CN114292824A - 表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株vp2基因的重组嵌合型新城疫病毒的构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物基因工程疫苗领域，具体涉及表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因的重组嵌合型新城疫病毒的构建方法与应用，具体是：将鸡传染性法氏囊病病毒变异毒株VP2基因共有序列插入到含有基因VII型F和HN基因的嵌合型LaSota弱毒株中，得到即为表达鸡传染性法氏囊病病毒变异毒株VP2基因的重组嵌合型新城疫病毒；所述嵌合型LaSota弱毒株是用基因VII型NDV的HN基因和碱性蛋白酶裂解位点附近氨基酸序列突变的F基因分别替换LaSota疫苗株的HN和F基因后得到的。本发明可作为多联疫苗制备用种毒为研发有效防控IBDV变异株和基因VII型NDV感染的廉价高效疫苗奠定基础。

Description

表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因的重组嵌合型新 城疫病毒的构建方法与应用

技术领域

本发明属于动物基因工程疫苗领域，具体涉及表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株VP2 基因的重组嵌合型新城疫病毒的构建方法与应用。

背景技术

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)感染引起的一种急性、高度接触性传染病。IBDV主要感染3～6周龄的雏鸡，感染后导致雏鸡中枢免疫器官法氏囊严重受损，B淋巴细胞功能损坏，从而导致机体产生免疫抑制，易引起其他病原的继发感染而导致严重损失。IBDV属于双RNA 病毒科、禽双RNA病毒属，其基因组包括A、B两个节段。A节段编码VP2、VP3、VP4和VP5四个蛋白。其中VP2是IBDV的衣壳蛋白和主要的宿主保护性抗原，能够诱导机体产生保护性中和抗体，是研制IBD基因工程疫苗的首选靶抗原。随着疫苗的广泛使用，IBD 的流行出现了新的变化。上世纪90年代出现的以急性、高致死率为临床特征的IBDV超强毒株逐渐被新型变异株所取代，非典型IBD不断出现。IBDV新型变异株感染鸡无明显临床症状，但可造成中枢免疫器官法氏囊的严重萎缩导致严重的免疫抑制，对我国养禽业造成严重威胁。因此研发针对我国流行的IBDV新型变异毒株引起IBD疫苗具有现实意义。

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染引起的能够感染各种禽类的急性、高度接触性和致死性传染病，严重危害我国和世界养禽业的健康发展。NDV颗粒表面的融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶(HN)是两种重要的功能性糖蛋白，在病毒感染、装配、出芽、决定宿主和组织嗜性等方面发挥重要作用。F蛋白介导病毒—细胞和细胞—细胞的融合，且与NDV的毒力直接相关。HN蛋白是一个多功能蛋白，在病毒感染过程中发挥重要作用，参与识别细胞表面的唾液酸受体，促进F蛋白的融合活性；HN蛋白的神经氨酸酶活性可以去除子代病毒颗粒上的唾液酸，防止病毒颗粒自我凝集。NDV目前只有一个血清型，但根据F基因的差异可以区分为18个基因型，目前我国禽群中NDV主要流行株以基因VII型为主。

疫苗免疫是防控IBD和ND的重要手段。现有的商品化IBD和ND疫苗包括单联或多联的弱毒活苗和灭活疫苗。与单苗相比较，多联疫苗在控制混合感染和降低疫苗接种劳动强度、减少动物应激等方面具有显著优势。传统的多联疫苗生产需要分别制备多种抗原，生产工艺繁琐，生产成本高。IBDV变异株的高效分离和高滴度培养目前还存在一定困难，基于IBDV VP2蛋白的亚单位疫苗存在纯化成本高和内毒素导致的安全隐患等问题。利用合适载体制备的基因工程多联疫苗能够克服传统多联疫苗制备工艺的缺陷。国内外利用基因II型NDV LaSota疫苗株作为载体构建了表达多种外源基因的基因工程多联疫苗(KIM SH,SAMAL SK.Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of humanand veterinary vaccines.Viruses,2016,4；8(7):183.；汪宏才,温国元,罗青平.新城疫多联疫苗研究进展[J].湖北农业科学,2018,57(24):5-8.)。但由于我国鸡群中普遍存在高水平抗NDVLaSota株母源抗体和基于LaSota株的疫苗不能有效控制我国目前流行的基因VII型NDV的感染等原因，使得基于LaSota株的重组活载体疫苗的临床应用受到限制。虽然我国已经有商品化的防控基因VII型NDV的单联灭活疫苗(姚舜禹,张丽琳.新城疫疫苗研究进展[J].生物技术进展,2020,10(5):470-478.)，但由于新兽药证书的限制和安全性的问题，目前国内尚没有防控基因VII型NDV的多联灭活疫苗和弱毒活疫苗。

发明内容

本发明利用反向遗传技术将LaSota疫苗株的HN和F基因分别替换为基因VII型NDV强毒株的HN基因和带有蛋白酶裂解位点氨基酸突变的F基因，构建了含有基因VII型F 和HN基因的嵌合型LaSota株感染性克隆，在证明能成功拯救出重组病毒rLaSota-7F-7HN 的基础上，将优化合成的不同IBDV变异毒株VP2基因共有序列插入到rLaSota-7F-7HN基因组中，构建出能够表达IBDV变异毒株VP2蛋白的重组嵌合型NDV，以期作为多联疫苗制备用种毒，为研发有效防控IBDV变异株和基因VII型NDV感染的廉价高效疫苗奠定基础。

本发明表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因的重组嵌合型新城疫病毒的构建方法，采用以下技术方案：

1、构建含有基因VII型F和HN基因的嵌合型LaSota弱毒株——rLaSota-7F-7HN

(1)LaSota的感染性克隆质粒的构建。

具体的，利用重叠PCR将涵盖整个LaSota株基因组的7个cDNA片段克隆到转录载体pOLTV5中，获得重组质粒pLaSota。

(2)分别构建含有VII型NDV流行毒株的F和HN基因的重组载体。

具体的，分别合成基因VII型NDV流行毒株全长的F和HN基因，并分别克隆在pUC57载体中，得到载体pUC-7F和pUC-7HN；在合成F基因过程中，将基因VII型NDV流行株的F基因中的碱性蛋白酶裂解位点氨基酸序列从112RRQKR↓F117突变为 112GRQGR↓L117。NDV的F基因与毒力相关，而且碱性蛋白酶裂解位点附近的氨基酸序列发挥决定作用，突变这些氨基酸是防止重组病毒的毒力增强。

(3)利用带有LaSota株的F和HN基因两侧同源序列的引物，以步骤(2)中制备的重组载体pUC-7F和pUC-7HN为模板，分别扩增优化突变后的基因VII型NDV的F基因和HN基因，以及氨苄青霉素抗性筛选标记(amp)和大肠杆菌自杀基因(ccdB)表达盒 amp-ccdB。

(4)将带有LaSota株F基因两侧同源臂的amp-ccdB表达盒与LaSota的感染性克隆质粒pLaSota共电转化进宿主菌，利用氨苄青霉素抗性筛选F基因被amp-ccdB替换的阳性克隆，得到重组质粒pLaSota-ΔF-amp-ccdB。

