CN109182278A - 塞尼卡谷病毒毒株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了塞尼卡谷病毒毒株及其应用，本发明提供的塞尼卡谷病毒SVV‑HeNXX/swine/2017保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:V201767。所述塞尼卡谷病毒SVV‑HeNXX/swine/2017具有良好的免疫原性，能够诱导免疫动物产生较高水平的免疫保护，可以用于制备预防塞尼卡谷病毒病的疫苗，制备的疫苗安全性高，免疫后动物不排毒，同时能够诱导动物快速产生较高水平的抗体，实现猪塞尼卡谷病毒病的高效预防，具有很好的推广应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及微生物生物技术领域，具体涉及塞尼卡谷病毒毒株及其应用。
背景技术
塞尼卡谷病毒(Senecavalley virus,SVV)也称为塞尼卡病毒A(SenecavirusA,SVA)，属于小RNA病毒科塞尼卡病毒属，与小RNA病毒科、心病毒属病毒的遗传关系较近。SVV感染可以导致原发性水疱性疾病，引起猪鼻镜及蹄冠处出现水疱和溃烂创面，从而导致跛足甚至死亡，与口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎等的临床症状难以区分。
2002年，SVV首例毒株(SVV-001株)由美国科研人员从细胞培养基污染物中分离，怀疑有可能来自猪胰蛋白酶或胎牛血清。2007年之前，SVV主要作为溶瘤细胞进行研究，可有效治疗一些神经内分泌肿瘤。2007年，SVV在美国和加拿大的猪群中被分离。目前国内外对SVV的认识及研究尚浅，迄今为止还没有商品化的SVV疫苗可用，为避免SVV感染给养殖业带来的经济损失，分离塞尼卡谷病毒毒株并开发塞尼卡谷病毒防疫和检测方法具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一株塞尼卡谷病毒毒株及其应用。
首先，本发明提供一种塞尼卡谷病毒毒株，所述塞尼卡谷病毒毒株的全基因组序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供的塞尼卡谷病毒毒株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V201767。
本发明提供的塞尼卡谷病毒SVV-HeNXX/swine/2017的保藏信息如下：微生物保藏编号：CCTCC NO:V201767；保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏时间：2017年11月22日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心。
另一方面，本发明提供一种塞尼卡谷病毒的3D基因，所述3D基因的核苷酸序列如下：
(1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
(2)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列。
塞尼卡谷病毒的3D基因编码的3D蛋白是3CD蛋白的一个组成部分，能够结合3AB蛋白，是RNA复制过程中的依赖RNA的RNA聚合酶的主要组成部分，主要功能为调控病毒复制和VPg的尿苷酰化，塞尼卡谷病毒的3D基因可作为区分不同病毒株的特征基因。
本发明提供的3D基因与2015年中国广东最早分离的CH-01-2015株的同源性为97.4％，与USA/IA46008/2015病毒毒株的同源性最近，核苷酸同源性为99.4％。
本发明所述的塞尼卡谷病毒毒株含有如上所述的3D基因。
本发明提供的病毒毒株具有良好的免疫原性，能够诱导动物产生特异性抗体，产生针对塞尼卡谷病毒的免疫保护。
进一步地，本发明提供所述的病毒毒株或所述的3D基因在制备预防或治疗塞尼卡谷病毒病的药物中的应用。
优选地，所述药物为疫苗或抗体。
其中，所述疫苗可以为减毒疫苗、灭活疫苗、多肽疫苗、基因工程疫苗中的任意一种。
所述抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。
另一方面，本发明提供一种塞尼卡谷病毒疫苗，包含所述的塞尼卡谷病毒毒株。
本发明所述的塞尼卡谷病毒疫苗可以根据需要制备成不同的剂型，如油包水剂型、水包油包水剂型、水包油剂型或冷冻干燥粉针剂中的任意一种，本领域技术人员可以根据制备的疫苗剂型不同，选择加入疫苗领域允许的佐剂或保护剂。
具体地，所述疫苗为单联或多联疫苗。
所述多联疫苗为所述疫苗除包括本发明所述的塞尼卡谷病毒毒株外，还包括其非塞尼卡谷病毒的抗原性物质。
优选地，所述非塞尼卡谷病毒的抗原性物质为猪口蹄疫病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、猪瘟疫苗中的一种或多种。
优选地，所述单联疫苗为灭活或减毒疫苗。
更优选地，所述疫苗为灭活疫苗。
所述灭活疫苗的制备方法包括如下步骤：
(1)将本发明所述的塞尼卡谷病毒毒株接种于细胞进行扩大培养，获得塞尼卡谷病毒毒株培养液；
(2)将病毒毒株培养液进行病毒灭活处理；
(3)将经灭活处理的病毒液与疫苗佐剂混合，经乳化处理，即得。
具体地，作为本发明的一种优选实施方式，所述细胞为BHK-21；
所述灭活为采用二乙烯亚胺进行处理；
所述疫苗佐剂为ISA206佐剂。
更进一步地，本发明还提供所述的病毒毒株或所述的3D基因在制备塞尼卡谷病毒的诊断试剂中的应用。
优选地，所述诊断试剂为抗原诊断试剂或抗体诊断试剂。
所述抗原诊断试剂可以为本发明所述的塞尼卡谷病毒毒株、其裂解成分、其多肽或蛋白中的任意一种。
