CN113403426A - 一种检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒和检测方法 - Google Patents

一种检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体是涉及到一种检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒和检测方法，包括AILTV‑反应液、DNA酶混合液、AILTV‑内标、AILTV‑阳性对照和AILTV‑阴性对照；本发明的灵敏度与特异性高，有效降低出现假阳假阴几率，并且可以“一步法”实现样品的快速可靠的检测。

Description

一种检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体是涉及到一种检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒和检测方法。
背景技术
禽传染性喉气管炎(Avian infectious laryngotracheitis，AILT)是由禽传染性喉气管炎病毒(Avian infectious laryngotracheitis virus，AILTV)感染引起的一种严重影响世界范围内家禽业的急性、高传染性病毒性疾病，发病率可高达90％～100％，死亡率5％～50％不等。该疾病最初于1925年在美国报道，兽医最初将这种疾病称为禽白喉，AILT的名称在1931年由美国兽医协会家禽疾病特别委员会采用。
AILT是一种高度传染性的鸡上呼吸道疾病，AILTV又称禽疱疹病毒I型((GaHV-1))，属于Iltovirus属，疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科。AILTV的基因组包含一个150-155kb的线性双链DNA，其编码一个独特的长序列(UL)，独特的短序列(US)和两个反向重复序列(IR)。在电镜下AILTV表现为典型的疱疹病毒粒子，病毒颗粒呈球形，为二十面立体对称，DNA核心在二十面体衣壳内，衣壳由被膜层和外包膜糖蛋白所包围。病毒衣壳的直径约为100nm，完整的病毒直径在200～350nm范围内。AILTV基因组由80个开放阅读框(OpenReading Frames,ORFs)组成。其中65个位于UL区域，9个位于US区域，6个位于IR区域。AILTV包膜糖蛋白gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL和gM分别由高度保守的ORFs UL27、UL44、US6、US8、US4、UL22、US7、US5、UL53、UL1和UL10编码。2001年，Roizman及Pellett研究揭示病毒糖蛋白对AILTV复制和诱导宿主体液及细胞免疫反应具有重要意义。2017年，Nadimpalli及其团队设计UL(-1)基因缺失的AILTV毒株，用编码绿色荧光蛋白(GFP)和巨细胞病毒主要即时启动子元件的基因代替UL(-1)，发现UL(-1)基因缺失的AILTV毒株在宿主细胞中失去复制能力，揭示UL基因在AILTV复制中发挥重要作用。同其他α疱疹病毒，AILTV基因组包含三个DNA复制起点，一个OriL位于UL区域，两个OriS位于内部重复(IR)和末端重复(TR)区域。病毒的复制与重组几乎是不可分割的，基于TaqMan SNP基因分型试验，位于AILTV UL(-1)、US5、US6、US7、US8和US9基因中的11个SNP及位于UL43和UL47基因中的两个SNP具有很高的重组率。
AILTV感染宿主后，进行基因组的复制、病毒包装、获得毒力而后致病，并建立潜在感染。AILTV可在三叉神经节中建立潜伏，当感染个体受到诸如接种疫苗、转移和产蛋等刺激时，病毒被重新激活。AILTV的复制发生在感染的第一周，结膜和气管粘膜是AILTV复制的主要部位，导致炎症、浆液或粘液排出和呼吸窘迫。由于AILTV首先与鼻腔内的细胞、结膜粘膜和哈德氏腺相互作用，因此这些组织在早期病毒复制中起着关键作用，并决定了感染的进程。除了在呼吸器官中可以检测到AILTV之外，在其他器官，如大脑、舌头、扁桃体、胸腺、心脏、前囊、胰腺、十二指肠、小肠、大肠、盲肠、肝、脾和肾中也可检测到AILTV。AILTV感染过程中病毒DNA进行复制，在宿主细胞中病毒DNA逐渐积累，随后这些DNA被整合到位于宿主细胞核内新形成的病毒颗粒中，导致嗜碱性核内包涵体的形成，在感染后12小时左右可检测到。
