和鸭腺病毒C型的DNA混合扩增的PCR产物经限制性内切酶SpeⅠ酶切后，琼脂糖凝胶电泳可显示3条片段，其中1条大小为459bp的片段是鸭腺病毒C型的DNA经PCR扩增后未被SpeⅠ酶切开的产物；另2条片段是鸭腺病毒B型的DNA扩增的PCR产物经SpeⅠ酶酶切后的产物，且2条片段中，1条大小为286bp，另1条大小为173bp。
其中，步骤(2)所述PCR扩增反应的优化体系为：在50μL体系中含有以下成分：
步骤(2)所述PCR扩增反应的反应条件为：94℃5min，预变性；94℃30s，53℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃10min；10℃hold；
步骤(3)所述酶切反应的体系为：在30μL体系中含有以下成分：
步骤(3)所述酶切反应的反应条件为：37℃水浴反应5min。
下面结合具体实施例对本发明的内容作更细致的阐述：
实施例一：
1.材料：
1.1实验试剂与耗材：200μL PCR管购自Corning公司；病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit、细菌基因组提取试剂盒EasyPure Bacteria Genomic DNAKit均购自北京全式金生物技术有限公司；Premix TaqTM(TaKaRa TaqTM Version 2.0plusdye)PCR试剂盒和QuickCutTM SpeⅠ限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.2毒株：鸭腺病毒C型(DAdV-C)、鸭瘟病毒(DPV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鹅细小病毒(GPV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、鸭源大肠杆菌(E.coli)、鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。由于未获得鸭腺病毒B型病毒株，所以鸭腺病毒B型的22K基因(DNA)由生工生物工程(上海)股份有限公司直接合成。
2.鸭腺病毒B型和C型22K基因序列分析、酶切位点选择及引物设计：
2.1基因序列分析和酶切位点选择
结合软件Oligo7和MegAlign比较分析鸭腺病毒B型和C型22K基因核苷酸序列的差异，发现在342-347位这两种鸭腺病毒的酶切位点不同，如图1所示，鸭腺病毒B型的酶切位点为ACTAGT，能被SpeⅠ限制性内切酶所识别，而鸭腺病毒C型该位点的序列CCTCGT，不能被SpeⅠ限制性内切酶所识别，所以选取该位点作为区分鸭腺病毒B型和C型的特异性酶切位点。
2.2引物设计
利用引物设计软件Oligo7，针对鸭腺病毒B型和C型22K基因设计引物，引物序列如下：
上游引物F：5’-GCTAGACAGATCGAGGGAGG-3’
下游引物R：5’-GAAGAAGAGCAGAGTTGGCG-3’
该引物需满足以下特征：①该引物对鸭腺病毒B型和C型均可扩增，扩增条带大小均为459bp。②鸭腺病毒B型扩增的PCR产物经SpeⅠ限制性内切酶酶切后，可切成2条片段，1条大小为286bp，另1条大小为173bp，而鸭腺病毒C型扩增的PCR产物经限制性内切酶SpeⅠ酶切后没有变化，还是原来PCR产物的片段。③鸭腺病毒B型和C型混合扩增的PCR产物经限制性内切酶SpeⅠ酶切后，电泳可显示3条带，其中1条大小为459bp的条带是鸭腺病毒C型PCR扩增后未被SpeⅠ酶切开的产物，另外2条片段(1条大小为286bp，另1条大小为173bp)是鸭腺病毒B型扩增的PCR产物经SpeⅠ酶酶切后的产物。根据琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物有1条带(459bp)、2条带(286bp和173bp)还是3条带(459bp、286bp和173bp)即可特异性地对鸭腺病毒B型和C型进行鉴别诊断。
3.PCR和SpeⅠ限制性内切酶酶切方法建立
3.1核酸的制备
核酸的提取：利用北京全式金生物技术有限公司的ViralDNA/RNAKit核酸提取试剂盒，按照说明书的操作方法提取鸭腺病毒C型(AH06株)、鸭瘟病毒(DPV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鹅细小病毒(GPV)、减蛋综合征病毒(EDSV)的核酸。利用北京全式金生物技术有限公司的细菌基因组提取试剂盒EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit，按照说明书的操作方法提取鸭源大肠杆菌(E.coli)、鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.)的核酸。
鸭腺病毒B型的22K基因的制备：由于未获得鸭腺病毒B型病毒株，所以鸭腺病毒B型的22K基因(DNA)由生工生物工程(上海)股份有限公司直接合成。
3.2 PCR反应及其条件的优化
本发明使用的Premix TaqTM(TaKaRa TaqTM Version 2.0plus dye)PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，在结合试剂盒推荐的反应体系配置的基础上对PCR反应液进行了优化，优化出的50μL最佳反应体系的具体配置方法见表1，最佳反应条件为：94℃5min，预变性；94℃30s，53℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃10min；10℃hold。
表1 PCR反应液的配置
3.3 PCR产物的酶切
将PCR产物进行SpeⅠ酶切分析。按照宝生物工程(大连)有限公司的QuickCutTM SpeⅠ试剂盒推荐的酶切反应体系(30μL体系，具体配置见表2)配置反应液。反应条件：37℃水浴反应5min。酶切结果见图2。
表2酶切反应液的配置
4.PCR的特异性试验
以制备的DNA为模板，利用优化的条件进行PCR检测，反应结束后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，在图2中，M为DL2000分子量标准；1为鸭腺病毒B型PCR扩增；2为鸭腺病毒C型PCR扩增；3为鸭腺病毒B型和C型混合PCR扩增；7为阴性对照；8为鸭瘟病毒(DPV)；9为番鸭细小病毒(MDPV)；10为鹅细小病毒(GPV)；11为减蛋综合征病毒(EDSV)；12为鸭源大肠杆菌(E.coli)；13为鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.)。
