CN110093452B - 基于定点基因质谱检测的鸭源病毒检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于定点基因质谱检测的鸭源病毒检测试剂盒及检测方法，涉及分子生物学检测技术领域。所述鸭源病毒检测试剂盒包括用于检测10种鸭源病毒的PCR引物及质量探针；本发明还提供一种可同时检测10种鸭源病毒的检测方法，该方法至少包括多重PCR、质量探针延伸、质谱分析检测步骤，该方法灵敏度高、成本低、特异性好，可以实现不同鸭源病毒的多重检测。

Description

基于定点基因质谱检测的鸭源病毒检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域。更具体地，涉及一种基于定点基因质谱检测的鸭源病毒检测试剂盒及检测方法。
背景技术
鸭病毒病是危害养鸭业的主要疫病。鸭肝炎病毒、鸭星状病毒、鸭肠炎病毒和鸭呼肠孤病毒是引起鸭病的经典毒株。20世纪90年代以来，禽流感病毒称为危害养鸭业的重要病原。近年来，我国鸭群中出现了许多新的病毒病，给养鸭业造成了巨大的经济损失。例如，番鸭“白点病”、由新型鸭肝炎病毒和星状病毒引起的鸭病毒性肝炎、番鸭“新肝病”和北京鸭“脾坏死病”等。自2010年以来，坦布苏病毒感染遍布我国蛋鸭主产区，导致产蛋下降及死亡。2015年，樱桃谷北京鸭感染鹅细小病毒发生了短喙和侏儒综合征。目前比较流行的鸭病毒性传染病的主要病原包括鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)、鸭甲肝病毒3型、鸭星状病毒1型、鸭星状病毒2型、鸭呼肠孤病毒1型、鸭呼肠孤病毒2型、坦布苏病毒、禽流感病毒、鹅细小病毒和鸭肠炎病毒。这10种病毒包括RNA病毒和DNA病毒，对这10种病毒进行同时检测对于鸭病毒病的防控具有重要意义。
针对致病病毒的常见诊断方法包括病毒培养、分子诊断方法和血清学检测等。其中，病毒培养方法包括在胚胎和细胞上分离病毒；分子诊断方法包括聚合酶链式反应(PCR)、多重PCR(mPCR)和实时荧光定量PCR(qPCR)等；血清学检测方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)。在临床上，病毒分离耗时较长，且有些病毒例如鸭星状病毒的分离培养较困难；血清学检测一般是针对血清中特定病原的抗体进行检测，一般用于检测抗体水平；近年来，分子生物学技术得到了快速发展，PCR技术具有以其灵敏、快速和特异等特征得到了广泛应用。一般来讲，普通PCR技术一般只用于检测一种病毒，灵敏性一般可以检测到102～103拷贝；荧光定量PCR技术的灵敏度较高，可达到101～102拷贝，但由于荧光通道的限制，一般也只用于3种病原以下的同时检测。最近，还有研究者开发了一种基于毛细管电泳的鸭病毒检测的GeXP方法，虽然该方法所检测的病毒包括11种，但是并不包括近期比较流行的鹅细小病毒和鸭星状病毒等病毒，且该方法在11种病毒均存在的情况下灵敏度仅为103拷贝，并且在结果判断方面存在较大的人为误差。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种可同时检测十种鸭源病毒的检测试剂盒，利用该试剂盒进行鸭源病毒检测的。
本发明的另一个目的在于提供一种利用上述试剂盒进行鸭源病毒检测的方法。
为达到上述第一个目的，本发明采用下述技术方案：
一组基于定点基因质谱检测的鸭源病毒检测引物和探针，包括：
鸭甲肝病毒1型的PCR引物序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和质量探针SEQ IDNo.23；鸭甲肝病毒3型的PCR引物序列SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和质量探针SEQ IDNo.24；鸭星状病毒1型的PCR引物序列SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和质量探针SEQ IDNo.25；鸭星状病毒2型的PCR引物序列SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和质量探针SEQ IDNo.26；鸭呼肠孤病毒1型的PCR引物序列SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和质量探针SEQ IDNo.27；鸭呼肠孤病毒2型的PCR引物序列SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和质量探针SEQ IDNo.28；坦布苏病毒的PCR引物序列SEQ ID No.13、SEQ ID No.14和质量探针SEQ ID No.29；禽流感病毒的PCR引物序列SEQ ID No.15、SEQ ID No.16和质量探针SEQ ID No.30；小鹅瘟病毒的PCR引物序列SEQ ID No.17、SEQ ID No.18和质量探针SEQ ID No.31；鸭肠炎病毒的PCR引物序列SEQ ID No.19、SEQ ID No.20和质量探针SEQ ID No.32；内参基因β-actin的PCR引物序列SEQ ID No.21、SEQ ID No.22和质量探针SEQ ID No.33。
优选地，所述鸭源病毒检测试剂盒包括如上所述的鸭源病毒检测引物和探针。
优选地，PCR引物序列SEQ ID No.1-SEQ ID No.22的5’端修饰有如SEQ ID No.56所示的碱基序列。