AILTV的潜伏期在6至14天之间，病程在11天到6周不等。临床上，本病的特点是结膜炎，鼻窦炎，眼窝分泌物，呼吸窘迫，血性粘液，眼眶鼻窦肿胀，发病率高，死亡率相当高和产蛋量减少等。AILTV的主要自然宿主是鸡，但在孔雀、野鸡、火鸡和豚鼠中也有报道。其他家养和野生鸟类，如鹌鹑、鸽子、珍珠鸡、麻雀和乌鸦等可能对AILTV具有抵抗力。AILTV在感染鸟类10天后可从呼吸道分泌物中脱落，脱落的病毒再次通过呼吸道、眼部和口腔途径进入宿主导致感染的扩散。
CEO和TCO作为对AILTV具有保护作用的减毒活疫苗已经有几十年的历史，鸡胚减毒活疫苗是第一个商业使用的疫苗，在20世纪50年代和60年代初进入市场。但是减毒活疫苗在宿主体内存在反强的风险，且不同的减毒活疫苗之间可能自发重组形成新的AILTV毒株。2020年，García和Spatz将来自不同国家的AILTV野毒株与市售疫苗株的基因组水平比较显示，野毒株基因组中仅少数氨基酸类似于疫苗株，这表明野毒株可能源自疫苗株。减毒活疫苗的广泛使用，在世界许多地区导致了AILTV的爆发。随后，表达不同AILTV糖蛋白的重组载体疫苗，如BACDMEQ-gB、BACDMEQ-gJ、ILT-HVT和rHVT-LT；以及基因缺失疫苗，如TK基因缺失株，以及联合免疫的实施等，对AILTV的防治起到了更好的保护效果。尽管如此，在将其商业化引入家禽业之前还需要进一步的研究，比如开发不依赖于宿主免疫系统的新方法，更高水平的生物安全、探索宿主的遗传抗性等，进一步改进新型疫苗。
荧光PCR检测方法为检测AILT病毒的较好的方法，但是目前的应该PCR方法，由于引物等原因，灵敏度和特异性不够，有时会出现假阳假阴现象，影响了荧光PCR检测试剂盒的使用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒和检测方法，灵敏度与特异性高，有效降低出现假阳假阴几率，并且可以“一步法”实现样品的快速可靠的检测。
本发明的内容为一种检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒，包括AILTV-反应液、DNA酶混合液、AILTV-内标、AILTV-阳性对照和AILTV-阴性对照；
所述AILTV-反应液包括PCR-Buffer、dNTP、引物、引物探针、内标引物和内标探针；
所述dNTP包括dATP、dUTP、dGTP和dCTP；使用dUTP代替了一般常用的dTTP，这样扩增条带为带有U碱基的DNA。这种双链结构在UNG酶存在时会被水解，因此可以减少扩增产物(PCR的主要污染源)残留的污染。
所述引物包括：
上游引物(RD-ILV02F01)的序列为5’-CATCAACTTGAACGCCACT-3’(SEQ ID NO:1)；
下游引物(RD-ILV02R01)的序列为5’-CCAGTATCTCTGAGTTCCTCG-3’(SEQ ID NO:2)；
引物探针(RD-ILVP02)为5’-Fam-ATACTTCGACGGGCACAAAGTCC-BHQ1-3’(SEQ IDNO:3)，Fam为报告荧光基团，BHQ1为淬灭荧光基团；扩增产物长度84bp，其核苷酸序列为：
CATCAACTTGAACGCCACTATACTAGAAGATTTGGACTTTGTGCCCGTCGAAGTATACACTCGCGAGGAACTCAGAGATACTGG(SEQ ID NO:4)。
所述引物的浓度为200～300nM，引物探针的浓度为100～200nM。
所述内标引物包括：
内标上游引物(IPC05F01)，序列为5’-CATAGTTGGACCGCTAGGA-3’(SEQ ID NO:5)，
内标下游引物(IPC05R01)，序列为5’-GAAAGGTCCCGCAAAGAGT-3’(SEQ ID NO:6)，
所述内标探针(IPC05P)为5’-Hex-CCGGTGATAAACCTTTGGACCCT-BHQ1-3’(SEQ IDNO:7)，Hex为报告荧光基团，BHQ1为淬灭荧光基团。