(5)利用Redαβ重组酶介导的同源重组技术，将pLaSota-ΔF-amp-ccdB中的amp-ccdB 替换为优化突变后的基因VII型NDV的F基因，得到重组质粒pLaSota-7F。

(6)利用带有LaSota株HN基因两侧同源臂的引物扩增的amp-ccdB表达盒片段与重组质粒pLaSota-7F共电转化进宿主菌，利用氨苄青霉素抗性筛选HN基因被amp-ccdB替换的筛选阳性克隆，得到重组质粒pLaSota-7F-ΔHN-amp-ccdB。

(7)用Redαβ重组酶介导的同源重组技术，将重组质粒pLaSota-7F-ΔHN-amp-ccdB中的amp-ccdB替换为基因VII型NDV的HN基因，得到重组质粒pLaSota-7F-7HN。

(8)将重组质粒pLaSota-7F-HN与辅助质粒pCI-NP-P-L共转染BHK-21细胞，收集转染后的细胞裂解液，接种10日龄SPF鸡胚，接种72小时后收获血凝活性阳性的鸡胚尿囊液即为重组病毒rLaSota-7F-7HN。重组病毒rLaSota-7F-7HN保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间：2021年12月13日，保藏编号：CGMCC NO.45059。

2、表达VP2蛋白的重组NDV感染性克隆的构建

将鸡传染性法氏囊病病毒变异毒株VP2基因经酶切后克隆至pGEM-PM穿梭质粒中获得pGEM-PM-VP2重组质粒；然后双酶切pGEM-PM-VP2和pLaSota-7F-7HN质粒，将IBDV VP2基因克隆至pLaSota-7F-7HN载体中，构建含有IBDV变异毒株VP2基因的重组NDV 全长感染性克隆pLaSota-7F-7HN-VP2。

3、重组NDV全长感染性克隆的拯救

将重组质粒pLaSota-7F-7HN-VP2与辅助质粒pCI-NP-P-L共转染BHK-21细胞，收获培养物上清，接种10日龄的SPF鸡胚并培养120h，收获HA阳性尿囊液即为拯救的重组病毒rChiLaSota-VP2。

本发明的有益效果为：

本发明利用NDV反向遗传学技术平台，在利用基因VII型NDV的HN和蛋白酶裂解位点附近氨基酸突变的F基因替换LaSota疫苗株的HN和F基因的基础上，将我国流行的IBDV变异株的VP2抗原基因插入到含有基因VII型NDV的F和HN基因的嵌合型LaSota 株全长基因组转录质粒pLaSota-7F-7HN中，获得重组质粒pLaSota-7F-7HN-VP2，并成功拯救出表达IBDV变异株VP2蛋白的重组NDV，将为满足我国防控IBD和ND的现实需求奠定基础。

本发明利用改造的基因VII型NDV的F和HN基因替换LaSota疫苗株的相应基因的策略，一方面避免了仅仅通过改造基因VII型NDV野毒株F蛋白的蛋白酶裂解位点附近的氨基酸所获得的毒力致弱毒株作为载体构建重组病毒所带来的毒力返强的风险，同时又可以提供针对基因VII型NDV感染的防控，具有明显的特色和优势。同时，构建的表达IBDV 变异株VP2蛋白的重组NDV，即可以直接作为二联活疫苗使用，同时也可以作为制备二联灭活疫苗的种毒，从而实现培养一种病毒，即可制备二联或多联疫苗。

本发明结果证明，构建的表达IBDV变异株VP2蛋白的重组rChiLaSota-VP2保留了LaSota株的安全性和在鸡胚中高滴度复制等生物学特性，提示其可以作为活疫苗使用，从而能够诱导针对IBDV变异株和基因VII型NDV的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫等全方位免疫。同时，也可以作为制备新城疫-传染性法氏囊病二联灭活疫苗的新型种毒，实现培养一种病毒即可制备二联疫苗，为制备更廉价的二联或多联疫苗奠定基础。

总之，本发明成功构建的表达流行IBDV变异株VP2基因重组病毒rChiLaSota-VP2，将为研发防控IBDV变异株和基因VII型NDV感染的新型高效、廉价二联和多联疫苗提供新思路，为有效防控IBD和ND提供新的辅助工具。

附图说明

图1为重组质粒pLaSota的结构示意图。

图2为重组质粒pLaSota-7F的ApaL I酶切鉴定结果图。

图3为重组质粒pLaSota-7F-7HN的图谱。

图4为重组质粒pLaSota-7F-7HN的ApaL I酶切鉴定结果图。

图5为重组质粒pCI-NP-P-L的图谱。

图6为含有VP2基因的重组NDV基因组全长感染性克隆构建示意图。

图7为重组质粒pLaSota-7F-7HN-VP2的酶切鉴定结果图。M.DL15000 DNA Marker；1.pLaSota-7F-7HN-VP2重组质粒；2.Apa I、Pml I酶切pLaSota-7F-7HN-VP2重组质粒。

图8为重组NDV rChiLaSota-VP2的RT-PCR鉴定结果图。M.DL2000 DNA Marker；1.NDV LaSota株的RT-PCR扩增产物；2.rChiLaSota-VP2的RT-PCR扩增产物。

图9为重组病毒rChiLaSota-VP2表达VP2蛋白鉴定结果图。M.蛋白Marker；1.重组病毒rChiLaSota-VP2尿囊液；2.NDV LaSota株尿囊液。

图10为重组NDV rChiLaSota-VP2与LaSota株在SPF鸡胚中复制动态比较图。

图11为免疫后四周3组鸡中抗NDV HI抗体滴度比较图。

图12为免疫后四周3组鸡中抗IBDV抗体ELISA滴度比较图。

图13为基因VII型NDV强毒分离株FJSW2021攻毒后3组鸡的存活率图。

图14为传染性法氏囊病毒变异株IBDV-FJSW2021攻毒后3组鸡的存活率图。

图15为基因VII型NDV强毒分离株FJSW2021攻毒后3组鸡的组织切片图。

图16为传染性法氏囊病毒变异株IBDV-FJSW2021攻毒后3组鸡的组织解剖图。

图17为传染性法氏囊病毒变异株IBDV-FJSW2021攻毒后3组鸡的组织切片图。

图18为鸡法氏囊中传染性法氏囊病毒的病毒载量。

图19为鸡各组织中基因VII型NDV的病毒载量。

保藏信息：

rLaSota-7F-7HN：保藏时间：2021年12月13日；保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：CGMCC NO.45059；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；分类命名：携带基因VII型F和HN基因重组Lasota毒株。

鸡新城疫病毒基因VII型分离株FJSW2021：保藏时间：2021年12月13日；保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：CGMCC NO.45060；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；分类命名：基因VII型新城疫病毒。

传染性法氏囊病毒变异株IBDV-FJSW2021：保藏时间：2021年12月13日；保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：CGMCC NO.45058；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；分类命名：传染性法氏囊病毒变异株。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。

实施例中所用pOLTV5质粒、pUC57质粒、pUC18质粒、p15A质粒、pCI-neo质粒、GBred-gyrA462感受态细胞、GB05-dir感受态细胞、Top10感受态细胞、BHK-21细胞、抗 IBDVVP2蛋白单克隆抗体均为市售产品。

