CN107937618A - A型塞内卡病毒的微滴数字rt‑pcr检测引物和探针及其应用 - Google Patents

A型塞内卡病毒的微滴数字rt‑pcr检测引物和探针及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子检测技术领域，具体公开了一种A型塞内卡病毒的微滴数字RT‑PCR检测引物和探针及其应用。所述引物为：上游引物：5’‑CACTACTCGAGAAGCTGCAAT‑3’，下游引物：5’‑TCCATCTTGCCTGCAGGTACT‑3’；所述探针为：5’‑R‑CTTCGCTGACTACGGTGCCGTACCGAGT‑Q‑3’，R为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。利用本发明所提供的微滴数字RT‑PCR检测引物和探针可以实现对SVA样品的精准检测，灵敏度可达到2个病毒拷贝；且对不含有SVA的检测样本均无扩增信号，表明其具有良好的特异性。该方法步骤简便且易于操作，有很强的实用性和灵活性，是实际应用中检测A型塞内卡病毒的有效方法。

Description

A型塞内卡病毒的微滴数字RT-PCR检测引物和探针及其应用
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，具体地说，涉及一种A型塞内卡病毒的微滴数字RT-PCR检测引物和探针及其应用。
背景技术
2002年，美国遗传治疗公司(Genetic Therapy Inc.)的科研人员在利用人胚胎视网膜细胞(PER.C6)培养腺病毒过程中发现存在未知病原体污染。经病原分离与鉴定得知该病原体具有微RNA病毒科(Picornaviridae)家族成员的形态特征和分子结构；系统进化分析表明，该病原与心病毒属(Cardiovirus)相关病毒的亲缘关系较近，但两者也存在许多不同之处(如IRES类型、2A蛋白长度等)。2002年， L.M.Hales等成功分离与鉴定了SVA的原型毒株SVV-001，并将该病原划归微RNA病毒科的一个新属，以其为原型毒株命名为“塞内卡谷病毒(Seneca Valley virus，SVV)”。2015年，国际病毒分类委员会 (ICTV)将SVV更名为“A型塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)”，其所在的属命名为“塞内卡病毒属(Senecavirus)”。2006年，N.J. Knowles等分析了12株从美国不同州具有水泡症状的猪体内分离到的微RNA病毒样(Picorna-like)病毒，借助中和试验、RT-PCR检测发现这些毒株与SVV-001具有相同的抗原性，提示SVA感染可能导致猪发病。SVA归属微RNA病毒科(Picornaviridae)塞内卡病毒属 (Senecavirus)，与心病毒属(Cardiovirus)成员的亲缘关系相对较近，如脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus)和泰勒病毒 (Theilovirus)。
SVA主要感染猪，不同性别、年龄阶段的猪(断奶前仔猪、保育猪和育肥猪等)均易感。国外有研究发现，猪、牛和鼠的血清中存在SVA中和抗体，揭示这些物种可能是SVA的自然宿主。另外，通过对60份健康人血清的检测发现1份SVA中和抗体阳性血清(中和效价1:8)，表明人类也可能是SVA的自然宿主。
SVA感染后与口蹄疫、猪水泡病、水疱性口炎和猪水疱性疹等具有相似的临床症状，因此SVA的确证主要依靠实验室诊断。目前已报道的SVA实验室检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、免疫组化 (IHC)、间接免疫荧光(IFA)、ELISA、病毒中和试验(VNT) 以及荧光定量RT-PCR等。荧光定量PCR(qPCR)方法以特异性强、灵敏度高、操作简便等特点被广泛应用于各种病毒的检测。然而， qPCR的定量方法依靠内参基因及标准样品的设定，依然只是“相对定量”，对低浓度的病毒样本无法实现绝对定量，更重要的，无法在病毒感染早期实现精准检测。
