CN109321683A - 一种a型塞尼卡病毒检测引物、试剂盒、病毒检测方法和应用 - Google Patents

一种a型塞尼卡病毒检测引物、试剂盒、病毒检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于动物病原分子诊断技术领域，具体是涉及到一种A型塞尼卡病毒检测引物、试剂盒、病毒检测方法和应用，包括如下引物：SVA上游引物为SEQ ID NO.1：5’‑AGAATTTGGAAGCCATGC‑3’，SVA下游引物为SEQ ID NO.2：5’‑GAAACAGAYTGCAGCTTCTC‑3’，Y表示简并碱基，为碱基T或者C，本发明在保证高灵敏度和特异性的同时，提高检测准确度，降低假阳假阴几率。

Description

一种A型塞尼卡病毒检测引物、试剂盒、病毒检测方法和应用
技术领域
本发明属于动物病原分子诊断技术领域，具体是涉及到一种A型塞尼卡病毒检测引物、试剂盒、病毒检测方法和应用。
背景技术
A型塞尼卡病毒(Senecavirus A，SVA)，旧称赛内卡谷病毒(Seneca Valleyvirus)，是一种近年来在国内新发的猪的疫病病原，同口蹄疫病毒(FMDV)、猪水泡病病毒(SVDV)、水泡性口炎病毒(VSV)类似，主要引起猪的黏膜病，并易造成小猪的死亡和肥猪的减产，对猪养殖业的经济危害较大。
SVA是塞尼卡病毒属中唯一的一种病毒，且只有一个血清型，然而国际上对其流行病学、感染机制、宿主类型仍然缺乏验证。目前一般认为SVA只是感染猪和在猪群内传播，同时可能通过鼠害等方式实现跨场传播。不同于FMDV，SVA并不属于目前OIE要求上报的重大疫病原，相关检测方法和检测标准并不健全，加上同其它几种病毒引起的症状极为相似，从临床上进行区分十分困难，最关键的是无有效的预防手段(无商品化疫苗)，因此建立新的诊断方法对于SVA的防控尤为关键。
SVA的诊断方法可包括病毒分离鉴定、病毒抗原的检测(免疫学检测)和病原RNA的检测(分子检测)三大类。
1.病毒分离鉴定。目前已报道的能够培养SVA的细胞系有人的肿瘤细胞系H1299、HEK293T，猪肾细胞系PK15、IBRS2及仓鼠肾细胞BHK21等，培养富集的病毒通过免疫电镜、中和试验等进行SVA的确定。
2.SVA抗原检测。已有报道针对VP1和VP2蛋白的免疫荧光抗体检测抗原和ELISA检测抗体的方法直接或间接对SVA的感染进行诊断。
3.SVA分子检测。SVA RNA能在感染病灶部位检出，如口鼻部、蹄部水泡，肺、心肌、扁桃体等脏器。常用RT-PCR和qRT-PCR方法对这些组织进行核酸的检测。
不同的检测方法具有不同的优势和劣势，结合不同类型的检测对SVA的感染诊断会更加精准。
现有技术的缺点/不足及原因分析：
1.病毒分离鉴定一直以来是实验室诊断的“金标准”，分离的病毒可方便开展后续一系列相关研究，但是对于早期诊断却捉襟见肘。动辄1周以上的检测周期显然不适合动物群体的检测，而且很多病毒不能通过现有的细胞系进行培养分离也限制了该方法的通用性。
2.因“空窗期”的存在，通过抗体检测间接诊断SVA的感染并不适合，很多时候猪群明显发病，但抗体仍然滞后。直接检测病毒抗原可以进行早期诊断，但必须通过化学发光等技术进一步提升抗原检测的灵敏度，技术壁垒和额外昂贵的仪器投入限制了在现地检测的推广。
3.针对SVA核酸的RT-PCR类检测具有最高的灵敏度优势，具有“空窗期”优势，在发病早期就能实现排查，但传统的RT-PCR检测操作还是要求较高，容易造成假阳性污染影响诊断的精准性，同时较难实现现地检测。
专利CN201710327691与CN201810415408公开的猪A型赛内卡病毒检测探针均使用MGB基团作为3’端标记基团。MGB基团具有提高探针Tm值的作用，降低合成成本，提高成功率，但使用该标记的探针序列往往很短(一般小于20bp)，常用于单核苷酸多态性SNP的检测，可以区分1个碱基的突变，因此用作基因组容易变异的病毒检测，往往会由于碱基突变引起漏检。
专利CN201710327691公开的A型赛内卡病毒的检测方法是将RNA反转录和cDNA扩增分为了两个独立的步骤，中间需要额外开盖转移样品和配制试剂，不仅容易造成操作失误，耗费更多的时间，同时也容易造成污染影响检测结果的准确性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种A型塞尼卡病毒检测引物、试剂盒、病毒检测方法和应用，在保证高灵敏度和特异性的同时，提高检测准确度，降低假阳假阴几率。