优选地，所述鸭源病毒检测试剂盒还包括进行反转录和PCR反应所需的试剂。
为达到上述第二个目的，本发明采用下述技术方案：
一种定点基因质谱法检测鸭源病毒多重PCR产物的方法，所述方法利用如上所述的试剂盒同时检测鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)、鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)、鸭星状病毒1型(DAstV-1)、鸭星状病毒2型(DAstV-2)、鸭呼肠孤病毒1型(DRV-1)、鸭呼肠孤病毒2型(DRV-2)、坦布苏病毒(TMUV)、禽流感病毒(AIV)、小鹅瘟病毒(GPV)和鸭肠炎病毒(DEV)10种病毒和1种内参基因β-actin。
优选地，所述方法至少包括以下步骤：
利用多重PCR技术同时扩增待检样品中的十种鸭源病毒的目的基因和内参基因β-actin；
将质量探针混合并对质量探针混合物进行特异的单个碱基延伸；
利用质谱检测质量探针的单个碱基延伸产物，并对质谱检测结果进行分析。
优选地，质谱检测采用的是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)。
优选地，对质谱检测结果进行分析时使用的是
Figure GDA0003558112250000021
基因分型系统。
优选地，质量探针混合物中各个质量探针的浓度分别为：6.80μM(β-actin)、6.00μM(AIV)、7.20μM(TMUV)、13.60μM(DHAV-1)、6.00μM(GPV)、10.00μM(DRV-1)、6.80μM(DAstV-2)、7.20μM(DAstV-1)、15.60μM(DRV-2)、12.00μM(DEV)、21.60μM(DHAV-3)。
优选地，进行多重PCR扩增时，10种病毒和1种内参基因的22条PCR引物在反应体系中等摩尔混合。
本发明的有益效果如下：
为了克服现有检测方法灵敏度较低或者无法做到多重检测的缺点，本发明利用定点基因质谱检测技术，即利用
Figure GDA0003558112250000022
核酸分型系统结合多重PCR技术、质量探针延伸技术和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术建立对特定位置的碱基进行检测的技术。多重PCR可以对多靶标进行扩增以扩大目的基因数量，利用质量探针延伸技术对特异的一个碱基进行延伸，利用MALDI-TOF MS对延伸后的质量探针进行质谱检测和分析，从而判断特定位点的碱基类型。本发明提供的检测试剂盒和检测方法具有以下主要的优点。
高敏感性：本发明利用了多重PCR和质量探针延伸两轮扩增过程，将待检目标的量放大。同时，本发明使用的
Figure GDA0003558112250000031
核酸分型系统是基于新一代宽谱定量飞行时间质谱
Figure GDA0003558112250000032
平台，该平台是利用靶板和离子探测器同时接地专利技术，保证了在全靶板范围内的质量检测精度，还配备了新一代离子光学系统，实现在较大质量范围内高灵敏度检测，可使检测的灵敏度达到100～101拷贝。
高特异性：本发明利用特异性质量探针识别已扩增的DNA片段，进行单个碱基的延长，和焦磷酸测序具有类似的原理，且只延伸一个碱基，错配率低，结果分析均为软件自动分析，不存在人为误差，特异性较好。
低成本：本发明一次可同时检测10种病毒和1种内参基因，根据需要还可对检测对象进行扩增，大大降低了检测成本，可为今后的快速诊断、分子流行病学调查和病毒监测提供便利。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出本发明实施例4中优化后的10种病毒和1种内参检测结果示意图。
图2示出本发明实施例4中单个病毒和内参检测结果示意图。
图3示出本发明实施例5中敏感性实验检测结果示意图。
图4示出本发明实施例6中特异性实验检测结果示意图。
图5示出本发明实施例7中模拟临床样品检测结果示意图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
现有技术中，鸭源病毒检测的方法灵敏度较低，或者无法做到多重检测的。有鉴于此，本发明提供一种可同时检测10种鸭源病毒的基于定点基因质谱检测的鸭源病毒检测试剂盒及检测方法。
首先，本发明提供一组基于定点基因质谱检测的鸭源病毒检测引物和探针，包括：
鸭甲肝病毒1型的PCR引物序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和质量探针SEQ IDNo.23；鸭甲肝病毒3型的PCR引物序列SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和质量探针SEQ IDNo.24；鸭星状病毒1型的PCR引物序列SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和质量探针SEQ IDNo.25；鸭星状病毒2型的PCR引物序列SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和质量探针SEQ IDNo.26；鸭呼肠孤病毒1型的PCR引物序列SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和质量探针SEQ IDNo.27；鸭呼肠孤病毒2型的PCR引物序列SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和质量探针SEQ IDNo.28；坦布苏病毒的PCR引物序列SEQ ID No.13、SEQ ID No.14和质量探针SEQ ID No.29；禽流感病毒的PCR引物序列SEQ ID No.15、SEQ ID No.16和质量探针SEQ ID No.30；小鹅瘟病毒的PCR引物序列SEQ ID No.17、SEQ ID No.18和质量探针SEQ ID No.31；鸭肠炎病毒的PCR引物序列SEQ ID No.19、SEQ ID No.20和质量探针SEQ ID No.32；内参基因β-actin的PCR引物序列SEQ ID No.21、SEQ ID No.22和质量探针SEQ ID No.33。