微滴数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)是一项检测和定量核酸的新技术。其原理是在反应前将反应体系进行微滴化处理，形成几万至几十万个油包水的液化微滴，每个微滴包含一个或数个拷贝的目标分子(DNA或RNA模板)，之后，在每个微滴中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后用微滴检测器对各个反应微滴的荧光信号进行统计学分析。与qPCR不同的是，ddPCR不依赖于CT值，因此不受扩增效率影响，PCR扩增结束后，根据检测到的阳性微滴数和泊松分布原理计算核酸拷贝数，不需要对照标准样品和标准曲线即可实现绝对定量。ddPCR是一种重现性很好的定量检测微量核酸分子的优良技术，与实时荧光定量PCR相比，该方法检测通量高、特异性强、灵敏度高，实现了真正意义上的绝对定量。目前数字微滴PCR技术已应用于拷贝数变异分析、转基因成分检测、单细胞分析、病原微生物检测、疫病检测、癌症早期诊断和产前诊断等研究领域。将微滴数字 RT-PCR技术用于SVA的检测，可以快速、精准的对SVA核酸进行绝对定量。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种A型塞内卡病毒的微滴数字RT-PCR检测引物和探针及其应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种A型塞内卡病毒的微滴数字RT-PCR 检测引物，包括：
上游引物SVA-3D-F：5’-CACTACTCGAGAAGCTGCAAT-3’，
下游引物SVA-3D-R：5’-TCCATCTTGCCTGCAGGTACT-3’。
为了配合上述引物在微滴数字RT-PCR检测A型塞内卡病毒上的应用，本发明还提供了一种A型塞内卡病毒的微滴数字RT-PCR检测探针，所述探针的核苷酸序列为：
5’-R-CTTCGCTGACTACGGTGCCGTACCGAGT-Q-3’；
其中，R为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。
优选地，所述探针为TaqMan探针：SVA-3D-P： FAM-CTTCGCTGACTACGGTGCCGTACCGAGT-BHQ1。
所述引物及探针是通过对GenBank中公布的不同国家和地区 SVA分离株的所有60余条基因组序列，以及其他微RNA病毒科中亲缘较近的相关病毒基因组序列进行比较与分析，选择无二级结构且高度保守的区段，设计数对引物和探针，引物长度一般为25个碱基左右，探针长度27-30个碱基左右，引物间和引物内无互补序列，经过对照实验得到最优引物和探针序列组合。
因此，含有本发明所述引物和探针的组合物也属于本发明的保护范围。
第二方面，本发明提供前述引物在制备A型塞内卡病毒检测试剂或检测试剂盒方面的应用。
进一步地，本发明提供前述引物和探针组合在制备A型塞内卡病毒检测试剂或检测试剂盒方面的应用。
需要说明的是，含有前述引物和/或探针的试剂或试剂盒也属于本发明的保护范围。
第三方面，本发明还提供了一种以非疾病诊断为目的的检测A 型塞内卡病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的RNA，获得PCR反应模板；
(2)利用权利要求1所述的引物与权利要求2或3所述的探针进行微滴数字RT-PCR扩增；
(3)扩增结束后，使用微滴荧光检测仪进行读数，计算每管反应体系中发出荧光的微滴数量，并根据泊松分布原理精确计算样品中SVA的拷贝数。
微滴荧光检测仪读数不为0，即检测到微滴化反应体系中的扩增信号，认为此反应孔为阳性扩增孔；微滴荧光检测仪读数为0，即未检测到微滴化反应体系中的扩增信号，认为此反应孔为阴性扩增孔。当阳性质控品的反应孔产生阳性结果，且阴性质控品的反应孔产生阴性结果时，认为该实验为有效实验，否则实验无效，需更换反应试剂或更改反应条件重新进行。阳性样品的判定标准为：在同一样品的3 个重复反应组中，至少出现一个阳性扩增孔，则说明待检样品中含有 A型塞内卡病毒核酸。阴性样品的判定标准为：在同一样品的3个重复反应组中均为阴性结果，则说明待检样品中不含A型塞内卡病毒核酸。
其中，步骤(2)中的RT-PCR扩增体系为：Supermix 5μL；Reverse Transcriptase 2μL；300mM DTT 1μL；20μM上下游引物各0.8μL、 20μM探针0.4μL；RNA模板1μL；ddH2O补足至20μL；
扩增条件为：45℃反转录60min；95℃酶激活10min；95℃变性 30sec、60℃退火及延伸1min，共40循环；98℃酶失活10min；4℃恒温。
上述反应体系及条件适用于从病猪组织、血清，或细胞培养液中提取到的RNA样品，可实现对A型塞内卡病毒的精准检测。
本发明的有益效果至少在于：
1、本发明对所有已知的SVA基因组序列进行分析比对，选择无二级结构且高度保守的区段进行引物和探针的设计，避免了假阴性结果的产生。
2、本发明提供的引物和探针对不含SVA的检测样本均无扩增信号出现，表明其具有良好的特异性。