1.本技术方案中的一种A型塞尼卡病毒实时荧光RT-PCR快速检测试剂，包括一组用于A型塞尼卡病毒检测的引物和Taqman探针，引物与探针序列信息如下：
(1)SVA上游引物(SVA-F1)：5’-AGAATTTGGAAGCCATGC-3’(SEQ ID NO.1)；
(2)SVA下游引物(SVA-R1)：5’-GAAACAGAYTGCAGCTTCTC-3’(SEQ ID NO.2)，Y表示碱基简并，为碱基T或者C；
(3)SVA探针(SVA-P1)：5’-FAM-CTCCTACTTCAAACCAGGAACACTAC-BHQ1-3’(SEQ IDNO.3)，FAM为报告荧光基团，BHQ1为淬灭荧光基团；
(4)上述引物扩增片段为A型塞尼卡病毒的3D基因部分，扩增产物长度为67bp，目标核苷酸序列为：
AGAATTTGGAAGCCATGCTCTCCTACTTCAAACCAGGAACACTACTCGAGAAGCTGCAATCTGTTTC(SEQ ID NO.8)。
2.根据上述扩增产物目标核苷酸序列，合成带有该核苷酸的重组克隆质粒(以质粒pUC57为基础)，编号为pUC-sva3d。使用蛋白核酸测定仪对重组质粒pUC-sva3d浓度进行定量，并使用TE溶液对重组质粒稀释。根据实际浓度测定值，将pUC-sva3d稀释至1.0×104～5.0×104copies/μL，作为阳性对照。
3.合成内标重组质粒，编号pUC-ipc，该重组质粒含有一段内标序列。
(1)核苷酸长度455bp，核苷酸序列为：
CTGGAGACTGAGGGTTGACGCGCATTCGTCATTGAACGCAGACACGGCTGAGAGAACATGGAGCGACTGCACTGCACTTGGTCGATCTGATTAGGAGTGGGGTTTATGCCCGCGGCTTATCCCCCTATCCTTGCGACACGGGAGAAGACAGATTGTCATCGATTTCGCAAGCCATGATATGTTTGGCCCGACCAACCGCGTTTTTCTCGCGCTTGGATAACGACCTATGGTGTGGACAGTGGCTTAGAGGACATGACACGACGGGCTGAAAGTATGTGGTGCTGGGGCCCTTAGATAGCTGCATAGTTGGACCGCTAGGAATTATATCAATTCGAGATCTCCAGCCGACAAAGTAGGCTCCTAACTAACAGGGTCCAAAGGTTTATCACCGGTCCTTACTCTTTGCGGGACCTTTCTACCCATACAATATCGTCCTCCGATGATGGATCACGGAG(SEQ ID NO.4)。
(2)以此序列为模板，设计引物与探针序列。引物与探针序列如下：
内标上游引物(IPC05F01)：5’-CATAGTTGGACCGCTAGGA-3’(SEQ ID NO.5)，
内标下游引物(IPC05R01)：5’-GAAAGGTCCCGCAAAGAGT-3’(SEQ ID NO.6)，
内标探针(IPC05P)：5’-Hex-CCGGTGATAAACCTTTGGACCCT-Bhq1-3’(SEQ ID NO.7)，Hex为报告荧光基团，Bhq1为淬灭荧光基团。
4.此技术方案中的一种A型塞尼卡病毒实时荧光RT-PCR快速检测试剂，其组分包括：SVA反应液、RNA酶混合液、SVA阳性对照、SVA阴性对照、RNA释放剂。各组分制备方法如下：
(1)SVA反应液包括PCR-Buffer、dNTP、上述SVA引物探针、上述内标引物探针。其中SVA引物SVA-F1与SVA-R1在反应液中的终浓度范围是200～300nM，SVA-P1在反应液中的浓度范围是100～200nM；内标引物IPC05F01与IPC05R01在反应液中的终浓度范围是100～200nM，内标探针IPC05P在反应液中的终浓度范围是100～200nM；dNTP包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷，其中使用dUTP代替了一般常用的dTTP，这样扩增条带为带有U碱基的DNA。这种双链结构在UNG酶存在时会被水解，因此可以减少扩增产物(PCR的主要污染源)残留的污染。特别的，该反应液中PCR-Buffer不同于常见Buffer，其中Tris-HCl浓度为125～200mM，高于常用的10mM的浓度，这样PCR反应才不受RNA释放剂的影响，保证本发明的试剂盒快检得以实现。