从图2可知：鸭腺病毒B型和C型均可扩增，扩增条带大小均为459bp。对家禽常见病原(DPV、MDPV、GPV、EDSV、E.coli、P.M.)进行检测，没有扩增出任何条带，说明本发明的PCR引物的特异性好。
对鸭腺病毒B型的PCR扩增产物、鸭腺病毒C型的PCR扩增产物以及鸭腺病毒B型和C型混合PCR扩增产物按上述酶切反应体系及反应条件进行SpeⅠ酶切，并将酶切后的产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2中的4、5以及6所示，图2中，4为鸭腺病毒B型PCR扩增产物的酶切产物；5为鸭腺病毒C型PCR扩增产物的酶切产物；6为鸭腺病毒B型和C型混合PCR扩增产物的酶切产物；从图2可知，鸭腺病毒B型扩增的PCR产物经SpeⅠ限制性内切酶酶切后，可切成2条片段，1条大小为286bp，另1条大小为173bp；而鸭腺病毒C型扩增的PCR产物经限制性内切酶SpeⅠ酶切后没有变化，还是原来PCR产物的片段；鸭腺病毒B型和C型混合扩增的PCR产物经限制性内切酶SpeⅠ酶切后，电泳可显示3条带，其中1条大小为459bp的条带是鸭腺病毒C型PCR扩增后未被SpeⅠ酶切开的产物，另外2条片段(1条大小为286bp，另1条大小为173bp)是鸭腺病毒B型扩增的PCR产物经SpeⅠ酶酶切后的产物。
5临床应用
使用本研究建立的PCR和SpeⅠ限制性内切酶酶切方法和设计的引物对前期鉴定的鸭腺病毒C型FJ06株、AH10株和人工合成的鸭腺病毒B型的22K基因进行检测，均和预期的相符，经特异性的PCR检测引物F2：5’-ACCCAAAAGCAAGTGGACGC-3’，R2:5’-CGGARTCACCACCTTCCTCG-3’检测，也为鸭源禽腺病毒阳性，阳性符合率为100％。将目的片段进行克隆测序，序列分析也符合上述特征，如图3所示。
对临床送检的86份鸭源病料样品进行检测后发现，鸭腺病毒C型有2份阳性，阳性率为2.3％，未检测到鸭腺病毒B型阳性样品。
需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物及其鉴别方法以及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gctagacaga tcgagggagg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gaagaagagc agagttggcg 20

Claims (9)

1.一种鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物，其特征在于：所述引物的序列如下：
上游引物F：5’-GCTAGACAGATCGAGGGAGG-3’
下游引物R：5’-GAAGAAGAGCAGAGTTGGCG-3’。
2.一种鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的方法，其特征在于：
利用上游引物F：5’-GCTAGACAGATCGAGGGAGG-3’和下游引物R：5’-GAAGAAGAGCAGAGTTGGCG-3’，以待检病毒样本的DNA为模板，进行PCR扩增，之后利用限制性内切酶SpeⅠ对PCR扩增产物进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物的片段数，特异性地对鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型进行鉴别诊断。
3.根据权利要求2所述的鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(1)核酸的制备：制备病毒样本的DNA；
(2)PCR扩增反应：
利用上游引物F：5’-GCTAGACAGATCGAGGGAGG-3’和下游引物R：5’-GAAGAAGAGCAGAGTTGGCG-3’，以步骤(1)得到的DNA作为模板，进行PCR扩增反应；所述引物对鸭腺病毒B型的DNA以及鸭腺病毒C型的DNA均可扩增，扩增条带大小均为459bp；
(3)PCR产物的酶切：
将步骤(2)扩增的PCR产物进行SpeⅠ酶切反应；
(4)琼脂糖凝胶电泳：
对步骤(3)酶切所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳；观察琼脂糖凝胶电泳，鸭腺病毒B型的DNA扩增的PCR产物经SpeⅠ限制性内切酶酶切后，可切成2条片段，1条大小为286bp，另1条大小为173bp；鸭腺病毒C型的DNA扩增的PCR产物经限制性内切酶SpeⅠ酶切后没有变化，还是原来PCR产物的片段，即大小为459bp的片段；对于鸭腺病毒B型的DNA和鸭腺病毒C型的DNA混合扩增的PCR产物经限制性内切酶SpeⅠ酶切后，琼脂糖凝胶电泳可显示3条片段，其中1条大小为459bp的片段是鸭腺病毒C型的DNA经PCR扩增后未被SpeⅠ酶切开的产物；另2条片段是鸭腺病毒B型的DNA扩增的PCR产物经SpeⅠ酶酶切后的产物，且2条片段中，1条大小为286bp，另1条大小为173bp。
4.根据权利要求3所述的鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的方法，其特征在于：步骤(2)所述PCR扩增反应的优化体系为：在50μL体系中含有以下成分：
5.根据权利要求3所述的鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的方法，其特征在于：步骤(2)所述PCR扩增反应的反应条件为：94℃5min，预变性；94℃30s，53℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃10min；10℃hold。
6.根据权利要求3所述的鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的方法，其特征在于：步骤(3)所述酶切反应的体系为：在30μL体系中含有以下成分：
7.根据权利要求3所述的鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的方法，其特征在于：步骤(3)所述酶切反应的反应条件为：37℃水浴反应5min。
8.根据权利要求1所述的鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物的应用，其特征在于：在制备区分鸭腺病毒C型与鸭腺病毒B型试剂盒上的应用。
9.根据权利要求1所述的鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物的应用，其特征在于：在检测鸭腺病毒C型与鸭腺病毒B型感染情况方面的应用。
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