CN104862421B - 鉴定狂犬病、犬瘟热、传染性肝炎、细小病毒病、钩端螺旋体病和弓形体病病原的成套产品 - Google Patents

鉴定狂犬病、犬瘟热、传染性肝炎、细小病毒病、钩端螺旋体病和弓形体病病原的成套产品 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鉴定狂犬病、犬瘟热、传染性肝炎、细小病毒病、钩端螺旋体病和弓形体病病原的成套产品。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定病原的成套产品，由分别鉴定或辅助鉴定狂犬病病毒、弓形虫、钩端螺旋体、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒和犬细小病毒的PCR引物对rv、tox、lep、cdv、ichv和cpv组成；病原为狂犬病病毒、弓形虫、钩端螺旋体、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒和犬细小病毒这六种病原中的六种、五种、四种、三种、两种或一种。

Description

鉴定狂犬病、犬瘟热、传染性肝炎、细小病毒病、钩端螺旋体病 和弓形体病病原的成套产品
技术领域
本发明涉及生物技术领域中鉴定或辅助鉴定狂犬病、犬瘟热、传染性肝炎、细小病毒病、钩端螺旋体病和弓形体病病原的成套产品。
背景技术
随着我国对外交流日益增多，出现旅客携带伴侣犬的出入境数量及种类不断增加；观赏犬、伴侣犬、工作犬以及实验用犬的国际贸易近年来发展迅速，我国举办各种国际犬业会展和比赛越来越频繁。同时，由于我国拥有世界最大的皮毛成衣出口基地——香港，对于我国大陆的皮毛供应提出了更大需求。尤其是乌苏里貉、白貉、银狐、彩狐、蓝狐和水貂等毛皮动物及其毛皮产品，近年来有大量进口。
犬、狐、貉和貂不但可以携带危害犬类健康的病原体，也能携带传播多种人畜共患病；可携带传播的疾病有狂犬病、犬瘟热、传染性肝炎和细小病毒病、钩端螺旋体病、弓形体病等。其中狂犬病、钩端螺旋体病和弓形体病是人畜共患疾病，严重威胁人类健康；犬瘟热、犬传染性肝炎和犬细小病毒病不但危害犬、狐、貉和貂的健康，还是虎、豹和熊猫等野生动物的主要传染病。特别是犬，为人类的亲密接触动物，加之动物可能来自不同的国家和地区，疫情复杂，如不对出入境犬进行严格检疫，很有可能造成疫病传入传出国境，威胁人类健康及动物卫生。
狂犬病是由狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV)引起的一种专门侵犯中枢神经系统的人兽共患传染病，人发病后死亡率高达100％。据报道，全世界每年估计因狂犬病导致死亡的人数为4万-7万，这些病例绝大多数发生在发展中国家，其中98％在亚洲。我国是狂犬病的高发地区，人的狂犬病病死数位居世界第二，仅次于印度。据国家疾病控制中心发布的疫情报告，自2002年以来每年因该病死亡的人数均超过2000人，这些数据突显出狂犬病对公共卫生安全有严重的威胁。
弓形虫病(Toxoplasmosis)是由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii，Tox)引起的一种重要的机会感染性寄生虫病，该疾病对人类特别是孕妇和胎儿具有严重的危害。
钩端螺旋体病(Leptospirosis，钩体病)是世界范围内广泛存在的热带病，尤其在湿热的热带和亚热带地区较为流行。致病性钩端螺旋体(Pathogenic Leptospira)通过粘膜或者伤口感染宿主后，迅速进入血流并扩散到肺、肝、肾及其他组织器官。不同致病性钩体感染宿主的临床症状复杂，包括眼结膜充血，腹泻，黄疽，肾衰和脑膜炎等。
犬瘟热(Canine distemper,CD)是犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。犬瘟热呈世界性分布，该病发病急、传播速度快、宿主广泛、病毒感染力强、死亡率在30-80％，因此常带来毁灭性损失，是养殖业重要传染病之一。调查显示只要有经济动物养殖的地方均有过本病的发生。
犬传染性肝炎(Infectious canine hepatitis，ICH)是由犬传染性肝炎病毒(Infectious canine hepatitis virus，ICHV)引起的一种常见的急性败血性传染病。本病多发生于1岁以内的幼犬,死亡率高达40％。
犬细小病毒病是犬的一种具有高度接触性传染的烈性传染病。临床上以急性出血性肠炎和心肌炎为特征。犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)，是引起犬出血性肠炎和幼犬心肌炎的主要病原，具有高度的接触传染性。犬出血性肠炎和幼犬心肌炎的发病率和病死率分别为20％-100％和10％-50％，给全球的养犬业造成很大的经济损失。
因此，目前迫切需要对狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV)、刚地弓形虫(Toxoplasmagondi i，Tox)、钩端螺旋体(Pathogenic Leptospira)、犬瘟热病毒(Canine distempervirus,CDV)、犬传染性肝炎病毒(Infectious canine hepatitis virus，ICHV)和犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)这些病原的严格快速的检疫。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提高检测狂犬病、犬瘟热、传染性肝炎、细小病毒病、钩端螺旋体病和弓形体病病原这六种病原的特异性、灵敏度、准确性，并实现高通量检测。
为解决上述技术问题，本发明提供了鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物，由名称为rv的鉴定或辅助鉴定狂犬病病毒的PCR引物对、名称为tox的鉴定或辅助鉴定弓形虫的PCR引物对、名称为lep的鉴定或辅助鉴定钩端螺旋体的PCR引物对、名称为cdv的鉴定或辅助鉴定犬瘟热病毒的PCR引物对、名称为ichv的鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的PCR引物对和名称为cpv的鉴定或辅助鉴定犬细小病毒的PCR引物对组成；
所述rv由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成；
所述tox由序列表中SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的两条单链DNA组成；
所述lep由序列表中SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的两条单链DNA组成；
所述cdv由序列表中SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的两条单链DNA组成；
所述ichv由序列表中SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的两条单链DNA组成；
所述cpv由序列表中SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示的两条单链DNA组成；
所述病原为狂犬病病毒、弓形虫、钩端螺旋体、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒和犬细小病毒这六种病原中的六种、五种、四种、三种、两种或一种。
其中，SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成的引物对名称为rv，可从狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV)的总RNA中进行RT-PCR扩增得到272bp的DNA片段，SEQ IDNo.1由19个核苷酸组成，SEQ ID No.2由20个核苷酸组成；
SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的两条单链DNA组成的引物对名称为tox，可从刚地弓形虫(Toxoplasma gondii，Tox)的基因组DNA中进行PCR扩增得到189bp的DNA片段，SEQID No.4由18个核苷酸组成，SEQ ID No.5由18个核苷酸组成；
SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的两条单链DNA组成的引物对名称为lep，可从钩端螺旋体(Pathogenic Leptospira)的基因组DNA中进行PCR扩增得到146bp的DNA片段，SEQID No.7由18个核苷酸组成，SEQ ID No.8由18个核苷酸组成；
SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的两条单链DNA组成的引物对名称为cdv，可从犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)的总RNA中进行RT-PCR扩增得到218bp的DNA片段，SEQ ID No.10由18个核苷酸组成，SEQ ID No.11由18个核苷酸组成；
SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的两条单链DNA组成的引物对名称为ichv，可从犬传染性肝炎病毒(Infectious canine hepatitis virus，ICHV)的基因组DNA中进行PCR扩增得到258bp的DNA片段，SEQ ID No.13由18个核苷酸组成，SEQ ID No.14由18个核苷酸组成；
SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示的两条单链DNA组成的引物对名称为cpv，可从犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)的基因组DNA中进行PCR扩增得到175bp的DNA片段，SEQ ID No.16由18个核苷酸组成，SEQ ID No.17由18个核苷酸组成。
上述鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物中，所述rv、所述tox、所述lep、所述cdv、所述ichv和所述cpv均可独立包装。
上述鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物中，所述rv、所述tox、所述lep、所述cdv、所述ichv和所述cpv的两条单链DNA均可独立包装。
上述鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物中，所述rv、所述tox、所述lep、所述cdv、所述ichv和所述cpv的两条单链DNA均可用生物素标记。
上述鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物中，所述rv、所述tox、所述lep、所述cdv、所述ichv和所述cpv的两条单链DNA均可在其5’端用生物素标记。
上述鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物中，所述rv和所述cdv可以单独使用，分别进行单独的RT-PCR，也可以组合使用进行多重RT-PCR；所述tox、所述lep、所述ichv和所述cpv这四种引物对可以单独使用分别进行单独的PCR，也可以组合使用进行多重PCR。这四种引物对组合使用的方式有多种，可以是其中任两种引物对组合在一起使用，也可以是其中任三种引物对组合在一起使用，也可以是四种引物对组合在一起使用。
这六种引物对单独使用时，本申请的鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物中这六种引物对的配比没有要求，可以根据待鉴定病原的数量确定。
所述rv和所述cdv组合使用时，组合在一起使用的各引物对的摩尔数相同。如这两种引物对组合在一起使用时，其摩尔比为1：1。所述tox、所述lep、所述ichv和所述cpv这四种引物对组合使用时，组合在一起使用的各引物对的摩尔数相同。如这四种引物对组合在一起使用时，所述四种引物对的摩尔比为1：1：1：1。
本申请中，每种引物对中的两条单链DNA的摩尔比均为1：1。
上述鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物中，所述鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物，由所述rv、所述tox、所述lep、所述cdv、所述ichv和所述cpv这六种PCR引物对中的五种、四种、三种、两种或一种组成；
所述病原为狂犬病病毒、弓形虫、钩端螺旋体、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒和犬细小病毒这六种病原中的六种、五种、四种、三种、两种或一种。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定病原的成套试剂。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定病原的成套试剂，由名称为CRV的鉴定或辅助鉴定狂犬病病毒的引物探针组合物、名称为CTox的鉴定或辅助鉴定弓形虫的引物探针组合物、名称为CLep的鉴定或辅助鉴定钩端螺旋体的引物探针组合物、名称为CCDV的鉴定或辅助鉴定犬瘟热病毒的引物探针组合物、名称为CICHV的鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的引物探针组合物和名称为CCPV的鉴定或辅助鉴定犬细小病毒的引物探针组合物组成；
所述CRV由所述rv和名称为PRV的鉴定或辅助鉴定狂犬病病毒的探针组成；
所述CTox由所述tox和名称为PTox的鉴定或辅助鉴定弓形虫的探针组成；
所述CLep由所述lep和名称为PLep的鉴定或辅助鉴定钩端螺旋体的探针组成；
所述CCDV由所述cdv和名称为PCDV的鉴定或辅助鉴定犬瘟热病毒的探针组成；
所述CICHV由所述ichv和名称为PICHV的鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的探针组成；
所述CCPV由所述cpv和名称为PCPV的鉴定或辅助鉴定犬细小病毒的探针组成；
所述PRV为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的DNA；
所述PTox为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.6的DNA；
所述PLep为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.9的DNA；
所述PCDV为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.12的DNA；
所述PICHV为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.15的DNA；
所述PCPV为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.18的DNA；
所述病原为狂犬病病毒、弓形虫、钩端螺旋体、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒和犬细小病毒这六种病原中的六种、五种、四种、三种、两种或一种。
其中，探针PRV的结合位点在所述rv从狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV)的总RNA中进行PCR扩增得到272bp的DNA片段上，SEQ ID No.3由20个核苷酸组成；探针PTox的结合位点在所述tox从刚地弓形虫(Toxoplasma gondii，Tox)的基因组DNA中进行PCR扩增得到189bp的DNA片段上，SEQ ID No.6由22个核苷酸组成；探针PLep的结合位点在所述lep从钩端螺旋体(Pathogenic Leptospira)的基因组DNA中进行PCR扩增得到146bp的DNA片段上，SEQ IDNo.9由22个核苷酸组成；探针PCDV的结合位点在所述cdv从犬瘟热病毒(Canine distempervirus,CDV)的总RNA中进行RT-PCR扩增得到218bp的DNA片段上，SEQ ID No.12由18个核苷酸组成；探针PICHV的结合位点在所述ichv从犬传染性肝炎病毒(Infectious caninehepatitis virus，ICHV)的基因组DNA中进行PCR扩增得到258bp的DNA片段上，SEQ IDNo.15由20个核苷酸组成；探针PCPV的结合位点在所述cpv从犬细小病毒(Canineparvovirus,CPV)的基因组DNA中进行PCR扩增得到175bp的DNA片段上，SEQ ID No.18由18个核苷酸组成。
上述鉴定或辅助鉴定病原的成套试剂中，所述成套试剂由所述CRV、所述CTox、所述CLep、所述CCDV、所述CICHV和所述CCPV这六种引物探针组合物中的五种、四种、三种、两种或一种组成；
所述病原为狂犬病病毒、弓形虫、钩端螺旋体、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒和犬细小病毒这六种病原中的六种、五种、四种、三种、两种或一种。
上述鉴定或辅助鉴定病原的成套试剂中，所述rv、所述tox、所述lep、所述cdv、所述ichv和所述cpv均可独立包装。
上述鉴定或辅助鉴定病原的成套试剂中，所述rv、所述tox、所述lep、所述cdv、所述ichv和所述cpv的两条单链DNA均可独立包装。
上述鉴定或辅助鉴定病原的成套试剂中，所述PRV、所述PTox、所述PLep、所述PCDV、所述PICHV和所述PCPV均可独立包装。
上述鉴定或辅助鉴定病原的成套试剂中，所述rv、所述tox、所述lep、所述cdv、所述ichv和所述cpv的两条单链DNA均可用生物素标记。
上述鉴定或辅助鉴定病原的成套试剂中，所述PRV、所述PTox、所述PLep、所述PCDV、所述PICHV和所述PCPV均可进行氨基化修饰。
上述鉴定或辅助鉴定病原的成套试剂中，所述PRV、所述PTox、所述PLep、所述PCDV、所述PICHV和所述PCPV均可在其5’端进行氨基化修饰。
上述PCR引物对组合物或上述成套试剂在制备鉴定或辅助鉴定病原的试剂或试剂盒中的应用，也属于本发明的保护范围。
上述PCR引物对组合物或上述成套试剂在制备鉴定或辅助鉴定病原的试剂或试剂盒中的应用中，所述病原为狂犬病病毒、弓形虫、钩端螺旋体、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒和犬细小病毒这六种病原中的六种、五种、四种、三种、两种或一种。
下述M1)-M3)，也属于本发明的保护范围：
M1)上述PCR引物对组合物的制备方法，包括将上述PCR引物对组合物中各引物对或/和各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤；
M2)上述成套试剂的制备方法，包括将上述成套试剂中各探针或/和各引物对或/和各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤；
M3)上述试剂或试剂盒的制备方法，包括将上述引物探针组合物中各探针或/和各引物对或/和各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