实施例1带有基因VII型NDV流行株HN基因和碱性蛋白酶裂解位点氨基酸突变的F基因的LaSota株感染性克隆的构建

1.1NDV LaSota疫苗株感染性克隆质粒的构建

根据GenBank中公布的NDV LaSota株序列(GenBank登录号AF077761)，利用重叠PCR将涵盖整个基因组的7个cDNA片段克隆到转录载体pOLTV5中，获得重组质粒 pLaSota，重组质粒pLaSota如图1所示；需要说明的是：完整的LaSota基因组cDNA上游为T7RNA聚合酶启动子，下游带有δ肝炎病毒(HDV)的核酶序列(ribozyme)和T7转录终止序列。

1.2构建含有VII型NDV流行毒株的F和HN基因的重组载体

根据GenBank数据库中公布的基因VII型NDV流行毒株的基因组序列，分别优化合成全长的F和HN基因，并分别克隆在pUC57载体中，得到载体pUC-7F和pUC-7HN；在合成F基因过程中，将基因VII型NDV流行株的F基因编码的碱性蛋白酶裂解位点氨基酸序列从112RRQKR↓F117突变为112GRQGR↓L117；优化突变后的F基因编码的蛋白序列见SEQ ID NO:1，优化合成的HN基因编码的蛋白质序列见SEQ ID NO:2。优化突变后的F 基因的序列如SEQID NO:3所示，优化合成的HN基因的序列如SEQ ID NO:4所示。

1.3基因VII型NDV的F基因和HN基因、抗性筛选标记的扩增

利用带有LaSota株的F和HN基因两侧同源序列的引物(见表1)，以pUC-7F和 pUC-7HN为模板，分别扩增优化突变后的基因VII型NDV的F基因和HN基因，以 p15A-ccdB-amp质粒(ccdB-amp是插在p15A的NdeI和EcoRI位点之间)为模板，扩增氨苄青霉素抗性筛选标记(amp)和大肠杆菌自杀基因(ccdB)表达盒amp-ccdB。

表1扩增基因VII型NDV毒株F和HN基因以及相应amp-ccdB表达盒的引物

1.4转化筛选重组质粒pLaSota-ΔF-amp-ccdB

将带有LaSota株的F基因两侧同源臂的amp-ccdB表达盒与LaSota的感染性克隆质粒 pLaSota共电转化进宿主菌GBred-gyrA462感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上筛选阳性克隆，得到LaSota株的F基因被amp-ccdB替换的重组质粒pLaSota-ΔF-amp-ccdB。

1.5重组质粒pLaSota-7F的构建

使用PacI限制性内切酶37℃过夜酶切pLaSota-ΔF-amp-ccdB质粒，通过T4 DNA聚合酶将线性化的pLaSota-ΔF-amp-ccdB载体与突变后的基因VII型NDV的F基因片段进行聚合反应。聚合体系为200ng的突变后的基因VII型NDV的F基因片段、2μg的线性化pLaSota-ΔF-amp-ccdB载体、2μL的10×NEB Buffer 2.1、0.2μL的T4 DNA聚合酶、加入双蒸水补足体系至20μL，反应程序为25℃1h、75℃20min、50℃30min；将反应体系电转化至10％L-阿拉伯糖诱导的GB05-dir感受态细胞中，复苏1h后涂布至带有氯霉素抗性的LB平板，37℃过夜培养；从平板上挑取单菌落扩大培养，提取质粒经ApaL I限制性内切酶酶切和测序得到重组质粒pLaSota-7F，重组质粒的ApaL I酶切鉴定结果见图2。

1.6重组质粒pLaSota-7F-ΔHN-amp-ccdB的构建

将利用带有HN基因两侧同源臂的引物扩增的amp-ccdB表达盒片段与重组质粒pLaSota-7F共电转化进宿主菌GBred-gyrA462感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上筛选阳性克隆，得到LaSota株的HN基因被amp-ccdB替换的重组质粒pLaSota-7F- ΔHN-amp-ccdB。

1.7重组质粒pLaSota-7F-7HN的构建

使用Pac I限制性内切酶37℃过夜酶切pLaSota-7F-ΔHN-amp-ccdB质粒，通过T4DNA聚合酶将线性化的pLaSota-7F-ΔHN-amp-ccdB载体与基因VII型NDV的HN基因片段进行聚合反应。聚合体系为200ng的突变后的基因VII型NDV的HN基因片段、2μg 的线性化pLaSota-7F-ΔHN-amp-ccdB载体、2μL的10×NEB Buffer 2.1、0.2μL的T4 DNA 聚合酶、加入双蒸水补足体系至20μL，反应程序为25℃1h、75℃20min、50℃30min；将反应体系电转化至10％L-阿拉伯糖诱导的GB05-dir感受态细胞中，复苏1h后涂布至带有氯霉素抗性的LB平板，37℃过夜培养；从平板上挑取单菌落扩大培养，提取质粒经ApaL I限制性内切酶酶切和测序得到重组质粒pLaSota-7F-7HN，质粒图谱见图3，重组质粒的 ApaL I酶切鉴定结果见图4。

实施例2带有基因VII型NDV流行株HN基因和碱性蛋白酶裂解位点氨基酸突变的 F基因的重组LaSota株的拯救

2.1表达NDV LaSota疫苗株核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和大聚合酶蛋白(L)的转录辅助质粒的构建

将编码NDV LaSota疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列克隆到pCI-neo真核表达载体的CMV启动子下游；将编码核蛋白(NP)和磷酸蛋白(P)的cDNA通过2A肽序列串联后克隆到pCI-neo真核表达载体的SV40启动子下游，获得同时表达NP、P和L蛋白的转录质粒pCI-NP-P-L。具体采用以下方案：

a、NP-2A-P的制备

以pLaSota质粒为模板，采用针对NP的引物：

NP-F:5’-ATGTCTTCCGTATTTGATGAG-3’；

NP-R:5’-ACGTCACCGCATGTTAGAAGACTTCCTCTGCCCTCATACCCCCAGTCGG-3’；

针对P基因的引物：

P-F:’-TAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGGCCACCTTTAC-3’；

P-R:5’-TTAGCCATTTAGAGCAAGGCGC-3’分别进行PCR扩增NP和P基因，分别以回收后的NP基因及P基因为模板，以NP-F/P-R引物进行融合PCR的扩增，并回收片段NP-2A-P。

b、重组质粒pCI-NP-2A-P的构建

以pCI-neo载体为模板，以带有NP基因和P基因同源臂序列的上下游引物TY-pCIneo-F: 5’-CATCAAATACGGAAGACATGGTGGCTCTAGCCTTAAGTTCG-3’和TY-pCIneo-R: 5’-GCCTTGCTCTAAATGGCTAAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATG-3’进行扩增，将回收的扩增片段pCI-neo载体与片段NP-2A-P使用NEBuilder重组试剂盒进行聚合重组，产物转化Top10感受态细胞，涂布氨苄抗性平板进行筛选阳性克隆，最终获得重组质粒 pCI-NP-2A-P。

c、重组质粒pCI-NP-P-L的构建

以L-XbaI-F:5’-ACGCGTTCTAGAAAGGCAAAACAGCTC-3’和L-NotI-R:5’-GAATTC GCGGCCGCCCGGGTCGACAATTGGCCAGAAAAG-3’为引物扩增L基因，将纯化的L基因和质粒pCI-NP-2A-P分别进行XbaI+NotI酶切，纯化后使用T4连接酶进行连接，转化 Top10感受态细胞，涂布氨苄抗性平板进行筛选阳性克隆，最终得到重组质粒pCI-NP-P-L。重组质粒pCI-NP-P-L的质粒图谱见图5。