本发明在PCR扩增片段内的保守区设计特异性检测质量探针，保证该病原的不同毒株所扩增的一个碱基相同，以达到精确诊断的目的。
此外，本发明还提供一种基于定点基因质谱检测的鸭源病毒检测试剂盒，所述鸭源病毒检测试剂盒包括如上所述的鸭源病毒检测引物和探针。
在该检测试剂盒中，优选地，PCR引物序列SEQ ID No.1-SEQ ID No.22的5’端修饰有如SEQ ID No.56所示的碱基序列(5’-ACGTTGGATG-3’)，可以避免PCR引物对检测的干扰。
进一步地，所述鸭源病毒检测试剂盒还包括完成鸭源病毒检测所需的试剂和酶，例如虾碱性磷酸酶(SAP)、RNA酶抑制剂以及反转录和PCR反应所需的试剂。
另一方面，本发明还提供一种定点基因质谱法检测鸭源病毒多重PCR产物的方法，所述方法利用如上所述的试剂盒同时检测鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)、鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)、鸭星状病毒1型(DAstV-1)、鸭星状病毒2型(DAstV-2)、鸭呼肠孤病毒1型(DRV-1)、鸭呼肠孤病毒2型(DRV-2)、坦布苏病毒(TMUV)、禽流感病毒(AIV)、小鹅瘟病毒(GPV)和鸭肠炎病毒(DEV)10种病毒和1种内参基因β-actin，检测的速度快，效率高，成本低，可为今后的快速诊断、分子流行病学调查和病毒监测提供便利。
优选地，所述方法至少包括以下步骤：
利用多重PCR技术同时扩增待检样品中的十种鸭源病毒的目的基因和内参基因β-actin；
将质量探针混合并对质量探针混合物进行特异的单个碱基延伸；
利用质谱检测质量探针的单个碱基延伸产物，并对质谱检测结果进行分析。
在多重PCR阶段，需要同时扩增10鸭源病毒和1种内参基因；在质量探针延伸阶段，需要对质量探针进行特异的单个碱基延伸，所延伸的碱基类型与需要检测的病毒或者内参一一对应；在质谱检测分析阶段，质谱图会显示出在扩增产物中是否有质量探针和延伸产物，系统软件根据谱图对检测结果进行展示，从而确定待检物中含有哪种病毒或哪几种病毒。
本领域技术人员可以理解的是，当病毒的遗传物质为RNA时，提取病毒总RNA后需要增加一步反转录的步骤，在进行临床样本检测时，可使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒同时提取DNA和RNA，再使用对DNA无影响的反转录酶进行反转录，然后再进行多重PCR、质量探针延伸以及质谱检测与分析等步骤。此外，在建立本方法时，需要确定方法的敏感性，需通过PCR技术构建含有DHAV-1、DHAV-3、DAstV-1、DAstV-2、DRV-1、DRV-2、TMUV、AIV、GPV、DEV和β-actin的重组质粒，进行定量后确定该方法的敏感性。
本发明优选实施方式中质谱检测采用的是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)，MALDI为一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定，TOF可根据离子到达检测器的飞行时间来确定离子的质荷比。本发明所采用的
Figure GDA0003558112250000051
基因分型系统，其质谱分析过程基于新一代
Figure GDA0003558112250000052
平台，该平台利用靶板和离子探测器同时接地专利技术，保证了在全靶板范围内的质量检测精度，还配备了新一代离子光学系统，实现在较大质量范围内高灵敏度检测，可使检测的灵敏度达到100～101拷贝。
进一步优选地，对质谱检测结果进行分析时使用的是
Figure GDA0003558112250000053
基因分型软件，软件界面包括靶板区、谱图区和检测信息区。该软件可完整建档，进行样本追溯，进行智能化分析谱图并给出推荐结果。
优选地，质量探针混合物中各个质量探针的浓度分别为：6.80μM(β-actin)、6.00μM(AIV)、7.20μM(TMUV)、13.60μM(DHAV-1)、6.00μM(GPV)、10.00μM(DRV-1)、6.80μM(DAstV-2)、7.20μM(DAstV-1)、15.60μM(DRV-2)、12.00μM(DEV)、21.60μM(DHAV-3)，这个浓度配比是根据不同质量探针的分子量和扩增效率，对11种质量探针的浓度进行优化得到的。
优选地，进行多重PCR扩增时，10种病毒和1种内参基因的22条PCR引物在反应体系中等摩尔混合。
本发明中以10种常见的鸭源病毒为例设计了这种检测方法，本领域技术人员也可以在本发明的基础上，利用本发明的思路对其它的鸭源病毒进行检测，本发明在此不再一一列举。
