CN110066890A - 一种快速检测ibv二温式纳米pcr试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测IBV二温式纳米PCR试剂盒及应用，所述快速检测IBV的二温式纳米PCR试剂盒包括：2×Nano buffer，Taq DNA聚合酶，10×loading buffer，根据IBV 3′端非编码区保守区域设计的一对特异性引物，无阳性核酸ddH2O以及阳性质粒；特异性引物的上游引物为：5′‑GAGAGGAACAATGCACAGC‑3′，下游引物为：5′‑CATTTCCCTGGCGATAGAC‑3′。本发明的IBV二温式纳米PCR试剂盒能提高了IBV检测的灵敏度，灵敏度是传统的PCR的100倍；以及缩短了反应时间28分钟，且具有很好的特异性。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和养殖技术领域，具体涉及一种快速检测IBV二温式纳米PCR试剂盒及应用。
背景技术
鸡传染性支气管炎是由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一种急性高度接触传染性呼吸道疾病。鸡传染性支气管炎主要侵害1～4周龄雏鸡，临床表现主要以气管啰音、咳嗽、张口呼吸、产蛋下降等为特征，给养禽业带来了巨大的经济损失。目前常规检测IBV技术主要有病毒分离、ELISA、RT-PCR技术和Real-time PCR技术等，但病毒分离和ELISA方法在快速、灵敏、特异以及操作要求上均存在某些不足。传统RT-PCR方法近几年来虽被广泛应用，但灵敏度不高，且容易产生非特异性条带，影响结果的观察，扩增效率也有待提高。Real-time PCR灵敏度虽高且可以定量，但成本高且设备过于昂贵，不适合临床推广应用。因此如何提供一种高灵敏度和检测时间缩短的快速检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒是本领域技术人员有待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测鸡传染性支气管炎病毒的二温式纳米PCR试剂盒及其应用，为了实现本发明的目的，拟采用以下技术方案：
一种快速检测IBV二温式纳米PCR试剂盒，所述该快速检测IBV的二温式纳米PCR试剂盒包括：2×Nano buffer，Taq DNA聚合酶，10×loading buffer，根据IBV 3′端非编码区保守区域设计的一对特异性引物，无阳性核酸ddH2O以及阳性质粒；特异性引物的上游引物为：5′-GAGAGGAACAATGCACAGC-3′，下游引物为：5′-CATTTCCCTGGCGATAGAC-3′。
本发明还涉及上述快速检测IBV的二温式纳米PCR试剂盒在制备检测IBV试剂中的应用。
所述的一种快速检测IBV二温式纳米PCR试剂盒，二温式纳米PCR试剂盒在制备检测IBV中的应用，优化的实施方式中检测IBV步骤包括以下：从病鸡组织或含毒的尿囊液中提取病毒核酸，将病毒RNA反转录为cDNA，然后在二温式纳米PCR反应体系进行扩增目的片段，7μL纳米PCR扩增产物与1μL 10×loading buffer液混合，用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，试剂盒所带的阳性质粒作为对照；其中二温式纳米PCR反应体系为：2×Nano buffer6μL，上游引物0.6μL，下游引物0.6μL，cDNA 1μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，补足ddH2O至12μL；扩增体系为：94℃预变性3分钟；94℃变性15秒，57℃退火及延伸两步共15秒，循环30次；最后72℃延伸3分钟；整个扩增时间为37分钟。传统PCR的扩增体系为：94℃预变性3分钟；94℃变性20秒，57℃退火20秒，72℃延伸30秒，循环35次；最后72℃延伸3分钟，整个扩增时间为65分钟。
本发明的快速检测IBV二温式纳米PCR试剂盒，提高了IBV检测的灵敏度，灵敏度是传统的PCR的100倍；以及缩短了反应时间，变性时间均为15秒比传统PCR的变性节约5秒；将传统的退火和延伸两个温度合并为一个温度为57℃，退火及延伸两步能同时进行，时间共为15秒，比原来的退火时间20秒和延伸30秒共少了35秒；此外，二温式纳米PCR比传统PCR扩增体系循环数少5个循环。二温式纳米PCR比传统PCR扩增体系总反应时间快28分钟；具有很好的特异性，在多种不同病毒干扰下，仍能特异检测出IBV。
附图说明
图1为二温式纳米PCR扩增产物鉴定示意图。M为DL2000 DNA Maker；1为阴性对照；2为普通PCR扩增产物；3为二温式纳米PCR扩增产物。
图2为IBV二温式纳米PCR退火温度优化示意图。M为DL2000 DNA Maker；1-6退火温度分别为51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、61℃；7为阴性对照。
