CN103773899A

CN103773899A - 鉴别11种鸭病毒病的GeXP检测试剂盒

Info

Publication number: CN103773899A
Application number: CN201410037453.1A
Authority: CN
Inventors: 谢芝勋; 张艳芳; 谢丽基; 刘加波; 庞耀珊; 范晴; 罗思思; 邓显文; 谢志勤
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2014-01-26
Filing date: 2014-01-26
Publication date: 2014-05-07
Anticipated expiration: 2034-01-26
Also published as: US9637801B2; WO2015109427A1; CN103773899B; US20160060716A1

Abstract

本发明公开了一种鉴别11种鸭病毒病的GeXP检测试剂盒。本发明提供了鉴定或辅助鉴定鸭传染病病原体的GeXP检测的引物组，由引物对A、引物对B、引物对C、引物对D、引物对E、引物对F、引物对G、引物对H、引物对I、引物对J、引物对K和引物对L组成；本发明的实验证明，本发明提供的引物组、PCR试剂、引物对，用于同时鉴别检测禽流感病毒、H5、H7和H9亚型禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒和鸭圆环病毒，特异性好，灵敏度高。本发明为常见的主要鸭传染性疾病病原体的检测提供了简便、高通量的检测试剂盒和检测体系，更符合实际的需要，应用前景广阔。

Description

鉴别11种鸭病毒病的GeXP检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及鉴别11种鸭病毒病的GeXP检测试剂盒。

背景技术

H5、H7和H9亚型禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒和鸭圆环病毒是严重危害鸭的11种主要传染性疾病。随着养鸭业的发展，鸭传染性病毒病的发病率也在逐渐升高，已成为限制养鸭业发展的一大重要因素。鉴别诊断这些鸭传染性疾病的传统方法，主要包括病原分离鉴定和血清学试验等，但这些方法常受临床病料新鲜度、污染程度或病程的限制，操作也十分繁琐、费时，对多重混合感染的鉴别诊断就更为困难。近年来，随着分子生物学的发展，PCR技术已被广泛应用于这些鸭传染病的检测，并建立了多重PCR检测技术，同时检测几种病原，但需几对引物组合在一起同时竞争地扩增，引物之间会产生相互干扰，多增加一对引物，敏感性就越低。PCR产物需通过琼脂糖电泳才可观察结果，该电泳难以区分50bp-100bp以内的条带，一般只可做到2-4重PCR，难以达到高通量的检测。多重荧光PCR一般只检测到3重，由于探针要标记不同发光波长的荧光基团，如标记太多的荧光基团，相互会产生干扰，因此，也只能检测到2-4重。由于在多重PCR反应体系中同时存在几对引物，使得形成复杂引物二聚体的概率大大增加，同时检测的目的基因数量有限（多在2-4个基因），使得多重PCR还达不到高通量快速检测和分析的目的。

GeXP系统(Gene Expression Profiler Genetic Analysis System)是美国BeckmanCoulter公司研发的用于研究多基因表达定量分析的平台，由两部分组成：用于设计引物的GeXP eXpression Profiler软件和用于结果分析的GenomeLabTM GeXPGenetic Analysis System毛细管电泳仪，后者可清晰分离出相差7bp以上的相邻扩增片段。GeXP多重PCR扩增采用荧光标记通用引物和特异性嵌合引物（即基因特异性引物5’端连接通用引物序列）相结合引发多重体系扩增。PCR反应之初，先由反向特异性嵌合引物与原始模板结合进行逆转录反应，再由正向特异性嵌合引物合成cDNA的第二链，此后，由正、反向嵌合引物的特异性序列以cDNA为模板启动PCR反应，分别扩增出通用引物的互补序列；再由反应体系中占主导地位的荧光标记通用引物，与其互补序列结合，引发后续扩增,通用引物与反应体系中带有荧光标记的碱基序列互补，PCR产物经GeXP毛细管电泳分离，含有荧光标记的PCR产物经GeXP检测窗口检测，依据检测片段与标准分子片段（DNA Size Standard,DSS）迁移时间计算出扩增片段的长度，荧光信号强度代表该分离片段的扩增含量。GeXP系统可在同一个体系里对多达40个目的基因进行有效分析。