(2)RNA酶混合液中包括酶稀释液、M-MLV反转录酶、热启动Taq酶与UNG酶。其中M-MLV反转录酶在RNA酶混合液中的终浓度为5～20U/μL，热启动Taq酶在RNA酶混合液中的终浓度为1～2U/μL，该酶需在月95℃活化才能行使扩增活性；UNG酶全称尿嘧啶-N-糖基化酶，能选择性水解断裂含有U碱基的扩增产物中的尿嘧啶糖苷键，进而消除扩增产物残留、气溶胶污染等，该酶最佳活性温度为50℃，95℃失活，同热启动Taq酶共同实现抑制假阳性的效果。
(3)使用蛋白核酸测定仪对重组质粒pUC-sva3d的浓度进行定量，并使用TE溶液对重组质粒稀释。根据实际浓度测定值，将pUC-sva3d稀释至1.0×104～5.0×104copies/μL，作为阳性对照。
(4)SVA-阴性对照为用depc H2O配制的TE溶液。
(5)此技术方案中的RNA释放剂为一种碱性裂解液，同时加入合适比例的RNAase抑制剂。具体包括75～150mM的NaOH、1～5％PEG6000、1～5mM EDTA、1～3mM DTT。该核酸释放剂中NaOH可以有效的裂解细胞或病毒，释放出内容物并使之变性失活，非离子型去垢剂PEG6000进一步分散蛋白与核酸，EDTA和DTT联合使用能有效的抑制一般样品中RNAase对RNA的水解作用。
上述方法制备的RNA释放剂能适用于无溶血的血清、血浆，组织，病毒培养物、体液等的裂解处理，并且无需高温加热处理的步骤，在室温下作用3～5min即可。样品经裂解后直接可用于后续荧光RT-PCR扩增，相比较RNA提取纯化过程(提取时间一般在1h以上)，在保证一致的扩增结果前提下，更省时省事，非常适合临床一线的快速检测(现地检测)。
(6)试剂盒(以50T计)中上述各组分装量如下：
5.本技术方案中的一种A型塞尼卡病毒实时荧光RT-PCR快速检测试剂盒，特异性强、灵敏度高、抗污染，可用于实验室和临床现地对于SVA感染猪群的快速准确检测。本试剂盒用法包括以下步骤：
(1)样品采集：活体采集口、鼻、蹄部的水泡液或拭子，血清和血浆，扁桃体组织，病死猪可采集肺、心肌组织。
(2)样品预处理：无溶血的血清和血浆、水泡液直接用于后续检测，鼻咽拭子使用生理盐水进行浸泡处理，浸出液用于后续检测；取约50mg组织病料，于研磨器具中研磨，加入1mL生理盐水研磨至匀浆，转移至1.5mL离心管，8000g离心5分钟，取上清用于检测。
(3)扩增试剂配制：取出包装盒中除RNA酶混合液外的各组分，室温放置，待其彻底溶解后，震荡混匀备用；按比例(SVA反应液38μL/头份+RNA酶混合液2μL/头份+SVA内标0.52μL/头份)取相应量的试剂，充分混匀成PCR-Mix，瞬时离心。
(4)裂解与加样：取离心管，向每管中加入100μL RNA释放剂，取10～20μL阴性对照/阳性对照/预处理样本分别加入对应管中，混匀后静置3～5min；12000rpm离心2min，取上清5μL转移至PCR反应管中；向每个反应管中分别加入45μL PCR-Mix，盖上管盖，短暂离心，转移至扩增区。
(5)上机扩增：将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照以及待测样本名称；选择FAM通道检测SVA核酸；选择HEX通道检测内标；设置反应体系为50μL；循环参数设定如下：
设置完毕，保存文件，运行反应程序。整个程序只需不到60min。
(6)结果分析与判定：待反应程序完成后，记录样品Ct值与扩增曲线。SVA阴性对照HEX通道Ct值≤35，FAM通道无报告Ct值，SVA阳性对照HEX通道Ct值≤35，FAM通道Ct值≤30；被检样品检测结果中FAM通道Ct值≤40，报告为SVA核酸阳性；被检样品检测结果中FAM通道Ct值>40或无报告Ct值，同时HEX通道(内标)Ct值≤35，报告为SVA核酸阴性；被检样品检测结果中FAM通道Ct值>40或无报告Ct值，同时HEX通道(内标)Ct值>35，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。
本发明还提供一种所述引物在制备检测A型塞尼卡病毒物品中的应用。
6.本技术方案中的一种A型塞尼卡病毒实时荧光RT-PCR快速检测试剂盒，结合目前防控形势与临床情况可以实现以下用途。
(1)用于疑似发病猪的实验室确诊检测；
(2)发病前或发病初期(无明显症状)的早期诊断；
(3)健康猪群“体检”，查看是否有SVA的存在；
(4)引种过程中的SVA病原检测，特别是从国外疫区引种的精准检测；
(5)进口肉制品的SVA病原检测，特别是从国外疫区进口肉制品的精准检测；
(6)直检技术方便用于现场的即时检测，结合小型化设备实现POCT；