所述抗体诊断试剂可以为本发明所述的塞尼卡谷病毒毒株、其裂解成分、其多肽或蛋白中的任意一种制备的单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明还提供一种塞尼卡谷病毒特异性抗体，所述特异性抗体为以本发明所述的3D基因编码的蛋白或所述的病毒毒株为免疫原制备得到。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明筛选得到了一株新的塞尼卡谷病毒毒株，根据病毒特异性3D基因分析结果，该塞尼卡谷病毒毒株与目前中国分离的病毒毒株不在同一个分支，亲缘关系较远。
(2)本发明提供的塞尼卡谷病毒毒株的TCID50为10-10/mL～10-13.5/mL，与中国分离的其它毒株(如SVV/FJ/001)相比，具有更强的感染力。
(3)利用本发明提供的塞尼卡谷病毒毒株制备的疫苗，具有很好的免疫原性，能够快速刺激免疫猪产生高水平的中和抗体，有效实现猪群的免疫保护，对塞尼卡谷病毒病的防控具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1中SVV-HeNXX/swine/2017毒株分离培养，其中A为正常BHK-21细胞；B为SVV-HeNXX/swine/2017毒株感染后出现细胞病变效应(CPE)的BHK-21细胞。
图2为实施例2中SVV-HeNXX/swine/2017毒株3D基因序列的进化分析图。
图3为实施例2中SVV-HeNXX/swine/2017毒株的电镜图片。
图4为实施例2中接种SVV-HeNXX/swine/2017毒株的细胞的间接免疫荧光结果，其中A表示接种SVV-HeNXX/swine/2017毒株后的细胞的荧光检测结果，B表示正常细胞对照。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，叙利亚仓鼠肾细胞系(BHK-21细胞)及MEM细胞培养基购自武汉博士德生物工程有限公司；Serapro胎牛血清购于德国赛若普公司；青链霉素、胰酶购于索莱宝公司；磁珠法全自动核酸提取试剂盒购自西安天隆生物科技有限公司；感受态细胞、Ex Taq DNA聚合酶、RnaseInhibitor、DL2000 DNA Marker、DNA回收试剂盒、质粒DNA小量纯化试剂盒等均购自宝生物工程(大连)有限公司；M-MLV反转录酶、pGEM-T easy载体均购自Promega公司。
实施例1 SVV毒株的分离与纯化
1、样品的处理
采集SVV荧光定量PCR检测为阳性的患病猪的水泡液或水泡皮，用MEM配制成1:5的悬液，使用匀浆仪匀浆5min，在4℃条件下8000r/min离心10min，取上清用0.22μm的滤器过滤获得样品处理液。
2、病毒的分离
取长满单层的、生长状态良好的BHK-21细胞接种步骤1得到的样品处理液。接种前用无血清D-Hanks液清洗BHK-21细胞2次，将1mL经过滤的SVV阳性悬液加到T 25细胞培养瓶中，在5％CO2、37℃细胞培养箱中培养1h，每20min摇动细胞培养瓶一次，使处理液中病毒与细胞充分接触并吸附细胞，同时设置阴性对照孔(采用MEM培养基为阴性对照)，弃去细胞瓶中液体，加入含有1％血清的MEM完全培养基6mL，放入5％CO2、37℃细胞培养箱培养24h～72h，12h观察一次细胞病变(CPE)，待80％以上细胞出现病变时，将细胞冻融3次后，收集细胞和培养液并继续传代培养。结果显示：接毒细胞出现皱缩、脱落，并逐渐形成CPE。图1中的A显示了正常对照BHK-21细胞，图1中的B显示了SVV毒株感染BHK-21细胞出现的CPE。
3、SVV分离毒株的RT-PCR鉴定
(1)引物的设计与合成
提取SVV分离毒株的基因组，进行基因组测序，得到的基因组序列如SEQ ID NO.1所示，根据基因组序列，利用Primer Premier6.0软件设计一对引物3D-P1/3D-P2用以检测3D基因的核心特征序列，理论扩增产物大小为460bp(序列如SEQ ID NO.2所示)。
3D基因的引物序列为：
SEQ ID NO.3：3D-P1：5'-CTTCTGGTTGGCACGGATTAC-3'，
SEQ ID NO.4：3D-P2：5'-TTTTTTTTTTTCCCTTTTCTGTTCC-3'。
(2)SVV的核酸提取和反转录
取SVV分离株细胞培养物200μL，采用DNA/RNA快速抽提试剂盒法提取RNA；按照如下试剂和程序对提取样品及阴、阳性对照的RNA分别进行反转录(cDNA)。体系总体积为20μL，各成分如表1所示：
表1反转录体系
| 试剂 | 体积(μL) |
| M-MLV 5×Reactin Buffer | 4.0 |
| dNTP(2.5mmol/L) | 4.0 |
| 3D-P2(20mmol/L) | 1.0 |
| Rnasin(40U/μL) | 0.5 |
| M-MLV RT(5U/μL) | 0.5 |
| RNA | 10.0 |
混匀后置37℃水浴锅，反应1h，得到的cDNA用于PCR扩增或-20℃冻存备用。
(3)RT-PCR扩增
分别以样品及阴、阳性对照的cDNA为模版，反应体积为25μL，加入以下成分，对其3D基因进行RT-PCR扩增。
表2 RT-PCR扩增体系
| 试剂 | 体积(μL) |
| ddH<sub>2</sub>O | 15.375 |
| 10×PCR Buffer | 2.5 |
| dNTPmix(2.5mmol/L) | 2.0 |
| 3D-P1(20μmol/L) | 0.5 |
| 3D-P2(20μmol/L) | 0.5 |
| Taq DNA聚合酶(2.5U/μL) | 0.125 |
| 模板(cDNA) | 4.0 |
扩增反应程序为：94℃预变性3min后，94℃30sec，55℃30sec，72℃40sec共35个循环，72℃延伸10min。反应结束后，取10μL PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测；检测为PCR阳性的病料，分别进行猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪水泡病病毒(SVD)和水泡性口炎病毒(VSV)4种其他病原的检测，检测结果为阴性的病料进行下一步的病毒分离纯化。