3、本发明提供的引物和探针可实现对SVA的精准检测，灵敏度可达到2个拷贝。
附图说明
图1为本发明提供的引物SVA-3D-F/R和TaqMan探针SVA-3D-P 的特异性实验结果示意图。
图2为本发明提供的引物SVA-3D-F/R和TaqMan探针SVA-3D-P 的灵敏度实验结果示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例用于说明本发明所述的A型塞内卡病毒的微滴数字 RT-PCR检测引物和探针。
通过对GenBank中公布的不同国家和地区SVA分离株的所有60 余条基因组序列，以及其他微RNA病毒科中亲缘较近的相关病毒基因组序列进行比较与分析，选择无二级结构且高度保守的区段，设计数对引物和探针，引物长度一般为25个碱基左右，探针长度27-30 个碱基左右，引物间和引物内无互补序列，最优引物和探针(根据 3D基因设计)序列组合如下：
上游引物SVA-3D-F：5’-CACTACTCGAGAAGCTGCAAT-3’，
下游引物SVA-3D-R：5’-TCCATCTTGCCTGCAGGTACT-3’，
TaqMan探针SVA-3D-P： FAM-CTTCGCTGACTACGGTGCCGTACCGAGT-BHQ1。
实施例2
本实施例用于说明使用本发明提供的A型塞内卡病毒的微滴数字RT-PCR检测引物和探针对SVA的检测。
具体检测方法如下：
1、猪组织或感染细胞中总RNA的提取：使用QIAGEN公司Plus Mini Kit试剂盒(Cat No.:74134)提取待测样品的总 RNA。
猪血清、病毒细胞培养上清液中总RNA的提取：使用QIAGEN 公司ViralRNA Mini Kit试剂盒(Cat No.:52904)提取待测样品的总RNA。
2、微滴数字RT-PCR扩增
此方法使用PCR扩增仪(Bio-Rad公司)和QX200TM Droplet DigitalTM PCRSystems(Bio-Rad公司)。
1)使用Bio-Rad公司One-Step RT-ddPCRTM Advanced Kit for Probes(SDS)试剂盒(Cat No.:1864021)配置微滴数字RT-PCR扩增反应体系：Supermix 5μL；ReverseTranscriptase 2μL；300mM DTT 1μL；20μM上下游引物各0.8μL、20μM探针0.4μL；RNA模板1μL；ddH2O补足至20μL。
2)在微滴数字RT-PCR的微滴生成卡(DG8cartridge)中间排的 8个孔内，加入步骤1)中的20μL反应体系，之后在DG8cartridge 最下面一排的8个孔内加入70μL微滴生成油(DG oil)，盖上胶垫，放入微滴生成仪进行微滴生成。将微滴化的反应体系相应的转移至96孔板中，封膜。
3)将封膜后的96孔板转入PCR扩增仪中进行扩增，扩增条件为：45℃反转录60min；95℃酶激活10min；95℃变性30sec、60℃退火及延伸1min，共40循环；98℃酶失活10min；4℃恒温。
PCR扩增结束后，将封膜的96孔板转入微滴荧光检测仪进行读数，计算每管反应体系中发出荧光的微滴数量，并根据泊松分布原理精确计算样品中SVA的拷贝数。
3、结果判定
微滴荧光检测仪读数不为0，即检测到微滴化反应体系中的扩增信号，认为此反应孔为阳性扩增孔；微滴荧光检测仪读数为0，即未检测到微滴化反应体系中的扩增信号，认为此反应孔为阴性扩增孔。当阳性质控品的反应孔产生阳性结果，且阴性质控品的反应孔产生阴性结果时，认为该实验为有效实验，否则实验无效，需更换反应试剂或更改反应条件重新进行。阳性样品的判定标准为：在同一样品的3 个重复反应组中，至少出现一个阳性扩增孔，则说明待检样品中含有 A型塞内卡病毒核酸。阴性样品的判定标准为：在同一样品的3个重复反应组中均为阴性结果，则说明待检样品中不含A型塞内卡病毒核酸。
实施例3
本实施例用于说明对A型塞内卡病毒微滴数字RT-PCR引物和探针进行特异性实验。
本实验采用从国内采集的A型塞内卡病毒样品SVA-GD-01及SVA-GD-04，以及29份SVA阴性猪组织样本，提取RNA后，使用微滴数字RT-PCR验证了引物和探针对A型塞内卡病毒的特异性。结果表明，所有阴性样本经微滴数字RT-PCR扩增，均未出现特异性扩增信号，SVA-GD-01及SVA-GD-04出现了典型扩增，说明设计的引物和探针对A型塞内卡病毒具有良好的特异性。
以图1为例，图1为本发明提供的引物SVA-3D-F/R和TaqMan 探针SVA-3D-P针对A型塞内卡病毒样品SVA-GD-01和阴性样本进行微滴数字RT-PCR扩增的实验结果示意图，其中，A01为A型塞内卡病毒样品SVA-GD-01，B01-H01为阴性样品。
