CN108796123A - 一种快速检测塞内卡病毒的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测塞内卡病毒的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括RPA引物探针混合液，PBST溶液，测流层析试纸条，RPA冻干酶和RPA反应预混液；所述RPA引物探针混合液中的引物的基因序列为：上游引物：5′‑AATTCCTGTTTGACCGATCTCGGCTACTGA‑3′；下游引物：5′‑biotin‑CCAGTAAAGTGGTAGGGTACGTGCAGTTGGTC‑3′；所述RPA引物探针的基因序列为：5′‑FAM‑GGCCTGTACGTCAACCCGTCTGACAGTGGCG‑THF‑TCTCGCTAACACTTC‑Spacer C3‑3′。本发明提供的检测塞内卡病毒的试剂盒特异性强，诊断准确，敏感性高于传统PCR，本发明提供的塞内卡病毒的检测方法操作极其简便快速，不仅适用于临床诊断而且可以应用于食品安全检测、养殖场现场检测、环境评估等多种领域。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及一种快速检测塞内卡病毒的试剂盒及其检测方法。
背景技术
A型塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)是小RNA病毒科塞内卡属的唯一成员，能够引起母猪严重的水疱病和新生仔猪死亡，对养殖业造成巨大损失。塞内卡病毒病是由SVA引起的动物传染病，主要感染对象是猪，不同年龄阶段的猪都易感染。SVA感染引发的水疱病与口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)、猪水疱病(swine vesicular disease，SVD)、猪水疱疹(vesicular exanthema of swine，VES)和水疱性口炎(vesicular stomatitis，VS)引起的病变极为类似，临床难以鉴别诊断，给疾病的确诊、治疗和防控带来极大的困难，因此，开发更加简便快捷，安全可靠的塞内卡病毒检测方法具有极其重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测塞内卡病毒的试剂盒及其检测方法，旨在解决上述背景技术中猪感染A型塞内卡病毒后，由于其产生的临床症状与口蹄疫、猪水疱病、猪水疱疹和水疱性口炎感染后所引起的临床症状相似，导致临床难以鉴别诊断，给疾病的确诊、治疗和防控带来很大困难的问题。
本发明是这样实现的，一种快速检测塞内卡病毒的试剂盒，该试剂盒包括RPA引物探针混合液，PBST溶液，测流层析试纸条，RPA冻干酶和RPA反应预混液；所述RPA引物探针混合液中的引物的基因序列为：
上游引物：5′-AATTCCTGTTTGACCGATCTCGGCTACTGA-3′；
下游引物：5′-biotin-CCAGTAAAGTGGTAGGGTACGTGCAGTTGGTC-3′；
所述RPA引物探针混合液中的探针的基因序列为：
5′-FAM-GGCCTGTACGTCAACCCGTCTGACAGTGGCG-THF-TCTCGCT AACACTTC-SpacerC3-3′。
优选地，所述RPA引物探针混合液中引物的浓度为10μM，探针的浓度为10μM。
本发明进一步提供了一种利用上述试剂盒快速检测塞内卡病毒的方法，该方法包括以下步骤：
(1)利用所述试剂盒对待测样品进行重组酶聚合酶扩增反应，得到扩增产物；
(2)将扩增产物滴加到测流层析试纸条上进行检验，根据试纸条上显示结果判定塞内卡病毒为阳性或阴性。
优选地，所述步骤(1)中重组酶聚合酶扩增反应的总反应体系为50μL，将浓度10μM的上游引物2.1μL，浓度10μM的下游引物2.1μL，浓度10μM的探针0.6μL，Buffer 29.5μL，蒸馏水9.2μL混匀后转入含有聚合酶、重组酶和单链结合蛋白冻干制剂的0.2mL反应管中，将4μL cDNA模板、2.5μL浓度为280mM的MgAc加入该反应管中。
优选地，所述步骤(2)中将扩增产物滴加到测流层析试纸条上进行检验的具体方法为：取2μL扩增产物与198μL PBST溶液混匀形成混合液，然后吸取10μL混合液滴加到测流层析试纸条的加样端，并将加样端竖直浸入装有200μL PBST溶液的离心管中，5分钟后观察试纸条上显示结果。
优选地，所述PBST溶液的制备方法为将1mL的吐温-20溶于1000mL PBS溶液中混匀即可。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明是建立在分子生物学基础上的，先基于塞内卡病毒VP1基因设计了特定引物和探针，该基因不仅高度保守，而且对其它病原高度特异，再应用重组酶聚合酶扩增-测流层析的方法制备了快速检测塞内卡病毒的试剂盒，敏感性高于传统PCR，特异性强，诊断准确，整个检测过程只需30分钟，结果的判定只需观察测流层析试纸条显示的结果即可，操作极其简便；得到核酸样品后整个反应过程可以在非实验室环境下进行，不仅适用于临床诊断而且可以应用于食品安全检测、养殖场现场检测、环境评估等多种领域。
附图说明
图1是本发明实施例提供的一种快速检测塞内卡病毒试剂盒的敏感性实验结果图。
图2是本发明实施例提供的一种快速检测塞内卡病毒试剂盒的特异性实验结果图。