图3为IBV二温式纳米PCR引物添加量优化示意图。M为DL2000 DNA Maker；1为阴性对照；2-6为引物添加量分别为0.2μL、0.4μL、0.6μL、0.8μL、1.0μL
图4为IBV二温式纳米PCR特异性试验示意图。M为DL2000 DNA Maker；1为阴性对照；2-10为分别用IBV、aMPV、AIV（H9）、NDV、ILTV、IBDV、MDV、ALV、DHV的RNA或DNA进行扩增。
图5为IBV二温式纳米PCR和传统PCR灵敏性试验示意图。传统PCR灵敏性试验示意图（A）与IBV二温式纳米PCR灵敏性试验示意图（B）；A和B图中M为DL2000 DNA Maker；1-6：依次为10-1-10-6倍比稀释病毒核酸的扩增产物；7为阴性对照。
图6为IBV二温式纳米PCR及普通PCR检测样品的结果示意图。二温式IBV纳米PCR（A）与IBV传统PCR（B）临床样品检测结果M为DL2000 DNA Maker；1为阴性对照；2-21为部分临床样品（送检可疑病料）。
具体实施方式
具体实施例1：
一种快速检测IBV二温式纳米PCR试剂盒，所述该快速检测IBV的纳米PCR试剂盒包括：2×Nano buffer，Taq DNA聚合酶，10×loading buffer，根据IBV 3′端非编码区保守区域设计的一对特异性引物，无阳性核酸ddH2O以及阳性质粒；特异性引物的上游引物为：5′-GAGAGGAACAATGCACAGC-3′，下游引物为：5′-CATTTCCCTGGCGATAGAC-3′。
所述该快速检测IBV的二温式纳米PCR试剂盒在制备检测IBV试剂中的应用。
所述二温式纳米PCR试剂盒在制备检测IBV中的应用，检测IBV包括以下步骤：从病鸡组织或含毒的尿囊液中提取病毒核酸，将病毒RNA反转录为cDNA，然后在纳米PCR反应体系进行扩增目的片段，7μL纳米PCR扩增产物与1μL 10×loading buffer液混合，用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，试剂盒所带的阳性质粒作为对照；其中纳米PCR反应体系为：2×Nano buffer 6μL，上游引物0.6μL，下游引物0.6μL，cDNA 1μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，补足ddH2O至12μL；扩增体系为：94℃预变性3分钟；94℃变性15秒，57℃退火及延伸15秒，循环30次；最后72℃延伸3分钟。
根据IBV基因组的3′非编码端保守区域设计及合成1对特异性引物，上游引物为：5′-GAGAGGAACAATGCACAGC-3′，下游引物为：5′-CATTTCCCTGGCGATAGAC-3′。对IBV纳米PCR扩增产物鉴定：提取IBV的GX-YL5毒株RNA，反转录为cDNA后，按照预设的纳米PCR反应体系进行PCR扩增，经1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，扩增出大小为346bp的目的片段（见附图1）。将目的片段回收，经连接转化后挑阳性克隆测序，测序结果通过NCBI的BLAST进行验证，表明扩增的片段为IBV序列。
对IBV二温式纳米PCR扩增体系的优化：
1、退火温度的优化：保持其它纳米PCR预设反应体系不变，设置退火温度为51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、61℃进行梯度PCR扩增，待扩增结束后，取7μL纳米PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，筛选出最佳退火温度为57℃（见附图2）。
2、引物添加量的优化：在反应体系中分别加入0.2μL、0.4μL、0.6μL、0.8μL、1.0μL上下游引物，同时确保其它反应体系不变，以优化后的退火温度进行PCR扩增。扩增结束后，取7μL PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，选出最佳引物添加量为0.6μL（见附图3）。
3、IBV二温式纳米PCR重复性试验：提取IBV病毒核酸，将病毒核酸用RNase-freeWater进行倍比稀释后作为模板，应用建立的二温式纳米PCR重复检测3次，验证方法的稳定性。
4、IBV二温式纳米PCR特异性试验验证：分别提取鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、禽偏肺病毒（aMPV）、禽流感病毒H9亚型（AIV H9）、新城疫病毒（NDV）、传染性喉气管炎病毒（ILTV）、传染性法氏囊病毒（IBDV）、马立克氏病毒（MDV）、禽白血病毒（ALV）、鸭肝炎病毒（DHV）的RNA或DNA作为模板，用已优化后的IBV二温式纳米PCR反应体系与扩增程序进行扩增，以验证该方法的特异性，结果显示只有IBV出现特异性条带，其余病毒检测结果均为阴性（见附图4），表明该方法具有良好的特异性。
