CN107841575A - 一种区分四种血清型禽腺病毒i群的纳米多重pcr方法 - Google Patents

一种区分四种血清型禽腺病毒i群的纳米多重pcr方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法，根据GenBank公布的4、8a、8b和11型禽腺病毒I群六邻体基因序列，设计合成各型特异性引物；提取基因后进行纳米多重PCR扩增，PCR反应条件为95℃预变性5min，94℃30s，53℃退火1min，72℃1min49s，30个循环；72℃延伸10min；纳米多重PCR扩增反应结束后，取PCR产物，以DL2000为Maker，1％琼脂糖凝胶电泳，观察扩增片段大小，确定病毒的血清型。本发明方法明显缩短检测时间；加入纳米颗粒，在同时检测到四种血清型病毒的情况下，敏感性较普通多重PCR至少提高10倍；特异性强、敏感性高、稳定性好，能快速、敏感、准确地对我国主要流行血清型的禽腺病毒I群进行分型。

Description

一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法
技术领域:
本发明涉及一种纳米多重PCR方法，特别是涉及一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法，属于动物病毒检测技术领域。
背景技术：
禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)I群主要包括12个血清型，Changjing Li等(2016)对我国2006年-2016年来临床禽腺病毒I群的分离毒株Hexon基因进行了测序分析，表明我国主要流行的血清型有4、8a、8b和11型，禽腺病毒I群对肉鸡的高感染率和高死亡率给养鸡业造成了严重的经济损失。这四种血清型禽腺病毒均引起肉鸡出现严重的肝脏炎症反应，引起的临床症状极为相似，这为临床不同血清型禽腺病毒I群感染的检测带来困难。此外，不同血清型禽腺病毒Ⅰ群之间不能形成交叉保护，故建立临床禽腺病毒Ⅰ群感染的检测方法并对感染病毒进行分型，对禽腺病毒Ⅰ群感染的预防与控制具有十分重要的意义。
血清学检测方法是禽腺病毒I群分型的常规方法，但缺乏标准抗血清，使得本方法应用受限。目前主要通过分子生物学方法进行分型，主要包括：PCR结合测序，通过比较分析基因序列对毒株进行基因分型；根据病毒基因组限制性酶切图谱分析分为不同的基因型；高分辨熔解曲线的基因进行分型。这三种方法中，其中第一种为目前最常用的分型方法，但这三种方法都需要通过PCR对基因进行扩增后，进行测序、酶切和荧光等相关分析，故由于费时、需要特殊仪器及价格昂贵等原因，不适合于临床大量样品中禽腺病毒I群的分型鉴定。
建立简便、快速的临床禽腺病毒I群感染的分型检测方法，关键在于缩短检测时间、去除繁琐的后续分析、且能一次性准确确定感染病毒的血清型。目前，有关禽腺病毒I群的通用检测方法已有报道，但现有方法中中尚未见有对我国主要流行的4、8a、8b和11型禽腺病毒I群的快速简便的分型检测方法的公开。
多重PCR分型方法可通过一次PCR扩增即可确定血清型，是一种快速、准确的分型方法。为提高普通多重PCR检测的敏感性，加入纳米颗粒，建立纳米多重PCR分型方法，可用于临床禽腺病毒I群的分型确定。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有禽腺病毒I群分型方法中的繁琐、需特殊仪器、敏感性差等方面存在的缺陷，寻求提供一种快速、简便、准确的区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法。鉴于目前我国禽腺病毒I群主要流行的为4、8a、8b和11型，建立针对这四种血清型的多重PCR区分方法可以快速简便进行分型，为进一步提高分型方法的敏感性，将多重PCR分型方法中加入纳米颗粒，建立纳米多重PCR的分型方法，以提高检测的敏感性。
为了实现上述目的，本发明的一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法按照以下步骤操作：
一、纳米多重PCR引物设计：
根据GenBank公布的4、8a、8b和11型禽腺病毒I群六邻体基因序列，设计合成各型特异性引物；4型禽腺病毒I群引物(F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’R:5’-AAGAGGCCCGGGCAATGC-3’)；8a型禽腺病毒I群引物(F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’R:5’-AATGTTTGACGAGCTGATGGG-3’)；8b型禽腺病毒I群引物(F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’R:5’-ATGCTGCAGCTGTTGCCGTAG-3’)；11型禽腺病毒I群引物(F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’R:5’-ACTGCCGTCGTCTCGTCTAAG-3’)；
