CN117431339A - 对含非洲猪瘟病毒的多种猪疫病毒同时检测引物组和方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种对含非洲猪瘟病毒的多种猪疫病毒同时检测引物组和方法。该引物组由特异性地针对非洲猪瘟病毒P72基因、猪瘟病毒5’UTR基因、猪繁殖与呼吸道综合征病毒ORF6基因、猪圆环病毒2型的Rep基因和猪伪狂犬病毒的gB基因的引物对组成。基于上述引物对，本发明建立了非洲猪瘟病毒及其他四种类症病毒的多重PCR检测方法。该方法的特异性和重复性好，对非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的最低检测限分别为1×101、1×101、1×103、1×104和1×104copies/μL；可为非洲猪瘟及其他难以临床区别的病毒性类症提供高效、快速和准确的鉴别手段。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种对含非洲猪瘟病毒的多种猪疫病毒同时检测引物组和方法。
背景技术
非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)、猪瘟病毒(Classical swinefever virus，CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)和猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)是目前国内生猪养殖和贸易过程中极具危害性的5种猪疫病病原，近年来这些病原在我国的防控形势非常严峻。
非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病和PCV2引起的猪皮炎和肾病综合征并不总是表现出典型的临床症状，而且这几种疾病的临床症状相似，容易相混淆，在疫病的早期阶段或者当少数动物受到感染时，可能很难实现临床诊断。
目前，这5种病原检测的研究多集中于血清学和分子生物学检测方法。其中ELISA、免疫层析等血清学检测方法成本低、操作简单快速，可满足大批量样本检测，但也存在特异性、敏感性相对较低的缺点，由此该方法在此类重大动物疫病种仅适用于大批量的样本筛选，而对于病原的精确定性仍需要结合其它检测方法。而PCR及荧光PCR技术在特异性、敏感性、稳定性和可定量分析等方面具有独特的优势，是目前当前国内外最常用和可靠的病原检测方法。
多重PCR在单重PCR的基础上进行改进和发展，即在同一个反应体系中加入两对以上引物，可实现对多种病原的快速精准同时检测。与单重PCR相比，多重PCR拥有单重PCR的灵敏性和特异性，又较之快捷和经济，也降低了试剂耗材及时间成本。
目前已有相关学者建立了非洲猪瘟及其1-3种病毒性类症的多重PCR检测方法，但尚未见针对非洲猪瘟病毒和上述4种类症病毒(CSFV、PRRSV、PCV2和PRV)的多重PCR检测方法。多重PCR方法的建立，不但要考虑引物的特异性等方面，还要特别考虑同一体系内各引物之间的相互干扰。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种高效同时检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的多重PCR检测引物及方法。针对非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪伪狂犬病毒(PRV)，根据Genebank发布的这五种病毒基因序列的保守序列，设计引物，建立一个简单、高效、灵敏的五重PCR检测技术体系以同时检测这五种病毒。
本发明目的之一在于：提出一种同时检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的多重PCR引物组，包括：
ASFV-F：3’-ATTTCCGTAACTGCTCAT-5’，如SEQ ID NO.1所示；
ASFV-R：3’-ACTGGGTTGGTATTCCTC-5’，如SEQ ID NO.2所示；
CSFV-F：3’-TAGTGGCGAGCTCCCTG-5’，如SEQ ID NO.3所示；
CSFV-R：3’-ATTCAACTCCATGTGCCAT-5’，如SEQ ID NO.4所示；
PRRSV-F：3’-CCGACTGCTAGGGCTTCT-5’，如SEQ ID NO.5所示；
PRRSV-R：3’-TTTCTGCCACCCAACACG-5’，如SEQ ID NO.6所示；
PCV2-F：3’-TTGTTGGCGAGGAGGGTA-5’，如SEQ ID NO.7所示；