4、SVV病毒蚀斑纯化
(1)将收获的病毒液用不含血清的MEM作1:10倍比稀释至10-12，稀释病毒以500μl接种到长满单层BHK-21细胞的六孔培养平皿中，37℃孵育1h(每15min摇匀一次，确保病毒均匀分布)。同时设置阴性对照。
(2)弃去培养板中的病毒液，并用无菌PBS洗两次，每孔沿壁缓慢加入2mL覆盖培养层(高压处理的2％琼脂糖降温至50～55℃时与2倍MEM 4％血清完全培养基1：1混合)，使营养琼脂糖覆盖在细胞表面，平放30min，待琼脂糖凝固，随后倒置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中继续培养，每天观察细胞形态以及出斑情况。
(3)待空斑长到合适大小，用1ml枪头挑起单个空斑于0.5mL无血清无双抗MEM中，空斑液反复冻融3次，以同样方法，进行下一轮空斑纯化。
(4)将经过多轮空斑纯化可稳定传代的毒株接种T25培养瓶中的BHK-21细胞，扩大培养，将获得的纯化SVV病毒毒株命名为SVV-HeNXX/swine/2017。
申请人已根据《布达佩斯条约》的规定，将塞尼卡谷病毒SVV-HeNXX/swine/2017提交至中国典型培养物保藏中心进行保藏。塞尼卡谷病毒SVV-HeNXX/swine/2017的具体保藏信息如下：微生物保藏号：CCTCC NO:V201767；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏时间：2017年11月22日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心。5、病毒半数感染量(TCID50)测定
经0.25％胰蛋白酶消化的BHK-21细胞悬液100μL(细胞含量以105个/mL左右)铺满96孔板，37℃培养过夜。用MEM培养液将病毒作10倍倍比稀释，设10-1～10-16共16个稀释度，每个稀释度取100μL加入96孔细胞培养板中，且每个稀释度做8个重复，并设正常细胞培养对照。每孔中补充100μL 2％完全培养基后，置37℃、5％二氧化碳培养箱中。逐日观察细胞病变和对照，共观察3d-4d，并记录细胞病变孔数。按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。按照该法测定SVV-HeNXX/swine/2017株在BHK-21细胞上的TCID50为10-10/mL～10-13.5/mL。
实施例2 SVV的鉴定
1、RT-PCR检测方法及基因测序分析鉴定
参照实施例1中SVV分离毒株RT-PCR鉴定方法对SVV的3D基因进行扩增，纯化回收目的片段克隆入pGEM-T载体中进行测序及序列分析，结果显示，可以扩增出了SVV的3D目的基因。
经基因测序分析，SVV-HeNXX/swine/2017毒株与2015年我国广东最早分离的CH-01-2015株的同源性为97.4％，SVV-HeNXX/swine/2017毒株与2个美国株在一个分支，与USA/IA46008/2015同源性最近，核苷酸同源性为99.4％(图2)。
2、荧光定量PCR(FQ-PCR)鉴定SVV-HeNXX/swine/2017毒株
在上述SVV的RT-PCR检测方法的基础上，参照GenBank登录的SVV保守区域核酸序列比对特征，应用PrimerExpress 3.0.1分析软件设计特异性引物对和TaqMan探针。建立了SVV的FQ-PCR检测方法。利用建立的SVV FQ-PCR方法对分离SVV毒株进行鉴定。以BHK-21细胞cDNA为阴性对照模板，以分离纯化的SVV病毒的基因组为阳性对照，同时检测分离病毒中是否含有PRV、FMDV、SVD、VSV等病原。结果显示，检测结果中只有SVV的特异性扩增曲线，说明分离的病毒中只含有SVV。所述荧光定量PCR鉴定方法中SVV的特异性引物对和TaqMan探针序列采用中国专利201710582343.7中的SVV检测引物和探针(SVV上游引物P3、SVV下游引物P4和SVV探针Probe-P6)。
3、电镜鉴定
将大量培养的SVV-HeNXX/swine/2017毒株进行离心去除细胞碎片、超速离心收集沉淀、蔗糖密度梯度离心纯化、脱糖及磷钨酸染色等处理，进行电镜鉴定。结果可观察到SVV呈二十面体对称的病毒粒子，直径27nm左右(图3)。
4、间接免疫荧光(IFA)鉴定
待细胞接毒48h后，洗涤、晾干、固定，用SVV阳性血清作为一抗，FITC标记的兔抗猪IgG作为二抗，同时设正常细胞对照，在荧光显微镜下观察。结果显示，图4中A显示接种SVV-HeNXX/swine/2017毒株的细胞中出现绿色特异性荧光，图4中B显示正常细胞对照无荧光。
实施例3 SVV-HeNXX/swine/2017毒株对小鼠攻毒模型的建立
8周龄Balb/C雌鼠6只，2只经腹腔注射SVV细胞培养物原液，2只同居，2只单独饲养做阴性对照；将制备的SVV-HeNXX/swine/2017毒株采用腹腔注射途径进行攻毒，攻毒剂量为每只小鼠200μL(含1010TCID 50)，另外2只同笼饲养。攻毒后小鼠出现蜷缩、被毛粗乱、精神萎靡等症状，攻毒小鼠鼻部出现疑似水泡状突起，同居及阴性对照小鼠无异常。攻毒鼠的心、肝、脾、肺、肾、肠及鼻部均检出SVV病毒核酸阳性，同居及阴性对照小鼠各组织未检出SVV病原。
实施例4 SVV-HeNXX/swine/2017毒株对猪攻毒模型的建立
购买30日龄的临床健康的试验用猪5头，其中3头作为攻毒猪，2头单独饲养作为阴性对照猪。将制备的SVV-HeNXX/swine/2017毒株采用耳后肌肉注射途径对3头猪进行攻毒，攻毒剂量为每头猪3mL(含1011TCID 50)，连续观察15天，观察并记录发病情况。结果显示，攻毒猪攻毒后从第3天开始出现眼结膜充血、蹄部肿胀、蹄部有溃疡点、蹄甲断裂等临床症状。