(7)用于SVA致病机制、流行病学等基础研究用途。
本发明的有益效果是，
1.更高的敏感性与特异性：筛选和优化了新的引物探针。通过生物信息学预测及实验验证，本技术方案优选的引物探针敏感性与特异性更好，特别是减少可能出现的因引物探针错配导致的漏检。
2.内标的使用可避免假阴性：检测结果可能因临床样品复杂性、保存不当，试剂配制错误，误加样等因素导致检测结果“假阴性”。本技术方案试剂盒添加内标可用于监测整个PCR反应体系是否正常，从而避免因使用不当造成的错误的判定结果。
3.UNG酶体系可减少假阳性：PCR扩增实验室最为常见的污染是扩增产物污染，且清除较为麻烦，形成气溶胶或者表面残留后对高灵敏度常的PCR检测影响很大。为防止和减少此种情况，UNG酶的作用不可少。
4.一步法RNA直检操作简单：使用RNA释放剂直扩，样品经裂解后直接可用于后续荧光RT-PCR扩增，相比较核酸提取纯化过程，在保证一致的扩增结果前提下，更省时省事，非常适合临床一线的现地检测。
5.扩增反应少于60min：相较于一般的荧光RT-PCR和商品化产品的扩增时间花费，节约40％。
现有技术中，常规的引物和探针难以达到要求，为了方便探针设计，提高配对与非配对模版间的Tm值差异，使实验结果更加稳定和精确，一般研发人员会在探针上标记MGB和荧光淬灭基团，本技术方案设计SVA探针长度为26bp，长度较长，但是通过引物和探针序列本身的设计，不使用MGB，探针和引物不仅在体系中稳定存在，不易受样本质量影响，而且探针在保证特异性的同时亦能兼容1-2个碱基错配，大大提高了对SVA的临床检出率。
本技术方案使用的一步法操作，反转录和扩增在同一体系中完成，速度快、污染少，加上使用RNA释放剂进行直扩，操作的简便性和准确度具有明显的优势。
附图说明
图1为病毒培养物经RNA释放剂裂解和核酸提纯的扩增效果比较图。
其中，虚线为RNA释放剂处理后的荧光扩增曲线图，实线为Trizol法核酸提纯后的荧光扩增曲线图。
图2为体液样本经RNA释放剂裂解和核酸提纯的扩增效果比较图。
其中，最左侧的虚线为RNA释放剂处理血清和水泡液后的荧光扩增曲线图，中间的点画线为RNA释放剂处理心积液后的荧光扩增曲线图，右侧的实线为Trizol法核酸提纯后的荧光扩增曲线图。
图3为组织样本经RNA释放剂裂解和核酸提纯的扩增效果比较图。
图4为不同浓度梯度的重组质粒pUC-sva3d的荧光扩增曲线图。
图5为拟合的线性标准直线图。
具体实施方式
实施例1
1.引物探针设计及反应体系优化
通过生物信息学分析比对NCBI中登陆的100株SVA全基因组序列信息，进行保守位点分析，选取高度保守区域的序列设计特异性的引物与探针序列。引物探针序列与相关信息如下表。
表1 SVA引物与探针序列信息
以SVA灭活病毒核酸为模板，使用上述引物探针不同浓度组合，进行扩增比较试验，从引物扩增效率、探针信噪比与扩增曲线形态等指标等方面进行评估。筛选最优化的引物探针浓度为：SVA-F1为200nM，SVA-R1为200nM，SVA-P1为100nM。在此浓度组合下，针对SVA的扩增获得最佳效果。
2.内标体系筛选
使用随机序列内标，行使内标作用监控假阴性同时，对目的基因的扩增不造成任何影响。
(1)内标质粒的构建：生成核苷酸序列，长度455bp，由上海生工进行序列合成。合成的该核苷酸片段连接至pUC57载体上，重组质粒编号pUC-ipc。内标核苷酸序列为：
CTGGAGACTGAGGGTTGACGCGCATTCGTCATTGAACGCAGACACGGCTGAGAGAACATGGAGCGACTGCACTGCACTTGGTCGATCTGATTAGGAGTGGGGTTTATGCCCGCGGCTTATCCCCCTATCCTTGCGACACGGGAGAAGACAGATTGTCATCGATTTCGCAAGCCATGATATGTTTGGCCCGACCAACCGCGtttttCTCGCGCTTGGATAACGACCTATGGTGTGGACAGTGGCTTAGAGGACATGACACGACGGGCTGAAAGTATGTGGTGCTGGGGCCCTTAGATAGCTGCATAGTTGGACCGCTAGGAATTATATCAATTCGAGATCTCCAGCCGACAAAGTAGGCTCCTAACTAACAGGGTCCAAAGGTTTATCACCGGTCCTTACTCTTTGCGGGACCTTTCTACCCATACAATATCGTCCTCCGATGATGGATCACGGAG。