所述内标引物的浓度为100～200nM，内标探针的浓度为100～200nM。
优选的，DNA酶混合液中包括酶稀释液、热启动Taq酶与UNG酶；其中热启动Taq酶在DNA酶混合液中的终浓度为1～2U/μL，该酶需在月95℃活化才能行使扩增活性；UNG酶全称尿嘧啶-N-糖基化酶，能选择性水解断裂含有U碱基的DNA中的尿嘧啶糖苷键，进而消除扩增产物残留、气溶胶污染等，该酶最佳活性温度为50摄氏度，95摄氏度失活，同热启动Taq酶共同实现抑制假阳性的效果。
优选的，所述AILTV-内标为连接有随机的内标核苷酸序列的重组质粒，浓度为1.0×103～2.0×103copies/μL，随机的内标核苷酸序列为：
CTGGAGACTGAGGGTTGACGCGCATTCGTCATTGAACGCAGACACGGCTGAGAGAACATGGAGCGACTGCACTGCACTTGGTCGATCTGATTAGGAGTGGGGTTTATGCCCGCGGCTTATCCCCCTATCCTTGCGACACGGGAGAAGACAGATTGTCATCGATTTCGCAAGCCATGATATGTTTGGCCCGACCAACCGCGTTTTTCTCGCGCTTGGATAACGACCTATGGTGTGGACAGTGGCTTAGAGGACATGACACGACGGGCTGAAAGTATGTGGTGCTGGGGCCCTTAGATAGCTGCATAGTTGGACCGCTAGGAATTATATCAATTCGAGATCTCCAGCCGACAAAGTAGGCTCCTAACTAACAGGGTCCAAAGGTTTATCACCGGTCCTTACTCTTTGCGGGACCTTTCTACCCATACAATATCGTCCTCCGATGATGGATCACGGAG(SEQ ID NO:8)。
优选的，所述AILTV-阳性对照为连接有目标核苷酸序列的重组质粒，Ct值为17.0-41.0，稀释液为TE溶液，目标核苷酸序列为SEQ ID NO:4序列，即：
CATCAACTTGAACGCCACTATACTAGAAGATTTGGACTTTGTGCCCGTCGAAGTATACACTCGCGAGGAACTCAGAGATACTGG。
优选的，AILTV-阴性对照为用DEPC H2O配制的TE缓冲液。
优选的，各组分的含量为：
Figure BDA0003164917550000041
本发明提供一种检测禽传染性喉气管炎病毒的荧光PCR检测方法，包括如下步骤，
(1)样品采集：禽鼻咽拭子、肺、气管和喉部组织；
(2)样品预处理：由于气管组织非常难破碎，故取约1g组织病料，剪碎后于研磨器具中研磨，加入1.2mL生理盐水研磨至匀浆，转移至1.5mL离心管，8 000g离心5分钟，取上清用于检测；
(3)扩增试剂配制：取出包装盒中除DNA酶混合液外的各组分，室温放置，待其彻底溶解后，震荡混匀备用；按比例(AILTV-反应液43μL/只份+DNA酶混合液2μL/只份+AILTV-内置参照0.5μL/只份)取相应量的试剂，充分混匀成PCR-Mix，瞬时离心；
(4)加样：向每个反应管中分别加入45μL PCR mix和5μL样品，盖上管盖，短暂离心，转移至扩增区；
(5)上机扩增：将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照以及待测样本名称；选择FAM通道检测禽传染性喉气管炎病毒核酸；选择HEX通道检测内标；设置反应体系为50μL；循环参数设定如下：
Figure BDA0003164917550000042
设置完毕，保存文件，运行反应程序。
(6)结果分析与判定：待反应程序完成后，记录样品Ct值与扩增曲线；AILTV-阴性对照HEX通道Ct值≤35，FAM通道无报告Ct值；AILTV-阳性对照HEX通道Ct值≤35，FAM通道Ct值≤35；被检样品检测结果中HEX通道Ct值≤35且FAM通道Ct值≤35，报告为AILTV核酸阳性；被检样品检测结果中HEX通道Ct值≤35且FAM通道Ct值>40或无报告Ct值，报告为AILTV核酸阴性；被检样品检测结果中HEX通道Ct值≤35且FAM通道35≤Ct值＜40，报告可疑，应重新进行检测，如复检无Ct值，则报告AILTV核酸检测阴性，反之为AILTV阳性；被检样品检测结果中FAM通道Ct值>40或无报告Ct值，同时HEX通道Ct值>35，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，对此样本进行重复实验。