含有上述PCR引物对的鉴定或辅助鉴定病原的成套产品(液相芯片检测系统)，也属于本发明的保护范围。
含有上述成套试剂的鉴定或辅助鉴定病原的成套产品(液相芯片检测系统)，也属于本发明的保护范围。
上述含有上述成套试剂的鉴定或辅助鉴定病原的成套产品中，所述成套产品中含有所述探针分别与荧光编码微球进行偶联得到的荧光微球混合物。
为解决上述技术问题，本发明还提供了PCR引物对组合物或成套试剂或成套产品或试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定病原中的应用。
本发明所提供的PCR引物对组合物或成套试剂或成套产品或试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定病原中的应用中，所述PCR引物对组合物为上述PCR引物对组合物，所述成套试剂为上述成套试剂，所述成套产品为含有上述PCR引物对的鉴定或辅助鉴定病原的成套产品或含有上述成套试剂的鉴定或辅助鉴定病原的成套产品，所述试剂或试剂盒为上述试剂或试剂盒；
所述病原为狂犬病病毒、弓形虫、钩端螺旋体、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒和犬细小病毒这六种病原中的六种、五种、四种、三种、两种或一种。
上述PCR引物对组合物或成套试剂或成套产品或试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定病原中的应用中，所述应用包括下述(1)和(2)，和/或，(3),和/或，(4)的步骤：
(1)在同一个PCR反应体系中，以待测病原的总RNA为模板，用所述rv和所述cdv进行RT-PCR扩增得到PCR产物1；
如果所述PCR产物1含有272bp的DNA片段，所述待测病原中含有狂犬病病毒或候选含有狂犬病病毒；如果PCR产物1不含有272bp的DNA片段，所述待测病原中不含有狂犬病病毒或候选不含有狂犬病病毒；如果所述PCR产物1含有218bp的DNA片段，所述待测病原中含有犬瘟热病毒或候选含有犬瘟热病毒；如果PCR产物1不含有218bp的DNA片段，所述待测病原中不含有犬瘟热病毒或候选不含有犬瘟热病毒；
(2)在同一个PCR反应体系中，以待测病原的基因组DNA为模板，用所述tox、所述lep、所述ichv和所述cpv进行PCR扩增得到PCR产物2；如果所述PCR产物2含有189bp的DNA片段，所述待测病原中含有弓形虫或候选含有弓形虫；如果PCR产物2不含有189bp的DNA片段，所述待测病原中不含有弓形虫或候选不含有弓形虫；如果所述PCR产物2含有146bp的DNA片段，所述待测病原中含有钩端螺旋体或候选含有钩端螺旋体；如果PCR产物2不含有146bp的DNA片段，所述待测病原中不含有钩端螺旋体或候选不含有钩端螺旋体；如果所述PCR产物2含有258bp的DNA片段，所述待测病原中含有犬传染性肝炎病毒或候选含有犬传染性肝炎病毒；如果PCR产物2不含有258bp的DNA片段，所述待测病原中不含有犬传染性肝炎病毒或候选不含有犬传染性肝炎病毒；如果所述PCR产物2含有175bp的DNA片段，所述待测病原中含有犬细小病毒或候选含有犬细小病毒；如果PCR产物2不含有175bp的DNA片段，所述待测病原中不含有犬细小病毒或候选不含有犬细小病毒；
(3)用所述PRV与所述PCR产物1进行杂交，如果杂交结果为阳性，所述待测病原中含有狂犬病病毒或候选含有狂犬病病毒；如果杂交结果为阴性，所述待测病原中不含有狂犬病病毒或候选不含有狂犬病病毒；
用所述PCDV与所述PCR产物1进行杂交，如果杂交结果为阳性，所述待测病原中含有犬瘟热病毒或候选含有犬瘟热病毒；如果杂交结果为阴性，所述待测病原中不含有犬瘟热病毒或候选不含有犬瘟热病毒；
用所述PTox与所述PCR产物2进行杂交，如果杂交结果为阳性，所述待测病原中含有弓形虫或候选含有弓形虫，如果杂交结果为阴性，所述待测病原中不含有弓形虫或候选不含有弓形虫；
用所述PLep与所述PCR产物2进行杂交，如果杂交结果为阳性，所述待测病原中含有钩端螺旋体或候选含有钩端螺旋体，如果杂交结果为阴性，所述待测病原中不含有钩端螺旋体或候选不含有钩端螺旋体；
用所述PICHV与所述PCR产物2进行杂交，如果杂交结果为阳性，所述待测病原中含有犬传染性肝炎病毒或候选含有犬传染性肝炎病毒，如果杂交结果为阴性，所述待测病原中不含有犬传染性肝炎病毒或候选不含有犬传染性肝炎病毒；
用所述PCPV与所述PCR产物2进行杂交，如果杂交结果为阳性，所述待测病原中含有犬细小病毒或候选含有犬细小病毒，如果杂交结果为阴性，所述待测病原中不含有犬细小病毒或候选不含有犬细小病毒；
(4)用所述PRV与所述病原进行杂交，如果杂交结果为阳性，所述待测病原中含有狂犬病病毒或候选含有狂犬病病毒；如果杂交结果为阴性，所述待测病原中不含有狂犬病病毒或候选不含有狂犬病病毒；
用所述PCDV与所述病原进行杂交，如果杂交结果为阳性，所述待测病原中含有犬瘟热病毒或候选含有犬瘟热病毒；如果杂交结果为阴性，所述待测病原中不含有犬瘟热病毒或候选不含有犬瘟热病毒；
用所述PTox与所述病原进行杂交，如果杂交结果为阳性，所述待测病原中含有弓形虫或候选含有弓形虫，如果杂交结果为阴性，所述待测病原中不含有弓形虫或候选不含有弓形虫；
用所述PLep与所述病原进行杂交，如果杂交结果为阳性，所述待测病原中含有钩端螺旋体或候选含有钩端螺旋体，如果杂交结果为阴性，所述待测病原中不含有钩端螺旋体或候选不含有钩端螺旋体；
用所述PICHV与所述病原进行杂交，如果杂交结果为阳性，所述待测病原中含有犬传染性肝炎病毒或候选含有犬传染性肝炎病毒，如果杂交结果为阴性，所述待测病原中不含有犬传染性肝炎病毒或候选不含有犬传染性肝炎病毒；
用所述PCPV与所述病原进行杂交，如果杂交结果为阳性，所述待测病原中含有犬细小病毒或候选含有犬细小病毒，如果杂交结果为阴性，所述待测病原中不含有犬细小病毒或候选不含有犬细小病毒。
上述PCR引物对组合物或成套试剂或成套产品或试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定病原中的应用中，(1)的PCR体系中，每25μL PCR体系中含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mmol/L的4种dNTP的混合物2.0μL，10×RT-PCR buffer 2.5μL，浓度为10pmol/μL的SEQ ID No.1和SEQ ID No.10所示的单链DNA各1μL，浓度为10pmol/μL的SEQ ID No.2和SEQID No.11所示的单链DNA各1μL，Inhibiter0.5μL，AMV XL 0.5μL，AMV Taq(5U/μL)0.25μL，25mmol/L MgCl25.0μL，待测病原RNA 5.0μL，双蒸水5.25μL。所述PCR扩增的循环条件为：先50℃30min；而后94℃2min；然后94℃30sec、58℃30sec、72℃30sec，30个循环；最后72℃延伸5min。
上述PCR引物对组合物或成套试剂或成套产品或试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定病原中的应用中，(2)的PCR体系中，每25μL PCR体系中含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mmol/L的4种dNTP的混合物2.0μL，10×PCR buffer 2.5μL，浓度为10pmol/μL的SEQID No.4、SEQ ID No.7、SEQ ID No.13和SEQ ID No.16所示的单链DNA各0.5μL，浓度为10pmol/μL的SEQ ID No.5、SEQ ID No.8、SEQ ID No.14和SEQ ID No.17所示的单链DNA各0.5μL，Taq(5U/μL)0.5μL，待测病原DNA2.0μL，双蒸水14μL。所述PCR扩增的循环条件为：先94℃5min；然后94℃30sec、58℃30sec、72℃30sec，30个循环；最后72℃延伸5min。
上述PCR引物对组合物或成套试剂或成套产品或试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定病原中的应用中，所述与所述PCR产物1进行杂交或所述与所述PCR产物2进行杂交包括以下步骤S1)-S2)：
S1)上述探针与微球共价偶联得到探针与微球共价偶联的微球；
S2)所述探针与微球共价偶联的微球中的探针与所述PCR产物1或所述与所述PCR产物2进行杂交，得到杂交产物。
上述PCR引物对组合物或成套试剂或成套产品或试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定病原中的应用中，所述微球为表面羧基化的荧光编码微球。
实验证明，本申请的鉴定病原的PCR引物对组合物和成套试剂鉴定狂犬病病毒、刚地弓形虫、钩端螺旋体、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒和犬细小病毒的特异性和灵敏度高：本申请的鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物中，这四对PCR引物对可以共用一个PCR体系进行多重PCR，这两对PCR引物对可以共用一个PCR体系进行多重PCR，从而简化了鉴定病原的步骤；本申请的鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物有效避免了多种核酸扩增产物的相互干扰，能同时对狂犬病病毒、弓形虫、钩端螺旋体、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒和犬细小病毒快速检测。采用本申请的鉴定或辅助鉴定病原的成套试剂(由鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物和探针组成)和含有该成套试剂的鉴定或辅助鉴定病原的成套产品(液相芯片检测系统)检测上述六种病原，灵敏度高，达到10拷贝病原DNA或RNA/μL；特异性强，大大杜绝了非特异性扩增造成的假阴性结果；检测时间短，从样品处理到出结果仅需3小时左右；避免了PCR检测中溴化乙锭对人员和环境的污染，非常适合对进出境动物进行高通量检测。杂交与检测过程中无需繁琐的洗涤步骤，且整个反应都在同一密闭反应管中进行，避免了开盖的交叉污染。实验证明，可以利用本申请的鉴定病原的PCR引物对组合物和成套试剂鉴定狂犬病病毒、刚地弓形虫、钩端螺旋体、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒和犬细小病毒。