由图可知，本发明提供的引物SVA-3D-F/R和TaqMan探针 SVA-3D-P针对A型塞内卡病毒样品SVA-GD-01出现了典型扩增，说明所述引物和探针对A型塞内卡病毒样品SVA-GD-01具有良好的特异性。
同时，当使用本发明提供的引物SVA-3D-F/R和TaqMan探针 SVA-3D-P针对A型塞内卡病毒样品SVA-GD-04和阴性样本进行微滴数字RT-PCR扩增的实验结果与图1相似，对SVA-GD-04也出现了典型扩增，证明本发明所述引物和探针对A型塞内卡病毒样品 SVA-GD-04也具有良好的特异性。
需要说明的是，由于图中仅能显示8种样品，因此，本实施例所使用的29份阴性样品，最终仅以7份阴性样品的实验结果作为示例性展示，其余22份阴性样品与图中所示的阴性样品，具有相同的实验结果。
实施例4
本实施例用于说明对A型塞内卡病毒微滴数字RT-PCR引物和探针进行灵敏度实验。
本实验采用A型塞内卡病毒阳性样品SVA-GD-01的RNA进行 10倍梯度稀释，共设置8个梯度，按照实施例2给出的方法进行检测。微滴数字RT-PCR结果显示，本实验在样品模板量为2个拷贝的情况下，可以产生稳定的扩增；或者说，本微滴数字RT-PCR实验方法，在20μL扩增体系时最低可以检测到2个拷贝。
图2为本发明提供的引物SVA-3D-F/R和TaqMan探针SVA-3D-P 的灵敏度实验结果示意图。
应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> A型塞内卡病毒的微滴数字RT-PCR检测引物和探针及其应用
<141> 2017-12-26
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cactactcga gaagctgcaa t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccatcttgc ctgcaggtac t 21
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cttcgctgac tacggtgccg taccgagt 28

Claims (10)

1.一种A型塞内卡病毒的微滴数字RT-PCR检测引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：
上游引物SVA-3D-F：5’-CACTACTCGAGAAGCTGCAAT-3’，
下游引物SVA-3D-R：5’-TCCATCTTGCCTGCAGGTACT-3’。
2.一种与权利要求1所述引物配合使用的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为：
SVA-3D-P：5’-R-CTTCGCTGACTACGGTGCCGTACCGAGT-Q-3’；
其中，R为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针为TaqMan探针，其中，R为FAM，Q为BHQ1。
4.含有权利要求1所述引物与权利要求2或3所述探针的组合物。
5.权利要求1所述的引物在制备A型塞内卡病毒检测试剂或试剂盒中的应用。
6.权利要求4所述的组合物在制备A型塞内卡病毒检测试剂或试剂盒中的应用。
7.含有权利要求1所述引物的试剂或试剂盒。
8.含有权利要求4所述组合物的试剂或试剂盒。
9.一种非疾病诊断目的的检测A型塞内卡病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的RNA，获得PCR反应模板；
(2)利用权利要求1所述的引物与权利要求2或3所述的探针进行微滴数字RT-PCR扩增；
(3)扩增结束后，使用微滴荧光检测仪进行读数，计算每管反应体系中发出荧光的微滴数量，并根据泊松分布原理精确计算样品中SVA的拷贝数。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的RT-PCR扩增体系为：Supermix 5μL；Reverse Transcriptase 2μL；300mM DTT 1μL；20μM上下游引物各0.8μL、20μM探针0.4μL；RNA模板1μL；ddH2O补足至20μL；
扩增条件为：45℃反转录60min；95℃酶激活10min；95℃变性30sec、60℃退火及延伸1min，共40循环；98℃酶失活10min；4℃恒温。
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