CN105695629A - 鉴别基因i型与ii型鸭呼肠孤病毒的引物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴别基因I型与II型鸭呼肠孤病毒的引物及方法。所述引物包括引物对1和引物对2，引物对1为：上游引物：5’-CTGACGCTTTTGAAGTCCACT-3’，下游引物：5’-AACACTGTATCCTGGACCAGC-3’，引物对2为：上游引物：5’-CGTCTATTCTCGTTTCCCTTC-3’，下游引物：5’-GAGAGAGAGGATAGCTCGGAC-3’。采用本发明引物及方法不仅能够同时检测基因I型与II型鸭呼肠孤病毒，而且还具有重复性好、特异性强、敏感性高的特点。

Description

鉴别基因I型与II型鸭呼肠孤病毒的引物及方法
技术领域
本发明涉及水禽病毒检测技术领域，特别是涉及鉴别基因I型与II型鸭呼肠孤病毒的引物及方法。
背景技术
鸭呼肠病毒病是由鸭呼肠病毒(duckreovirus，DRV)引起的番鸭、鸭、半番鸭和鹅等水禽的一种急性传染病。1997以来在我国南方广东、广西、福建、浙江和江西等广泛流行，主要感染番鸭，引起鸭坏死性肝炎(也称为番鸭“白点病”或者“花肝病”)。2000年以后，在我国的江苏、浙江、福建、广东、河北、山东等省鸭群中流行一种新肝病(亦称“出血性坏死性肝炎”或“脾出血坏死症”)。该病原除能感染番鸭、半番鸭和鹅外，还能感染肉鸭(北京鸭和樱桃谷鸭)和野鸭等多种水禽，经分离鉴定该病原为一种新型鸭呼肠孤病毒(novalduckreovirus，N-DRV)。N-DRV感染不仅引起雏鸭和雏鹅发病和死亡，还可以引起免疫抑制和生长发育障碍。据调查，雏鸭群发病率和死亡率差异较大，发病率为5％-40％，病死率10％-50％，而发病鸭耐过后也成为僵鸭。该疫病的流行给番鸭、肉鸭等水禽养殖业造成了严重的危害和经济损失。
近年来，国内学者将两种流行的鸭呼肠孤病毒分别定义为经典性鸭呼肠孤病毒(classicalduckreovirus，C-DRV)，即番鸭呼肠孤病毒(Muscoveyduckreovirus，MDRV)和鸭新型呼肠孤病毒(new-typeduckreovirus，N-DRV)。随着C-DRV和N-DRV全基因组序列的破译，通过进化树分析可知：这两种病毒同属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)，正呼肠孤病毒属(Orthoreovirusgenus)，禽正呼肠孤病毒群(AvianOrthoreovirusspeciesgroupII)成员，并揭示二者属于不同的基因型：基因I型(C-DRV)和II型(N-DRV)。
随着我国鸭养殖规模的不断扩大，DRV的流行和发病特点都在不断的变化，临床表现上趋于复杂化，尤其N-DRV引起的临床病理变化。最初，N-DRV病的主要特征为肝脏不同程度点斑/块状出血和坏死及脾脏肿大坏死等，单从临床剖检及病理变化就可区分N-DRV与C-DRV病。但近些年来，临床上出现了一些类似C-DRV病临床病理变化的N-DRV病例，即肝脏表面白色点坏死灶，且无明显特征出血斑，使得从临床上无法区分诊断，此外，DRV也易于与其他病原混合感染，这些问题给兽医临床诊断带来了很大困难。因此，亟需建立一种速度快，敏感性、特异性与重复性好的鉴别诊断基因I型与II型两种基因型鸭呼肠孤病毒的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴别基因I型与II型鸭呼肠孤病毒的引物及方法，以解决临床上不易区分诊断基因I型与II型鸭呼肠孤病毒的问题。
一种用于鉴别基因I型与II型鸭呼肠孤病毒的引物，包括引物对1和引物对2，
引物对1为：
上游引物：5’-CTGACGCTTTTGAAGTCCACT-3’，
下游引物：5’-AACACTGTATCCTGGACCAGC-3’，
引物对2为：
上游引物：5’-CGTCTATTCTCGTTTCCCTTC-3’，
下游引物：5’-GAGAGAGAGGATAGCTCGGAC-3’。
引物对1用于扩增基因I型鸭呼肠孤病毒的P10基因序列，扩增片段大小为249bp。引物对2用于扩增基因II型鸭呼肠孤病毒的P18基因序列，扩增片段大小为505bp。
根据基因I型与II型鸭呼肠孤病毒各自基因组10个节段预测的各蛋白编码基因对比发现，N-DRV与C-DRV基因组片段中主要不同在于编码σC蛋白的基因。N-DRVσC蛋白由S1基因编码，该基因为三顺反子，3个读码框(ORF)相互重叠，依次编码p10、p18和σC；而C-DRVσC蛋白由S4基因编码，该基因为双顺反子，依次编码p10和σC，并且C-DRV与N-DRV的p10、p18(C-DRV无)和σC核酸序列是各片段编码蛋白核酸序列中变异最大，同源性均≤40％。本发明利用C-DRV的P10基因序列和N-DRV的P18基因序列作为各自的分子标记，分别设计了上述引物对1和引物对2。
本发明又提供了一种包含所述引物的试剂盒。
所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为克隆有基因I型鸭呼肠孤病毒P10基因的质粒与克隆有基因II型鸭呼肠孤病毒P18基因的质粒的混合。
本发明还提供了所述试剂盒在鉴别基因I型与II型鸭呼肠孤病毒中的应用。
本发明还提供了一种鉴别基因I型与II型鸭呼肠孤病毒的方法，步骤如下：