利用GeXP多重基因表达遗传分析系统，建立一种能同时鉴别多种病原体的检测方法和检测试剂盒，关键是设计特异性引物，将多重引物组合，利用通用引物，把多重引物的扩增转化为1对通用引物的扩增，从而达到高通量检测的目的。目前，还没有基于GeXP系统的同时可检测鸭源多种传染性疾病病原体的试剂或试剂盒。

发明内容

本发明的一个目的是提供鉴定或辅助鉴定鸭传染病病原体的GeXP检测引物组。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定鸭传染病病原体的GeXP检测引物组，由单独使用的引物对A、引物对B、引物对C、引物对D、引物对E、引物对F、引物对G、引物对H、引物对I、引物对J、引物对K和引物对L组成；

所述引物对A由序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成；

所述引物对B由序列表序列3所示的单链DNA和序列表序列4所示的单链DNA组成；

所述引物对C由序列表序列5所示的单链DNA和序列表序列6所示的单链DNA组成；

所述引物对D由序列表序列7所示的单链DNA和序列表序列8所示的单链DNA组成；

所述引物对E由序列表序列9所示的单链DNA和序列表序列10所示的单链DNA组成；

所述引物对F由序列表序列11所示的单链DNA和序列表序列12所示的单链DNA组成；

所述引物对G由序列表序列13所示的单链DNA和序列表序列14所示的单链DNA组成；

所述引物对H由序列表序列15所示的单链DNA和序列表序列16所示的单链DNA组成；

所述引物对I由序列表序列17所示的单链DNA和序列表序列18所示的单链DNA组成；

所述引物对J由序列表序列19所示的单链DNA和序列表序列20所示的单链DNA组成；

所述引物对K由序列表序列21所示的单链DNA和序列表序列22所示的单链DNA组成；

所述引物对L由序列表序列23所示的单链DNA和序列表序列24所示的单链DNA组成。

上述引物组中，所述引物对A、引物对B、引物对C、引物对D、引物对E、引物对F、引物对G、引物对H、引物对I、引物对J、引物对K和引物对L中的各条引物为等摩尔混合；

所述鸭传染病病原体为H5亚型禽流感病毒、H7亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒和/或鸭圆环病毒。

本发明的另一个目的是提供鉴定或辅助鉴定鸭传染病病原体的GeXP检测PCR试剂。

本发明提供的GeXP检测PCR试剂，包括上述的引物组。

上述PCR试剂由PCR扩增缓冲液、上述的引物组中的引物对A-L、MgCl₂、DNA聚合酶和水组成；

所述引物对A-L中的各条引物在所述PCR试剂中的浓度为10nM。

上述PCR试剂中，

本发明的第三个目的是提供鉴定或辅助鉴定鸭传染病病原体的GeXP检测试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述的PCR试剂。

上述试剂盒中，所述鸭传染病病原体为H5亚型禽流感病毒、H7亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒和/或鸭圆环病毒。

上述的引物组或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在制备利用GeXP检测鉴定或辅助鉴定待测样本是否含有鸭传染病病原体的产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述鸭传染病病原体为H5亚型禽流感病毒、H7亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒和/或鸭圆环病毒。

本发明所提供的试剂或试剂盒中的引物对可检测的病原体种类分别如下：引物对A可检测16种HA亚型禽流感病毒，即H1—H16亚型的禽流感病毒；引物对B可检测H5亚型禽流感病毒；引物对C可检测H7亚型禽流感病毒；引物对D可检测H9亚型禽流感病毒；引物对E可检测鸭肝炎病毒；引物对F可检测鸭瘟病毒；引物对G可检测鸭黄病毒；引物对H可检测新城疫病毒；引物对I可检测减蛋综合征病毒；引物对J可检测番鸭呼肠孤病毒；引物对K可检测番鸭细小病毒；引物对L可检测鸭圆环病毒。