附图说明
图1为RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道M为DL2000marker，泳道1为双重RT-PCR产物，泳道2为作为空白对照的RT-PCR产物，泳道3为rv单重RT-PCR产物，泳道4为cdv单重RT-PCR产物。
图2为PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。其中，泳道M为DL2000marker，泳道1为四重PCR产物，泳道2为ichv单重PCR产物，泳道3为cpv单重PCR产物，泳道4为lep单重PCR产物，泳道5为tox单重PCR产物，泳道6为作为空白对照的PCR产物。
图3为病原RV、CPV、Tox、Lep、CDV和ICHV的液相芯片检测结果。其中，a为荧光编码微球的数量及范围，P1表示荧光编码微球数量及范围)；b为RV、CPV、Tox、Lep、CDV、ICHV液相芯片在Red-A、Yellow-A通道下的相对荧光强度，P2表示RV、CPV、Tox、Lep、CDV、ICHV液相芯片在Red-A、Yellow-A通道下相对荧光强度)；c为RV、CPV、Tox、Lep、CDV、ICHV液相芯片在Red-A通道下的相对荧光强度；d为RV、CPV、Tox、Lep、CDV、ICHV液相芯片在Yellow-A通道下的相对荧光强度。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的表面羧基化的荧光编码微球、鞘液、甲基咪唑(TE)、碳二亚胺均为美国BD公司产品；下述实施例中的TMAC(temtrameihyl-ammdnium chloride)、Tris、SDS(10％solution)、链霉菌抗生物素蛋白－藻红蛋白(SA-PE)均为美国Sigma公司产品；下述实施例中的SPAE Streptavidin-R-phycoerythrin为美国Prozyme公司产品；下述实施例中的RNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.3.0)、RT-PCR试剂盒(RT-PCR Kit II)、DNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA ExtractionKit Ver.3.0)、PCR试剂盒(PCR Kit II)、DL2000marker均为大连宝生物公司产品。下述实施例中的BD FACSArray液相芯片仪为美国BD公司生产的仪器；下述实施例中的EppendorfMastercycler Gradient梯度PCR扩增仪为德国Eppendorf公司生产的仪器；下述实施例中的Alphamager TM 2200凝胶成像系统为美国AP公司生产的仪器；下述实施例中的Eppendorf高速冷冻离心机为德国Eppendorf公司生产的仪器。
下述实施例中所用的狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV)(王铁成,张涛,杨松涛,王化磊,高玉伟,孙玮,靳晓霞,赵平森,冯娜,黄耕,邹啸环,夏咸柱.狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸的制备[J].生物工程学报,2011,05:799-804.)公众可从中华人民共和国济南出入境检验检疫局获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中所用的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii，Tox)(王林,沈继龙.刚地弓形虫基因型和与基因型相关的致病机制研究进展[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2013,04:319-324.)公众可从中华人民共和国济南出入境检验检疫局获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中所用的钩端螺旋体(Pathogenic Leptospira)(王元伦,唐雨德,陶开华,李越希,金慧英,张锦海.基因芯片技术在钩端螺旋体病传染源监测中的应用[J].动物医学进展,2005,02:61-64.)公众可从中华人民共和国济南出入境检验检疫局获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中所用的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)(王琛,袁宝,任文陟.犬瘟热病毒分子生物学研究进展[J].动物医学进展，2007，0101:84-87.)公众可从中华人民共和国济南出入境检验检疫局获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中所用的犬传染性肝炎病毒(Infectious canine hepatitis virus，ICHV)(范泉水,夏咸柱,邱薇,黄耕,何洪彬,余春,乔军,武银莲.犬传染性肝炎病毒的血凝抑制抗体和中和抗体的关系[J].动物医学进展,2002,01:64-66.)公众可从中华人民共和国济南出入境检验检疫局获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中所用的犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)(耿志贤,时彦胜,郑亚平,邱旭方,周晓丽,孔德强.犬细小病毒病的流行现状调查[J].中国畜牧兽医,2009,11:135-137)公众可从中华人民共和国济南出入境检验检疫局获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、鉴定病原的PCR引物对组合物和成套试剂的制备
鉴定狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondi i，Tox)、钩端螺旋体(Pathogenic Leptospira)、犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)、犬传染性肝炎病毒(Infectious canine hepatitis virus，ICHV)和犬细小病毒(Canineparvovirus,CPV)的PCR引物对组合物，由名称为rv的鉴定或辅助鉴定狂犬病病毒的PCR引物对、名称为tox的鉴定或辅助鉴定弓形虫的PCR引物对、名称为lep的鉴定或辅助鉴定钩端螺旋体的PCR引物对、名称为cdv的鉴定或辅助鉴定犬瘟热病毒的PCR引物对、名称为ichv的鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的PCR引物对和名称为cpv的鉴定或辅助鉴定犬细小病毒的PCR引物对组成。
鉴定病原的成套试剂由名称为CRV的鉴定或辅助鉴定狂犬病病毒的引物探针组合物、名称为CTox的鉴定或辅助鉴定弓形虫的引物探针组合物、名称为CLep的鉴定或辅助鉴定钩端螺旋体的引物探针组合物、名称为CCDV的鉴定或辅助鉴定犬瘟热病毒的引物探针组合物、名称为CICHV的鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的引物探针组合物和名称为CCPV的鉴定或辅助鉴定犬细小病毒的引物探针组合物组成；
CRV由rv和名称为PRV的鉴定或辅助鉴定狂犬病病毒的探针组成；
CTox由所述tox和名称为PTox的鉴定或辅助鉴定弓形虫的探针组成；
CLep由lep和名称为PLep的鉴定或辅助鉴定钩端螺旋体的探针组成；
CCDV由cdv和名称为PCDV的鉴定或辅助鉴定犬瘟热病毒的探针组成；
CICHV由ichv和名称为PICHV的鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的探针组成；
CCPV由cpv和名称为PCPV的鉴定或辅助鉴定犬细小病毒的探针组成。
分别设计用于鉴定狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV)、刚地弓形虫(Toxoplasmagondii，Tox)、钩端螺旋体(Pathogenic Leptospira)、犬瘟热病毒(Canine distempervirus,CDV)、犬传染性肝炎病毒(Infectious canine hepatitis virus，ICHV)和犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)的液相芯片检测探针，并对这些探针的5’端进行氨基化修饰，得到名称分别为氨基化探针PRV、氨基化探针PTox、氨基化探针PLep、氨基化探针PCDV、氨基化探针PICHV和氨基化探针PCPV的探针。