本发明的有益效果是，一种禽传染性喉气管炎病毒荧光PCR检测试剂盒，特异性强、灵敏度高、抗污染，可用于临床对于AILTV隐性感染、低载量感染等早期快速准确检测。
采用本发明，可以进行以下用途：
(1)用于疑似病例的实验室确诊检测；
(2)发病前或发病初期(无明显症状)的早期诊断；
(3)健康鸡群的“体检”，查看是否存在AILTV隐性感染；
(4)引种过程中的AILTV病原检测，特别是从国外疫区引种的精准检测；
(5)进口肉制品的AILTV病原检测，特别是从国外疫区进口肉制品的精准检测；
(6)检测技术方便用于现场的即时检测；
(7)用于AILTV致病机制、流行病学等基础研究用途。
本发明具有以下优点：
1.更高的敏感性与特异性：基于AILTV基因组中高度保守的gB基因序列，筛选和优化了特异性的引物和探针。通过生物信息学预测及实验验证，本技术方案优选的引物探针具有高度敏感性与特异性，可避免因引物探针错配导致的漏检。
2.内标的使用可避免假阴性：检测结果可能因临床样品复杂性、保存不当，试剂配制错误，误加样等因素导致检测结果“假阴性”。本技术方案试剂盒添加内标可用于监测整个PCR反应体系是否正常，从而避免因使用不当造成的错误的判定结果。
3.UNG酶体系可减少假阳性：PCR扩增实验室最为常见的污染是扩增产物污染，且清除较为麻烦，形成气溶胶或者表面残留后对高灵敏度常的PCR检测影响很大。为防止和减少此种情况，UNG酶的作用不可少。
附图说明
图1为序号1的第1组引物探针扩增曲线图。
图2为序号2的第2组引物探针扩增曲线图。
图3为序号1的IPC01的内标荧光扩增曲线图。
图4为序号2的IPC01的内标荧光扩增曲线图。
图5为序号3的IPC01的内标荧光扩增曲线图。
其中，图3-5的右下方的线为内标扩增曲线。
图6为无内标时的荧光扩增曲线图。
图7为试剂盒扩增图。
图8为试剂盒扩增结果标准曲线。
图9为试剂盒精密度测试曲线图。
图10为试剂盒最小检测限测定曲线图。
具体实施方式
实施例1AILTV引物探针序列筛选
通过生物信息学分析比对NCBI中登陆的85株AILTV基因组gB基因序列信息，选取该基因高度保守区域的序列设计特异性的引物与探针序列。各组引物探针序列与相关信息如下表。
表1AILTV引物与探针序列信息
Figure BDA0003164917550000061
对以上各组引物探针进行扩增比较试验，从引物扩增效率、探针信噪比与扩增曲线形态等方面进行验证。最终筛选第2组引物探针用于试剂盒的生产。
第1组与第2组引物探针扩增曲线图如图1-2所示。第2组的扩增曲线形态、灵敏度较之第1组更好。
实施例2内标体系筛选
使用随机序列内标，行使内标作用监控假阴性同时，对目的基因的扩增不造成任何影响。
(1)内标质粒的构建：随机生成核苷酸序列，长度455bp，由上海生工进行序列合成。合成的该核苷酸片段连接至pUC57载体上，重组质粒编号pUC-ipc。内标核苷酸序列为：
CTGGAGACTGAGGGTTGACGCGCATTCGTCATTGAACGCAGACACGGCTGAGAGAACATGGAGCGACTGCACTGCACTTGGTCGATCTGATTAGGAGTGGGGTTTATGCCCGCGGCTTATCCCCCTATCCTTGCGACACGGGAGAAGACAGATTGTCATCGATTTCGCAAGCCATGATATGTTTGGCCCGACCAACCGCGTTTTTCTCGCGCTTGGATAACGACCTATGGTGTGGACAGTGGCTTAGAGGACATGACACGACGGGCTGAAAGTATGTGGTGCTGGGGCCCTTAGATAGCTGCATAGTTGGACCGCTAGGAATTATATCAATTCGAGATCTCCAGCCGACAAAGTAGGCTCCTAACTAACAGGGTCCAAAGGTTTATCACCGGTCCTTACTCTTTGCGGGACCTTTCTACCCATACAATATCGTCCTCCGATGATGGATCACGGAG。
