CN107099617A - 一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量pcr检测方法 - Google Patents

一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR（real‑time PCR）检测方法，涉及分子生物学领域，本发明针对鸡传染性喉气管炎病毒的gB基因设计并合成了一对引物PF：5′‑CAATGGCTTCGGAGAAAGAG‑3′和PR：5′‑GGCAATCCTGATCCCATCTA‑3′，经PCR扩增和标准品制备，建立检测鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量PCR方法，具有特异性更强，灵敏度高，操作简单快速，对PCR进程进行实时检测，对每一个循环进行定量和定性分析，并可利用建立的鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量PCR方法检测出组织内的病毒含量。

Description

一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种鸡传染性喉气管炎病毒的检测方法。
背景技术
传染性喉气管炎病毒（ILTV）是疱疹病毒科的一个成员。本病主要侵害家禽，可引起鸡传染性喉气管炎(AILT)是一种急性、接触性上部呼吸道传染病。其特征是呼吸困难、咳嗽和咳出含有血样的渗出物。剖检时可见喉部、气管粘膜肿胀、出血和糜烂。病死率在20%以上。本病1925年在美国首次报道后，现已遍及世界许多养鸡地区。本病传播快，死亡率较高，在我国较多地区发生和流行，危害养鸡业的发展。目前尚无有效的治疗药物，主要依靠疫苗进行免疫预防。
目前，在流行病学监测和致病机理研究中，对传染性喉气管炎病毒基因诊断方法经常使用的是传统PCR方法，其特异性不强，易出现假阳性，操作繁琐，易产生PCR污染问题，只能对反应的终产物进行半定量或定性分析，且结果必须通过下一步的电泳进行条带分析得到。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，解决传统PCR方法特异性不强，易出现假阳性，操作繁琐，易产生PCR污染，只能对反应的终产物进行半定量或定性分析的问题，具有特异性强，灵敏度高，操作简单快速，不易出现假阳性，不易产生PCR污染，对PCR进程进行实时检测，对每一个循环进行定量和定性分析，分析结果可以直接通过计算机读出的特点。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：
（1）引物设计：针对鸡传染性喉气管炎病毒的gB基因设计并合成了一对引物PF和PR，上游引物PF为5′- CAATGGCTTCGGAGAAAGAG-3′，下游引物PR为5′- GGCAATCCTGATCCCATCTA-3′；
（2）传统PCR扩增：首先对提取出对鸡传染性喉气管炎病毒DNA进行传统PCR扩增，通过预变性、变性、退火、延伸步骤，快速特异地在体外扩增出目的DNA片段；
（3）阳性标准品制作：将目的DNA片段连接入载体，转入感受态细胞，构建重组质粒作为阳性标准品；
（4）荧光定量PCR检测：用梯度稀释的质粒标准品进行real-time PCR扩增，得到扩增曲线，并以拷贝数为x轴，以Ct值为y轴，构建real-time PCR标准曲线，建立检测鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量PCR方法；
（5）对该引物进行了特异性和灵敏度检测。
传统PCR检测结果显示，引物特异性良好，ILTV的DNA 有扩增条带，大小为116bp，阴性对照ddH2O未检测到扩增条带；real-time PCR 检测结果同样表明引物特异性，该对引物对ILTV只有唯一的产物吸收峰。
进一步地，步骤（3）中所述阳性标准品制作的步骤为：将PCR产物与pUC19-T载体25℃条件下连接，转化于DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养，挑取单菌落，转于含有Amp的LB液体培养基中，37℃环境下，以200 r/min振荡培养12h，提取重组质粒，测序，用微量紫外可见分光光度计测定浓度和纯度，根据摩尔定律，计算出单位体积质粒所含的DNA拷贝数浓度，依据计算出的拷贝数进行10倍梯度稀释，作为标准品。
进一步地，步骤（4）中所述荧光定量PCR检测的步骤为：用10倍梯度稀释的质粒标准品进行real-time PCR扩增 ，得到扩增曲线，并以拷贝数为x轴，以Ct值为y轴，构建real-time PCR标准曲线，建立检测鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量PCR方法。
进一步地，步骤（1）中所述gB基因Gen Bank登录号为EU104985。
进一步地，步骤（2）中所述传统PCR扩增的20μL的反应体系为：2×mix 10μL、25μmol/μL上游引物PF 0.5μL、25μmol/μL下游引物PR 0.5μL、模板DNA 2μL、ddH2O 7μL。
进一步地，步骤（2）中所述反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30s，60℃退火30 s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸5 min。