分别在PRV、PTox、PLep、PCDV、PICHV和PCPV的上下游设计用于鉴定狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii，Tox)、钩端螺旋体(PathogenicLeptospira)、犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)、犬传染性肝炎病毒(Infectious canine hepatitis virus，ICHV)和犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)的引物对，并对这些引物对每条单链DNA的5’端进行生物素标记，得到名称分别为rv、tox、lep、cdv、ichv和cpv的引物对。
其中，名称为rv的引物对由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA在其5’端进行生物素标记得到，rv的PCR产物或RT-PCR产物上有PRV的结合位点，PRV的核苷酸序列是SEQ ID No.3；SEQ ID No.1由19个核苷酸组成，SEQ ID No.2由20个核苷酸组成，SEQ ID No.3由20个核苷酸组成；名称为tox的引物对由序列表中SEQ ID No.4和SEQ IDNo.5所示的两条单链DNA在其5’端进行生物素标记得到，tox的PCR产物上有PTox的结合位点，SEQ ID No.4由18个核苷酸组成，SEQ ID No.5由18个核苷酸组成，SEQ ID No.6由22个核苷酸组成；名称为lep的引物对由序列表中SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的两条单链DNA在其5’端进行生物素标记得到，lep的PCR产物上有PLep的结合位点，SEQ ID No.7由18个核苷酸组成，SEQ ID No.8由18个核苷酸组成，SEQ ID No.9由22个核苷酸组成；名称为cdv的引物对由序列表中SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的两条单链DNA在其5’端进行生物素标记得到，cdv的PCR产物或RT-PCR产物上有PCDV的结合位点，SEQ ID No.10由18个核苷酸组成，SEQ ID No.11由18个核苷酸组成，SEQ ID No.12由18个核苷酸组成；名称为ichv的引物对由序列表中SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的两条单链DNA在其5’端进行生物素标记得到，ichv的PCR产物上有PICHV的结合位点，SEQ ID No.13由18个核苷酸组成，SEQ ID No.14由18个核苷酸组成，SEQ ID No.15由20个核苷酸组成；名称为cpv的引物对由序列表中SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示的两条单链DNA在其5’端进行生物素标记得到，cpv的PCR产物上有PCPV的结合位点，SEQ ID No.16由18个核苷酸组成，SEQ ID No.17由18个核苷酸组成，SEQ ID No.18由18个核苷酸组成。
实施例2、病原的鉴定
分别用引物对rv、tox、lep、cdv、ichv、cpv和PRV、PTox、PLep、PCDV、PICHV、PCPV对狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii，Tox)、钩端螺旋体(Pathogenic Leptospira)、犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)、犬传染性肝炎病毒(Infectious canine hepatitis virus，ICHV)和犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)用液相芯片技术进行鉴定。
1、双重RT-PCR
采用RNA提取试剂盒(大连宝生物公司)提取狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV)和犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)的RNA，分别得到狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV)RNA和犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)RNA。
以上述狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV)RNA和犬瘟热病毒(Canine distempervirus,CDV)RNA为模板，用名称为rv的鉴定或辅助鉴定狂犬病病毒的PCR引物对和名称为cdv的鉴定或辅助鉴定犬瘟热病毒的PCR引物对进行双重RT-PCR。双重RT-PCR的25μL体系为：向0.2mL PCR反应管中，依次加入dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mmol/L的4种dNTP的混合物2.0μL，10×RT-PCR buffer 2.5μL，浓度为10pmol/μL的SEQ ID No.1和SEQ IDNo.10所示的单链DNA各1μL，浓度为10pmol/μL的SEQ ID No.2和SEQ ID No.11所示的单链DNA各1μL，Inhibiter 0.5μL，AMV XL0.5μL，AMV Taq(5U/μL)0.25μL，25mmol/L MgCl25.0μL，狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV)RNA 2.5μL，犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)RNA 2.5μL，双蒸水5.25μL。在梯度PCR扩增仪(Eppendorf Mastercycler Gradient，德国Eppendorf公司)上进行双重RT-PCR扩增，双重RT-PCR扩增的条件为：先50℃30min；而后94℃2min；然后94℃30sec、58℃30sec、72℃30sec，30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保温，得到双重RT-PCR产物。
按照上述方法，将狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV)RNA和犬瘟热病毒(Caninedistemper virus,CDV)RNA均替换为蒸馏水，其他方法不变，进行RT-PCR扩增，得到作为空白对照的RT-PCR产物。
下述单重RT-PCR中RNA模板为狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV)RNA或犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)RNA，下述配对使用的两条单链DNA为rv中的两条单链DNA或cdv中的两条单链DNA。
分别以上述狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV)RNA或犬瘟热病毒(Canine distempervirus,CDV)RNA为模板，用名称为rv的鉴定或辅助鉴定狂犬病病毒的PCR引物对或名称为cdv的鉴定或辅助鉴定犬瘟热病毒的PCR引物对进行单重RT-PCR。rv单重RT-PCR体系和cdv单重RT-PCR体系均为：dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mmol/L的4种dNTP的混合物2.0μL，10×RT-PCR buffer 2.5μL，配对使用的两条单链DNA中每条单链DNA各1μL，Inhibiter0.5μL，AMV XL 0.5μL，AMV Taq(5U/μL)0.25μL，25mmol/L MgCl25.0μL，RNA模板5.0μL，双蒸水7.25μL。
其中，rv单重RT-PCR体系为扩增狂犬病病毒基因的PCR体系；cdv单重RT-PCR体系为扩增犬瘟热病毒基因的PCR体系。
分别在梯度PCR扩增仪(Eppendorf Mastercycler Gradient，德国Eppendorf公司)上进行单重RT-PCR扩增，rv单重RT-PCR和cdv单重RT-PCR扩增的条件均为为：先50℃30min；而后94℃2min；然后94℃30sec、58℃30sec、72℃30sec，30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保温，分别得到rv单重RT-PCR产物和cdv单重RT-PCR产物。
将上述双重RT-PCR产物、作为空白对照的RT-PCR产物、rv单重RT-PCR产物和cdv单重RT-PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶图像分析系统(Alphamager TM2200)上观察、分析扩增产物，结果见图1。结果显示，双重RT-PCR产物中含有大小为272bp、218bp左右的条带，作为空白对照的RT-PCR产物中不含任何条带，rv单重RT-PCR产物中含有大小为272bp左右的条带，cdv单重RT-PCR产物中含有大小为218bp左右的条带，表明可以狂犬病病毒RNA和犬瘟热病毒RNA为模板用引物对rv和cdv进行双重RT-PCR。
2、四重PCR