二、基因的提取：
取4、8a、8b和11型禽腺病毒I群标准毒株(购自中国兽药监察所)细胞研磨液400μL于1.5mLEP管中，加入400μL氯仿、600μL裂解液，混匀后4℃沉淀10min，之后12000r/min离心，取上清600μL，加入异丙醇800μL,4℃沉淀30min后12000r/min离心，弃上清后干燥，用20μL去离子水溶解；所述裂解液的组成为：硫氰酸胍9.456g，硫氰酸胺3.044g，醋酸钠13.60g，甘油5ml，苯酚38ml，水57ml；
三、纳米多重PCR扩增:
1、PCR反应体系：2×Nano-QPCRmix6μL(上海户实医药科技有限公司)，Taq enzyme0.2μL(大连宝生物工程有限公司)，上、下游混合引物各1μL，模板(制备的DNA溶液)0.5μL，去离子水3.3μL；所述上、下游混合引物同第一步；
2、PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃30s，53℃退火1min，72℃1min49s，30个循环；72℃延伸10min；
四、琼脂糖凝胶电泳：
纳米多重PCR扩增反应结束后，取PCR产物8μL，以DL2000为Maker，质量百分比为1％的琼脂糖凝胶电泳，观察扩增片段大小，确定病毒的血清型；扩增片段为2193bp为4型禽腺病毒I群，扩增片段为1045bp为8a型禽腺病毒I群，扩增片段为371bp为8b型禽腺病毒I群，扩增片段为674bp为11型禽腺病毒I群。
纳米多重PCR特异性试验：应用上述建立的纳米多重PCR方法分别对传染性支气管炎病毒(IBV)、减蛋综合症病毒(EDSV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)和新城疫(NDV)的cDNA进行检测，验证该方法的特异性。试验结果均未扩增出条带，仅扩增出4、8a、8b和11型四种血清型禽腺病毒I群的特异性条带，说明引物特异性良好。
敏感性试验：应用4、8a、8b和11型禽腺病毒I群标准毒株六邻体全基因建立的阳性质粒为模板，进行10倍系列稀释，进行纳米多重PCR和普通多重PCR最小检测浓度测定。在四种血清型病毒都同时检出的情况下，纳米多重PCR的敏感性比普通多重PCR至少提高10倍。
临床样品检测：取实验室分离保存的、并进行测序确定血清型的禽腺病毒I群临床毒株，进行纳米多重PCR分型检测。检测结果显示，纳米多重PCR分型结果与测序结果相一致，表明本研究建立的纳米多重PCR方法能够用于临床大量样本的检测。
本发明与现有技术相比，采用简便的多重PCR分型方法，无需对PCR产物进行繁琐的特殊处理和特殊仪器分析，明显缩短检测时间；加入纳米颗粒，在同时检测到四种血清型病毒的情况下，敏感性较普通多重PCR至少提高10倍；且不能扩增传染性支气管炎病毒、减蛋综合症病毒、H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒等临床感染鸡的主要病毒。纳米多重PCR方法特异性强、敏感性高、稳定性好，能快速、敏感和特异性地对我国主要流行血清型的禽腺病毒I群进行分型。
附图说明：
图1为本发明的四种血清型禽腺病毒I群的单一纳米PCR预设条件确定图；
图2为本发明的四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR反应条件优化图；
图3为本发明的四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR的特异性检测图；
图4为本发明的四种血清型禽腺病毒I群的多重PCR的敏感性检测图；
图5为本发明的四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR的敏感性检测图；
图6为本发明的四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR的稳定性检测图。
具体实施方式：
下面结合附图并通过具体实施例对本发明方法作进一步阐述。
实施例1、
一、纳米多重PCR引物合成：