PCV2-R：3’-TCCGTGGATTGTTCTGTAGC-5’，如SEQ ID NO.8所示；
PRV-F：3’-CCCTGAACCTGACGCTGCTC-5’，如SEQ ID NO.9所示；
PRV-R：3’-GCCTTGTGCTCCTGCTGCTC-5’，如SEQ ID NO.10所示。
优选地，引物对ASFV-F和ASFV-R的目的基因为非洲猪瘟病毒的P72基因。
优选地，引物对CSFV-F和CSFV-R的目的基因为猪瘟病毒的5’UTR基因。
优选地，引物对PRRSV-F和PRRSV-R的目的基因为猪繁殖与呼吸道综合征病毒的ORF6基因。
优选地，引物对PCV2-F和PCV2-R的目的基因为猪圆环病毒2型的Rep基因。
优选地，引物对PRV-F和PRV-R的目的基因为猪伪狂犬病毒的gB基因。
优选地，引物对ASFV-F和ASFV-R的PCR产物片段大小为168bp。
优选地，引物对CSFV-F和CSFV-R的PCR产物片段大小为248bp。
优选地，引物对PRRSV-F和PRRSV-R的PCR产物片段大小为363bp。
优选地，引物对PCV2-F和PCV2-R的PCR产物片段大小为748bp。
优选地，引物对PRV-F和PRV-R的PCR产物片段大小为550bp。
本发明目的之二在于：提出上述多重PCR引物组在制备同时检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒产品中的应用。
本发明目的之三在于：提出包含上述多重PCR引物组的试剂或试剂盒。
本发明目的之四在于：提出上述试剂或试剂盒在制备同时检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒产品中的应用。
本发明目的之五在于：提出一种同时检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的DNA或/和RNA，并将RNA反转录为cDNA；
(2)以步骤(1)所得DNA或/和cDNA为模板，采用上述多重PCR引物组进行PCR扩增；
(3)将步骤(2)所得PCR扩增产物进行凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，根据PCR扩增产物片段大小及阳性对照，判断病毒感染情况。
优选地，步骤(3)中，若PCR扩增产物片段含有168bp，则表示待测样品中含有非洲猪瘟病毒；若PCR扩增产物片段含有248bp，则表示待测样品中含有猪瘟病毒；若PCR扩增产物片段含有363bp，则表示待测样品中含有猪繁殖与呼吸道综合征病毒；若PCR扩增产物片段含有748bp，则表示待测样品中含有猪圆环病毒2型；若PCR扩增产物片段含有550bp，则表示待测样品中含有猪伪狂犬病毒。
优选地，步骤(2)中，PCR的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，50-60℃退火15s，72℃延伸10s，循环25-40次；72℃终延伸5min。
优选地，非洲猪瘟病毒的最低检测下限为1×101copies/μL；猪瘟病毒的最低检测下限为1×101copies/μL；猪繁殖与呼吸综合征病毒的最低检测下限为1×103copies/μL；猪圆环病毒2型的最低检测下限为1×104copies/μL，猪伪狂犬病毒的最低检测下限为1×104copies/μL。
本发明所提供的多重PCR引物组合可同时检测非洲猪瘟病毒和猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒，经设计和实验优化，既可保证PCR扩增时引物的特异性，又能减少同一反应体系中引物之间的相互干扰。
本发明所建立的多重PCR方法可对非洲猪瘟病毒和猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒进行快速检测，具有良好的特异性和灵敏性。
附图说明
图1是质粒标准品的PCR电泳图；其中，泳道1和泳道7为DL2000Marker，泳道2为ASFV，泳道3为CSFV，泳道4为PRRSV，泳道5为PRV，泳道6为PCV2。
图2是不同退火温度的多重PCR扩增结果；其中，泳道1为DL2000Marker，泳道2为50℃，泳道3为52℃，泳道4为54℃，泳道5为56℃，泳道6为58℃，泳道7为60℃；
图3是PCR引物浓度优化的PCR电泳图；其中，泳道1和泳道8为DL2000Marker，而泳道2-7依次对应引物终浓度分别为0.2、0.24、0.28、0.32、0.36和0.4pmol/μL。
图4是多重PCR循环数优化的PCR电泳图；其中，泳道1为DL2000Marker，泳道2-5依次为循环数为25、30、35、40。