需要说明的是，本发明实施例中所使用的试剂盒和各种试剂，本领域技术人员均可以从市场上购得，生产厂家不限，能达到本发明中的目的即可。例如，本发明实施例中病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒选用的是天根生化科技(北京)有限公司的产品，本领域技术人员也可以根据实际需要选择其它公司的产品和仪器，或采用其它方法，只要能达到本发明中的实验或检测的目的即可，本发明对此不做进一步限定。
实施例1样品和毒株
本实施例使用的样品分别为：鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)C83株、鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)C-GY株、鸭星状病毒1型(DAstV-1)D17株、鸭星状病毒2型(DAstV-2)SL4株、鸭呼肠孤病毒1型(DRV-1)815-12株、鸭呼肠孤病毒2型(DRV-2)091株、坦布苏病毒(TMUV)PS株、小鹅瘟病毒(GPV)JS1株、鸭肠炎病毒(DEV)、禽流感病毒(AIV)H9N2亚型，以上样品均由中国农业大学惠赠。
实施例2引物和质量探针设计
选取DHAVs和GPV的VP1基因，DAstVs的ORF2基因，DRVs的S1片段，TMUV的NS5基因，DEV的UL6基因为靶基因，选取β-actin为内参，分别设计构建重组质粒的引物、多重PCR引物和质量探针。质量探针的分子量以及单碱基延长后的分子量详见下表1和表2，构建重组质粒的引物序列见表3。为了避免多重PCR引物对检测的干扰，可以在多重PCR引物的5’端修饰一段10nt的碱基序列ACGTTGGATG(如SEQ ID No.56所示)。按照SEQ ID No.1-SEQ ID No.56所述，将序列送至生工生物工程(上海)有限公司进行合成。
表1 PCR引物
Figure GDA0003558112250000061
表2质量探针
Figure GDA0003558112250000062
Figure GDA0003558112250000071
表3构建重组质粒的引物
Figure GDA0003558112250000072
实施例3重组质粒的构建
3.1核酸提取
采用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取病毒基因组核酸。取0.3g组织样品剪碎置于2ml研磨管中，加入5颗玻璃珠和1ml灭菌生理盐水(含有100U/ml青霉素和10mg/ml链霉素混合液)，置于研磨器(Mini Beadbeater-16)中研磨1min，冰浴1min，反复3次，制成匀浆，定容至1.5ml，置于4℃离心机12,000×g离心15min，吸取上清液备用。按照说明书的指示，通过裂解、沉淀、洗涤和洗脱等步骤提取核酸，使用Nanodrop 2000测定核酸浓度，并将核酸稀释至20-50ng/μl备用。
3.2反转录
对于本实施例中的样品，需要先进行反转录步骤，具体地，将1μl核酸与10pmol随机引物N6混合，70℃反应5min，4℃反应5min。随后加入1μl 5×Buffer，1μl dNTP Mixture(10mM each)，0.1μl RNA酶抑制剂和40U反转录酶，用DEPC水补至5μl，再置于42℃60min、94℃5min。
3.3PCR扩增
具体地，PCR反应的体系为50μl，包括5μl的反转录产物，20pmol质粒构建引物，1μldNTPs(10mM each)、10μl的5×SF Buffer、1μl的Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase(南京诺唯赞生物科技有限公司的DNA聚合酶)。PCR程序为95℃3min、35个循环(95℃15s、56℃15s，72℃30s)，72℃5min。随后使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit(北京全式金生物技术有限公司)回收目的片段，并将其连接至Blunt TOPO vectors(中美泰和生物技术(北京)有限公司)构建重组质粒，随后使用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit(北京全式金生物技术有限公司)提取含有DHAV-1、DHAV-3、DAstV-1、DAstV-2、DRV-1、DRV-2、TMUV、AIV、GPV、DEV和β-actin的重组质粒。使用Nanodrop2000测定质粒浓度，并计算拷贝数备用。
实施例4十种鸭源病毒检测方法的建立
4.1单个病毒检测方法的建立
具体地包括核酸提取、反转录、PCR扩增、酶消化、质量探针延伸和质谱检测与分析等步骤。选取实施例3中的方式进行核酸提取、反转录，以此来建立单个病毒和内参基因的检测方法。具体地，反转录体系包括1μl核酸和10pmol随机引物N6，70℃反应5min，4℃反应5min。随后加入1μl 5×Buffer，1μl dNTP Mixture(10mM each)，0.1μl RNA酶抑制剂和40U反转录酶，用DEPC水补至5μl，再置于42℃60min、94℃5min。PCR体系包括1μl反转录产物、2μl 2.5×PCR mix、1μl PCR primers(0.5μM each)和1μl ddH2O。反应程序为95℃反应15min，35个循环(95℃反应15s，56℃反应30s，72℃反应30s)，72℃延伸10min。酶消化体系包括5μl的PCR产物，0.3U的SAP，0.7μl的SAP buffer，用ddH2O补齐至7μl。在37℃消化30min，然后在85℃加热5min灭活SAP。质量探针延伸体系为10μl，包含延伸酶0.3μl，延伸因子0.7μl，质量探针1μl(10μM)，反应产物7μl。反应程序为95℃预变性10s，40个循环(95℃变性30s，37℃反应60s，72℃延伸60s)，最终72℃延伸3min。优选地，在扩增产物中加入15μlddH2O，采用树脂对该产物进行纯化，翻转30min后离心。取上清加入基质，并将样品点在聚焦靶板上，干燥后放入MALDI-TOF质谱仪中进行检测，利用