(1)提取样本基因组RNA；
(2)以提取的样本基因组RNA为模板，分别以所述引物对1和引物对2为引物进行两组RT-PCR扩增；
(3)RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，
若以所述引物对1为引物的扩增产物大小为249bp，则有基因I型鸭呼肠孤病毒，若以所述引物对2为引物的扩增产物大小为505bp，则有基因II型鸭呼肠孤病毒，反之则否。
利用该方法既可以检测出样本是否感染鸭呼肠孤病毒，还可以鉴别出样本所感染的鸭呼肠孤病毒是感染了基因I型还是基因II型的，或者同时感染了基因I型与II型两种。
优选的，所述RT-PCR扩增为一步法RT-PCR扩增。
优选的，所述RT-PCR扩增反应体系为：
优选的，所述RT-PCR扩增反应方法为：50℃逆转录30min；94℃预变性2min；94℃变性30sec，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环。
本发明利用基因I型鸭呼肠孤病毒的P10基因特异性引物对与基因II型鸭呼肠孤病毒的P18基因特异性引物对，建立快速鉴别基因I型与II型鸭呼肠孤病毒的双重一步法RT-PCR检测方法。采用本发明引物及方法不仅能够同时检测基因I型与II型鸭呼肠孤病毒，而且还具有重复性好、特异性强、敏感性高的特点。
附图说明
图1为引物对1和引物对2分别扩增I型与II型鸭呼肠孤病毒基因组产物电泳图；其中泳道M为DL2000DNAMarker(下同)，泳道1为C-DRVZJ2000株(基因I型，下同)，泳道2为N-DRVZJ00M株(基因II型，下同)，泳道3为N-DRV03G株(基因II型，下同)，各检测样本均为病毒或细胞的RNA/DNA(下同)，
图2为本发明方法特异性检测结果图；其中泳道1为C-DRVZJ2000株；泳道2为N-DRVZJ00M株；泳道3为DTMUV；泳道4为DEV；泳道5为NDV；泳道6为MDPV；泳道7为DHAV-1；泳道8为AIVH9N2；泳道9为正常DF-1细胞，
图3为引物对1敏感性检测结果图；其中泳道1-7分别为C-DRVZJ2000病毒液10倍浓度梯度稀释(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)后提取RNA，
图4为引物对2敏感性检测结果图；其中泳道1-7分别为N-DRVZJ00M病毒液10倍浓度梯度稀释(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)后提取RNA，
图5为本发明方法敏感性检测结果图；其中泳道1-7分别为C-DRVZJ2000和N-DRVZJ00M病毒等量混合液10倍浓度梯度稀释(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)后提取RNA，
图6为本发明方法重复性检测结果图；其中泳道1-3为同一时间提取的C-DRVZJ2000和N-DRVZJ00MRNA等量混合后，不同时间扩增3次的结果；泳道4-6为3次不同时间提取的C-DRVZJ2000和N-DRVZJ00MRNA等量混合后扩增的结果。
具体实施方式
本发明中涉及的部分实验材料来源如下：传统鸭呼肠孤病毒(C-DRV)株ZJ2000、新型鸭呼肠孤病毒(N-DRV)株03G和ZJ00M、鸭坦布苏病毒(DTMUV)株ZJ407、鸭瘟病毒(DEV)疫苗株、鸭源新城疫病毒(NDV)株ZJ99、番鸭细小病毒(MDPV)、1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)和H9N2亚型禽流感病毒(AIV)，均由浙江省农科院畜牧兽医研究所禽病研究室分离保存；DF-1细胞，由浙江省农科院畜牧兽医研究所禽病研究室传代保存；宿主菌E.coliDH-5α，由浙江省农科院畜牧兽医研究所禽病研究室繁殖保存。
实施例1
通过对比GenBank提供的C-DRV株与N-DRV株P10、P18基因序列以及本实验室分离鉴定的C-DRVZJ2000株，N-DRVZJ00M、03G等毒株P10、P18区域(GenBank登录号为KF306091、KF154116和JX145334)，利用Oligo6.0软件设计了4条引物，由上海铂尚生物技术有限公司合成。引物序列如下：
P1：5’-CTGACGCTTTTGAAGTCCACT-3’，
P2：5’-AACACTGTATCCTGGACCAGC-3’，
P3：5’-CGTCTATTCTCGTTTCCCTTC-3’，
P4：5’-GAGAGAGAGGATAGCTCGGAC-3’。
其中P1，P2为扩增C-DRVP10基因引物，预期扩增产物大小为249bp；P3，P4引物为扩增N-DRVP18基因引物，预期扩增产物大小为505bp(如图1所示)。
实施例2
取鸭呼肠孤病毒毒株C-DRVZJ2000、N-DRV03G和ZJ00M的DF-1细胞分离病毒液各200μL，按照MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司，货号9766)说明书进行RNA提取，-70℃保存备用。对照病毒菌株DTMUV、DEV、DNDV、MDPV、DHAV-1、EDSV和AIV(H9N2)的基因组RNA或DNA提取方法同上。
实施例3