图5是多重PCR特异性试验的PCR电泳图；其中，泳道1为DL2000Marker，泳道2为ASFV、CSFV、PRRSV、PCV2、PRV，泳道3为PCV2，泳道4为PRV，泳道5为PRRSV，泳道6为CSFV，泳道7为ASFV，泳道8为PEDV，泳道9为TGEV，泳道10为PPV，泳道11为阴性对照；
图6是多重PCR灵敏性试验的PCR电泳图；其中，泳道1和泳道10为DL2000Marker，泳道2-9依次为标准质粒浓度101～108copies/μL。
图7是多重PCR重复性性试验的PCR电泳图；其中，泳道1为DL2000Marker，泳道2-4为1010copies/μL，泳道5-7为108copies/μL，泳道8-10为106copies/μL。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
引物设计与合成
下载NCBI已发布的非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪伪狂犬病毒(PRV)的基因序列，通过DNAstar进行比对找到高度保守区，根据ASFV的P72基因、CSFV的5’UTR基因、PRRSV的ORF6基因、PCV2的Rep基因和PRV的gB基因保守区设计特异性引物，引物均由通用生物公司合成。引物及相关信息见表1。
表1 ASFV、CSFV、PRRSV、PCV2、PRV多重PCR引物
实施例2
非洲猪瘟病毒及其四种类症病毒的多重PCR检测方法
(1)质粒标准品的构建
利用实施例1设计的CSFV、PRRSV、PCV2、PRV引物，自疫苗和样品中扩增相应基因片段，合成ASFV的P72基因中168bp的基因片段，连接pMD19-T克隆载体，转化，将过夜培养的菌液提取质粒作为模板进行普通PCR检测，结果均为预期大小目的片段(如图1所示)。
将所得阳性质粒送测序，基因序列在BLAST(NCBI)中比对，结果显示与相对应目的基因的标准序列同源性均为100％，用核酸蛋白分析仪测定质粒浓度，经计算后ASFV拷贝数为3.38×1010copies/μL、CSFV拷贝数为2.14×1010copies/μL，PRRSV拷贝数为2.23×1010copies/μL，PCV2拷贝数为4.48×1010copies/μL，PRV拷贝数为2.11×1010copies/μL。
(2)多重PCR退火温度优化
分别以50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃六个不同退火温度对ASFV、CSFV、PRRSV、PCV2、PRV多重PCR退火温度优化，结果如图2所示。
以上退火温度均可扩增出明亮条带，经过对比分析，其中泳道4所获得的PCR产物浓度最高，因此54℃为最佳退火温度。
(3)多重PCR引物浓度优化
分别以0.2pmol/μL、0.24pmol/μL、0.28pmol/μL、0.32pmol/μL、0.36pmol/μL、0.4pmol/μL六个不同引物终浓度进行ASFV、CSFV、PRRSV、PCV2、PRV多重PCR引物浓度优化，结果如图3所示。
以上引物浓度均可扩增出明亮条带，为了节约试剂成本，选择0.2pmol/μL作为最佳引物浓度。
(4)多重PCR循环数优化
固定最佳引物浓度和退火温度，其他条件不变，将循环数分别设置为25、30、35、40个循环，进行多重PCR循环数的优化，结果如图4所示。
当循环数为30时，扩增的条带清晰且节约时间。
(5)多重PCR特异性试验
分别对ASFV、CSFV、PRRSV、PCV2、PRV以及PEDV(猪流行性腹泻病毒)、TGEV(猪传染性胃肠炎病毒)、PPV(猪细小病毒)进行特异性检验，以ddH2O作为阴性对照。
结果如图5所示，五种靶标模板(ASFV、CSFV、PRRSV、PCV2、PRV)可扩增出阳性条带，而对PEDV、TGEV、PPV不能扩增出阳性条带，表明无交叉反应。
(6)多重PCR灵敏性试验
分别将10倍梯度稀释的ASFV、CSFV、PRRSV、PCV2、PRV五个标准质粒进行同浓度梯度的等比例混合，进行敏感性试验。
结果如图6所示，ASFV的最低检测下限为1×101copies/μL；CSFV最低检测下限为1×101copies/μL；PRRSV最低检测下限为1×103copies/μL；PCV2最低检测下限为1×104copies/μL，PRV最低检测下限为1×104copies/μL。
(7)多重PCR重复性性试验
选取1010、108、106copies/μL三个不同浓度的标准质粒作为模板，其他条件不变，进行重复试验。