Figure GDA0003558112250000081
基因分型系统对结果进行分析。对10种病毒和1种内参基因的检测结果如图2所示，其中图2(a)～图2(k)分别表示DHAV-1、DHAV-3、DAstV-1、DAstV-2、DRV-1、DRV-2、TMUV、AIV、GPV、DEV和β-actin的质量探针延伸一个特定碱基后的峰。
4.2 10种病毒检测方法的建立和优化
为了同时检测10种病毒和1种内参基因，将11种重组质粒等体积混合，并将质粒混合物稀释至混合物中各重组质粒的浓度为104copies/μl，按照实施例4.1中的方式进行实验，建立11种目标物同时检测的方法。并根据质量探针的分子量和扩增效率，对11种质量探针的浓度进行优化，优化后的各个质量探针的浓度如下：6.80μM(β-actin)、6.00μM(AIV)、7.20μM(TMUV)、13.60μM(DHAV-1)、6.00μM(GPV)、10.00μM(DRV-1)、6.80μM(DAstV-2)、7.20μM(DAstV-1)、15.60μM(DRV-2)、12.00μM(DEV)、21.60μM(DHAV-3)。
针对10种病毒和1种内参基因的检测结果如图1所示，其中：峰1A-β-actin(3803.6)表示内参基因β-actin的质量探针SEQ ID No.33延伸一个A碱基后的峰；峰2C-AIV(3926.6)表示禽流感病毒AIV的质量探针SEQ ID No.30延伸一个C碱基后的峰；峰3G-TMUV(4327.8)表示坦布苏病毒TMUV的质量探针SEQ ID No.29延伸一个G碱基后的峰；峰4T-DHAV-1(4558)表示鸭甲肝病毒1型DHAV-1的质量探针SEQ ID No.23延伸一个T碱基后的峰；峰5A-GPV(4855.2)表示小鹅瘟病毒GPV的质量探针SEQ ID No.31延伸一个A碱基后的峰；峰6C-DRV-1(5070.4)表示呼肠孤病毒1型DRV-1的质量探针SEQ ID No.27延伸一个C碱基后的峰；峰7A-DAstV-2(5179.4)表示鸭星状病毒2型DAstV-2的质量探针SEQ ID No.26延伸一个A碱基后的峰；峰8C-DAstV-1(5409.6)表示鸭星状病毒1型DAstV-1的质量探针SEQ IDNo.26延伸一个C碱基后的峰；峰9C-DRV-2(5793.8)表示鸭呼肠孤病毒2型DRV-2的质量探针SEQ ID No.28延伸一个C碱基后的峰；峰10T-DEV(6027)表示鸭肠炎病毒DEV的质量探针SEQID No.32延伸一个T碱基后的峰；峰11C-DHAV-3(6130)表示鸭甲肝病毒3型DHAV-3的质量探针SEQ ID No.24延伸一个C碱基后的峰。
实施例5敏感性
将混合质粒进行10倍系列稀释(1010-100copies/μl)，并按照实施例4.2中的方式进行实验，从而确定该方法的敏感性。结果如图3所示，图3(a)为未进行扩增的质量探针，图3(b)～(d)分别为108、104和100copies/μl的重组质粒扩增后的结果，在将重组质粒混合物稀释至10-10时仍能检测到11种目标，对应的拷贝数分别为1.5copies(β-actin)、1.7copies(AIV)、3.9copies(TMUV)、4.0copies(DHAV-1)、3.4copies(GPV)、1.3copies(DRV-1)、2.1copies(DAstV-2)、1.3copies(DAstV-1)、3.3copies(DRV-2)、7.8copies(DEV)、和7.3copies(DHAV-3)。
实施例6特异性
为了验证该方法的特异性，分别对目标毒株和非目标的细菌进行检测，包括鸭甲肝病毒1型C83株、鸭甲肝病毒3型C-GY株、鸭星状病毒1型D17株、鸭星状病毒2型SL4株、鸭呼肠孤病毒1型815-12株、鸭呼肠孤病毒2型091株、坦布苏病毒PS株、小鹅瘟病毒JS1株、鸭肠炎病毒、禽流感病毒H9N2亚型、大肠杆菌、沙门氏菌和鸭疫里默氏杆菌。按照实施例3中的方式进行核酸提取和反转录，按照实施例4.2中的方式进行检测。结果如图4所示，图4(a)～图4(j)分别表示使用本方法对含有DHAV-1、DHAV-3、DAstV-1、DAstV-2、DRV-1、DRV-2、TMUV、AIV、GPV和DEV的样品进行检测的质谱峰。由软件分析可知，该谱图分别包含内参基因β-actin的质量探针延伸一个碱基A后的峰以及该病毒延伸一个特定碱基后的峰。图4(k)～(m)分别表示使用该方法检测大肠杆菌、沙门氏菌和鸭疫里默氏杆菌的质谱图，由软件分析可知，对着三种细菌的扩增结果均为未检出。
实施例7模拟临床样品检测
为了进一步验证该方法在临床检测中应用的可能性，本实施例采取将已有毒株样品进行混合来模拟临床样品的方式，来验证该方法在多重检测中的应用。样品(a)是指DRV-1和DRV-2的混合物，样品(b)是指DHAV-1、DHAV-3、DAstV-1和DAstV-2的混合物，样品(c)是指AIV、DRV-1、DEV和GPV的混合物，样品(d)是指10种病毒的混合物。本实施例按照实施例3中的方式进行核酸提取和反转录，按照实施例4.2中的方式进行检测。结果如图5所示，图5(a)是指检测到DRV-1、DRV-2和内参基因，图5(b)是指检测到DHAV-1、DHAV-3、DAstV-1、DAstV-2和内参基因，图5(c)是指检测到AIV、DRV-1、DEV、GPV和内参基因，图5(d)是指检测到10种病毒和内参基因。