实施例5 SVV-HeNXX/swine/2017毒株的再分离及对猪攻毒模型的建立
1、病毒再分离
SVV-HeNXX/swine/2017毒株攻毒小鼠和猪后均引起发病，自发病小鼠和猪的脾脏、淋巴结等病毒含量高的组织样品中再次分离病毒，接种BHK-21细胞上增殖培养，经鉴定确实为SVV。分离鉴定方法参照实施例1。自小鼠和猪体内分离的SVV分别命名为S-SVV、Z-SVV。
2、S-SVV、Z-SVV对猪的攻毒试验
购买30日龄的临床健康试验用猪8头，其中3头作为S-SVV组攻毒猪，3头作为Z-SVV组攻毒猪，2头作为阴性对照猪，这3组试验猪均为隔离单独饲养。将制备的S-SVV和Z-SVV毒株采用耳后肌肉注射途径分别S-SVV组和Z-SVV组的3头猪进行攻毒，攻毒剂量为每头猪3mL(含1011TCID50)，连续观察15天，观察并记录发病情况。结果显示，S-SVV组自攻毒后第2天开始，鼻部及腹部出现水泡，蹄部出现溃烂等典型临床症状，而Z-SVV组自攻毒后第8天才开始出现蹄部水泡等临床症状，其症状没有S-SVV组出现早，也不如S-SVV组严重和典型。
实施例6 SVV灭活疫苗的制备
本实施例用于说明所述SVV-HeNXX/swine/2017毒株的应用，具体体现为利用所述SVV-HeNXX/swine/2017毒株制备SVV灭活疫苗。
SVV灭活疫苗的制备包括如下步骤：
(1)病毒扩大培养
将分离纯化的SVV-HeNXX/swine/2017毒株按照实施例1的方法培养，将病毒按照培养液体积的5％接入已形成单层的BHK-21细胞上培养，当细胞病变达80％以上时收获病毒细胞培养液，反复冻融3次后，置于-80℃保存备用。同时按照实施例1方法测定病毒含量，结果表明，病毒含量不低于1010TCID50。
(2)病毒的灭活
将BEA粉加入新配制的0.2mol/L的NaOH溶液中，至37℃水浴中，每隔10-15分钟振摇1次，使BEA充分环化1h后终止环化，产生二乙烯亚胺(BEI)，最终浓度为0.2mol/L。无菌过滤后置2-8℃备用。
在扩大培养的病毒液中加入BEI至终浓度为0.003mol/L，30℃灭活28h，期间2-4h摇晃混匀一次，每次10-15分钟。灭活结束后立即在灭活病毒液中加入过滤除菌的50％硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为2％，充分搅拌均匀，取样后迅速降温至15℃以下待检。
(3)灭活效果验证
灭活后的病毒液在BHK-21细胞上盲传3代观察细胞状态，细胞无病变，表明病毒灭活充分。
(4)疫苗制备
无菌称取重量比为1:1的水相(灭活的SVV病毒液)和油相(ISA 206佐剂)并预热至30℃，在磁力搅拌器上低速搅拌油相，边搅拌边缓慢加入预热好的水相，调高转速至1500rpm，15分钟后即乳化完成。
(5)疫苗检验
①性状
外观：淡粉红色或乳白色略带粘滞性乳状液。
剂型：水包油包水型(W/O/W)。取一清洁吸管，吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面，呈云雾状扩散。
稳定性：吸取疫苗10mL加入离心管中，以3000rpm离心15分钟，不破乳，管底析出的水相不超过0.5mL。
黏度：用1mL吸管(出口内径1.2mm)，吸取25℃左右的疫苗1mL，令其垂直自然流出0.4mL所需的时间在3s-8s内。
②装量检查：按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果表明，符合规定。
③无菌检查：按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果表明，无菌生长。
④安全检验：用体重18-22g小鼠5只，每只皮下注射疫苗0.5mL。连续观察7d，未出现因注射疫苗引起的死亡或明显的不良反应。
上述制备的疫苗经检验合格后分装备用。
实施例7 SVV疫苗的免疫效果评价
1、SVV灭活疫苗的安全性试验
仔猪、保育猪、育肥猪各3头，耳后肌肉注射实施例5制备的SVV灭活疫苗2mL，同时设置未免疫猪未阴性对照，连续观察28d，观察期内免疫猪和未免疫猪的精神状态、采食、饮水等均未见异常，注射部位均未见不良反应、无肿块形成。结果表明本发明的SVV灭活疫苗安全性良好。
2、SVV疫苗免疫攻毒保护试验
购买16头临床健康试验用猪。将实施例5制备的检验合格的SVV灭活疫苗免疫10头猪，同时设6头非免疫对照猪，分别在免疫当天、免疫后7天、14天、21天、28天采集血清，利用中和试验测定其抗体产生情况。猪免疫28天后，用1010TCID50的SVV-HeNXX/swine/2017毒株和S-SVV毒株对猪进行攻毒，每个毒株各攻毒5头免疫猪和3头非免疫猪，连续观察30天。结果表明，该疫苗具有很好的免疫原性，能有效激发血清中和抗体。攻毒后，免疫猪均没有出现临床症状，100％保护；非免疫猪均出现不同程度的体温升高，蹄部、鼻部、腹部出现水泡、溃烂等临床症状，S-SVV毒株攻毒的非免疫猪比SVV-HeNXX/swine/2017毒株攻毒的非免疫猪出现症状早且症状更加明显。SVV灭活疫苗免疫后不同时间，免疫猪和非免疫猪血清的中和抗体水平如表3所示，在免疫后第7天，免疫猪血清中即产生较高水平的中和抗体，第14、21和28天的抗体水平逐渐提高，结果表明，SVV灭活疫苗能够快速诱导机体产生高水平的中和抗体，实现对猪塞尼卡谷病毒病的有效免疫保护。
表3 SVV疫苗免疫不同时间的中和抗体效价
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 河南省动物疫病预防控制中心
<120> 塞尼卡谷病毒毒株及其应用
<130> KHP181115249.2
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7287