所述禽源具体可为鸡源或鸭源，但不限于上述病毒的上述来源。

本发明的实验证明，使用本发明所提供的基于GeXP系统的试剂或试剂盒中的12种引物对同时检测禽流感病毒、H5、H7和H9亚型禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒和鸭圆环病毒的特异性强，灵敏度分别为10拷贝/μl、100拷贝/μl、100拷贝/μl、100拷贝/μl、10拷贝/μl、100拷贝/μl、10拷贝/μl、10拷贝/μl、100拷贝/μl、10拷贝/μl、100拷贝/μl、100拷贝/μl，与病毒分离和血凝抑制实验等常规实验方法的鉴定结果相比，符合率达100%。本发明为常见的主要鸭常见传染病及其病原体的检测提供了简便、高通量的检测试剂盒和检测体系，更符合实际的需要，应用前景广阔。

附图说明

图1为H5、H7、H9亚型禽流感病毒cDNA混合模板的GeXP十二重PCR的毛细管电泳分析图。

图2为H5亚型禽流感病毒cDNA、鸭黄病毒cDNA、减蛋综合征病毒DNA、鸭瘟病毒DNA和新城疫病毒cDNA混合模板的GeXP十二重PCR的毛细管电泳分析图。

图3为11种鸭传染性疾病病原的GeXP十二重PCR的毛细管电泳分析图。

图1-3中，横坐标为PCR扩增产物的碱基数，纵坐标为荧光信号值。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用一些材料和试剂如下：

禽流感病毒毒株：Duck/HK/717/79-d1（H1N3亚型）、Duck/HK/77/76（H2N3亚型）、Duck/HK/526/79/2B（H3N6亚型）、Duck/HK/668/79（H4N5亚型）、Duck/HK/531/79（H6N8亚型）、Turkey/ont/6118/68（H8N4亚型）、Duck/Guangxi/1/00（H9N2亚型）、Duck/HK/876/80（H10N3亚型）、Duck/HK/661/79（H11N3亚型）、Duck/HK/862/80（H12N5亚型）、Gull/MD/704/77（H13N5亚型）均记载在“Zhixun Xie,Yao-shan Pang,JiaboLiu,et al.A multiplex RT-PCR for detection of type A influenza virus anddifferentiation of avian H5,H7,and H9hemagglutinin subtypes”，Molecular andCellular Probes,2006,20(3-4):245-249，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

禽流感病毒毒株Duck/HK/313/78（H5N3亚型）和Duck/HK/47/76（H7N2亚型）均记载在“同时鉴别六种鸡病毒性呼吸道病GeXP检测方法的建立”，病毒学报，2013,2（3）：250-257，由香港大学惠赠，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；分别是以cDNA形式留存的样品，并已经HA基因测序证实。

鸭肝炎病毒AV2111株购自中国兽医药品监察所；

鸭瘟病毒AV1221株购自中国兽医药品监察所；

鸭黄病毒记载在“4株广西鸭源坦布苏病毒分离及初步鉴定”，中国动物检疫，2013，30(6):31-35，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

新城疫病毒记载在“新城疫植物油乳剂苗的研究”，中国预防兽医学报，2000，(04):23-27，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

减蛋综合症病毒记载在“减蛋综合症植物油乳剂苗的研究”，中国预防兽医学报，2000，(04):23-27,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

番鸭呼肠孤病毒记载在“番鸭花肝病的病原研究”，中国兽医科技，2003，33（5）:7-9，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

番鸭细小病毒记载在“广西番鸭细小病毒的分离和鉴定”，广西畜牧兽医，2002，18(6):5-7，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

鸭圆环病毒记载在“广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查”，中国畜牧兽医，2010，37（11):156-158，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

实施例1、引物对的设计

以GenBank公布的引物序列为参考，从NCBI上下载已知序列使用DNASTAR软件进行序列比对，选取针对各个靶基因高度保守与特异的基因片段，由primer premier5.0软件设计了12种特异性引物，并在引物的5’端添加GeXP通用引物（下划线标出的序列），引物方向均为从5’-3’端，具体如下：