5、IBV二温式纳米PCR灵敏性试验验证：用分光光度计测定抽提的IBV GX-YL5毒株RNA浓度为100.81ng/μL，再用RNase-free Water进行10倍倍比稀释后反转录为cDNA作为模板，设立双蒸水代替阳性cDNA模板的阴性对照，用优化后的二温式纳米PCR与普通PCR进行扩增并比较，纳米PCR使用2×Nano buffer，Taq DNA聚合酶和10×loading buffer，纳米PCR变性、退火及延伸时间均为15秒，比传统PCR的变性、退火及延伸时间分别节约5秒和35秒，二温式纳米PCR比传统PCR扩增体系总的反应时间快28分钟，缩短了检测时间；传统PCR可检测到最低浓度约为1.01×10-3ng/μL，二温式纳米PCR可检测到最低浓度约为1.01×10-5ng/μL，表明二温式纳米PCR敏感性是传统PCR的100倍（见附图5）。
从20份送检的疑似感染IBV发病鸡只采集气管、肾脏等组织；50份攻毒鸡病料为IBV毒株进行人工感染SPF鸡后1-21d所采集的气管和肾脏；将采取的组织置于研钵中，充分用灭菌后的剪刀剪碎，将其进行研磨后加入适量PBS制成病毒悬液，置于-80℃冰箱反复冻融三次，12000 rpm离心5分钟，取上清液；应用建立的二温式纳米PCR及传统PCR两种方法对20份送检病料及50份攻毒样品进行检测，结果显示，两种检测方法结果符合率为100%，其中送检样品检出率为50%(10/20)，攻毒样品检出率为60%(30/50），且两种方法检测结果为阳性的均是来自同一份样品，从而确定本发明中二温式纳米PCR能够特异性检测IBV（见附图6）。
以上所述是本发明的优选实施例，在此基础上的改进和进一步优化都视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种快速检测IBV二温式纳米PCR试剂盒，其特征在于，该快速检测IBV的二温式纳米PCR试剂盒包括：2×Nano buffer，Taq DNA聚合酶，10×loading buffer，根据IBV 3′端非编码区保守区域设计的一对特异性引物，无阳性核酸ddH2O以及阳性质粒；特异性引物的上游引物为：5′-GAGAGGAACAATGCACAGC-3′，下游引物为：5′-CATTTCCCTGGCGATAGAC-3′。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测IBV二温式纳米PCR试剂盒，其特征在于，该快速检测IBV的二温式纳米PCR试剂盒在制备检测IBV试剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的一种快速检测IBV二温式纳米PCR试剂盒，其特征在于，二温式纳米PCR试剂盒在制备检测IBV中的应用，检测IBV包括以下步骤：从病鸡组织或含毒的尿囊液中提取病毒核酸，将病毒RNA反转录为cDNA，然后在二温式纳米PCR反应体系进行扩增目的片段，7μL纳米PCR扩增产物与1μL 10×loading buffer液混合，用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，试剂盒所带的阳性质粒作为对照；其中纳米PCR反应体系为：2×Nano buffer 6μL，上游引物0.6μL，下游引物0.6μL，cDNA 1μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，补足ddH2O至12μL；扩增体系为：94℃预变性3分钟；94℃变性15秒，57℃退火及延伸两步共15秒，循环30次；最后72℃延伸3分钟；所述的检测是非诊断目的的。
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| CN201910476504.3A CN110066890A (zh) | 2019-06-03 | 2019-06-03 | 一种快速检测ibv二温式纳米pcr试剂盒及应用 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113403428A (zh) * | 2020-09-14 | 2021-09-17 | 广西大学 | 检测1型、3型鸭甲型肝炎病毒和鸭坦布苏病毒的引物及应用 |
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2019
- 2019-06-03 CN CN201910476504.3A patent/CN110066890A/zh active Pending
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