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttgaaatgg ggggctgggc ccttatgccc agtccttcct ttccccttcc ggggggtaaa 60
ccggctgtgt ttgctagagg cacagaggag caacatccaa cctgcttttg tggggaacgg 120
tgcggctcca attcctgcgt cgccaaaggt gttagcgcac ccaaacggcg catctaccaa 180
tgctattggt gtggtctgcg agttctagcc tactcgtttt cttcccctac tcactcattc 240
acgcacaaaa agtgtgttgt aactacaaga tttagccctc gcacgggatg tgcgataacc 300
gcaagattga ctcaagcgcg gaaagcgctg taaccacatg ctgttagtcc ctccgtggct 360
gcgagatggc tatccacctc ggatcactga actggagctc gaccctcctt agtaagggaa 420
ccgagaggcc ttcttgcaac aagctccgac acagagtcca cgtgattgct accaccatga 480
gtacatggtt ctcccctctc gacccaggac ttctttttga atatccacgg ctcgatccag 540
agggtggggc atgatccccc tagcatagcg agctacagcg ggaactgtag ctaggcctta 600
gcgtgccttg gatactgcct gatagggcga cggcctagtc gtgtcggttc tataggtagc 660
acatacaaat atgcagaact ctcatttttc tttcgataca gcctctggca cctttgaaga 720
cgtaaccgga acaaaagtca agatcgttga ataccccaga tcggtgaaca gtggtgttta 780
cgattcgtcc actcatttag agatactgaa cctacagggt gaaatttgaa attttaaagt 840
ctttcaacga gtaccaaatt cgcgccgcca aacaacaact tggactggac atcgtatacg 900
aactacaggg taatgttcag acaacctcaa agaatgattt tgattcccgc ggcaataatg 960
gtaacatgac cttcaattac tacgcaaaca cttaccagaa ttcagtagac ttctcgacct 1020
cctcgtcggc gtcaggcgcc ggacccggga actcccgggg cggactagcg ggtctcctca 1080
caaatttcag tggaatcttg aaccctcttg gctacctcaa agatcacaat accgaagaaa 1140
tggaaaactc tgctgatcga gtcataacgc aaacggcggg caacactgcc ataaacacgc 1200
aatcatcact gggtgtgttg tgtgcctacg ttgaagaccc gaccaaatct gaccctccgt 1260
ccagcagtac agatcaaccc accaccactt ttactgccat cgacaggtgg tatactggac 1320
gtctcaattc ttggacaaaa gctgtaaaaa ccttctcttt tcaggccgtc ccgctccctg 1380
gagccttcct gtctagacag ggaggcctca acggaggggc cttcacggct accctacata 1440
gacatttctt aatgaagtgc gggtggcagg tgcaggtcca atgcaatttg acgcaattcc 1500
accaaggtgc tcttcttgtt gccatggtcc cagagaccac ccttgatgtc aaacctgacg 1560
gcaaggcaaa gagcttacag gagctgaatg aagagcagtg ggtggaaatg tctgacgatt 1620
accggaccgg gaaaaacatg ccttttcaat ctcttggcac atactatcgg ccccctaact 1680
ggacttgggg ccccaatttt atcaacccct atcaagtaac agttttccca caccaaattc 1740
tgaacgcgag aacctctacc tcggtagaca taagtgtccc atacatcggg gagactccta 1800
cacaatcctc agagacacag aactcctgga ccctcctcgt catggtgctt gtccccttag 1860
actacaagga gggagccaca actgacccag aaattacatt ctctgtaagg cctacaagcc 1920
cttacttcaa tgggcttcgt aaccgtttca cgaccgggac ggacgaggaa caggggccca 1980
ttcccacagc acccagagaa aattcgctta tgtttctctc aaccatccct gacgatactg 2040
tccctgctta cgggaatgtg cgtacccctc ccgtcaatta cctccccggt gaaataaccg 2100
acctcttaca actggcccgt atacccactc tcatggcgtt tgggcgggtg tctgaacccg 2160