2.2重组病毒的拯救

a、转录质粒和辅助质粒转染BHK-21细胞

将BHK-21细胞培养于6孔细胞培养板内生长至80％单层时，用表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3以MOI＝1感染细胞1h，吸弃重组痘苗病毒vTF7-3感染物，然后将2μg转录质粒pLaSota-7F-7HN与2μg辅助质粒pCI-NP-P-L按照Lipofectamine 3000转染试剂盒操作说明共转染BHK-21细胞。转染后24h，弃去转染混合物，用PBS洗涤细胞 2次，加入含有2％胎牛血清的MEM培养基继续孵育至96h。

b、重组病毒rLaSota-7F-7HN的获得

收获培养物上清，接种10日龄的SPF鸡胚并培养120h，收获HA阳性尿囊液即为拯救的重组病毒rLaSota-7F-7HN。

实施例3表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因的重组嵌合型新城疫病毒的构建

3.1主要试剂和材料

实施例1构建的含有基因VII型NDV毒株F和HN基因的嵌合型NDV LaSota-7F-7HN全长基因组cDNA的质粒pLaSota-7F-7HN；实施例2构建的表达LaSota株NP、P和L蛋白的辅助质粒pCI-NP-P-L。

pGEM-PM穿梭载体为申请人构建，具体的，pGEM-PM穿梭载体是pGEM商品化载体中利用Apa I和Pml I限制性内切酶位点克隆入NDV LaSota株的P和M部分基因以及二者之间的非编码区，在P和M序列之间引入额外的NDV基因终止(GE)和基因起始(GS) 序列，并在GE和GS下游引入两个Sap I限制性内切酶位点以方便外源基因的插入。pGEM 商品化载体中Apa I和Pml I限制性内切酶位点克隆入的序列如SEQ ID NO:6所示。

含有中国近年来IBDV变异毒株VP2基因共有序列的质粒pUC-VP2由申请人构建，具体是将优化合成的IBDV变异株VP2基因共有序列插入到pUC18质粒的EcoR I和Hind III之间，优化合成的IBDV变异株VP2基因共有序列如SEQ ID NO:5所示。

SPF鸡胚购自山东昊泰实验动物繁育有限公司。

3.2表达VP2蛋白的重组NDV感染性克隆的构建

以pUC-VP2质粒为模板，利用带有Sap I限制性内切酶位点的特异性引物(表2)进行PCR扩增VP2基因。VP2基因经Sap I酶切后克隆至pGEM-PM质粒中获得 pGEM-PM-VP2重组质粒；然后利用Apa I和Pml I分别双酶切pGEM-PM-VP2和 pLaSota-7F-7HN质粒，将IBDVVP2基因克隆至pLaSota-7F-7HN载体中，构建含有IBDV 变异毒株VP2基因的重组NDV全长感染性克隆，将Apa I和Pml I双酶切鉴定和测序正确的重组质粒命名为pLaSota-7F-7HN-VP2(图6)。

表2引物序列信息

注：表2中下划线序列为Sap I限制性内切酶位点；斜体部分为Kozak序列。

利用限制性内切酶Apa I和Pml I对pLaSota-7F-7HN-VP2进行酶切鉴定结果显示，重组质粒被切成16093bp和2884bp两个预计大小的片段(图7)，质粒测序结果也与理论序列相符，证明重组质粒pLaSota-7F-7HN-VP2构建成功。

3.3重组NDV的拯救

将BHK-21细胞培养于6孔细胞培养板内生长至80％单层时，用表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3以MOI＝1感染细胞1h，吸弃重组痘苗病毒vTF7-3感染物，然后将2μg转录质粒pLaSota-7F-7HN-VP2与2μg辅助质粒pCI-NP-P-L按照Lipofectamine3000 转染试剂盒操作说明共转染BHK-21细胞。转染后24h，弃去转染混合物，用PBS洗涤细胞2次，加入含有2％胎牛血清的MEM培养基继续孵育至96h，收获培养物上清，接种 10日龄的SPF鸡胚并培养120h，收获HA阳性尿囊液即为拯救的重组病毒rChiLaSota-VP2。 3.4rChiLaSota-VP2的鉴定

3.4.1 rChiLaSota-VP2的RT-PCR鉴定

将拯救的重组NDV rChiLaSota-VP2和LaSota株分别在SPF鸡胚中连续传代10次，利用病毒基因组RNA提取试剂盒分别提取LaSota株尿囊液和rChiLaSota-VP2鸡胚尿囊液的总RNA。针对IBDVVP2基因插入位点两侧基因序列设计鉴定引物JD-F： 5′-GGAAAATCAAGCGCCTTGCTC-3′和JD-R：5′-GACGATCGGAAATGCTAACAGG-3′，进行RT-PCR；对PCR产物进行序列测定，以鉴定IBDV VP2基因是否正确插入。

结果显示，rChiLaSota-VP2模板中能够扩增出重组病毒中包含VP2基因的1681bp预计大小片段，而LaSota株对照模板仅能扩增出325bp预计大小片段(图8)；同时，PCR 产物序列-测定结果显示重组病毒中插入的IBDV VP2基因序列正确。

3.4.2 rChiLaSota-VP2Western blotting鉴定

为了验证rChiLaSota-VP2是否成功表达IBDV变异毒株的VP2蛋白，分别取rChiLaSota-VP2鸡胚尿囊液、LaSota株鸡胚尿囊液进行SDS-PAGE，将蛋白电转印至硝酸纤维素(NC)膜上，以抗IBDV VP2单克隆抗体为一抗，HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗进行Western blot，并利用ECL试剂盒进行显色并拍照。

结果如图9所示，抗IBDV VP2单克隆抗体可以在rChiLaSota-VP2感染鸡胚尿囊液中特异性检测到与IBDV VP2蛋白的理论分子量大小一致的约48kDa蛋白条带，证明重组NDV rChiLaSota-VP2成功表达IBDV变异株的VP2蛋白。

3.5 rChiLaSota-VP2的生物学特性分析

为了评估重组病毒rChiLaSota-VP2的生物学特性，按照OIE标准测定第25代rChiLaSota-VP2的鸡胚平均致死时间(MDT)、鸡胚半数感染量(EID₅₀)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)及6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)致病性指标。

结果显示，重组NDV rChiLaSota-VP2第25代鸡胚毒的MDT为134h，ICPI与IVPI 均为0，表明重组病毒rChiLaSota-VP2具有与NDV LaSota疫苗株类似的生物学特性，且遗传稳定性良好。