(2)内标质粒的定量：使用蛋白核酸测定仪对重组质粒pUC-ipc浓度进行定量，并使用TE溶液对重组质粒稀释。其中：根据实际浓度测定值，将pUC-ipc稀释至1.0×103～2.0×103copies/μL，作为内标。
(3)根据内标序列设计3套引物探针，其中探针5’端统一标记Hex荧光基团。3套内标引物探针序列如下表。
表2内标引物与探针序列信息表
Figure BDA0003164917550000071
(4)分别将3套内标体系加入AILTV检测体系中组合成双重扩增体系，加入模板进行扩增，将扩增结果同未加内标体系的AILTV单重扩增体系进行荧光曲线、Ct值等指标比较，筛选对AILTV检测体系无干扰的内标引物探针作为优选的内标体系。
扩增试验结果(图3-6)表明：添加3组内标引物探针对原AILTV检测体系均无较大影响，AILTV扩增Ct值与扩增曲线无明显变化。根据内标体系(绿色曲线)扩增情况看，IPC01引物与探针组合是最佳的内标体系。
实施例3试剂盒组成
根据以上各项实验结果，此禽传染性喉气管炎病毒荧光PCR检测试剂盒，其组分包括：AILTV-反应液、DNA酶混合液、AILTV-内标、AILTV-阳性对照、AILTV-阴性对照。各组分制备方法如下：
(1)AILTV-反应液中包括PCR-Buffer、dNTP、上述AILTV引物探针、上述内标引物探针。其中AILTV引物RD-ILV02F01与RD-ILV02R01在反应液中的终浓度范围是200～300nM，AILTV探针RD-ILVP02在反应液中的浓度范围是100～200nM；内标引物IPC05F01与IPC05R01在反应液中的终浓度范围是100～200nM，内标探针IPC05P在反应液中的终浓度范围是100～200nM；dNTP包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷，其中使用dUTP代替了一般常用的dTTP，这样扩增条带为带有U碱基的DNA。这种双链结构在UNG酶存在时会被水解，因此可以减少扩增产物(PCR的主要污染源)残留的污染。特别的，该反应液中PCR-Buffer不同于常见Buffer，其中Tris-HCl浓度为125～200mM，高于常用的10mM的浓度，这样PCR反应才不受碱性核酸释放剂的影响，这也是该试剂盒检测得以实现的核心内容。
(2)DNA酶混合液中包括酶稀释液、热启动Taq酶与UNG酶。其中热启动Taq酶在DNA酶混合液中的终浓度为1～2U/μL，该酶需在月95℃活化才能行使扩增活性；UNG酶全称尿嘧啶-N-糖基化酶，能选择性水解断裂含有U碱基的DNA中的尿嘧啶糖苷键，进而消除扩增产物残留、气溶胶污染等，该酶最佳活性温度为50摄氏度，95摄氏度失活，同热启动Taq酶共同实现抑制假阳性的效果。
(3)AILTV-内标：使用蛋白核酸测定仪对重组质粒pUC-ipc浓度进行定量，并使用TE溶液对重组质粒稀释。根据实际浓度测定值，将pUC-ipc稀释至1.0×103～2.0×103copies/μL，作为内标。
(4)使用蛋白核酸测定仪对重组质粒pUC-p72浓度进行定量，并使用TE溶液对重组质粒稀释。其中：根据实际浓度测定值，将pUC-p72稀释至1.0×104～5.0×104copies/μL，作为阳性对照。
(5)AILTV-阴性对照为用DEPC H2O配制的TE溶液。
(6)试剂盒(以50T计)中上述各组分装量如下：
Figure BDA0003164917550000081
实施例4线性范围与扩增效率测定
对定量的重组质粒pUC-p72进行10倍梯度连续稀释，使其拷贝数范围为：107～1copies/μl，对每个梯度作为模板进行实时荧光PCR，根据扩增结果制作标准曲线。
如图7-8所示。该AILTV试剂盒对107～1copies/μl的梯度模板扩增正常，呈线性扩增，相关系数R2＝0.99；在此线性扩增范围内，该试剂盒的扩增效率为94％。根据以上结果，该试剂盒不仅可用于AILTV的定性测定，也符合定量测定的要求。
实施例5精密度测定
调整重组质粒pUC-p72浓度至10copies/μl，作为精密度测定的扩增模板。对此浓度模板重复扩增8个重复，计算Ct值的变异系数(CV)，一般来讲，荧光PCR精密度CV应＜10％，且越低重复性就越好。
精密度测试结果表明(表3)，该试剂盒对低浓度模板扩增精密度为0.79％，重复性很好，且扩增曲线形态重复性也较好(如图9)。