由以上实施例可知，本发明的方法可同时检测10种鸭源病毒(DHAV-1、DHAV-3、DAstV-1、DAstV-2、DRV-1、DRV-2、TMUV、AIV、GPV和DEV)和1种内参基因β-actin，可对同一样品进行多种病毒的检测，使整体检测成本下降。该方法所检测的病毒包括DNA病毒和RNA病毒且敏感性高，针对不同病毒，该方法的敏感性分别为1.5copies(β-actin)、1.7copies(AIV)、3.9copies(TMUV)、4.0copies(DHAV-1)、3.4copies(GPV)、1.3copies(DRV-1)、2.1copies(DAstV-2)、1.3copies(DAstV-1)、3.3copies(DRV-2)、7.8copies(DEV)、和7.3copies(DHAV-3)。该方法的特异性好，不同病毒之间互不干扰，且通量较高，可为今后的快速诊断、分子流行病学调查和病毒监测提供便利。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
序列表
<110> 融智生物科技（青岛）有限公司
<120> 基于定点基因质谱检测的鸭源病毒检测试剂盒及检测方法
<130> JLC19I0044E
<160> 56
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggccaactcg accaattcct 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctggyttyt tgagacccat 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgaccrggg tcaygcatct 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgcaaycat rcadggtgtt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccgagtagg atcgagggta 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggtgattcc ayatggtcgg 20
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<211> 20
<212> DNA
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cttgtttggg cagccctttg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catcgattgt gcgctgttgt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
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ggtbsacatg gtgtttgacg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctcggrrgca acyggtatcc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgtattcact attccgccag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gctatgtcag ccataaagga 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgcaatggac ccaggtatga 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgaccattcc ccagtcagtc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctatcrtycc rtcaggcccc 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtcagaggtg acargattgg t 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtacaagacg gaggagccac 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
attrcccact ccatcggcac c 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ttcggctgct acttgcctac 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cggcatttac acgatacggc 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cagcagatgt ggatcagcaa g 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cargggtgtg ggtgttggta a 21