3.6 rChiLaSota-VP2在鸡胚中的生长特性分析

为了比较第25代重组rChiLaSota-VP2与LaSota疫苗株在10日龄SPF鸡胚中的复制动态，将LaSota疫苗株和第25代rChiLaSota-VP2按每胚10²EID₅₀的剂量分别接种10日龄SPF鸡胚，在接种后24h、48h、72h和96h分别收获鸡胚尿囊液，测定EID₅₀，分析 LaSota疫苗株与rChiLaSota-VP2在鸡胚中的生长特性差异。结果显示，rChiLaSota-VP2 与LaSota疫苗株保持相近的复制动态，可以在鸡胚上高滴度繁殖，第25代重组 rChiLaSota-VP2的EID₅₀最高可达10^-8.16/100μL(图10)。

实施例4重组病毒rChiLaSota-VP2的免疫原性和免疫效力评价

4.1重组rChiLaSota-VP2活疫苗接种

将购自北京梅里亚的60只1周龄白来航SPF鸡随机平均分成3组，各组鸡均分别饲养于负压隔离器中。组1通过点眼和滴鼻途径接种100微升含10⁷EID₅₀(半数鸡胚感染剂量)的重组rChiLaSota-VP2；组2通过点眼和滴鼻途径接种100微升的正常鸡胚尿囊液；组3作为不接种不感染的空白对照。

4.2血凝抑制试验(HI)检测疫苗免疫后的NDV抗体水平和酶联免疫吸附试验测定抗 IBDV抗体

疫苗免疫后每周采取静脉血，分离血清后利用HI试验测定疫苗免疫后的抗NDV抗体水平。血凝抑制试验按照常规方法操作：将25微升血清样品进行2倍倍比稀释后转移到V型底的96孔血凝板中，每孔加入25微升的4个血凝单位的基因VII型NDV抗原，震荡混匀后室温静置30分钟，然后每孔加入50微升0.5％鸡红血球，轻微振荡混匀后，室温静置 30分钟观察血凝抑制效果。以能够完全抑制血球凝集的最大血清稀释度的倒数作为抗体的 HI抗体滴度。

疫苗免疫后每周采取各组鸡的血清样品，利用商品化的ProFLOKIBDPLUSAb(美国硕腾辛百克斯公司)ELISA试剂盒，按照厂家说明书测定重组病毒诱导的抗IBDV抗体。将100微升1:100稀释的血清样品加入IBDV抗原包被的孔中，室温孵育30分钟，用洗涤缓冲液洗涤3次；每孔加入100微升1×偶联物溶液，室温孵育30分钟，用洗涤缓冲液洗涤3次；然后每孔加入100微升底物溶液，室温避光显色5分钟，每孔加入100微升终止液，然后测定405nm吸光度值。每次测试设定试剂盒提供的阳性样品对照，计算血清样品与阳性对照样品的吸光度比值(S/P)，按照公式Log₁₀滴度＝(1.172×Log₁₀S/P)+3.614计算抗IBDV抗体的ELISA滴度。

检测结果显示，单剂量点眼和滴鼻免疫即可诱导鸡体产生高水平的抗NDVHI抗体和抗IBDV抗体。在免疫后第四周，抗NDV HI抗体滴度达到2⁸(图11)，抗IBDV抗体ELISA 滴度达到2000以上(如图12)。

4.3免疫后攻毒鸡的存活情况和组织情况

在免疫后4周，将组1和组2的鸡各取10只分别用10⁵ELD₅₀(半数鸡胚致死剂量) 的鸡新城疫病毒基因VII型中国分离株FJSW2021(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间：2021年12月13日，保藏编号：CGMCC NO.45060)和10⁴ELD₅₀的传染性法氏囊病毒变异株IBDV-FJSW2021(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间：2021年12月13日，保藏编号：CGMCC NO.45058)通过点眼和滴鼻途径进行攻毒，组3不攻毒作为对照。攻毒后每天观察各组鸡的临床表现并记录鸡的发病率和死亡率，连续观察7天。

观察结果显示，未接种疫苗的鸡表现精神沉郁，羽毛凌乱，在攻毒后第2天表现呼吸困难，张口喘气。病鸡排出绿色水样粪便，且在攻毒后84h开始出现死亡。图13结果显示，rChiLaSota-VP2活疫苗接种组对基因VII型NDV强毒分离株FJSW2021的攻毒提供完全保护，而未免疫攻毒组在攻毒后第4天全部发病死亡(图13)。

rChiLaSota-VP2活疫苗免疫组对于IBDV强毒株传染性法氏囊病毒变异株IBDV-FJSW2021的攻击提供100％保护，未免疫攻毒组在攻毒第二天表现精神沉郁，拉白色稀粪，在攻毒后第4天死亡率达到80％(图14)。

4.4攻毒鸡的口咽和泄殖腔排毒检测

对4.3中攻毒后的鸡，在攻毒后的第1至第7天每天采集基因VII型新城疫病毒攻毒鸡的口咽棉拭子和泄殖腔棉拭子；同时，每天采集传染性法氏囊病毒变异株攻毒鸡的泄殖腔棉拭子，分别利用反转录PCR测定攻毒鸡的排毒情况。

采用常规反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测攻毒鸡的口咽棉拭子和泄殖腔棉拭子中的病毒核酸，以便确定排毒情况。RT-PCR引物采用针对基因VII型NDV的特异性引物NDV-F:5’-GGAAGATCAAACGCCTTGC-3和NDV-R:5’- GACAATCGGGAATGCTAACAGG-3’。基因VII型新城疫病毒核酸模板在反转录PCR反应中将扩增出325bp的片段，而重组病毒rChiLaSota-VP2的核酸模板将扩增出1681bp的片段。检测鸡传染性法氏囊病病毒的引物为：VP1-F:5’-AGTCCACAGGCGCGAAGCA-3’， VP1-R:5’-GATGGAGCTGACCATATGTT-3’；传染性法氏囊病病毒核酸模板在反转录PCR 反应中将扩增出1000bp的片段。

表3结果显示，rChiLaSota-VP2活疫苗免疫组鸡只在免疫后第3天即停止排毒，而未免疫攻毒组在攻毒后持续排毒直至死亡。

表3攻毒后不同天数的排毒情况

4.5组织显微病变情况和组织中的NDV和IBDV的检测

采集4.3中攻毒后发病死亡鸡的肺、气管、腺胃、十二指肠、盲肠扁桃体和法氏囊。每个器官样品平均分成两份，一份用于制备组织病理切片，观察组织显微病变情况，另一份利用荧光定量PCR测定组织中的NDV和IBDV。

对未免疫且基因VII型NDV强毒分离株FJSW2021的攻毒后病死鸡进行剖检发现，未免疫攻毒组所有病死鸡均有新城疫的典型剖检病变，包括腺胃坏死和出血，脾脏肿大。而rChiLaSota-VP2活疫苗接种组和空白对照组的鸡仍然表现临床健康状况，没有出现明显的肉眼病变。死鸡的组织学病变包括肺间质慢性炎症浸润；脾、盲肠扁桃体和法氏囊淋巴细胞坏死；肠上皮和腺胃上皮细胞坏死，而rChiLaSota-VP2活疫苗免疫组和空白对照组的鸡没有出现上述组织学体征(图15)。