1）、以禽流感病毒(AIV)M基因为靶基因的引物对A：

AIV-F:AGGTGACACTATAGAATACAGAAACGGATGGGAGTGC（序列表序列1）；

AIV-R:GTACGACTCACTATAGGGATATCAAGTGCAAGATCCCAATGAT（序列表序列2）；

预计扩增产物长度（即目的峰位置）为122bp；

2）、以H5亚型禽流感病毒(AIV-H5)HA基因为靶基因的引物对B：

AIV-H5-F:AGGTGACACTATAGAATACTTCAGGCATCAAAATGCACA（序列表序列3序列）；

AIV-H5-R:GTACGACTCACTATAGGGATAGTTTGTTCATTTCTGAGTCGGTC（序列表序列4序列）；

预计扩增产物长度（即目的峰位置）为286bp；

3）、以H7亚型禽流感病毒(AIV-H7)HA基因为靶基因的引物对C：

AIV-H7-F:AGGTGACACTATAGAATAAATGGGGCHTTCATAGCTCC（序列表序列5序列）；

AIV-H7-R:GTACGACTCACTATAGGGATGATAGCARTCRCCTTCACAA（序列表序列6序列，其中的R为兼并碱基，代表A或G）；

预计扩增产物长度（即目的峰位置）为144bp；

4）、以H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)HA基因为靶基因的引物对D：

AIV-H9-F:AGGTGACACTATAGAATAACAACAAGTGTGACAACAGAAGA（序列表序列7序列）；

AIV-H9-R:GTACGACTCACTATAGGGATCTTCCGTGGCTCTCTCC（序列表序列8序列）；

预计扩增产物长度（即目的峰位置）为237bp；

5）、以鸭肝炎病毒(DHV)5'UTR区域为靶基因的引物对E：

DHV-F:AGGTGACACTATAGAATATCTTCGTTGTGAAACGGATTACC（序列表序列9序列）；

DHV-R:GTACGACTCACTATAGGGATGCCTGGACAGATDTGTGCCTACT（序列表序列10序列，其中的D为兼并碱基，代表A或G或T）；

预计扩增产物长度（即目的峰位置）为133bp；

6）、以鸭瘟病毒(DPV)UL6基因为靶基因的引物对F：

DPV-F:AGGTGACACTATAGAATAGGGAGGAGCAAACAAAGA（序列表序列11序列）；

DPV-R:GTACGACTCACTATAGGGAATCGCAAATTCCATCACATA（序列表序列12序列）；

预计扩增产物长度（即目的峰位置）为151bp；

7）、以鸭黄病毒（BYD）E基因为靶基因的引物对G：

BYD-F:AGGTGACACTATAGAATAATGGACAGGGTCATCAGCGG（序列表序列13序列）；

BYD-R:GTACGACTCACTATAGGGAGAATRGCTCCYGCCAATGCT（序列表序列14序列,其中的R为兼并碱基，代表A或G；Y为兼并碱基，代表C或T）；

预计扩增产物长度（即目的峰位置）为177bp；

8）、以新城疫病毒(ND)L基因为靶基因的引物对H：

ND-F:AGGTGACACTATAGAATAGTRGCAGCAAGRACAAGG（序列表序列15序列，其中的R为兼并碱基，代表A或G）；

ND-R:GTACGACTCACTATAGGGACATATCYGCATACATCAA（序列表序列16序列,其中的Y为兼并碱基，代表C或T）；

预计扩增产物长度（即目的峰位置）为196bp；

9）、以减蛋综合征病毒(EDSV)penton基因为靶基因的引物对I：

EDSV-F:AGGTGACACTATAGAATAAATCGGCAACTCAAGACATC（序列表序列17序列）；

EDSV-R:GTACGACTCACTATAGGGACCCATTCATAAACAGGATTC（序列表序列18序列）；

预计扩增产物长度（即目的峰位置）为208bp；

10)、以番鸭呼肠孤病毒(MDRV)S1基因为靶基因的引物对J：

MDRV-F:AGGTGACACTATAGAATACAGTTGAGCCGGAYGGTAATT（序列表序列19序列，其中的Y为兼并碱基，代表C或T）；

MDRV-R:GTACGACTCACTATAGGGAACTCGGTTGGTGTTAGTVGCVTAGAA（序列表序列20序列,其中的V为兼并碱基，代表A或G或C）；