结果如图7所示，三个不同浓度均可扩增出清晰均匀的条带，表明该方法的重复性良好。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种同时检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的多重PCR引物组，其特征在于，包括：
ASFV-F：3’-ATTTCCGTAACTGCTCAT-5’，如SEQ ID NO.1所示；
ASFV-R：3’-ACTGGGTTGGTATTCCTC-5’，如SEQ ID NO.2所示；
CSFV-F：3’-TAGTGGCGAGCTCCCTG-5’，如SEQ ID NO.3所示；
CSFV-R：3’-ATTCAACTCCATGTGCCAT-5’，如SEQ ID NO.4所示；
PRRSV-F：3’-CCGACTGCTAGGGCTTCT-5’，如SEQ ID NO.5所示；
PRRSV-R：3’-TTTCTGCCACCCAACACG-5’，如SEQ ID NO.6所示；
PCV2-F：3’-TTGTTGGCGAGGAGGGTA-5’，如SEQ ID NO.7所示；
PCV2-R：3’-TCCGTGGATTGTTCTGTAGC-5’，如SEQ ID NO.8所示；
PRV-F：3’-CCCTGAACCTGACGCTGCTC-5’，如SEQ ID NO.9所示；
PRV-R：3’-GCCTTGTGCTCCTGCTGCTC-5’，如SEQ ID NO.10所示。
2.根据权利要求1所示多重PCR引物组，其特征在于，引物对ASFV-F和ASFV-R的目的基因为非洲猪瘟病毒的P72基因；
引物对CSFV-F和CSFV-R的目的基因为猪瘟病毒的5’UTR基因；
引物对PRRSV-F和PRRSV-R的目的基因为猪繁殖与呼吸道综合征病毒的ORF6基因；
引物对PCV2-F和PCV2-R的目的基因为猪圆环病毒2型的Rep基因；
引物对PRV-F和PRV-R的目的基因为猪伪狂犬病毒的gB基因。
3.根据权利要求1所示多重PCR引物组，其特征在于，引物对ASFV-F和ASFV-R的PCR产物片段大小为168bp；引物对CSFV-F和CSFV-R的PCR产物片段大小为248bp；引物对PRRSV-F和PRRSV-R的PCR产物片段大小为363bp；引物对PCV2-F和PCV2-R的PCR产物片段大小为748bp；引物对PRV-F和PRV-R的PCR产物片段大小为550bp。
4.如权利要求1-3任一项所述多重PCR引物组在制备同时检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒产品中的应用。
5.一种包含如权利要求1-3任一项所述多重PCR引物组的试剂或试剂盒。
6.如权利要求5所述试剂或试剂盒在制备同时检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒产品中的应用。
7.一种同时检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的DNA或/和RNA，并将RNA反转录为cDNA；
(2)以步骤(1)所得DNA或/和cDNA为模板，采用权利要求1-3任一项所述多重PCR引物组进行PCR扩增；
(3)将步骤(2)所得PCR扩增产物进行凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，根据PCR扩增产物片段大小及阳性对照，判断病毒感染情况。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤(3)中，若PCR扩增产物片段含有168bp，则表示待测样品中含有非洲猪瘟病毒；若PCR扩增产物片段含有248bp，则表示待测样品中含有猪瘟病毒；若PCR扩增产物片段含有363bp，则表示待测样品中含有猪繁殖与呼吸道综合征病毒；若PCR扩增产物片段含有748bp，则表示待测样品中含有猪圆环病毒2型；若PCR扩增产物片段含有550bp，则表示待测样品中含有猪伪狂犬病毒。
9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，50-60℃退火15s，72℃延伸10s，循环25-40次；72℃终延伸5min。
10.根据权利要求7所述方法，其特征在于，非洲猪瘟病毒的最低检测下限为1×101copies/μL；猪瘟病毒的最低检测下限为1×101copies/μL；猪繁殖与呼吸综合征病毒的最低检测下限为1×103copies/μL；猪圆环病毒2型的最低检测下限为1×104copies/μL，猪伪狂犬病毒的最低检测下限为1×104copies/μL。
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