未免疫攻IBDV强毒株传染性法氏囊病毒变异株组的病死鸡剖检可见胸肌和大腿肌出血；肾脏肿大，肾小管有尿酸盐沉积；法氏囊严重萎缩，黏膜面有黄色奶油样黏液渗出(图 16)。病死鸡的显微病变主要是法氏囊、脾脏和盲肠扁桃体等免疫器官的淋巴细胞衰竭和变性坏死(图17)。

利用针对基因VII型NDV的HN基因的上、下游引物HN-qF： 5’-GCAGAGACCACTCACACTCACA-3’，HN-qR： 5’-TGCAGGACTTCCGATTTTGGGTG-3’；和针对IBDV的VP1基因的上、下游引物进 VP1-qF:5’-AGTCCACAGGCGCGAAGCA-3’，VP1-qR:5’-CTTTGCCAGTCGACTAGG-3’进行实时荧光定量PCR检测组织中的病毒载量；实时荧光定量PCR的反应体系包括10μL of 2x ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞，南京)，上、下游引物(10μM)各 1μL，1μL cDNA模板，用无核酸酶的纯水补足体积20μL。反应条件为95℃预变性30秒，然后进行95℃10秒和60℃15秒扩增40个循环。将扩增的129bp NDV HN基因片段和 138bp的VP1片段克隆入pMD18-T载体(宝生物工程(大连)有限公司)制备标准质粒。利用10⁹～10³拷贝/微升10倍倍比稀释的标准质粒借助CFX Maestro软件建立标准曲线。病毒载量计算为每mg组织中的HN基因拷贝数。结果报告为三次重复试验的平均值加上标准差。

结果发现，rChiLaSota-VP2活疫苗免疫组和空白对照组的病毒载量没有明显差异，但疫苗免疫组鸡的法氏囊中的IBDV病毒载量显著低于未免疫攻毒组(图18)；疫苗免疫组鸡的各组织中基因VII型NDV的病毒载量也显著低于未免疫攻毒组(图19)。

以上结果证明，利用本发明构建的重组病毒rChiLaSota-VP2作为活疫苗免疫，可以为鸡提供针对基因VII型NDV和IBDV变异株感染的良好保护。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因的重组嵌合型新城疫病毒的构建

与应用

<130> 无

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 540

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Leu Ile Thr Arg Ile Met Leu Ile Leu Gly Cys Ile Arg Pro Thr

1 5 10 15

Ser Ser Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr

20 25 30

Gly Asp Lys Ala Val Asn Val Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile

35 40 45

Ile Val Lys Leu Leu Pro Asn Met Pro Arg Asp Lys Glu Ala Cys Ala

50 55 60

Lys Ala Pro Leu Glu Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr

65 70 75 80

Pro Leu Gly Asp Ser Ile Arg Lys Ile Gln Gly Ser Val Ser Thr Ser

85 90 95

Gly Gly Gly Arg Gln Gly Arg Leu Ile Gly Ala Val Ile Gly Ser Val

100 105 110

Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Ala Ala Ala Leu

115 120 125

Ile Gln Ala Asn Arg Asn Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys Glu Ser

130 135 140

Ile Ala Ala Thr Asn Glu Ala Val His Glu Val Thr Asp Gly Leu Ser

145 150 155 160

Gln Leu Ser Val Ala Val Gly Lys Met Gln Gln Phe Val Asn Asp Gln

165 170 175

Phe Asn Asn Thr Ala Arg Glu Leu Asp Cys Ile Lys Ile Thr Gln Gln

180 185 190

Val Gly Val Glu Leu Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Val Phe

195 200 205

Gly Pro Gln Ile Thr Ser Pro Ala Leu Thr Gln Leu Thr Ile Gln Ala

210 215 220

Leu Tyr Asn Leu Ala Gly Gly Asn Met Asp His Leu Leu Thr Arg Leu

225 230 235 240

Gly Ile Gly Asn Asn Gln Leu Ser Ser Leu Ile Gly Ser Gly Leu Ile

245 250 255

Thr Gly Tyr Pro Ile Leu Tyr Asp Ser Gln Thr Gln Leu Leu Gly Ile

260 265 270

Gln Val Asn Leu Pro Ser Val Gly Asn Leu Asn Asn Met Arg Ala Thr

275 280 285

Tyr Leu Glu Thr Leu Ser Val Ser Thr Thr Lys Gly Tyr Ala Ser Ala

290 295 300

Leu Val Pro Lys Val Val Thr Gln Val Gly Ser Val Ile Glu Glu Leu

305 310 315 320

Asp Thr Ser Tyr Cys Ile Glu Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Cys Thr Arg

325 330 335

Ile Val Thr Leu Pro Met Ser Pro Gly Ile Tyr Ser Cys Leu Ser Gly

340 345 350

Asn Thr Ser Ala Cys Met Tyr Ser Lys Thr Glu Gly Ala Leu Thr Thr

355 360 365

Pro Tyr Met Ala Leu Lys Gly Ser Val Ile Ala Asn Cys Lys Ile Thr

370 375 380

Thr Cys Arg Cys Thr Asp Pro Pro Gly Ile Ile Ser Gln Asn Tyr Gly

385 390 395 400

Glu Ala Val Ser Leu Ile Asp Arg His Leu Cys Asn Val Leu Ser Leu

405 410 415

Asp Gly Ile Thr Leu Arg Leu Ser Gly Glu Phe Asp Ala Thr Tyr Gln

420 425 430

Lys Asn Ile Ser Ile Leu Asp Ser Gln Val Ile Val Thr Gly Asn Leu

435 440 445

Asp Ile Ser Thr Glu Leu Gly Asn Val Asn Asn Ser Ile Ser Asn Ala

450 455 460

Leu Asp Arg Leu Ala Glu Ser Asn Ser Lys Leu Glu Lys Val Asn Val

465 470 475 480

Arg Leu Thr Ser Thr Ser Ala Leu Ile Thr Tyr Ile Val Leu Thr Val

485 490 495

Ile Ser Leu Val Phe Gly Ala Leu Ser Leu Gly Leu Ala Cys Tyr Leu

500 505 510

Met Tyr Lys Gln Lys Ala Gln Gln Lys Thr Leu Leu Trp Leu Gly Asn

515 520 525

Asn Thr Leu Asp Gln Met Arg Ala Thr Thr Arg Ala

530 535 540

<210> 2

<211> 571

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Asp Arg Ala Val Asn Arg Val Val Leu Glu Asn Glu Glu Arg Glu

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Trp Arg Leu Val Phe Arg Ile Ala Val Leu Leu Leu

20 25 30

Met Val Met Thr Leu Ala Ile Ser Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Ser Thr