预计扩增产物长度（即目的峰位置）为218bp；

11）、以番鸭细小病毒（MDPV）VP1基因为靶基因的引物对L：

MDPV-F:AGGTGACACTATAGAATACTTTCAGGCTACATCTTCAA（序列表序列21序列）；

MDPV-R:GTACGACTCACTATAGGGAAATTCTCTTTTCACCCATCC（序列表序列22序列）；

预计扩增产物长度（即目的峰位置）为253bp；

12)、以鸭圆环病毒（DuCV）REP基因为靶基因的引物对L：

DuCV-F:AGGTGACACTATAGAATATGCKCCAAAGAGTCGACATA（序列表序列23序列，其中的K为兼并碱基，代表T或G）；

DuCV-R:GTACGACTCACTATAGGGACAAAYGCATAACGGCTCTTTCC（序列表序列24序列，其中的Y为兼并碱基，代表C或T）；

预计扩增产物长度（即目的峰位置）为300bp；

根据实际检测的病原体的毒株不同以及GeXP系统如GenomeLabTM GeXP GeneticAnalysis System毛细管电泳仪的误差，使用上述引物对A—L及GeXP通用引物对检测获得的实际扩增产物长度可在预计扩增产物的长度基础上上下波动3bp。

实施例2、引物对的特异性检测

一、模板的制备

1、病毒RNA提取及cDNA的获得

1）病毒RNA提取

使用DNA/RNA提取试剂盒（均购自北京全式金生物技术有限公司，目录号为ER201），按照试剂盒说明书，分别以下提取病毒的RNA（以提取阴性鸭胚尿囊液获得的样品为阴性对照样品）：禽流感病毒毒株：Duck/HK/717/79-d1（H1N3亚型）、Duck/HK/77/76（H2N3亚型）、Duck/HK/526/79/2B（H3N6亚型）、Duck/HK/668/79（H4N5亚型）、Duck/HK/531/79（H6N8亚型）、Turkey/ont/6118/68（H8N4亚型）、Duck/Guangxi/1/00（H9N2亚型）、Duck/HK/876/80（H10N3亚型）、Duck/HK/661/79（H11N3亚型）、Duck/HK/862/80（H12N5亚型）、Gull/MD/704/77（H13N5亚型）；鸭肝炎病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、番鸭呼肠孤病毒。

2）cDNA的获得

将步骤1）获得的RNA样品分别按照如下反应体系和反应条件进行反转录，得到cDNA；以DEPC水作为总RNA的对照。

反应体系（20μL）：5×Reverse Transcriptase Buffer4μL,Random Primer(9mer)50pmol、dNTP Mixture(10mM)2μL,Ribonuclease Inhibitor20U,AMV ReverseTranscriptase,模板RNA1μg，DEPC水补足至20μL。

用反转录试剂Random Primer(9mer)、dNTP Mixture、Ribonuclease Inhibitor、Reverse Transcriptase XL(AMV)（均购自大连TaKaRa公司，目录号分别为D3802、D4030RA、D2313A、D2620）。

反应条件：抽提的总RNA加完DEPC水和Random Primer(9mer)后，瞬离，70℃10min后立即冰浴5min。加完其余四样后，瞬离，42℃1.5h，置于-20℃保存。

3）禽流感病毒毒株Duck/HK/313/78（H5N3亚型）和Duck/HK/47/76（H7N2亚型）分别是以cDNA形式留存的样品，并已经HA基因测序证实。

2、基因组DNA的提取

使用DNA/RNA提取试剂盒（均购自北京全式金生物技术有限公司，目录号为ER201），按照试剂盒说明书，分别从减蛋综合征病毒、鸭瘟病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒提取病毒基因组DNA（以提取阴性鸭胚尿囊液获得的样品为阴性对照样品）。