采用DNA提取试剂盒(大连宝生物公司)分别提取刚地弓形虫(Toxoplasmagondii，Tox)、钩端螺旋体(Pathogenic Leptospira)、犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)和犬传染性肝炎病毒(Infectious canine hepatitis virus，ICHV)的DNA，分别得到刚地弓形虫(Toxoplasma gondii，Tox)DNA、钩端螺旋体(Pathogenic Leptospira)DNA、犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)DNA和犬传染性肝炎病毒(Infectious caninehepatitis virus，ICHV)DNA。
以上述刚地弓形虫(Toxoplasma gondii，Tox)DNA、钩端螺旋体(PathogenicLeptospira)DNA、犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)DNA和犬传染性肝炎病毒(Infectious canine hepatitis virus，ICHV)DNA为模板，用名称为tox的鉴定或辅助鉴定弓形虫的PCR引物对、名称为lep的鉴定或辅助鉴定钩端螺旋体的PCR引物对、名称为ichv的鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的PCR引物对和名称为cpv的鉴定或辅助鉴定犬细小病毒的PCR引物对进行四重PCR。四重PCR的25μL体系为：向0.2mL PCR反应管中，依次加入dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mmol/L的4种dNTP的混合物2.0μL，10×PCR buffer2.5μL，浓度为10pmol/μL的SEQ ID No.4、SEQ ID No.7、SEQ ID No.13和SEQ ID No.16所示的单链DNA各0.5μL，浓度为10pmol/μL的SEQ ID No.5、SEQ ID No.8、SEQ ID No.14和SEQID No.17所示的单链DNA各0.5μL，Taq(5U/μL)0.5μL，刚地弓形虫(Toxoplasma gondii，Tox)DNA、钩端螺旋体(Pathogenic Leptospira)DNA、犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)DNA和犬传染性肝炎病毒(Infectious canine hepatitis virus，ICHV)DNA各0.5μL，双蒸水14μL。在梯度PCR扩增仪(Eppendorf Mastercycler Gradient，德国Eppendorf公司)上进行四重PCR扩增，四重PCR扩增的条件为：先94℃5min；然后94℃30sec、58℃30sec、72℃30sec，30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保温，得到四重PCR产物。
按照上述方法，将刚地弓形虫(Toxoplasma gondii，Tox)DNA、钩端螺旋体(Pathogenic Leptospira)DNA、犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)DNA和犬传染性肝炎病毒(Infectious canine hepatitis virus，ICHV)DNA各0.5μL替换为蒸馏水2.0μL，其他方法不变，进行RT-PCR扩增，得到作为空白对照的PCR产物。
下述单重PCR中DNA模板为刚地弓形虫(Toxoplasma gondii，Tox)DNA或钩端螺旋体(Pathogenic Leptospira)DNA或犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)DNA或犬传染性肝炎病毒(Infectious canine hepatitis virus，ICHV)DNA，下述配对使用的两条单链DNA为tox中的两条单链DNA、lep中的两条单链DNA、ichv中的两条单链DNA或cpv中的两条单链DNA。
分别以上述刚地弓形虫(Toxoplasma gondii，Tox)DNA或钩端螺旋体(PathogenicLeptospira)DNA或犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)DNA或犬传染性肝炎病毒(Infectious canine hepatitis virus，ICHV)DNA为模板，用名称为tox的鉴定或辅助鉴定弓形虫的PCR引物对、名称为lep的鉴定或辅助鉴定钩端螺旋体的PCR引物对、名称为ichv的鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的PCR引物对和名称为cpv的鉴定或辅助鉴定犬细小病毒的PCR引物对进行单重PCR。tox单重PCR体系、lep单重PCR体系、ichv单重PCR体系和cpv单重PCR体系均为：向0.2mL PCR反应管中，依次加入dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mmol/L的4种dNTP的混合物2.0μL，10×PCR buffer 2.5μL，配对使用的两条单链DNA中每条单链DNA各0.5μL，Taq(5U/μL)0.5μL，DNA模板2.0μL，双蒸水17μL。
其中，tox单重PCR体系为扩增刚地弓形虫基因的PCR体系，含有刚地弓形虫DNA和tox；lep单重PCR体系为扩增钩端螺旋体基因的PCR体系，含有钩端螺旋体DNA和lep；ichv单重PCR体系为扩增犬传染性肝炎病毒基因的PCR体系，含有犬传染性肝炎病毒DNA和ichv；cpv单重PCR体系为扩增犬细小病毒基因的PCR体系，含有犬细小病毒DNA和cpv。
在梯度PCR扩增仪(Eppendorf Mastercycler Gradient，德国Eppendorf公司)上分别进行单重PCR扩增，tox单重PCR扩增、lep单重PCR扩增、ichv单重PCR扩增和cpv单重PCR扩增的条件均为：先94℃5min；然后94℃30sec、58℃30sec、72℃30sec，30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保温，分别得到tox单重PCR产物、lep单重PCR产物、ichv单重PCR产物和cpv单重PCR产物。
将上述四重PCR产物、作为空白对照的PCR产物、tox单重PCR产物、lep单重PCR产物、ichv单重PCR产物和cpv单重PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶图像分析系统(Alphamager TM 2200)上观察、分析扩增产物，结果见图2。结果显示，四重PCR产物中含有大小为189bp、146bp、258bp、175bp左右的条带，作为空白对照的PCR产物中不含任何条带，tox单重PCR产物中含有大小为189bp左右的条带，lep单重PCR产物中含有大小为146bp左右的条带，ichv单重PCR产物中含有大小为258bp左右的条带，cpv单重PCR产物中含有大小为175bp左右的条带。表明可以刚地弓形虫DNA、钩端螺旋体DNA、犬细小病毒DNA和犬传染性肝炎病毒DNA为模板，用tox、lep、ichv和cpv的引物对进行四重PCR。
3、液相芯片技术鉴定病原
实验重复三次，每次重复实验的具体方法如下：
3.1探针与微球共价偶联
①将表面羧基化的荧光编码微球漩涡混合20s，使表面羧基化的荧光编码微球充分分散，得到离散的微球溶液；取75μL离散的微球溶液(该75μL离散的微球溶液含有3×106个微球)，于1.5mL离心管中10000g下离心1min，去上清液，得到微球；
②向步骤①中得到的微球中加入50μL浓度为0.1mol/L、pH为4.5的甲基咪唑水溶液，漩涡使该甲基咪唑水溶液与微球混合，得到微球甲基咪唑水溶液，超声波处理微球甲基咪唑水溶液30s-1min(400W的功率,每超声9秒停6秒)，得到微球超声液；
③向步骤②得到的微球超声液中加入氨基化探针PRV 1.0nmol，漩涡使二者混合，得到PRV微球溶液1；
④向步骤③得到的PRV微球溶液1中加入2.5μL碳二亚胺溶液(碳二亚胺溶液的制备方法为：向10mg的碳二亚胺粉末中加入1.0mL的灭菌纯水，溶解碳二亚胺粉)充分混匀，室温避光孵育30min，得到PRV微球溶液2；
⑤向步骤④得到的PRV微球溶液2中加入步骤④的2.5μL碳二亚胺溶液充分混匀，室温避光孵育30min，得到PRV微球溶液3。
⑥向步骤⑤得到的PRV微球溶液3中加入1.0mL Tween-20浓度为0.02g/100mL的Tween-20水溶液，使二者混匀，并于10000g下离心1min，弃上清液，得到PRV微球1；
⑦向步骤⑥得到的PRV微球1中加入1.0mL SDS浓度为0.1g/100mL的SDS水溶液，使二者混匀，并于10000g下离心1min，弃上清液，得到PRV微球2；
⑧向步骤⑦得到的PRV微球2中加入步骤②的0.1mol/L甲基咪唑溶液100μL，重悬PRV微球2，得到氨基化探针PRV与表面羧基化的荧光编码微球共价偶联的PRV微球溶液，于2-8℃避光保存，待用。
按照上述步骤①-⑧，将氨基化探针PRV替换为氨基化探针PTox，其他方法不变，得到氨基化探针PTox与表面羧基化的荧光编码微球共价偶联的PTox微球溶液。
按照上述步骤①-⑧，将氨基化探针PRV替换为氨基化探针PLep，其他方法不变，得到氨基化探针PLep与表面羧基化的荧光编码微球共价偶联的PLep微球溶液。
按照上述步骤①-⑧，将氨基化探针PRV替换为氨基化探针PCDV，其他方法不变，得到氨基化探针PCDV与表面羧基化的荧光编码微球共价偶联的PCDV微球溶液。
按照上述步骤①-⑧，将氨基化探针PRV替换为氨基化探针PICHV，其他方法不变，得到氨基化探针PICHV与表面羧基化的荧光编码微球共价偶联的PICHV微球溶液。
按照上述步骤①-⑧，将氨基化探针PRV替换为氨基化探针PCPV，其他方法不变，得到氨基化探针PCPV与表面羧基化的荧光编码微球共价偶联的PCPV微球溶液。