(2)内标质粒的定量：使用蛋白核酸测定仪对重组质粒pUC-ipc浓度进行定量，并使用TE溶液对重组质粒稀释。其中：根据实际浓度测定值，将pUC-ipc稀释至1.0×103～2.0×103copies/μL，作为试剂盒内标；
(3)根据内标序列设计3套引物探针，其中探针5’端统一标记Hex荧光基团。3套内标引物探针序列如下表。
表2内标引物与探针序列信息表
(4)分别将3套内标体系加入SVA扩增体系中组合成双重扩增体系，加入模板进行扩增，将扩增结果同未加内标体系的SVA单重扩增体系进行荧光曲线、Ct值等指标比较，筛选对SVA体系无干扰的内标引物探针作为优选的内标体系。根据实验结果，确定最优化的内标为IPC05，其中最佳的使用浓度为：IPC05F浓度100nM，IPC05R浓度100nM，IPC05P浓度100nM。
3.RNA释放剂测试
测试RNA释放剂对于不同类型临床样本的裂解效果，并同Trizol法核酸提取试剂比较，包括纯病毒培养物、血清、水泡液、心积液、脾脏组织等。
(1)纯病毒培养物的裂解效果比较
取等量的纯病毒培养物，分别用RNA释放剂裂解和Trizol法核酸提纯进行提取，两种核酸样本用本技术方案的SVA荧光RT-PCR试剂进行扩增，从Ct值比较RNA释放剂裂解和Trizol法的效果差异。如图1所示，RNA释放剂的裂解效果明显优于Trizol提取，Ct值提前约6个Ct单位。Trizol法是通过多次关键步骤操作来纯化RNA，虽然具有纯度高的优势，但因多次且长时间操作会造成的RNA浓度的损失，而RNA释放剂直接裂解样本后用于扩增，RNA损失少，虽然可能存在杂质未祛除造成扩增的抑制，但从本实验的效果看，RNA释放剂裂解纯病毒培养物样本的效果较Trizol法具有明显优势。
(2)体液样本的裂解效果比较
取血清、水泡液和心积液样本，分别用RNA释放剂裂解和Trizol法核酸提纯进行提取，两种核酸样本用本技术方案的SVA荧光RT-PCR试剂进行扩增，从Ct值比较RNA释放剂裂解和Trizol法针对上述体液样本的效果差异。结果如图2所示，RNA释放剂裂解体液样本的效果较Trizol法提纯效果好，其中释放剂处理血清和水泡液的效果相当，Ct值较Trizol法提前约3个单位，释放剂处理心积液的效果较Trizol法提前约1个Ct值。整体来看，RNA释放剂对体液样本的处理效果较好。
(3)组织样本的裂解效果比较
取发病猪的脾脏样本，分别用RNA释放剂裂解和Trizol法核酸提纯进行提取，两种核酸样本用本技术方案的SVA荧光RT-PCR试剂进行扩增，从Ct值比较RNA释放剂裂解和Trizol法针对上述组织样本的效果差异。结果如图3所示，两种核酸处理方法的效果接近一致。不同于病毒液、体液等样本，组织样本含有较多的杂质，如蛋白、脂质、多糖等，高浓度的杂质会成为PCR扩增的阻化物，从而影响PCR的效果，从此实验来看，虽然本技术方案的RNA释放剂对组织样本的处理效果较病毒液、体液样本的效果有所下降，但仍与Trizol提纯法的效果相当。
实施例2
基于前期实验结论，本SVA实时RT-PCR监测试剂盒，其组分包括：SVA-反应液、RNA酶混合液、SVA-阳性对照、SVA-阴性对照、RNA释放剂。各组分制备方法如下：
(1)SVA-反应液包括PCR-Buffer、dNTP、上述SVA引物探针、上述内标引物探针。其中SVA引物SVA-F1与SVA-R1在反应液中的终浓度范围是200～300nM，SVA-P1在反应液中的浓度范围是100～200nM；内标引物IPC05F01与IPC05R01在反应液中的终浓度范围是100～200nM，内标探针IPC05P在反应液中的终浓度范围是100～200nM；dNTP包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷，其中使用dUTP代替了一般常用的dTTP，这样扩增条带为带有U碱基的DNA。这种双链结构在UNG酶存在时会被水解，因此可以减少扩增产物(PCR的主要污染源)残留的污染。特别的，该反应液中PCR-Buffer不同于常见Buffer，其中Tris-HCl浓度为125～200mM，高于常用的10mM的浓度，这样PCR反应才不受RNA释放剂的影响，这也是该试剂盒快检得以实现的核心内容。
(2)RNA酶混合液中包括酶稀释液、M-MLV反转录酶、热启动Taq酶与UNG酶。其中M-MLV反转录酶在RNA酶混合液中的终浓度为5～20U/μL，热启动Taq酶在RNA酶混合液中的终浓度为1～2U/μL，该酶需在月95℃活化才能行使扩增活性；UNG酶全称尿嘧啶-N-糖基化酶，能选择性水解断裂含有U碱基的扩增产物中的尿嘧啶糖苷键，进而消除扩增产物残留、气溶胶污染等，该酶最佳活性温度为50摄氏度，95摄氏度失活，同热启动Taq酶共同实现抑制假阳性的效果。