agcctgcctc agacgcttat gtgccctacg ttgccgttcc tgcccagttc gacgacaagc 2220
ctctcatctc cttcccgatc accctttcag atcctgtcta ccagaacacc ctggtaggcg 2280
ccatcagttc gaacttcgcc aactacaggg ggtgtatcca aatcactctg acattttgtg 2340
gacccatgat ggcaagaggg aaattcctgc tctcgtattc tccccctaat ggagcacaac 2400
cacagaccct ttctgaagct atgcagtgca catattctat ttgggacata ggcttgaact 2460
ctagttggac ctttgtcatc ccctacatct cgcccagtga ttaccgtgaa actcgggcta 2520
ttaccaactc agtttattct gctgatggtt ggtttagctt acacaagctg accaaaatca 2580
ctttaccacc tgactgccca cagagtccct gtattctctt tttcgcctct gctggtgagg 2640
attacaccct ccgtctccct gttgattgta atccttccta cgtgttccac tccaccgaca 2700
acgccgagac tggtgttatt gaggcaggta acactgacac cgatttctct ggtgaactgg 2760
cggctcctgg ctctaaccat actaatgtca aattcctgtt tgaccgatct cgactactga 2820
atgtaattaa ggtactggag aaggacgccg tcttcccccg tcctttcccc acagcaacag 2880
gtgcacagca ggacgatggt tacttttgtc ttctaacacc ccgcccaaca gtcgcttccc 2940
gacccgctac tcgtttcggc ctgtacgtca acccgtctga cagtggcgtt ctcgctaaca 3000
cttcactgga tttcaatttt tatagtttgg cctgtttcac ttactttaga tcagatcttg 3060
aagtcacggt ggtctcactg gagccagatt tggaattcgc cgtggggtgg ttcccctctg 3120
gcagtgagta ccaggcttct agctttgtct acgaccaact gcatgtaccc taccacttta 3180
ctgggcgcac cccccgcgct ttcaccagca agggtggaaa ggtatctttc gtgctccctt 3240
ggaactctgt ctcttccgtg cttcccgtgc gctggggggg cgcttccaag ctttcttctg 3300
ccacgcgggg tctgccggct catgctgact gggggaccat ttacgccttt atcccccgtc 3360
ccaacgagaa gaaaagcacc gctgtaaagc acgtggcggt gtacgttcgg tacaagaacg 3420
cgcgtgcttg gtgccccagc atgcttccct ttcgcagcta taaacagaag atgctgatgc 3480
aatcaggcga catcgagacc aaccctggcc ctgcttctga caacccaatc ttggagtttc 3540
ttgaagcgga aaacgatcta gtcactctgg cctctctctg gaagatggta cactccgttc 3600
aacagacctg gagaaagtat gtgaagaacg acaatttttg gcccaacttg ctcagtgagc 3660
tagtggggga aggctccatc gccttggccg ccacgctatc taaccaagct tcagtgaaag 3720
ctctcttggg cctgcatttt ctctctcgag ggctcaatta cacagatttt tactctttac 3780
tgatagagaa atgctctagt ttctttactg tagaaccgcc tcctccacca gctgaaaatc 3840
tgatgaccaa gccctccgtg aagtcgaaat tccgaaagct gtttaagatg cagggaccca 3900
tggatacagt caaagactgg aaccaaatag ccgccggctt gaagaatttc caatttgttc 3960
gtgatctagt caaagaggtg gtcgactggc tccaggcctg gatcaataaa gagaaagcca 4020
gccctgtcct ccagtaccag ctggagatga agaagctcgg gcccgtggct ttggctcatg 4080
atgccttcat ggccggttct gggccccctc ttggtgacga ccagattgaa tacctccaga 4140
acctcaaatc tcttgcccta acactgggga agactaattt ggcccaaagt ctcaccacta 4200
tgatcaatgc caagcagagc tccgcccaac gagtcgaacc cgttgtggtg gtcctcagag 4260
gcaagccggg atgtggcaaa agcttggcct ccacgttgat tgcccaggct gtgtccaagc 4320