3、测定核酸含量

用核酸蛋白分析仪BioPhotometer测定其OD值，得出其浓度与纯度值，并以此控制核酸质量。

二、各引物对单重PCR的特异性检测

1、引物对A的特异性检测

1）PCR扩增

用引物对A对步骤一中1获得的Duck/HK/717/79-d1（H1N3亚型）、Duck/HK/77/76（H2N3亚型）、Duck/HK/526/79/2B（H3N6亚型）、Duck/HK/668/79（H4N5亚型）、Duck/HK/531/79（H6N8亚型）、Turkey/ont/6118/68（H8N4亚型）、Duck/Guangxi/1/00（H9N2亚型）、Duck/HK/876/80（H10N3亚型）、Duck/HK/661/79（H11N3亚型）、Duck/HK/862/80（H12N5亚型）、Gull/MD/704/77（H13N5亚型）及Duck/HK/313/78（H5N3亚型）和Duck/HK/47/76（H7N2亚型）13种HA亚型禽流感病毒毒株、鸭肝炎病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、番鸭呼肠孤病毒的cDNA样品以及步骤一中2获得的减蛋综合征病毒、鸭瘟病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的DNA样品分别进行PCR扩增，以步骤一获得的阴性鸭胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序如下：

反应体系（20μL）：GenomeLabTM GeXP Start Kit5×PCR Buffer(含GeXP通用引物对，美国贝克曼公司，PN A85017)4μL,引物对A（每条引物在反应体系中的终浓度为10nM）、25mM MgCl₂4μL(美国贝克曼公司,PN A25395)、JumpStart Taq DNAPolymerase1.4μL(美国SIGMA公司,D4184),模板cDNA或DNA0.5pg-0.5μg,加灭菌水至20μL。每个cDNA/DNA设置3个重复。

反应程序：95℃30s，55℃30s，72℃30s，10个循环；95℃30s，63℃30s，72℃30s，10个循环；95℃30s，50℃30s，72℃30s，20个循环；4℃终止。

2）毛细管电泳

使用GenomeLab GeXP遗传分析系统对步骤1）的各PCR产物同时进行毛细管电泳检测，操作步骤如下：用甲酰胺为上样缓冲液（美国贝克曼库尔特公司,目录编号608082），DNA size standard Kit-400Base Pairs（美国贝克曼库尔特公司,目录编号608098）与上样缓冲液按体积比1:（80-160）彻底混匀，在样品板上每孔加入39μL混匀好的液体，用PCR产物进行10-100倍稀释，取稀释后的产物1μL加至样品板，吹打混匀，最后在每孔滴入一滴石蜡油封闭，以免甲酰胺氧化和样品蒸发。在缓冲液板上每孔加入2/3的缓冲液，进行毛细管电泳。毛细管电泳的条件如下：毛细管升温：温度50℃；变性：90℃,120s；注入样品：2.0KV，30s；分离：6.0KV，35min。利用GenomeLab GeXP遗传分析系统分析检测结果。

结果：13种HA亚型禽流感病毒毒株的cDNA样品均可扩增得到120bp-123bp的扩增产物，经测序证实，13种亚型扩增产物大小均为122bp，该扩增产物的序列为引物对A的靶序列；非禽流感病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对A的特异性很好，可特异检出13种HA亚型（H1—H13亚型）的禽流感病毒。另外，将引物对A的序列与H14、H15、H16亚型禽流感病毒的RNA序列进行NCBI BLASA比对，同源性很高，如引物对A的序列与H14N6（登录号：CY005394）、H14N5（登录号为：CY014605）、H14N5（登录号为：GU052253）、H15N9（登录号CY077617）、H15N6（登录号为：GU052261）、H15N9（登录号为：CY005406）、H16N3（登录号为：HM060055）的靶引物序列同源性均为100.00%，说明引物对A也可检出H14、H15、H16亚型禽流感病毒。

2、引物对B的特异性检测

1）PCR扩增

用引物对B对步骤一中1的H5亚型（H5N3）禽流感病毒毒株的cDNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一获得的H7N2和H9N2亚型禽流感病毒毒株、鸭肝炎病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、番鸭呼肠孤病毒的cDNA样品以及步骤一中2获得的减蛋综合征病毒、鸭瘟病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的DNA样品，以步骤一获得的阴性鸭胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序与步骤1中1）方法相同。