35 40 45

Gly Ala Ser Thr Pro His Asp Leu Ala Gly Ile Ser Thr Val Ile Ser

50 55 60

Lys Thr Glu Asp Lys Val Thr Ser Leu Leu Ser Leu Ser Gln Asp Val

65 70 75 80

Ile Asp Lys Ile Tyr Lys Gln Val Ala Leu Glu Ser Pro Leu Ala Leu

85 90 95

Leu Asn Thr Glu Ser Ile Ile Met Asn Ala Ile Thr Ser Leu Ser Tyr

100 105 110

Gln Ile Asn Gly Ala Ala Asn Asn Ser Gly Cys Gly Ala Pro Val His

115 120 125

Asp Pro Asp Tyr Ile Gly Gly Ile Gly Lys Glu Leu Ile Val Asp Asp

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Ile Ser Asp Val Thr Ser Phe Tyr Pro Ser Ala Tyr Gln Glu His Leu

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165 170 175

Ser Phe Asp Met Ser Thr Thr His Tyr Cys Tyr Thr His Asn Val Ile

180 185 190

Leu Ser Gly Cys Arg Asp His Ser His Ser His Gln Tyr Leu Ala Leu

195 200 205

Gly Val Leu Arg Thr Ser Ala Thr Gly Arg Val Phe Phe Ser Thr Leu

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Arg Ser Thr Asn Leu Asp Asp Thr Gln Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val

225 230 235 240

Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Met Leu Cys Ser Lys Val Thr Glu

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Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gln Tyr His Glu Lys Asp Leu Asp Thr

275 280 285

Thr Val Leu Phe Lys Asp Trp Val Ala Asn Tyr Pro Gly Ala Gly Gly

290 295 300

Gly Ser Phe Ile Asp Asp Arg Val Trp Phe Pro Val Tyr Gly Gly Leu

305 310 315 320

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325 330 335

Tyr Lys Arg His Asn Asn Thr Cys Pro Asp Glu Gln Asp Tyr Gln Ile

340 345 350

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355 360 365

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Asn His Thr Leu Arg Gly Val Phe Gly Thr Met Leu Asp Asp Glu Gln

485 490 495

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Leu Leu Val Glu Ile Leu Lys Asp Asp Arg Val

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<210> 3

<211> 1623

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgctgatta ctagaataat gctcatactt ggttgtatca ggcccaccag ctctttggac 60

gggaggcctc ttgcagccgc gggtatagtc gtgacaggtg ataaggctgt gaatgtatat 120

accagcagtc aaaccggcag tatcatcgtt aaattgctgc ctaacatgcc acgcgacaag 180

gaagcctgtg caaaagcacc gcttgaagca tataaccgca cgttgactac actgttgact 240

ccacttggtg actcaattag aaagattcaa ggttctgtgt caacgagcgg aggaggtcgc 300

cagggcagac tcataggagc ggtcataggg agcgtcgcgc tcggtgtggc tacggcagcc 360

cagattacag ccgcagctgc ccttatacaa gccaacagga acgccgctaa tattctgagg 420

cttaaagaaa gtatagcagc aactaacgaa gcggttcatg aagtgacgga cggtttgtcc 480

cagctttctg tcgctgtagg taaaatgcag cagtttgtta acgatcaatt taataacacc 540

gcgagggaac tggactgcat taaaatcacc caacaagtag gtgtggaact caacctctat 600

ttgacggagt tgacaacggt gttcggacca cagatcactt ctccagcgct tacacagctt 660

accatccaag ccctttataa cttggccgga ggaaacatgg atcacctgct tacacgcctt 720

ggaatcggaa ataatcaact gtcctctctc atcggtagtg ggttgattac gggatatccg 780

atactctacg acagccaaac gcagctgctc ggtattcaag ttaatcttcc gtccgtgggc 840

aacttgaaca atatgagggc tacttatctt gagactttga gtgtgagcac cacaaagggc 900

tatgccagcg ccctcgtccc caaggtagta actcaagtgg ggtctgtgat cgaggaactt 960

gatacatctt actgcatcga gagtgacttg gacctctatt gcaccaggat tgtgacactt 1020

cccatgtctc cgggcattta cagttgcctt tcagggaata catcagcttg catgtatagc 1080

aagacagaag gagcgctcac gaccccttac atggccctga aaggttccgt aattgccaat 1140

tgtaagatta ctacttgccg ctgcacagac ccgcctggca tcattagtca gaactacggt 1200

gaagctgtct ccctgattga tagacatttg tgtaatgttc tgtccctgga cggcataact 1260

cttaggttgt caggcgagtt cgacgccacg tatcaaaaaa acatctctat actcgacagc 1320

caagttattg taaccggcaa tctggatatc agcaccgagt tgggcaacgt aaataacagc 1380

atttctaatg cgttggatag actcgcggaa tccaactcta aattggagaa agttaatgtg 1440

agactgacga gtacgagtgc tctgattacc tatatcgtct tgactgtcat aagtctcgtg 1500

tttggggctc tcagtcttgg gttggcgtgt tacctgatgt ataaacagaa agcgcagcaa 1560

aaaacccttt tgtggctggg taacaatacc ctcgaccaga tgagagcaac tactagagcg 1620

tga 1623

<210> 4

<211> 1716

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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gccgccgcgc tggcgtattc taccggggcg agcacgcccc atgacctggc cggtataagt 180

acggtaatat caaaaacgga ggacaaagta acgtcccttc tcagcctgtc tcaggacgtc 240

atagataaga tatataagca ggttgctctg gagtctccat tggcgctgct gaacacagag 300

tccataatta tgaacgcgat cacttctttg tcatatcaga ttaacggggc ggccaacaac 360

tcagggtgcg gggctccagt acacgatccc gattacatag ggggtatagg taaggaactt 420

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aattttatcc cagcaccaac cactgggtcc gggtgcacta ggatcccctc ttttgacatg 540

agcaccactc attattgtta cacgcacaac gttatactga gtggttgcag ggaccactcc 600

cactcacacc agtatttggc acttggggtc ctgcgcacgt ccgcaacggg aagagttttt 660

ttctctacac tgcgctcaac caatctcgac gacacgcaaa atcgcaagtc atgctccgtg 720

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<212> DNA

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gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180

cctggattcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagagcaa tgggaactac 240

aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagctacaa ctactgcaga 300

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atctacctta taggctttga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtagc cgcagataat 840

gggctgacgg ccggcaccga caatcttatg ccattcaatc ttgtcattcc aaccaatgag 900

ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtga cctccaaaag tggtggtcag 960

gcaggggatc agatgtcatg gtcggcaagt gggagcctag cagtgacgat ccatggtggc 1020

aactatccag gggccctccg tcccgtcaca ctagtagcct acgaaagagt ggcaacaggc 1080

tccgtcgtta cggtcgctgg ggtgagtaac ttcgagctga ttccaaatcc tgaactagca 1140

aagaacctgg ttacagaata cggccgattt gacccaggag ccatgaacta cacaaaattg 1200

atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtct ggccaacaag ggagtacact 1260

gattttcgtg agtacttcat ggaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga 1320

gcatttggct tcaaagacat aatccgggct ataaggaggt aa 1362

<210> 6

<211> 1476

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gggcccatgg tcgagccccc aagaggggaa tcaccaacgt ccgactcaac agcaggggag 60