(3)使用蛋白核酸测定仪对重组质粒pUC-sva3d的浓度进行定量，并使用TE溶液对重组质粒稀释。根据实际浓度测定值，将pUC-sva3d稀释至1.0×104～5.0×104copies/μL，作为阳性对照。
(4)SVA-阴性对照为用depcH2O配制的TE溶液。
(5)此技术方案中的RNA释放剂为一种碱性裂解液，同时加入合适比例的RNAase抑制剂。具体包括75～150mM的NaOH、1～5％PEG6000、1～5mM EDTA、1～3mM DTT。该核酸释放剂中NaOH可以有效的裂解细胞或病毒，释放出内容物并使之变性失活，非离子型去垢剂PEG6000进一步分散蛋白与核酸，EDTA和DTT联合使用能有效的抑制一般样品中RNAase对RNA的水解作用。
上述方法制备的RNA释放剂能适用于无溶血的血清、血浆，组织，病毒培养物、体液等的裂解处理，并且无需高温加热处理的步骤，在室温下作用3～5min即可。样品经裂解后直接可用于后续荧光RT-PCR扩增，相比较RNA提取纯化过程，在保证一致的扩增结果前提下，更省时省事，非常适合临床一线的快速检测(现地检测)。
(6)试剂盒(以50T计)中上述各组分装量如下：
实施例3
线性范围与扩增效率测定
对定量的重组质粒pUC-sva3d进行10倍梯度连续稀释，使其拷贝数范围为：107～1copies/μl，对每个梯度作为模板进行实时荧光PCR，根据扩增结果制作标准曲线。
如图4-5所示。该SVA试剂盒对107～100copies/μl的梯度模板扩增正常，呈线性扩增，相关系数R2＝0.99；在此线性扩增范围内，该试剂盒的扩增效率为93％。根据以上结果，该试剂盒不仅可用于SVA的定性测定，在此线性扩增范围内也符合定量测定的要求。
精密度测定
调整重组质粒pUC-sva3d浓度至10copies/μl，作为精密度测定的扩增模板。对此浓度模板重复扩增8个重复，计算Ct值的变异系数(CV)，一般来讲，荧光PCR精密度CV应＜10％，且越低重复性就越好。
精密度测试结果表明(表3)，该试剂盒对低浓度模板扩增精密度为2.96％，重复性很好，且扩增曲线形态重复性也较好。
表3 SVA试剂盒的精密度测试结果表
编号 目的基因Ct
1 38.43
2 36.27
3 39.01
4 37.26
5 36.10
6 38.11
7 38.90
8 37.43
CV(％) 2.96
特异性测定
为了检测本技术方案试剂盒的特异性，利用本发明的试剂盒检测常见猪病病原，包括猪圆环病毒(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、灭活口蹄疫病毒O型、A型、Asia1型，病毒性水泡病毒(SVDV)等样本进行特异性试验。
检测结果表明(表4)：本发明的试剂盒仅对SVA目的基因进行扩增，不与其它常见猪病病原及症状相似病原的核酸发生交叉反应。该试剂盒特异性良好。
表4 ASFV试剂盒特异性测试结果表
检测项目 SVA PCV2 PRV CSFV PRRSV FMDV-O FMDV-A FMDV-asia1 SVDV
Ct值 19.97 NoCt NoCt NoCt NoCt NoCt NoCt NoCt NoCt
判定 + - - - - - - - -
实施例4
试剂盒使用方法
本试剂盒用法包括以下步骤：
(1)样品采集：活体采集口、鼻、蹄部的水泡液或拭子，血清和血浆，扁桃体组织，病死猪可采集肺、心肌组织。
(2)样品预处理：无溶血的血清和血浆、水泡液直接用于后续检测，鼻咽拭子使用生理盐水进行浸泡处理，浸出液用于后续检测；取约50mg组织病料，于研磨器具中研磨，加入1mL生理盐水研磨至匀浆，转移至1.5mL离心管，8000g离心5分钟，取上清用于检测。
(3)扩增试剂配制：取出包装盒中除RNA酶混合液外的各组分，室温放置，待其彻底溶解后，震荡混匀备用；按比例(SVA-反应液38μL/头份+RNA酶混合液2μL/头份+SVA-内标0.52μL/头份)取相应量的试剂，充分混匀成PCR-Mix，瞬时离心。
(4)裂解与加样：取离心管，向每管中加入100μL RNA释放剂，取10～20μL阴性对照/阳性对照/预处理样本分别加入对应管中，混匀后静置3～5min；12000rpm离心2min，取上清5μL转移至PCR反应管中；向每个反应管中分别加入45μL PCR-Mix，盖上管盖，短暂离心，转移至扩增区。