根据表1中设计的4、8a、8b和11型禽腺病毒I群分型检测引物序列，合成各型特异性引物；4型禽腺病毒I群引物(F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’R:5’-AAGAGGCCCGGGCAATGC-3’)；8a型禽腺病毒I群引物(F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’R:5’-AATGTTTGACGAGCTGATGGG-3’)；8b型禽腺病毒I群引物(F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’R:5’-ATGCTGCAGCTGTTGCCGTAG-3’)；11型禽腺病毒I群引物(F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’R:5’-ACTGCCGTCGTCTCGTCTAAG-3’)；
二、基因的提取：
取4、8a、8b和11型禽腺病毒I群标准毒株(购自中国兽药监察所)细胞研磨液400μL于1.5mLEP管中，加入400μL氯仿、600μL裂解液，混匀后4℃沉淀10min；之后12000r/min离心10min，取上清600μL，加入异丙醇800μL,4℃沉淀30min后12000r/min离心10min；弃上清后干燥，用20μL去离子水溶解；所述裂解液的组成为：硫氰酸胍9.456g，硫氰酸胺3.044g，醋酸钠13.60g，甘油5ml，苯酚38ml，水57ml；
三、纳米多重PCR扩增:
1、PCR反应体系：2×Nano-QPCRmix6μL(上海户实医药科技有限公司)，Taq enzyme0.2μL(大连宝生物工程有限公司)，上、下游混合引物各1μL，模板(制备的DNA溶液)0.5μL，去离子水3.3μL；所述上、下游混合引物同第一步；
2、PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃30s，53℃退火1min，72℃1min49s，30个循环；72℃延伸10min；
4、8a、8b和11型禽腺病毒I群单一纳米PCR预设条件扩增结果如图1所示，M:DNAmaker2000；1:FAdV-8a；2:FAdV-4；3:FAdV-11；4:FAdV-8b；
纳米多重PCR反应条件优化如图2所示，M:2000maker；1-4:50℃；5-8:53℃；9-12:54℃；13-16:54℃；17-20:56℃；
四、琼脂糖凝胶电泳：
纳米多重PCR扩增反应结束后，取PCR产物8μL，以DL2000为Maker，质量百分比为1％的琼脂糖凝胶电泳，观察扩增片段大小，确定病毒的血清型；扩增片段为2193bp为4型禽腺病毒I群，扩增片段为1045bp为8a型禽腺病毒I群，扩增片段为371bp为8b型禽腺病毒I群，扩增片段为674bp为11型型禽腺病毒I群。
表1. 4、8a、8b和11型禽腺病毒Ⅰ群分型纳米多重PCR引物
实施例2、纳米多重PCR特异性试验：
应用上述建立的纳米多重PCR方法分别对传染性支气管炎病毒(IBV)、减蛋综合症病毒(EDSV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)和新城疫(NDV)的cDNA进行检测，验证该方法的特异性。
如图3所示，M:2000maker，1:四种血清型禽腺病毒I群阳性样品混合物，2:IBV，3:EDSV，4:AIV-H9，5:NDV。
试验结果均未扩增出条带，仅扩增出四种血清型禽腺病毒-I群的特异性条带，说明引物特异性良好。
实施例3、敏感性试验：
应用4、8a、8b和11型禽腺病毒I群标准毒株六邻体全基因建立的阳性质粒为模板，进行10倍系列稀释，进行纳米多重PCR和普通多重PCR最小检测浓度测定。
如图4所示，多重PCR浓度梯度：M:2000maker，1：原浓度质粒，2：10×101倍稀释质粒，3：10×102倍稀释质粒，4：10×103倍稀释质粒，5：10×104倍稀释质粒，6：10×105倍稀释质粒，7：10×106倍稀释质粒，8：10×107倍稀释质粒。普通多重PCR检测最小浓度分别为：FAdV-4为5.14×107拷贝·μL-1、FAdV-8a为2.87×107拷贝·μL-1、FAdV-8b为1.71×106拷贝·μL-1、FAdV-11为4.35×107拷贝·μL-1。
如图5所示，纳米多重PCR浓度梯度：M:2000maker，1：原浓度质粒，2：10×101倍稀释质粒，3：10×102倍稀释质粒，4：10×103倍稀释质粒，5：10×104倍稀释质粒，6：10×105倍稀释质粒，7：10×106倍稀释质粒，8：10×107倍稀释质粒，9：10×108倍稀释质粒，10：10×109倍稀释质粒。纳米多重PCR检测最小浓度分别为：FAdV-4为5.14×106拷贝·μL-1、FAdV-8a为2.87×104拷贝·μL-1、FAdV-8b为1.71×104拷贝·μL-1、FAdV-11为4.35×105拷贝·μL-1。