表3AILTV试剂盒的精密度测试结果
编号 目的基因Ct
1 34.20
2 34.55
3 34.31
4 34.34
5 34.04
6 34.39
7 34.07
8 34.36
CV(％) 0.50
实施例6本试剂盒用法包括以下步骤：
(1)样品采集：禽鼻咽拭子、肺、气管和喉部组织。
(2)样品预处理：由于气管组织非常难破碎，故取约1g组织病料，剪碎后于研磨器具中研磨，加入1.2mL生理盐水研磨至匀浆，转移至1.5mL离心管，8000g离心5分钟，取上清用于检测。
(3)扩增试剂配制：取出包装盒中除DNA酶混合液外的各组分，室温放置，待其彻底溶解后，震荡混匀备用；按比例(AILTV-反应液43μL/只份+DNA酶混合液2μL/只份+AILTV-内置参照0.5μL/只份)取相应量的试剂，充分混匀成PCR-Mix，瞬时离心。
(4)加样：向每个反应管中分别加入45μL PCR mix和5μL样品，盖上管盖，短暂离心，转移至扩增区。
(5)上机扩增：将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照以及待测样本名称；选择FAM通道检测禽传染性喉气管炎病毒核酸；选择HEX通道检测内标；设置反应体系为50μL；循环参数设定如下：
Figure BDA0003164917550000101
设置完毕，保存文件，运行反应程序。
(6)结果分析与判定：待反应程序完成后，记录样品Ct值与扩增曲线。AILTV-阴性对照HEX通道Ct值≤35，FAM通道无报告Ct值；AILTV-阳性对照HEX通道Ct值≤35，FAM通道Ct值≤35；被检样品检测结果中HEX通道Ct值≤35且FAM通道Ct值≤35，报告为AILTV核酸阳性；被检样品检测结果中HEX通道Ct值≤35且FAM通道Ct值>40或无报告Ct值，报告为AILTV核酸阴性；被检样品检测结果中HEX通道Ct值≤35且FAM通道35≤Ct值＜40，报告可疑，应重新进行检测，如复检无Ct值，则报告AILTV核酸检测阴性，反之为AILTV阳性；被检样品检测结果中FAM通道Ct值>40或无报告Ct值，同时HEX通道(内标)Ct值>35，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。
实施例7最小检测限测定
调整重组质粒pUC-p72浓度至1copies/μl，作为检测限测定的扩增模板。对此浓度模板重复扩增8个重复，应全部检出。
检测结果如图10，对1copies/μl的模板重复检测8次，均检出阳性。根据此结果将该AILTV试剂盒的最小检测限定位1000copies/mL。
实施例8特异性测定
为了检测本发明试剂盒的特异性，利用本发明的试剂盒检测常见禽病病原，包括鸡马立克氏病病毒、禽支气管炎病毒、禽传染性法式囊病毒、新城疫病毒、阴性血清样本及病料组织样本进行特异性试验。
检测结果表明(表4)：本发明的试剂盒仅对AILTV目的基因gB进行扩增，不与其它病原及正常阴性血液与组织样本的核酸发生交叉反应，该试剂盒特异性良好。
表4AILTV试剂盒特异性测试结果
检测项目 AILTV MDV IBV IBDV NDV 血清 组织
AILTV(Fam) 26.50 No Ct No Ct No Ct No Ct No Ct No Ct
内标(hex) 28.65 28.71 28.76 28.54 28.74 28.58 28.47
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本公开的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本申请中一个或多个实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本申请中一个或多个实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本申请中一个或多个实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
<110> 湖南国测生物科技有限公司
<120> 一种检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒和检测方法