(5)上机扩增：将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照以及待测样本名称；选择FAM通道检测SVA核酸；选择HEX通道检测内标；设置反应体系为50μL；循环参数设定如下：
设置完毕，保存文件，运行反应程序。整个程序只需不到60min。
(6)结果分析与判定：待反应程序完成后，记录样品Ct值与扩增曲线。SVA-阴性对照HEX通道Ct值≤35，FAM通道无报告Ct值，SVA-阳性对照HEX通道Ct值≤35，FAM通道Ct值≤30；被检样品检测结果中FAM通道Ct值≤40，报告为SVA核酸阳性；被检样品检测结果中FAM通道Ct值>40或无报告Ct值，同时HEX通道(内标)Ct值≤35，报告为SVA核酸阴性；被检样品检测结果中FAM通道Ct值>40或无报告Ct值，同时HEX通道(内标)Ct值>35，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。
<110> 湖南新南方养殖服务有限公司
<120> 一种A型塞尼卡病毒检测引物、试剂盒、病毒检测方法和应用
<160>8
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
agaatttgga agccatgc 18
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
gaaacagayt gcagcttctc 20
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ctcctacttc aaaccaggaa cactac 26
<210>4
<211>455
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
ctggagactg agggttgacg cgcattcgtc attgaacgca gacacggctg agagaacatg 60
gagcgactgc actgcacttg gtcgatctga ttaggagtgg ggtttatgcc cgcggcttat 120
ccccctatcc ttgcgacacg ggagaagaca gattgtcatc gatttcgcaa gccatgatat 180
gtttggcccg accaaccgcg tttttctcgc gcttggataa cgacctatgg tgtggacagt 240
ggcttagagg acatgacacg acgggctgaa agtatgtggt gctggggccc ttagatagct 300
gcatagttgg accgctagga attatatcaa ttcgagatct ccagccgaca aagtaggctc 360
ctaactaaca gggtccaaag gtttatcacc ggtccttact ctttgcggga cctttctacc 420
catacaatat cgtcctccga tgatggatca cggag
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
catagttggaccgctagga 19
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
gaaaggtcccgcaaagagt 19
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
ccggtgataaacctttggaccct 23
<210>8
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
agaatttgga agccatgctc tcctacttca aaccaggaac actactcgag aagctgcaat 60
ctgtttc 67

Claims (10)

1.一种A型塞尼卡病毒检测引物，其特征是，包括如下引物：
SVA上游引物为SEQ ID NO.1：5’-AGAATTTGGAAGCCATGC-3’，SVA下游引物为SEQ IDNO.2：5’-GAAACAGAYTGCAGCTTCTC-3’，Y表示简并碱基，为碱基T或者C。