3.2杂交
杂交体系为：1.5μL微球溶液(该微球溶液包含步骤3.1得到的PRV微球溶液0.25μL、PTox微球溶液0.25μL、PLep微球溶液0.25μL、PCDV微球溶液0.25μL、PICHV微球溶液0.25μL、PCPV微球溶液0.25μL)，1.5×TMAC杂交液(TMAC(temtrameihyl-ammdnium chloride)：美国Sigma公司，货号为87718；按照产品说明书配制1×TMAC杂交液和1.5×TMAC杂交液)33μL，TE 9μL，DNA片段扩增产物混合物8μL(该DNA片段扩增产物混合物包含步骤1得到的双重RT-PCR产物4μL、步骤2得到的四重PCR产物4μL)。将上述杂交体系中各溶液混合均匀后于98℃变性10min，52℃下孵育15min，然后于18000g下离心2min，去上清液，得到沉淀；向该沉淀中加入50μL SA-PE稀释液(SA-PE稀释液为用上述1×TMAC杂交液将SA-PE(链霉菌抗生物素蛋白－藻红蛋白)(美国Sigma公司，货号为S6940)稀释500倍得到的液体))，52℃下孵育10min进行杂交，于18000g下离心2min，弃上清液，得到杂交产物；向杂交产物中加入50μL上述1×TMAC杂交液，漩涡混合使微球重悬，得到杂交液。将杂交液置于BD FACSArray液相芯片仪中进行分析，每次实验设三个重复处理。
将含有没有连接探针的微球作为空白对照，空白对照组设三个重复处理。
参与计数的荧光编码微球均在100个以上，表明用于计算的荧光编码微球数量有效，所产生的荧光强度中位值(MFI)可信，3个荧光编码微球的空白对照MFI值均小于500，试验可进行结果判断。液相芯片定性比值结果(LQRR)等于样品校正后的MFI值(MFIS)与空白对照MFI平均值(MFIB)的比值，即LQRR＝MFIS/MFIB。如果LQRR≥3，样本判定为阳性；如果2≤LQRR＜3，样本判定为可疑；如果LQRR＜2，样本判定为阴性。RV、CPV、Tox、Lep、CDV、ICHV液相芯片检测结果见图3。
结果显示，偶联在微球上的探针与相应病毒的RT-PCR扩增产物或PCR扩增产物在Red-A、Yellow-A检测通道下均有荧光信号，表明可以利用液相芯片技术及本发明的鉴定病原的PCR引物对组合物和成套试剂鉴定狂犬病病毒、刚地弓形虫、钩端螺旋体、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒和犬细小病毒。
改变本实施例中杂交温度的实验表明，杂交温度为48-54℃时，荧光变动幅度都不大，显示52℃度杂交效果最好，当杂交温度高于54℃时，荧光下降剧烈，因此最佳杂交温度为52℃。
实施例3、液相芯片检测体系的特异性验证
按照实施例2中步骤3中3.1的方法，分别得到PRV微球溶液、PTox微球溶液、PLep微球溶液、PCDV微球溶液、PCPV微球溶液和PICHV微球溶液。
按照下述方法对本申请的液相芯片检测体系进行特异性验证：
按照实施例2中步骤3中3.2的方法，将DNA片段扩增产物混合物8μL替换为rv单重RT-PCR产物8μL，其他方法不变，进行犬传染性肝炎病毒的液相芯片检测；
按照实施例2中步骤3中3.2的方法，将DNA片段扩增产物混合物8μL替换为tox单重PCR产物8μL，其他方法不变，进行刚地弓形虫的液相芯片检测；
按照实施例2中步骤3中3.2的方法，将DNA片段扩增产物混合物8μL替换为lep单重PCR产物8μL，其他方法不变，进行钩端螺旋体的液相芯片检测；
按照实施例2中步骤3中3.2的方法，将DNA片段扩增产物混合物8μL替换为cdv单重RT-PCR产物8μL，其他方法不变，进行犬瘟热病毒的液相芯片检测；
按照实施例2中步骤3中3.2的方法，将DNA片段扩增产物混合物8μL替换为cpv单重PCR产物8μL，其他方法不变，进行犬细小病毒的液相芯片检测；
按照实施例2中步骤3中3.2的方法，将DNA片段扩增产物混合物8μL替换为ichv单重PCR产物8μL，其他方法不变，进行犬传染性肝炎病毒的液相芯片检测；
按照实施例2中步骤3中3.2的方法，将DNA片段扩增产物混合物8μL替换为rv单重RT-PCR产物4μL和cdv单重RT-PCR产物4μL，其他方法不变，进行狂犬病病毒和犬瘟热病毒的液相芯片检测；
按照实施例2中步骤3中3.2的方法，将DNA片段扩增产物混合物8μL替换为tox单重PCR产物4μL和lep单重PCR产物4μL，其他方法不变，进行刚地弓形虫和钩端螺旋体的液相芯片检测；
按照实施例2中步骤3中3.2的方法，将DNA片段扩增产物混合物8μL替换为cpv单重PCR产物4μL和ichv单重PCR产物4μL，其他方法不变，进行犬细小病毒和犬传染性肝炎病毒的液相芯片检测；
按照实施例2中步骤3中3.2的方法，将DNA片段扩增产物混合物8μL替换为rv单重RT-PCR产物2.7μL、tox单重PCR产物2.7μL和cdv单重RT-PCR产物2.7μL，其他方法不变，进行狂犬病病毒、刚地弓形虫和犬瘟热病毒的液相芯片检测；
按照实施例2中步骤3中3.2的方法，将DNA片段扩增产物混合物8μL替换为rv单重RT-PCR产物2.0μL、tox单重PCR产物2.0μL、lep单重PCR产物2.0μL和cdv单重RT-PCR产物2.0μL，其他方法不变，进行狂犬病病毒、刚地弓形虫、钩端螺旋体和犬瘟热病毒的液相芯片检测；
按照实施例2中步骤3中3.2的方法，将DNA片段扩增产物混合物8μL替换为rv单重RT-PCR产物1.6μL、tox单重PCR产物1.6μL、lep单重PCR产物1.6μL、cpv单重PCR产物1.6μL和cdv单重RT-PCR产物1.6μL，其他方法不变，进行狂犬病病毒、刚地弓形虫、钩端螺旋体、犬细小病毒和犬瘟热病毒的液相芯片检测；
按照实施例2中步骤3中3.2的方法，将DNA片段扩增产物混合物8μL替换为rv单重RT-PCR产物1.3μL、tox单重PCR产物1.3μL、lep单重PCR产物1.3μL、cpv单重PCR产物1.3μL、ichv单重PCR产物1.3μL和cdv单重RT-PCR产物1.3μL，其他方法不变，进行狂犬病病毒、刚地弓形虫、钩端螺旋体、犬细小病毒、犬传染性肝炎病毒和犬瘟热病毒的液相芯片检测。
实验结果见表1和表2，结果表明，不同病原的探针对对应病原的检测结果均为阳性，而对非对应病原的扩增产物的检测结果均为阴性，本申请的鉴定病原的方法及鉴定病原的PCR引物对组合物和成套试剂具有很好的特异性。
表1、液相芯片检测体系特异性验证
表2、液相芯片检测体系特异性验证
实施例4、液相芯片检测体系灵敏度验证
用核酸分析仪测定狂犬病病毒、刚地弓形虫、钩端螺旋体、犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬传染性肝炎病毒的OD值，根据阿佛加德罗常数换算出每微升病原中核酸的拷贝数，对并对病原的核酸进行10倍系列稀释，分别得到以下不同病原的不同稀释倍数的稀释液：
狂犬病病毒106拷贝数的稀释液(狂犬病病毒基因组含量为106个狂犬病病毒基因组拷贝数/μL，即6ng狂犬病病毒基因组拷贝数/μL)、狂犬病病毒105拷贝数的稀释液(狂犬病病毒基因组含量为105个狂犬病病毒基因组拷贝数/μL，即600pg狂犬病病毒基因组拷贝数/μL)、狂犬病病毒104拷贝数的稀释液(狂犬病病毒基因组含量为104个狂犬病病毒基因组拷贝数/μL，即60pg狂犬病病毒基因组拷贝数/μL)、狂犬病病毒103拷贝数的稀释液(狂犬病病毒基因组含量为103个狂犬病病毒基因组拷贝数/μL，即6pg狂犬病病毒基因组拷贝数/μL)、狂犬病病毒102拷贝数的稀释液(狂犬病病毒基因组含量为102个狂犬病病毒基因组拷贝数/μL，即600fg狂犬病病毒基因组拷贝数/μL)、狂犬病病毒101拷贝数的稀释液(狂犬病病毒基因组含量为101个狂犬病病毒基因组拷贝数/μL，即60fg狂犬病病毒基因组拷贝数/μL)、狂犬病病毒100拷贝数的稀释液(狂犬病病毒基因组含量为100个狂犬病病毒基因组拷贝数/μL，即6fg狂犬病病毒基因组拷贝数/μL)；
刚地弓形虫106拷贝数的稀释液(刚地弓形虫基因组含量为106个刚地弓形虫基因组拷贝数/μL，即40ng刚地弓形虫基因组拷贝数/μL)、刚地弓形虫105拷贝数的稀释液(刚地弓形虫基因组含量为105个刚地弓形虫基因组拷贝数/μL，即4ng刚地弓形虫基因组拷贝数/μL)、刚地弓形虫104拷贝数的稀释液(刚地弓形虫基因组含量为104个刚地弓形虫基因组拷贝数/μL，即400pg刚地弓形虫基因组拷贝数/μL)、刚地弓形虫103拷贝数的稀释液(刚地弓形虫基因组含量为103个刚地弓形虫基因组拷贝数/μL，即40pg刚地弓形虫基因组拷贝数/μL)、刚地弓形虫102拷贝数的稀释液(刚地弓形虫基因组含量为102个刚地弓形虫基因组拷贝数/μL，即4pg刚地弓形虫基因组拷贝数/μL)、刚地弓形虫101拷贝数的稀释液(刚地弓形虫基因组含量为101个刚地弓形虫基因组拷贝数/μL，即400fg刚地弓形虫基因组拷贝数/μL)、刚地弓形虫100拷贝数的稀释液(刚地弓形虫基因组含量为100个刚地弓形虫基因组拷贝数/μL，即40fg刚地弓形虫基因组拷贝数/μL)；
钩端螺旋体106拷贝数的稀释液(钩端螺旋体基因组含量为106个钩端螺旋体基因组拷贝数/μL，即50ng钩端螺旋体基因组拷贝数/μL)、钩端螺旋体105拷贝数的稀释液(钩端螺旋体基因组含量为105个钩端螺旋体基因组拷贝数/μL，即5ng钩端螺旋体基因组拷贝数/μL)、钩端螺旋体104拷贝数的稀释液(钩端螺旋体基因组含量为104个钩端螺旋体基因组拷贝数/μL，即500pg钩端螺旋体基因组拷贝数/μL)、钩端螺旋体103拷贝数的稀释液(钩端螺旋体基因组含量为103个钩端螺旋体基因组拷贝数/μL，即50pg钩端螺旋体基因组拷贝数/μL)、钩端螺旋体102拷贝数的稀释液(钩端螺旋体基因组含量为102个钩端螺旋体基因组拷贝数/μL，即5pg钩端螺旋体基因组拷贝数/μL)、钩端螺旋体101拷贝数的稀释液(钩端螺旋体基因组含量为101个钩端螺旋体基因组拷贝数/μL，即500fg钩端螺旋体基因组拷贝数/μL)、钩端螺旋体100拷贝数的稀释液(钩端螺旋体基因组含量为100个钩端螺旋体基因组拷贝数/μL，即50fg钩端螺旋体基因组拷贝数/μL)；