<160>8
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
catcaacttg aacgccact 19
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ccagtatctc tgagttcctc g 21
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
atacttcgac gggcacaaag tcc 23
<210>4
<211>84
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
catcaacttg aacgccacta tactagaaga tttggacttt gtgcccgtcg aagtatacac 60
tcgcgaggaa ctcagagata ctgg 84
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
catagttgga ccgctagga 19
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
gaaaggtccc gcaaagagt 19
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
ccggtgataa acctttggac cct 23
<210>8
<211>455
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
ctggagactg agggttgacg cgcattcgtc attgaacgca gacacggctg agagaacatg 60
gagcgactgc actgcacttg gtcgatctga ttaggagtgg ggtttatgcc cgcggcttat 120
ccccctatcc ttgcgacacg ggagaagaca gattgtcatc gatttcgcaa gccatgatat 180
gtttggcccg accaaccgcg tttttctcgc gcttggataa cgacctatgg tgtggacagt 240
ggcttagagg acatgacacg acgggctgaa agtatgtggt gctggggccc ttagatagct 300
gcatagttgg accgctagga attatatcaa ttcgagatct ccagccgaca aagtaggctc 360
ctaactaaca gggtccaaag gtttatcacc ggtccttact ctttgcggga cctttctacc 420
catacaatat cgtcctccga tgatggatca cggag 455

Claims (7)

1.一种检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒，其特征是，包括AILTV-反应液、DNA酶混合液、AILTV-内标、AILTV-阳性对照和AILTV-阴性对照；
所述AILTV-反应液包括PCR-Buffer、dNTP、引物、引物探针、内标引物和内标探针；
所述dNTP包括dATP、dUTP、dGTP和dCTP；
所述引物包括：
上游引物的序列为5’-CATCAACTTGAACGCCACT-3’；
下游引物的序列为5’-CCAGTATCTCTGAGTTCCTCG-3’；
引物探针为5’-Fam-ATACTTCGACGGGCACAAAGTCC-BHQ1-3’，Fam为报告荧光基团，BHQ1为淬灭荧光基团；
所述内标引物包括：
内标上游引物，序列为5’-CATAGTTGGACCGCTAGGA-3’，
内标下游引物，序列为5’-GAAAGGTCCCGCAAAGAGT-3’，
所述内标探针为5’-Hex-CCGGTGATAAACCTTTGGACCCT-BHQ1-3’，Hex为报告荧光基团，BHQ1为淬灭荧光基团。