进一步地，步骤（3）中所述振荡培养的条件为37℃环境下，以200 r/min振荡培养12h。
进一步地，步骤（4）中所述real-time PCR扩增的20μL的反应体系为：2×SYBRGreenⅠ qPCR Master Mix 10μL、25μmol/μL上游引物PF 0.5μL、25μmol/μL下游引物PR 0.5μL、模板DNA 2μL、ddH2O 7μL。
进一步地，步骤（4）中所述real-time PCR扩增的反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性10s，60℃退火30s，40℃延伸30s，共40个循环；扩增反应结束后加热至95℃变性15s，降至60℃保温1min，以0.1℃/s递增加热至95℃。
进一步地，步骤（5）中所述特异性检测方法为：对提取出的病毒DNA 分别进行传统PCR和real-time PCR扩增，以ddH2O为阴性对照。
进一步地，步骤（5）中所述灵敏度检测的方法为：将10倍梯度稀释的质粒标准品用引物分别进行传统PCR和real-time PCR扩增。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，具有特异性更强，灵敏度高，操作简单快速，更规范不易产生假阳性，不易产生PCR污染，对PCR进程进行实时检测，对每一个循环进行定量和定性分析，并可利用建立的ILTV的实时荧光定量PCR方法检测出组织内的病毒含量，且分析结果可以直接通过计算机读出的特点。
附图说明
图1是普通PCR敏感性检测结果。
图2是Real-time PCR敏感性检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：
一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：
（1）引物设计：针对鸡传染性喉气管炎病毒的gB基因设计并合成了一对引物PF和PR，上游引物PF为5′- CAATGGCTTCGGAGAAAGAG-3′，下游引物PR为5′- GGCAATCCTGATCCCATCTA-3′；
（2）传统PCR扩增：首先使用病毒基因组DNA提取试剂盒提取ILTV的DNA，然后进行PCR扩增，PCR反应体系为：2×mix 10μL、上下游引物(25 μmol/μL)各0.5μL、模板DNA 2μL、ddH2O将体积补足至20μL。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸5min，之后4℃保存。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像仪中观察结果；
（3）阳性标准品制作：将PCR产物与pUC19-T载体25℃条件下连接，转化于DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养，挑取单菌落，转于含有Amp的LB液体培养基中，37℃环境下，以200 r/min振荡培养12h，提取重组质粒，测序，测序结果与Gen Bank序列比对无误后，用微量紫外可见分光光度计测定浓度和纯度，根据摩尔定律，计算出单位体积质粒所含的DNA拷贝数浓度，依据计算出的拷贝数进行10倍梯度稀释，作为标准品；
质粒拷贝数=[质粒浓度（ng. μL-1）×质粒体积（μL ）×6.02×1023]/[总片段长度（bp）×660g.mol-1]，总片段长度=载体长度（bp）+片段长度（bp）；
（4）荧光定量PCR检测：建立检测鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量PCR方法，用10倍梯度稀释的质粒标准品进行real-time PCR扩增 ，得到扩增曲线，并以拷贝数为x轴，以Ct值为y轴，构建real-time PCR标准曲线，Real-time PCR反应体系：每个样品取2μL作为模板，上下游引物各0.5μL、ddH2O 7μL、2×SYBR GreenⅠ qPCR Master Mix 10μL，95℃预变性10min, 95℃变性10s，60℃退火30s，40℃延伸30s，共40个循环,每个循环退火结束时采用End Points荧光信号采集方式检测荧光信号，扩增反应结束后加热至95℃变性15s，然后降至60℃保温1min，开始以0.1℃/s递增加热至95℃，在温度上升过程中采用All Points荧光信号采集方式检测荧光信号；PCR实验过程全封闭有效解决PCR污染问题，仪器自动分析和获取实验结果，无后续实验操作，操作简单快速；
（5）对该引物进行了特异性和灵敏度检测：
引物特异性检测：对提取出的病毒DNA分别进行传统PCR和real-time PCR扩增，以ddH2O为阴性对照，反应体系与程序同上。
敏感性检测：将10倍梯度稀释的质粒标准品用引物分别进行传统PCR和 real-time PCR扩增，反应体系与程序同上。
结果表明传统PCR检测的最低限为3.34×10-6copies/μL（如图1所示，M：DL2000,1-5：3.34×10-3copies/μL，3.34×10-4copies/μL3.34×10-5copies/μL3.34×10-6copies/μL3.34×10-7copies/μL），real-time PCR的检测可达到为3.34×10-7copies/μL（如图2所示，1-5：3.34×10-3copies/μL，3.34×10-4copies/μL，3.34×10-5copies/μL，3.34×10- 6copies/μL，3.34×10-7copies/μL）。