2）毛细管电泳

与步骤1中2）方法相同。

结果：2种H5亚型禽流感病毒毒株的cDNA样品可扩增得到285—287bp的扩增产物，经测序证实，H5N3的扩增产物大小为286bp；扩增产物的序列为引物对B的靶序列；非H5亚型禽流感病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对B的特异性很好，可以特异检出H5亚型禽流感病毒。

3、引物对C的特异性检测

1）PCR扩增

用引物对C对步骤一中1的H7亚型（H7N2）禽流感病毒毒株的cDNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一获得的H5N3和H9N2亚型禽流感病毒毒株、鸭肝炎病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、番鸭呼肠孤病毒的cDNA样品以及步骤一中2获得的减蛋综合征病毒、鸭瘟病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的DNA样品，以步骤一获得的阴性鸭胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序与步骤1中1）方法相同。

2）毛细管电泳

与步骤1中2）方法相同。

结果：H7亚型禽流感病毒毒株的cDNA样品可扩增得到142—145bp的扩增产物，经测序证实，H7N2的扩增产物大小为144bp，该扩增产物的序列为引物对C的靶序列；非H7亚型禽流感病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对C的特异性很好，可以特异检出H7亚型禽流感病毒。

4、引物对D的特异性检测

1）PCR扩增

用引物对D对步骤一中1的H9亚型（H9N2）禽流感病毒毒株的cDNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一获得的H5N3和H7N2亚型禽流感病毒毒株、鸭肝炎病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、番鸭呼肠孤病毒的cDNA样品以及步骤一中2获得的减蛋综合征病毒、鸭瘟病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的DNA样品，以步骤一获得的阴性鸭胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序与步骤1中1）方法相同。

2）毛细管电泳

与步骤1中2）方法相同。

结果：H9亚型禽流感病毒毒株的cDNA样品可扩增得到236-239bp的扩增产物，经测序证实，H9N2的扩增产物大小为237bp，扩增产物的序列为引物对D的靶序列；非H9亚型禽流感病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对D的特异性很好，可以特异检出H9亚型禽流感病毒。

5、引物对E的特异性检测

1）PCR扩增

用引物对E对步骤一中2的鸭肝炎病毒的cDNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一获得的H5N3、H7N2和H9N2亚型禽流感病毒毒株、鸭黄病毒、新城疫病毒、番鸭呼肠孤病毒的cDNA样品以及步骤一中2获得的减蛋综合征病毒、鸭瘟病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的DNA样品，以步骤一获得的阴性鸭胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序与步骤1中1）方法相同。

2）毛细管电泳

与步骤1中2）方法相同。

结果：鸭肝炎病毒的cDNA样品可扩增得到132—135bp的扩增产物，经测序证实，鸭肝炎病毒的扩增产物大小为133bp；该扩增产物的序列为引物对E的靶序列；非鸭肝炎病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对E的特异性很好，可以特异检出鸭肝炎病毒。

6、引物对F的特异性检测

1）PCR扩增

用引物对F对步骤一中2的鸭瘟病毒的DNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一获得的H5N3、H7N2、H9N2亚型禽流感病毒毒株、鸭肝炎病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、番鸭呼肠孤病毒的cDNA样品以及步骤一中2获得的减蛋综合征病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的DNA样品，以步骤一获得的阴性鸭胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序与步骤1中1）方法相同。

2）毛细管电泳

与步骤1中2）方法相同。

结果：鸭瘟病毒的DNA样品可扩增得到150—153bp的扩增产物，经测序证实，鸭瘟病毒的扩增产物大小为151bp；该扩增产物的序列为引物对F的靶序列；非鸭瘟病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对F的特异性很好，可以特异检出鸭瘟病毒。

7、引物对G的特异性检测

1）PCR扩增

用引物对G对步骤一中2的鸭黄病毒的cDNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一获得的H5N3、H7N2和H9N2亚型禽流感病毒毒株、鸭肝炎病毒、新城疫病毒、番鸭呼肠孤病毒的cDNA样品以及步骤一中2获得的减蛋综合征病毒、鸭瘟病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的DNA样品，以步骤一获得的阴性鸭胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序与步骤1中1）方法相同。