C-DRVZJ2000株和N-DRVZJ00M株的细胞毒RNA为模版，用不同引物浓度、退火温度进行一步法RT-PCR，确定了最佳的反应体系及反应条件。最佳的反应体系为：
最佳反应条件为：50℃逆转录30min；94℃预变性2min；94℃变性30sec，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环。
实施例4
分别将RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，目的条带用MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0胶回收试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司，货号9762)进行纯化，然后TA克隆，转化感受态细胞，将鉴定为阳性的转化菌送上海铂尚生物技术有限公司测序验证。
实施例5
采用上述优化的一步法RT-PCR方法，分别以C-DRVZJ2000株和N-DRVZJ00M株，及参考毒株鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭瘟病毒(DEV)、鸭新城疫病毒(NDV)、番鸭细小病毒(MDPV)、1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)、产蛋下降综合症病毒(EDSV)和H9N2禽流感病毒(AIV)提取的病毒DNA或RNA进行一步法RT-PCR扩增，以检测各引物和鉴别诊断检测方法的特异性。结果如图2所示，C-DRVZJ2000株能扩增出249bp左右的条带，N-DRVZJ00M株能扩增出505bp左右的条带，其余均未扩增出条带，说明该检测方法具有良好的特异性。
实施例6
将C-DRVZJ2000株(3.89×106/0.1mL)和N-DRVZJ00M株(5.13×106/0.1mL)的细胞毒分别做10倍梯度倍比稀释，同时提取各稀释度的RNA，采用上述优化的一步法RT-PCR方法确定其敏感性。结果如图3和图4所示，从10-1稀释到10-6时均能扩增出特异性条带，故其最低检出量分别约为0.47个TCID50和0.62个TCID50，而在两种基因型毒株同时存在的条件下，检测的敏感性基本无变化(如图5所示)。
实施例7
用建立的一步法RT-PCR检测法，对C-DRVZJ2000株和N-DRVZJ00M株同一时间提取的细胞毒RNA，在不同的时间对其重复扩增3次；以及对3个不同时间提取的细胞毒RNA样品进行扩增，以验证该方法的重复性，结果如图6所示，所有以C-DRVZJ2000株的细胞毒RNA为模版的结果一致，所有以N-DRVZJ00M株的细胞毒RNA为模版的结果一致。
实施例8
利用上述一步法RT-PCR鉴别诊断检测方法。对2011-2015年期间临床收集的来自浙江各地的DRV疑似病料(肝脏和脾脏)239份进行检测，并对部分病料的扩增产物进行了测序验证。结果C-DRV6份，N-DRV75份，阳性率分别为2.5％和31.4％。6份C-DRV阳性病料均为番鸭，而75份N-DRV病料中：番鸭54份(占N-DRV阳性率的72％)，鹅5份(占总阳性率的6.7％)，其它鸭16份(占总阳性率的21.3％)。

Claims (8)

1.一种用于鉴别基因I型与II型鸭呼肠孤病毒的引物，包括引物对1和引物对2，其特征在于，
引物对1为：
上游引物：5’-CTGACGCTTTTGAAGTCCACT-3’，
下游引物：5’-AACACTGTATCCTGGACCAGC-3’，
引物对2为：
上游引物：5’-CGTCTATTCTCGTTTCCCTTC-3’，
下游引物：5’-GAGAGAGAGGATAGCTCGGAC-3’。
2.一种包含如权利要求1所述引物的试剂盒。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照。
4.如权利要求2所述试剂盒在鉴别基因I型与II型鸭呼肠孤病毒中的应用。
5.一种鉴别基因I型与II型鸭呼肠孤病毒的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)提取样本基因组RNA；
(2)以提取的样本基因组RNA为模板，以所述引物进行RT-PCR扩增；
(3)RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，
若扩增产物大小为249bp，则样本为基因I型鸭呼肠孤病毒，若扩增产物大小为505bp，则样本为基因II型鸭呼肠孤病毒。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述RT-PCR扩增为一步法RT-PCR扩增。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述RT-PCR扩增反应体系为：
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述RT-PCR扩增反应方法为：50℃逆转录30min；94℃预变性2min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环。
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