2.如权利要求1所述的检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒，其特征是，DNA酶混合液中包括酶稀释液、热启动Taq酶与UNG酶。
3.如权利要求1所述的检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒，其特征是，所述AILTV-内标为连接有随机的内标核苷酸序列的重组质粒，浓度为1.0×103～2.0×103copies/μL，随机的内标核苷酸序列为：
CTGGAGACTGAGGGTTGACGCGCATTCGTCATTGAACGCAGACACGGCTGAGAGAACATGGAGCGACTGCACTGCACTTGGTCGATCTGATTAGGAGTGGGGTTTATGCCCGCGGCTTATCCCCCTATCCTTGCGACACGGGAGAAGACAGATTGTCATCGATTTCGCAAGCCATGATATGTTTGGCCCGACCAACCGCGTTTTTCTCGCGCTTGGATAACGACCTATGGTGTGGACAGTGGCTTAGAGGACATGACACGACGGGCTGAAAGTATGTGGTGCTGGGGCCCTTAGATAGCTGCATAGTTGGACCGCTAGGAATTATATCAATTCGAGATCTCCAGCCGACAAAGTAGGCTCCTAACTAACAGGGTCCAAAGGTTTATCACCGGTCCTTACTCTTTGCGGGACCTTTCTACCCATACAATATCGTCCTCCGATGATGGATCACGGAG。
4.如权利要求1所述的检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒，其特征是，所述AILTV-阳性对照为连接有目标核苷酸序列的重组质粒，Ct值为17.0-41.0，目标核苷酸序列为：CATCAACTTGAACGCCACTATACTAGAAGATTTGGACTTTGTGCCCGTCGAAGTATACACTCGCGAGGAACTCAGAGATACTGG。
5.如权利要求1所述的检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒，其特征是，AILTV-阴性对照为用DEPC H2O配制的TE缓冲液。
6.如权利要求1所述的检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒，其特征是，各组分的含量为：
Figure FDA0003164917540000021
7.一种检测禽传染性喉气管炎病毒的检测方法，其特征是，包括如下步骤，
(1)样品采集；
(2)样品预处理；
(3)扩增试剂配制：取出除DNA酶混合液外的各组分，室温放置，待其彻底溶解后，震荡混匀备用；按比例取相应量的试剂，充分混匀成PCR-Mix，离心；
(4)加样：向每个反应管中分别加入PCR mix和样品，离心，转移至扩增区；
(5)上机扩增：将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照以及待测样本；选择FAM通道检测禽传染性喉气管炎病毒核酸；选择HEX通道检测内标；循环参数设定如下：
Figure FDA0003164917540000022
(6)结果分析与判定：待反应程序完成后，记录样品Ct值与扩增曲线；AILTV-阴性对照HEX通道Ct值≤35，FAM通道无报告Ct值；AILTV-阳性对照HEX通道Ct值≤35，FAM通道Ct值≤35；被检样品检测结果中HEX通道Ct值≤35且FAM通道Ct值≤35，报告为AILTV核酸阳性；被检样品检测结果中HEX通道Ct值≤35且FAM通道Ct值>40或无报告Ct值，报告为AILTV核酸阴性；被检样品检测结果中HEX通道Ct值≤35且FAM通道35≤Ct值＜40，报告可疑，应重新进行检测，如复检无Ct值，则报告AILTV核酸检测阴性，反之为AILTV阳性；被检样品检测结果中FAM通道Ct值>40或无报告Ct值，同时HEX通道Ct值>35，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，对此样本进行重复实验。
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