结果显示，在四种血清型病毒都同时检出的情况下，纳米多重PCR的敏感性比普通多重PCR至少提高10倍。
实施例4、临床样品检测：
取实验室分离保存的、并进行测序确定血清型的禽腺病毒I群临床毒株，进行纳米多重PCR分型检测。
如图6所示，M：2000maker；1:四种血清型禽腺病毒I群阳性样品混合物；2:空白对照；3、4：8a型禽腺病毒I群；5、8：11型禽腺病毒I群；6、7、9、10、12、13：4型禽腺病毒I群；11：8b型禽腺病毒I群。
检测结果显示，纳米多重PCR分型结果与测序结果相一致，表明本研究建立的纳米多重PCR方法能够用于临床大量样本的检测。

Claims (4)

1.一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法，其特征在于按照以下步骤操作：第一步，纳米多重PCR引物设计：根据GenBank公布的4、8a、8b和11型禽腺病毒I群六邻体基因序列，设计合成各型特异性引物；4型禽腺病毒I群引物F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’R:5’-AAGAGGCCCGGGCAATGC-3’；8a型禽腺病毒I群引物F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’R:5’-AATGTTTGACGAGCTGATGGG-3’；8b型禽腺病毒I群引物F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’R:5’-ATGCTGCAGCTGTTGCCGTAG-3’；11型禽腺病毒I群引物F:5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’R:5’-ACTGCCGTCGTCTCGTCTAAG-3’；第二步，基因的提取：取4、8a、8b和11型禽腺病毒I群标准毒株细胞研磨液400μL于1.5mLEP管中，加入400μL氯仿、600μL裂解液，混匀后4℃沉淀10min，之后12000r/min离心，取上清600μL，加入异丙醇800μL,4℃沉淀30min后12000r/min离心，弃上清后干燥，用20μL去离子水溶解；所述裂解液的组成为：硫氰酸胍9.456g，硫氰酸胺3.044g，醋酸钠13.60g，甘油5ml，苯酚38ml，水57ml；第三步，纳米多重PCR扩增:1、PCR反应体系：2×Nano-QPCRmix6μL，Taq enzyme 0.2μL，上、下游混合引物各1μL，模板0.5μL，去离子水3.3μL；所述上、下游混合引物同第一步；2、PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃30s，53℃退火1min，72℃1min49s，30个循环；72℃延伸10min；第四步，琼脂糖凝胶电泳：纳米多重PCR扩增反应结束后，取PCR产物8μL，以DL2000为Maker，质量百分比为1％的琼脂糖凝胶电泳，观察扩增片段大小，确定病毒的血清型；扩增片段为2193bp为4型禽腺病毒I群，扩增片段为1045bp为8a型禽腺病毒I群，扩增片段为371bp为8b型禽腺病毒I群，扩增片段为674bp为11型禽腺病毒I群。
2.根据权利要求1所述的一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法，其特征在于在4、8a、8b和11型四种血清型病毒都同时检出的情况下，纳米多重PCR的敏感性比普通多重PCR至少提高10倍。
3.根据权利要求1所述的一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法，其特征在于应用该方法分别对传染性支气管炎病毒、减蛋综合症病毒、H9亚型禽流感病毒和新城疫的cDNA进行检测，验证该方法的特异性，试验结果均未扩增出条带，仅扩增出4、8a、8b和11型四种血清型禽腺病毒I群的特异性条带。
4.根据权利要求1所述的一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法，其特征在于取实验室分离保存的、并进行测序确定血清型的禽腺病毒I群临床毒株，进行纳米多重PCR分型检测，检测结果显示，纳米多重PCR分型结果与测序结果相一致，表明本研究建立的纳米多重PCR方法能够用于临床大量样本的检测。
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