犬瘟热病毒106拷贝数的稀释液(犬瘟热病毒基因组含量为106个犬瘟热病毒基因组拷贝数/μL，即5ng犬瘟热病毒基因组拷贝数/μL)、犬瘟热病毒105拷贝数的稀释液(犬瘟热病毒基因组含量为105个犬瘟热病毒基因组拷贝数/μL，即500pg犬瘟热病毒基因组拷贝数/μL)、犬瘟热病毒104拷贝数的稀释液(犬瘟热病毒基因组含量为104个犬瘟热病毒基因组拷贝数/μL，即50pg犬瘟热病毒基因组拷贝数/μL)、犬瘟热病毒103拷贝数的稀释液(犬瘟热病毒基因组含量为103个犬瘟热病毒基因组拷贝数/μL，即5pg犬瘟热病毒基因组拷贝数/μL)、犬瘟热病毒102拷贝数的稀释液(犬瘟热病毒基因组含量为102个犬瘟热病毒基因组拷贝数/μL，即500fg犬瘟热病毒基因组拷贝数/μL)、犬瘟热病毒101拷贝数的稀释液(犬瘟热病毒基因组含量为101个犬瘟热病毒基因组拷贝数/μL，即50fg犬瘟热病毒基因组拷贝数/μL)、犬瘟热病毒100拷贝数的稀释液(犬瘟热病毒基因组含量为100个犬瘟热病毒基因组拷贝数/μL，即5fg犬瘟热病毒基因组拷贝数/μL)；
犬细小病毒106拷贝数的稀释液(犬细小病毒基因组含量为106个犬细小病毒基因组拷贝数/μL，即7ng犬细小病毒基因组拷贝数/μL)、犬细小病毒105拷贝数的稀释液(犬细小病毒基因组含量为105个犬细小病毒基因组拷贝数/μL，即700pg犬细小病毒基因组拷贝数/μL)、犬细小病毒104拷贝数的稀释液(犬细小病毒基因组含量为104个犬细小病毒基因组拷贝数/μL，即70pg犬细小病毒基因组拷贝数/μL)、犬细小病毒103拷贝数的稀释液(犬细小病毒基因组基因组含量为103个犬细小病毒基因组拷贝数/μL，即7pg犬细小病毒基因组拷贝数/μL)、犬细小病毒102拷贝数的稀释液(犬细小病毒基因组含量为102个犬细小病毒基因组拷贝数/μL，即700fg犬细小病毒基因组拷贝数/μL)、犬细小病毒101拷贝数的稀释液(犬细小病毒基因组含量为101个犬细小病毒基因组拷贝数/μL，即70fg犬细小病毒基因组拷贝数/μL)、犬细小病毒100拷贝数的稀释液(犬细小病毒基因组含量为100个犬细小病毒基因组拷贝数/μL，即7fg犬细小病毒基因组拷贝数/μL)；
犬传染性肝炎病毒106拷贝数的稀释液(犬传染性肝炎病毒基因组含量为106个犬传染性肝炎病毒基因组拷贝数/μL，即60ng犬传染性肝炎病毒基因组拷贝数/μL)、犬传染性肝炎病毒105拷贝数的稀释液(犬传染性肝炎病毒基因组含量为105个犬传染性肝炎病毒基因组拷贝数/μL，即6ng犬传染性肝炎病毒基因组拷贝数/μL)、犬传染性肝炎病毒104拷贝数的稀释液(犬传染性肝炎病毒基因组含量为104个犬传染性肝炎病毒基因组拷贝数/μL，即600pg犬传染性肝炎病毒基因组拷贝数/μL)、犬传染性肝炎病毒103拷贝数的稀释液(犬传染性肝炎病毒基因组含量为103个犬传染性肝炎病毒基因组拷贝数/μL，即60pg犬传染性肝炎病毒基因组拷贝数/μL)、犬传染性肝炎病毒102拷贝数的稀释液(犬传染性肝炎病毒基因组含量为102个犬传染性肝炎病毒基因组拷贝数/μL，即6pg犬传染性肝炎病毒基因组拷贝数/μL)、犬传染性肝炎病毒101拷贝数的稀释液(犬传染性肝炎病毒基因组含量为101个犬传染性肝炎病毒基因组拷贝数/μL，即600fg犬传染性肝炎病毒基因组拷贝数/μL)和犬传染性肝炎病毒100拷贝数的稀释液(犬传染性肝炎病毒基因组含量为100个犬传染性肝炎病毒基因组拷贝数/μL，即60fg犬传染性肝炎病毒基因组拷贝数/μL)。
按照实施例2中步骤3中3.2的方法，将DNA片段扩增产物混合物8μL分别替换为上述不同病原不同稀释倍数的稀释液8μL，其他方法不变，进行不同病原不同稀释倍数的液相芯片检测，进行液相芯片检测体系灵敏度的检测，结果见表3和表4。结果表明，利用本发明的鉴定病原的PCR引物对组合物和成套试剂鉴定狂犬病病毒、刚地弓形虫、钩端螺旋体、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒和犬细小病毒的灵敏度均达到10copies/μL。
表3、液相芯片检测体系灵敏度验证
表4、液相芯片检测体系灵敏度验证

Claims (9)

1.鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物，由名称为rv的鉴定或辅助鉴定狂犬病病毒的PCR引物对、名称为tox的鉴定或辅助鉴定弓形虫的PCR引物对、名称为lep的鉴定或辅助鉴定钩端螺旋体的PCR引物对、名称为cdv的鉴定或辅助鉴定犬瘟热病毒的PCR引物对、名称为ichv的鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的PCR引物对和名称为cpv的鉴定或辅助鉴定犬细小病毒的PCR引物对组成；
所述rv由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成；
所述tox由序列表中SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的两条单链DNA组成；
所述lep由序列表中SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的两条单链DNA组成；
所述cdv由序列表中SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的两条单链DNA组成；
所述ichv由序列表中SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的两条单链DNA组成；
所述cpv由序列表中SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示的两条单链DNA组成。
2.鉴定或辅助鉴定病原的成套试剂，由名称为CRV的鉴定或辅助鉴定狂犬病病毒的引物探针组合物、名称为CTox的鉴定或辅助鉴定弓形虫的引物探针组合物、名称为CLep的鉴定或辅助鉴定钩端螺旋体的引物探针组合物、名称为CCDV的鉴定或辅助鉴定犬瘟热病毒的引物探针组合物、名称为CICHV的鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的引物探针组合物和名称为CCPV的鉴定或辅助鉴定犬细小病毒的引物探针组合物组成；
所述CRV由权利要求1所述组合物中所述rv和名称为PRV的鉴定或辅助鉴定狂犬病病毒的探针组成；
所述CTox由权利要求1所述组合物中所述tox和名称为PTox的鉴定或辅助鉴定弓形虫的探针组成；
所述CLep由权利要求1所述组合物中所述lep和名称为PLep的鉴定或辅助鉴定钩端螺旋体的探针组成；
所述CCDV由权利要求1所述组合物中所述cdv和名称为PCDV的鉴定或辅助鉴定犬瘟热病毒的探针组成；
所述CICHV由权利要求1所述组合物中所述ichv和名称为PICHV的鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的探针组成；
所述CCPV由权利要求1所述组合物中所述cpv和名称为PCPV的鉴定或辅助鉴定犬细小病毒的探针组成；
所述PRV为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的DNA；
所述PTox为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.6的DNA；
所述PLep为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.9的DNA；
所述PCDV为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.12的DNA；
所述PICHV为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.15的DNA；
所述PCPV为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.18的DNA。
3.权利要求1所述的PCR引物对组合物或权利要求2所述的成套试剂在制备鉴定或辅助鉴定病原的试剂或试剂盒中的应用；
所述病原为狂犬病病毒、弓形虫、钩端螺旋体、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒和犬细小病毒这六种病原。
4.权利要求1所述的PCR引物对组合物的制备方法，包括将权利要求1所述的PCR引物对组合物中各引物对或各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
5.权利要求2所述的成套试剂的制备方法，包括将权利要求2所述的成套试剂中各探针和各引物对或各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
6.权利要求1所述的PCR引物对组合物或权利要求2所述的成套试剂在鉴定或辅助鉴定病原中的应用；
所述应用为非疾病诊断或治疗为目的的应用；
所述病原为狂犬病病毒、弓形虫、钩端螺旋体、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒和犬细小病毒这六种病原中的六种、五种、四种、三种、两种或一种。
7.含有权利要求1所述引物对的鉴定或辅助鉴定病原的成套产品。
8.含有权利要求2所述成套试剂的鉴定或辅助鉴定病原的成套产品。
9.根据权利要求8所述的成套产品，其特征在于：所述成套产品中含有所述探针分别与荧光编码微球进行偶联得到的荧光微球混合物。
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