gtctctatgg ctcacaaagt gtgtattctc ttcctccgga cccagacttc ttcgacggat 4380
acaaaggaca gtttgtaacc ttgatggacg atctgggaca aaacccggat gggcaagatt 4440
tctccacctt ttgtcagatg gtgtcgaccg cccaatttct tcccaacatg gcggaccttg 4500
cagagaaggg gcgtcccttc acctccaatc ttatcattgc aaccacaaac ctccctcact 4560
ttagccccgt caccattgct gatccttctg cagtctctcg gcgtatcaac tacgacctga 4620
ctctagaagt atctgaggcc tacaagaagc acacacggct gaattttgac ctggctttca 4680
gacgcactga cgcccccccc atttatcctt ttgctgccca tgtgcctttc gtggacgtgg 4740
ctgtgcgctt caaaaatggt catcaaagct tcaatctcct agagttggtc gactccattt 4800
gtgcagacat tcggaccaag caacaaggtg cccgaaatat gcagactctg gttctgcaga 4860
gccctaacga gaacgacgac acccccgtcg acgaggcgtt gggtagagtt ctcacccccg 4920
ctgcggtcga cgaggcgctt gtcgacctcg ctccagatgc cgacccggtt ggccgcttgg 4980
ctatcctcgc caagctgggt cttgccctag ctgcggtcac ccctggtttg ataatcttgg 5040
cagtgggact ctacaagtac ttctctggct ctgatacaga ccaagaagaa acagaaagtg 5100
aggagcctgc taaagcgcct aggagcgaga atgcttatga cggcccgaag aaaactctaa 5160
gccccctgga gcgctctctc ttatggaaat gcaacagccc aacgtggaca tgggctttga 5220
ggccgcggtc gctaagaaag tggtcgtccc cattaccttc atggttccca acagaccttc 5280
tggacttaca caatccgctc ttcttgtgac tggccggacc ttcctaatca atgagcacac 5340
gtggtccaac ccctcttgga ccagcttcac aatccgtggt gaggtgcaca ctcgtgatga 5400
gcctttccaa acggttcatt ttactcacca tggtcttccc acagatctga tgatggtacg 5460
tctcggaccg ggcaactcct tccctaacaa tctagacaag tttggacttg accagatgcc 5520
ggcacgtaac tcccgtgtgg tcggcgtttc ggctagttac ggcaacttct tcttctctgg 5580
gaacttcctc gggtttgttg actccatcac ctctgaccaa ggaacctatg cgagactttt 5640
caggtacagg gtgacgactt acaagggatg gtgcggttcg gccctagtct gtgaggccgg 5700
tggtgtccga cgcatcattg gcctgcattc tgctggtgcc tctggtatcg gcgccgggac 5760
ttacatctca aaattaggac tgatcaaagc ccttaaacac ctcggtgagc ctctggctac 5820
aatgcaagga ctgatgactg agctagagcc tggagtcacc gtacatgtac cccgaaaatc 5880
taaattgaga aagacgaccg cacacgcggt gtacaaaccg gagtttgaac ccgctgtgtt 5940
gtcaaaattt gatcccagac tgaacaagga cgttgacctg gatgaggtaa tttggtctaa 6000
acacactgcc aacgtccctt atcaacctcc tttgttctac acatacatgt tagagtacgc 6060
tcatcgggtt ttctcctttt tgggaaaaga caatgacatt ctgaccgtca aagaagcaat 6120
cttgggcatc cctggactag accctatgga tccccacaca gctccgggtt tgccctacgc 6180
cattagcggc cttcgacgta ctgatctcgt cgattttgcg aacggcacgg tagacccggc 6240
actggccatg caaatccaga aattcttaga cggtgactac tctgatcatg tcttccaaac 6300
ttttctgaaa gatgaaatca gaccctcaga gaaagtccga gcgggaaaaa cccgcattgt 6360
cgatgtgccc tccctggcgc actgcattgt gggcagaatg ctgcttgggc gctttgccgc 6420
caagtttcaa tcccatccgg gctttctcct tggctccgct atcgggtctg acctgatgtc 6480