tcaacccagt cgcggaaaca gtcaggaaag accgcagaac caagtcaagg ccgcccctgg 120

aaaccagggc acagacgtga acacagcata tcatggacaa tgggaggagt cacaactatc 180

agctggtgca acccctcatg ctctccgatc aaggcagagc caagacaata cccttgtatc 240

tgcggatcat gtccagccac ctgtagactt tgtgcaagcg atgatgtcta tgatggaggc 300

gatatcacag agagtaagta aggttgacta tcagctagat cttgtcttga aacagacatc 360

ctccatccct atgatgcggt ccgaaatcca acagctgaaa acatctgttg cagtcatgga 420

agccaacttg ggaatgatga agattctgga tcccggttgt gccaacattt catctctgag 480

tgatctacgg gcagttgccc gatctcaccc ggttttagtt tcaggccctg gagacccctc 540

tccctatgtg acacaaggag gcgaaatggc acttaataaa ctttcgcaac cagtgccaca 600

tccatctgaa ttgattaaac ccgccactgc atgcgggcct gatataggag tggaaaagga 660

cactgtccgt gcattgatca tgtcacgccc aatgcacccg agttcttcag ccaagctcct 720

aagcaagtta gatgcagccg ggtcgatcga ggaaatcagg aaaatcaagc gccttgctct 780

aaatggctaa ttactactgc cacacgtagc gggtccttaa gaaaaaatac gggtagaata 840

tctgcaccga gttccccccc gcagacccaa ggtccagctc ttcaagcggc aatcctctcg 900

ctcttcctca gccccactga atggtcgcgt aaccgtaatt aatctagcta catttaagat 960

taagaaaaaa tacgggtaga attggagtgc cccaattgtg ccaagatgga ctcatctagg 1020

acaattgggc tgtactttga ttctgcccat tcttctagca acctgttagc atttccgatc 1080

gtcctacaag gcacaggaga tgggaagaag caaatcgccc cgcaatatag gatccagcgc 1140

cttgacttgt ggactgatag taaggaggac tcagtattca tcaccaccta tggattcatc 1200

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ttactttccg ctgcgatgct ctgcctagga agcgtcccaa ataccggaga ccttattgag 1320

ctggcaaggg cctgtctcac tatgatagtc acatgcaaga agagtgcaac taatactgag 1380

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aacaaatact catcagtgaa tgcagtcaag cacgtg 1476

Claims (9)

1.表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因的重组嵌合型新城疫病毒，其特征在于，将鸡传染性法氏囊病病毒变异毒株VP2基因共有序列插入到含有基因VII型F和HN基因的嵌合型LaSota弱毒株中，得到即为表达鸡传染性法氏囊病病毒变异毒株VP2基因的重组嵌合型新城疫病毒；

所述嵌合型LaSota弱毒株是用基因VII型NDV的HN基因和碱性蛋白酶裂解位点附近氨基酸序列突变的F基因分别替换LaSota疫苗株的HN和F基因后得到的。

2.根据权利要求1所述的表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因的重组嵌合型新城疫病毒，其特征在于，所述嵌合型LaSota弱毒株是以带有LaSota全基因组cDNA的载体为骨架，在大肠杆菌中利用同源重组技术和反向筛选标记系统，将LaSota疫苗株的HN和F基因分别替换为基因VII型NDV流行株的HN基因和碱性蛋白酶裂解位点附近氨基酸优化突变后的基因VII型F基因，得到重组的转录质粒；然后将转录质粒和表达NDV LaSota疫苗株核蛋白、磷酸蛋白和大聚合酶蛋白的辅助质粒共转染细胞进行病毒拯救，进而得到重组LaSota疫苗株；优化突变后的基因VII型F基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因的重组嵌合型新城疫病毒，其特征在于，所述基因VII型NDV流行株的HN基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。

4.表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因的重组嵌合型新城疫病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）构建LaSota株的感染性克隆质粒；

（2）分别构建含有VII型NDV流行毒株的HN基因和优化突变后的F基因的重组载体；其中基因VII型NDV流行株的F基因中的碱性蛋白酶裂解位点氨基酸序列从112RRQKR↓F117突变为112GRQGR↓L117；

（3）利用带有LaSota株的F和HN基因两侧同源序列的引物，以步骤（2）中制备的重组载体、含有抗性筛选标记以及大肠杆菌自杀基因的重组质粒为模板，分别扩增优化突变后的基因VII型NDV的F基因和HN基因，以及抗性筛选标记和大肠杆菌自杀基因的筛选表达盒；

（4）将带有LaSota株F基因两侧同源臂的筛选表达盒与LaSota的感染性克隆质粒共转化进宿主菌，筛选阳性克隆，得到重组质粒pLaSota-ΔF-筛选表达盒；

（5）利用Redαβ重组酶介导的同源重组技术，将pLaSota-ΔF-筛选表达盒中的筛选表达盒替换为优化突变后的基因VII型NDV的F基因，得到重组质粒pLaSota-7F；

（6）利用带有LaSota株HN基因两侧同源臂的引物扩增的筛选表达盒片段与重组质粒pLaSota-7F共转化进宿主菌，筛选阳性克隆，得到重组质粒pLaSota-7F-ΔHN-筛选表达盒；

（7）用Redαβ重组酶介导的同源重组技术，将重组质粒pLaSota-7F-ΔHN-筛选表达盒中的筛选表达盒替换为基因VII型NDV的HN基因，得到重组质粒pLaSota-7F-7HN；

（8）表达VP2蛋白的重组NDV 感染性克隆的构建：将鸡传染性法氏囊病病毒流行变异毒株VP2基因经酶切后克隆至穿梭质粒中，得到重组穿梭质粒；然后双酶切重组穿梭质粒和步骤（7）得到的重组质粒pLaSota-7F-7HN，将IBDV VP2基因克隆至pLaSota-7F-7HN载体中，得到含有IBDV变异毒株VP2基因的重组NDV全长感染性克隆；

（9） 重组NDV全长感染性克隆的拯救：将重组NDV全长感染性克隆与表达NDV LaSota疫苗株核蛋白、磷酸蛋白和大聚合酶蛋白的辅助质粒共转染BHK-21细胞，收获培养物上清，接种鸡胚并培养120 h，收获HA阳性尿囊液即为拯救的重组病毒。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，利用重叠PCR将涵盖整个LaSota株基因组的cDNA片段克隆到转录载体pOLTV5中，获得重组质粒pLaSota。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述抗性筛选标记为青霉素抗性筛选标记，大肠杆菌自杀基因为大肠杆菌自杀基因ccdB。

7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述辅助质粒的构建方法为：

将编码NDV LaSota疫苗株的大聚合酶蛋白的cDNA序列克隆到pCI-neo真核表达载体的CMV启动子下游；将编码核蛋白、磷酸蛋白的cDNA通过2A肽序列串联后克隆到pCI-neo真核表达载体的SV40启动子下游，获得同时表达核蛋白、磷酸蛋白和大聚合酶蛋白的辅助质粒。

8.权利要求1所述重组嵌合型新城疫病毒在制备预防IBDV变异株和基因VII型NDV的多联疫苗中的应用。

9.权利要求1所述重组嵌合型新城疫病毒在制备IBDV变异株和基因VII型NDV诊断试剂和治疗药物中的应用。

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