图中：1-塞内卡病毒；2-A型口蹄疫病毒；3-O型口蹄疫病毒；4-猪水疱病病毒；5-猪水疱疹病病毒；6-水疱性口炎病病毒；NC-空白对照。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
一种快速检测塞内卡病毒的试剂盒，包括：
RPA引物探针混合液，PBST溶液，测流层析试纸条(MileniaHybridtech1strips,Milenia Biotec)，RPA冻干酶和RPA反应预混液，RPA反应预混液为29.5μL RehydrationBuffer和2.5μL 280mM Magnesium Acetate混合液。
上述试剂盒的具体制备方法为：
1.提取SVA的RNA，提取方法按照现有的技术进行。
2.反转录合成cDNA，反转录方法按照现有的技术进行。
3.RPA引物和探针的设计与合成
参考GenBank中塞内卡病毒VP1基因序列，选择特异性保守区域，设计RPA引物和探针。所有引物和探针均由上海生工合成，所属引物和探针的基因序列如表1所示。
表1引物和探针序列信息
实施例2
利用上述试剂盒快速检测塞内卡病毒的方法，具体包括以下步骤：
(1)重组酶聚合酶扩增(RPA)反应：
使用TwistAmpTM nfo kit配制50μL实时RPA反应体系，加入浓度10μM的上游引物2.1μL，浓度10μM的下游引物2.1μL，浓度10μM的探针0.6μL，Buffer 29.5μL，蒸馏水9.2μL，混匀后转入含有聚合酶、重组酶和单链结合蛋白冻干制剂的0.2mL反应管中，将4μL cDNA模板、2.5μL浓度为280mM的MgAc加入该反应管中，得到扩增产物。
(2)扩增产物的检测：
配制PBST溶液：将1mL的吐温-20溶于1000mL PBS溶液中混匀即可。扩增反应后吸取2μL RPA扩增产物与198μL PBST溶液混匀后形成混合液，接着吸取10μL混合液滴加到测流层析试纸条的加样端，最后将试纸条竖着插入的装有200μL PBST溶液的离心管中，5分钟后观察试纸条显示的结果，如果试纸条显示两条杠，则为塞内卡病毒阳性，如果为一条杠则为阴性。
实施例3：
本发明的试剂盒的敏感性实验：
实验过程为：将塞内卡病毒cDNA进行RPA扩增反应，每个扩增反应中加入的塞内卡病毒cDNA的量分别为400pg，40pg，4pg，400fg，40fg，4fg，0.4fg，反应结束后按照本发明塞内卡病毒快速检测方法进行测流层析试纸条检测，检测结果如图1所示，可以看出，该方法可以检测到反应体系中加入40fg的塞内卡病毒cDNA，检测敏感性高。
实施例4：
本发明的试剂盒的特异性实验：
实验过程为：用O型口蹄疫病毒，A型口蹄疫病毒、猪水疱病毒、猪水疱疹病毒和水疱性口炎病毒(VS)的cDNA与塞内卡病毒cDNA进行特异性实验，实验结果如图2所示，可以看出，只有检测塞内卡病毒cDNA的试纸条出现了两条杠，检测其他病毒的试纸条均为一条杠，说明本发明试剂盒对塞内卡病毒cDNA具有很强的特异性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种快速检测塞内卡病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括RPA引物探针混合液，PBST溶液，测流层析试纸条，RPA冻干酶和RPA反应预混液；所述RPA引物探针混合液中的引物的基因序列为：
上游引物：5′-AATTCCTGTTTGACCGATCTCGGCTACTGA-3′；
下游引物：5′-biotin-CCAGTAAAGTGGTAGGGTACGTGCAGTTGGTC-3′；
所述RPA引物探针混合液中的探针的基因序列为：
5′-FAM-GGCCTGTACGTCAACCCGTCTGACAGTGGCG-THF-TCTCGCTAACACTTC-Spacer C3-3′。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA引物探针混合液中引物的浓度为10μM，探针的浓度为10μM。
3.一种利用权利要求1或2所述的试剂盒快速检测塞内卡病毒的方法，其特征在于，所述该方法包括以下步骤：
(1)利用所述试剂盒对待测样品进行重组酶聚合酶扩增反应，得到扩增产物；
(2)将扩增产物滴加到测流层析试纸条上进行检验，根据试纸条上显示结果判定塞内卡病毒为阳性或阴性。
4.如权利要求1所述的快速检测塞内卡病毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)中重组酶聚合酶扩增反应的总反应体系为50μL，将浓度10μM的上游引物2.1μL，浓度10μM的下游引物2.1μL，浓度10μM的探针0.6μL，Buffer 29.5μL，蒸馏水9.2μL混匀后转入含有聚合酶、重组酶和单链结合蛋白冻干制剂的0.2mL反应管中，将4μL cDNA模板、2.5μL浓度为280mM的MgAc加入该反应管中。
5.如权利要求1所述的快速检测塞内卡病毒的方法，其特征在于，所述步骤(2)中将扩增产物滴加到测流层析试纸条上进行检验的具体方法为：取2μL扩增产物与198μL PBST溶液混匀形成混合液，然后吸取10μL混合液滴加到测流层析试纸条的加样端，并将加样端竖直浸入装有200μL PBST溶液的离心管中，5分钟后观察试纸条上显示结果。
6.如权利要求5所述的快速检测塞内卡病毒的方法，其特征在于，所述PBST溶液的制备方法为将1mL的吐温-20溶于1000mL PBS溶液中混匀即可。
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