ttctggaccg tcataggggc tcagctcgag ggaagaaaga acacgtatga cgtggattac 6540
agtgcctttg actcttcaca cggcactggc tccttcgagg ctctcatctc tcactttttt 6600
accgtggaca atggttttag ccctgcgctg ggaccgtatc tcagatccct ggctgtctcg 6660
gtgcacgctt acggcgagcg tcgcatcaag attaccggag gcctcccctc tggttgtgcc 6720
gcgaccagcc tgctgaacac agtgctcaac aatgtgatca tcaggactgc tctggcattg 6780
acctacaagg aatttgagta tgacatggtt gatatcatcg cctacggtga cgaccttctg 6840
gttggtacgg actacgatct ggacttcaat gaggtggcgc ggcgcgctgc caaattgggg 6900
tataagatga ctcctgccaa caaaggttct gtcttccctc cgacttcctc tctctccgat 6960
gctgtttttc taaaacgcaa attcgtccaa aacaatgacg gcttatacaa accagttatg 7020
gatttaaaga atttggaagc catgctctcc tacttcaaac caggaacact actcgagaag 7080
ctgcaatctg tttctatgtt ggctcaacat tctggaaaag aagaatacga tagattgatg 7140
caccccttcg ctgactacgg tgccgtaccg agtcacgagt acctgcaggc aagatggagg 7200
gccttgttcg actgacctgg atagcccaac gcgcttcggt gctgccggcg attctgggag 7260
aactcagtcg gaacagaaaa gggaaaa 7287
<210> 2
<211> 462
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcttctggtt ggcacggatt acgatctgga cttcaatgag gtggcgcggc gcgctgccaa 60
actggggtat aagatgactc ctgccaacaa gggttctgtc ttccctccga cttcctctct 120
ctctgatgct gtttttctaa aacgcaaatt cgtccaaaac aatgacggct tatatagacc 180
agttatggat gtaaagaatt tggaagccat gctctcctac ttcaaaccag gaacactact 240
cgagaagctg caatctgttt ctatgttggc tcaacattct ggaaaagaag aatatgatag 300
attgatgcac cccttcgctg actacggtgc cgtaccgagt cacgagtacc tgcaggcaag 360
atggagggcc ttgttcgact gacctggata gcccaacgcg cttcggtgct gccggcgatt 420
ctgggagaac ccagtcggaa cagaaaaggg aaaaaaaaaa aa 462
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cttctggttg gcacggatta c 21
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttttttttt tcccttttct gttcc 25
Claims (10)
1.一种塞尼卡谷病毒毒株，其特征在于，所述塞尼卡谷病毒毒株的全基因组序列如SEQID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的塞尼卡谷病毒毒株，其特征在于，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V201767。
3.一种塞尼卡谷病毒的3D基因，其特征在于，所述3D基因的核苷酸序列如下：
(1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
(2)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列。
4.权利要求1或2所述的病毒毒株或权利要求3所述的3D基因在制备预防或治疗塞尼卡谷病毒病的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物为疫苗或抗体。
6.一种塞尼卡谷病毒疫苗，其特征在于，包含权利要求1或2所述的塞尼卡谷病毒毒株。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为单联或多联疫苗；优选地，所述单联疫苗为灭活或减毒疫苗。
8.权利要求1或2所述的病毒毒株或权利要求3所述的3D基因在制备塞尼卡谷病毒的诊断试剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述诊断试剂为抗原诊断试剂或抗体诊断试剂。
10.一种塞尼卡谷病毒的特异性抗体，其特征在于，所述特异性抗体为以权利要求1或2所述的病毒毒株或权利要求3所述的3D基因的编码蛋白为免疫原制备得到。
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