<210> 23
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctgttcatgt ggac 14
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tctggagaag tgattctga 19
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tccctaagca aaattga 17
<210> 26
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aatgggcacg acaaca 16
<210> 27
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agcttctctc tgtcga 16
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgccattgac gttgctat 18
<210> 29
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
agagctgtga gct 13
<210> 30
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aagccgagat cg 12
<210> 31
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctgtggcagc atctg 15
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tagctctgtc gttaccaca 19
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<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cctccattgt cc 12
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
accaaccagc taggggatga 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tgttgtggaa gtgggagcag 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
atacaagggg agtcgcacac 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ctgccaaaag tcaagccacc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
aacctctcgt ccggtttgag 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tcccgaaaac acagggcrat a 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tgcaatctac gcctccgttg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
acggtgcgtt tatcatggtg 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctttggmcaa cggacaacat t 21
<210> 43
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agaagcgaac cgckcgaata 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctcctccca agtytcgtcg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccgggaccca agcgatag 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cggctcaagt gggaatgtga 20
<210> 47
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
cccagggctg cgttactatt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agtcttctaa ccgaggtcga aa 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gracaaabcg tctacgctgc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ttcaatcacg ctgaccagga ct 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gatgactgtg tttcccatcc attg 24
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ttgccacacc accatacact 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gccatacgac aaatccaggc 20
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ctttcttggg tatggagtcc tgt 23
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ttgtagaact ttgggggcgt t 21
<210> 56
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
acgttggatg 10

Claims (10)

1.一组基于定点基因质谱检测的鸭源病毒检测引物和探针，其特征在于，包括：
鸭甲肝病毒1型的PCR引物序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和质量探针SEQ ID No.23；鸭甲肝病毒3型的PCR引物序列SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和质量探针SEQ ID No.24；鸭星状病毒1型的PCR引物序列SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和质量探针SEQ ID No.25；鸭星状病毒2型的PCR引物序列SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和质量探针SEQ ID No.26；鸭呼肠孤病毒1型的PCR引物序列SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和质量探针SEQ ID No.27；鸭呼肠孤病毒2型的PCR引物序列SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和质量探针SEQ ID No.28；坦布苏病毒的PCR引物序列SEQ ID No.13、SEQ ID No.14和质量探针SEQ ID No.29；禽流感病毒的PCR引物序列SEQ ID No.15、SEQ ID No.16和质量探针SEQ ID No.30；小鹅瘟病毒的PCR引物序列SEQID No.17、SEQ ID No.18和质量探针SEQ ID No.31；鸭肠炎病毒的PCR引物序列SEQ IDNo.19、SEQ ID No.20和质量探针SEQ ID No.32；内参基因β-actin的PCR引物序列SEQ IDNo.21、SEQ ID No.22和质量探针SEQ ID No.33。
2.一种基于定点基因质谱检测的鸭源病毒检测试剂盒，其特征在于，所述鸭源病毒检测试剂盒包括如权利要求1所述的鸭源病毒检测引物和探针。
3.根据权利要求2所述的鸭源病毒检测试剂盒，其特征在于，PCR引物序列SEQ IDNo.1-SEQ ID No.22的5’端修饰有如SEQ ID No.56所示的碱基序列。
4.根据权利要求2所述的鸭源病毒检测试剂盒，其特征在于，所述鸭源病毒检测试剂盒还包括进行反转录和PCR反应所需的试剂。
5.一种非诊断目的定点基因质谱法检测鸭源病毒多重PCR产物的方法，其特征在于，所述方法利用如权利要求2所述的试剂盒同时检测鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、鸭星状病毒1型、鸭星状病毒2型、鸭呼肠孤病毒1型、鸭呼肠孤病毒2型、坦布苏病毒、禽流感病毒、小鹅瘟病毒和鸭肠炎病毒10种病毒和1种内参基因β-actin。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法至少包括以下步骤：
利用多重PCR技术同时扩增待检样品中的十种鸭源病毒的目的基因和内参基因β-actin；
将质量探针混合并对质量探针混合物进行特异的单个碱基延伸；
利用质谱检测质量探针的单个碱基延伸产物，并对质谱检测结果进行分析。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，质谱检测采用的是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱MALDI-TOF MS。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对质谱检测结果进行分析时使用的是
Figure FDA0003558112240000011
基因分型系统。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，质量探针混合物中各个质量探针的浓度分别为：β-actin质量探针6.80μM、禽流感病毒质量探针6.00μM、坦布苏病毒质量探针7.20μM、鸭甲肝病毒1型质量探针13.60μM、小鹅瘟病毒质量探针6.00μM、鸭呼肠孤病毒1型质量探针10.00μM、鸭星状病毒2型质量探针6.80μM、鸭星状病毒1型质量探针7.20μM、鸭呼肠孤病毒2型质量探针15.60μM、鸭肠炎病毒质量探针12.00μM、鸭甲肝病毒3型质量探针21.60μM。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，进行多重PCR扩增时，10种病毒和1种内参基因的22条PCR引物在反应体系中等摩尔混合。
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