本发明中建立的检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR方法可以检测出组织内的病毒含量，运用建立的real-time PCR方法检测临床送检的6份疑似病料，并且测定出各份病料的病毒载量,如表1所示。
表1 临床送检6份病料的病毒载量
由以上数据可以得出，本发明所提供的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，具有特异性更强，灵敏度高，对PCR进程进行实时检测，对每一个循环进行定量和定性分析，并可利用建立的ILTV的实时荧光定量PCR方法检测出组织内的病毒含量，且分析结果可以直接通过计算机读出的特点。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）引物设计：针对鸡传染性喉气管炎病毒的gB基因设计并合成了一对引物PF和PR，上游引物PF为5′- CAATGGCTTCGGAGAAAGAG-3′，下游引物PR为5′- GGCAATCCTGATCCCATCTA-3′；
（2）传统PCR扩增：首先对提取出对鸡传染性喉气管炎病毒DNA进行传统PCR扩增，通过预变性、变性、退火、延伸步骤，快速特异地在体外扩增出目的DNA片段；
（3）阳性标准品制作：将目的DNA片段连接入载体，转入感受态细胞，构建重组质粒作为阳性标准品；
（4）荧光定量PCR检测：用梯度稀释的质粒标准品进行real-time PCR扩增 ，得到扩增曲线，并以拷贝数为x轴，以Ct值为y轴，构建real-time PCR标准曲线，建立检测鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量PCR方法；
（5）对该引物进行了特异性和灵敏度检测。
2.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（3）中所述阳性标准品制作的步骤为：将PCR产物与pUC19-T载体25℃条件下连接，转化于DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养，挑取单菌落，转于含有Amp的LB液体培养基中，37℃环境下，以200 r/min振荡培养12h，提取重组质粒，测序，用微量紫外可见分光光度计测定浓度和纯度，根据摩尔定律，计算出单位体积质粒所含的DNA拷贝数浓度，依据计算出的拷贝数进行10倍梯度稀释，作为标准品。
3.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（4）中所述荧光定量PCR检测的步骤为：用10倍梯度稀释的质粒标准品进行real-time PCR扩增 ，得到扩增曲线，并以拷贝数为x轴，以Ct值为y轴，构建real-time PCR标准曲线，建立检测鸡传染性喉气管炎病毒的荧光定量PCR方法。
4.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（1）中所述gB基因Gen Bank登录号为EU104985。
5.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（2）中所述传统PCR扩增的20μL的反应体系为：2×mix 10μL、25μmol/μL上游引物PF 0.5μL、25μmol/μL下游引物PR 0.5μL、模板DNA 2μL、ddH2O 7μL。
6.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（2）中所述反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30s，60℃退火30 s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸5 min。
7.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（4）中所述real-time PCR扩增的20μL的反应体系为：2×SYBR GreenⅠ qPCRMaster Mix 10μL、25μmol/μL上游引物PF 0.5μL、25μmol/μL下游引物PR 0.5μL、模板DNA 2μL、ddH2O 7μL。
8.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（4）中所述real-time PCR扩增的反应条件为：95℃预变性10min,95℃变性10s，60℃退火30s，40℃延伸30s，共40个循环；扩增反应结束后加热至95℃变性15s，降至60℃保温1min，以0.1℃/s递增加热至95℃。
9.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（5）中所述特异性检测方法为：对提取出的病毒DNA 分别进行传统PCR和real-time PCR扩增，以ddH2O为阴性对照。
10.根据权利要求１所述的鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤（5）中所述灵敏度检测的方法为：将10倍梯度稀释的质粒标准品用引物分别进行传统PCR和real-time PCR扩增。
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