2.一种检测A型塞尼卡病毒的试剂盒，其特征是，包括如权利要求1所述的A型塞尼卡病毒检测引物，还包括SVA探针SEQ ID NO.3：5’-CTCCTACTTCAAACCAGGAACACTAC-3’。
3.如权利要求2所述的检测A型塞尼卡病毒的试剂盒，其特征是，还包括内标重组质粒，所述内标重组质粒含有内标序列，所述内标序列为SEQ ID NO.4：
CTGGAGACTGAGGGTTGACGCGCATTCGTCATTGAACGCAGACACGGCTGAGAGAACATGGAGCGACTGCACTGCACTTGGTCGATCTGATTAGGAGTGGGGTTTATGCCCGCGGCTTATCCCCCTATCCTTGCGACACGGGAGAAGACAGATTGTCATCGATTTCGCAAGCCATGATATGTTTGGCCCGACCAACCGCGtttttCTCGCGCTTGGATAACGACCTATGGTGTGGACAGTGGCTTAGAGGACATGACACGACGGGCTGAAAGTATGTGGTGCTGGGGCCCTTAGATAGCTGCATAGTTGGACCGCTAGGAATTATATCAATTCGAGATCTCCAGCCGACAAAGTAGGCTCCTAACTAACAGGGTCCAAAGGTTTATCACCGGTCCTTACTCTTTGCGGGACCTTTCTACCCATACAATATCGTCCTCCGATGATGGATCACGGAG。
4.如权利要求3所述的检测A型塞尼卡病毒的试剂盒，其特征是，还包括内标引物和探针，内标上游引物为SEQ ID NO.5：5’-CATAGTTGGACCGCTAGGA-3’，内标下游引物为SEQ IDNO.6：5’-GAAAGGTCCCGCAAAGAGT-3’，内标探针为SEQ ID NO.7：CCGGTGATAAACCTTTGGACCCT。
5.如权利要求2-4任一项所述的检测A型塞尼卡病毒的试剂盒，其特征是，包括SVA反应液、RNA酶混合液、SVA阳性对照、SVA阴性对照和RNA释放剂，所述SVA反应液包括PCR-Buffer、dNTP、SVA引物、SVA探针以及内标引物和内部探针，所述PCR-Buffer含有Tris-HCl，Tris-HCl的浓度为125-200mM。
6.如权利要求5所述的检测A型塞尼卡病毒的试剂盒，其特征是，所述dNTP包括dATP、dUTP、dGTP和dCTP。
7.如权利要求5所述的检测A型塞尼卡病毒的试剂盒，其特征是，RNA酶混合液包括酶稀释液、M-MLV酶、热启动Taq酶与UNG酶，所述M-MLV酶的浓度为5～20U/μL，热启动Taq酶的浓度为1～2U/μL。
8.如权利要求5所述的检测A型塞尼卡病毒的试剂盒，其特征是，所述SVA阳性对照包括重组克隆质粒，含有目标核苷酸序列，为SEQ ID NO.8：AGAATTTGGAAGCCATGCTCTCCTACTTCAAACCAGGAACACTACTCGAGAAGCTGCAATCTGTTTC。
9.一种非疾病诊断目的使用如权利要求2-8所述试剂盒检测A型塞尼卡病毒的方法，其特征是，包括如下步骤：
(1)样品采集；
(2)样品预处理：无溶血的血清和血浆、水泡液直接用于后续检测，鼻咽拭子使用生理盐水进行浸泡处理，浸出液用于后续检测；
(3)扩增试剂配制：取SVA反应液和RNA酶混合液，混匀成PCR-Mix，瞬时离心；
(4)裂解与加样：取离心管，向每管中加入RNA释放剂，取阴性对照、阳性对照、预处理样本分别加入对应管中，混匀后静置，离心，取上清液转移至PCR反应管中；向每个反应管中分别加入PCR-Mix，盖上管盖，短暂离心，转移至扩增区；
(5)上机扩增：将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照以及待测样本名称；选择FAM通道检测SVA核酸序列；选择HEX通道检测内标序列；
(6)结果分析与判定：待反应程序完成后，记录样品Ct值与扩增曲线，SVA阴性对照HEX通道Ct值≤35，FAM通道无报告Ct值，SVA阳性对照HEX通道Ct值≤35，FAM通道Ct值≤30；被检样品检测结果中FAM通道Ct值≤40，报告为SVA核酸阳性；被检样品检测结果中FAM通道Ct值>40或无报告Ct值，同时HEX通道Ct值≤35，报告为SVA核酸阴性；被检样品检测结果中FAM通道Ct值>40或无报告Ct值，同时HEX通道Ct值>35，则该样本的检测结果无效。
10.一种如权利要求1所述引物在制备检测A型塞尼卡病毒物品中的应用。
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