2）毛细管电泳

与步骤1中2）方法相同。

结果：鸭黄病毒的cDNA样品可扩增得到175—178bp的扩增产物，经测序证实，鸭黄病毒的扩增产物大小为176bp；该扩增产物的序列为引物对G的靶序列；非鸭黄病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对G的特异性很好，可以特异检出鸭黄病毒。

8、引物对H的特异性检测

1）PCR扩增

用引物对H对步骤一中2的新城疫病毒的cDNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一获得的H5N3、H7N2和H9N2亚型禽流感病毒毒株、鸭肝炎病毒、鸭黄病毒、番鸭呼肠孤病毒的cDNA样品以及步骤一中2获得的减蛋综合征病毒、鸭瘟病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的DNA样品，以步骤一获得的阴性鸭胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序与步骤1中1）方法相同。

2）毛细管电泳

与步骤1中2）方法相同。

结果：新城疫病毒的cDNA样品可扩增得到195—198bp的扩增产物，经测序证实，新城疫病毒的扩增产物大小为196bp；该扩增产物的序列为引物对H的靶序列；非新城疫病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对H的特异性很好，可以特异检出新城疫病毒。

9、引物对I的特异性检测

1）PCR扩增

用引物对I对步骤一中2的减蛋综合症病毒的DNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一获得的H5N3、H7N2和H9N2亚型禽流感病毒毒株、鸭肝炎病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、番鸭呼肠孤病毒的cDNA样品以及步骤一中2获得的鸭瘟病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的DNA样品，以步骤一获得的阴性鸭胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序与步骤1中1）方法相同。

2）毛细管电泳

与步骤1中2）方法相同。

结果：减蛋综合症病毒的DNA样品可扩增得到207—210bp的扩增产物，经测序证实，减蛋综合症病毒的扩增产物大小为208bp；该扩增产物的序列为引物对I的靶序列；非减蛋综合症病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对I的特异性很好，可以特异检出减蛋综合症病毒。

10、引物对J的特异性检测

1）PCR扩增

用引物对J对步骤一中2的番鸭呼肠孤病毒的cDNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一获得的H5N3、H7N2和H9N2亚型禽流感病毒毒株、鸭肝炎病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒的cDNA样品以及步骤一中2获得的减蛋综合征病毒、鸭瘟病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的DNA样品，以步骤一获得的阴性番鸭胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序与步骤1中1）方法相同。

2）毛细管电泳

与步骤1中2）方法相同。

结果：番鸭呼肠孤病毒的cDNA样品可扩增得到218—221bp的扩增产物，经测序证实，番鸭呼肠孤病毒的扩增产物大小为218bp；该扩增产物的序列为引物对J的靶序列；非番鸭呼肠孤病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对J的特异性很好，可以特异检出番鸭呼肠孤病毒。

12、引物对K的特异性检测

1）PCR扩增

用引物对K对步骤一中2的番鸭细小病毒的DNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一获得的H5N3、H7N2和H9N2亚型禽流感病毒毒株、鸭肝炎病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、番鸭呼肠孤病毒的cDNA样品以及步骤一中2获得的减蛋综合征病毒、鸭瘟病毒和鸭圆环病毒的DNA样品，以步骤一获得的阴性番鸭胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序与步骤1中1）方法相同。

2）毛细管电泳

与步骤1中2）方法相同。

结果：番鸭细小病毒的DNA样品可扩增得到252—255bp的扩增产物，经测序证实，：番鸭细小病毒的扩增产物大小为253bp；该扩增产物的序列为引物对K的靶序列；非番鸭细小病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对K的特异性很好，可以特异检出番鸭细小病毒。

12、引物对L的特异性检测

1）PCR扩增

用引物对L对步骤一中2的鸭圆环病毒的DNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一获得的H5N3、H7N2和H9N2亚型禽流感病毒毒株、鸭肝炎病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、番鸭呼肠孤病毒的cDNA样品以及步骤一中2获得的减蛋综合症病毒、鸭瘟病毒和番鸭细小病毒的DNA样品，以步骤一获得的阴性鸭胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序与步骤1中1）方法相同。

2）毛细管电泳

与步骤1中2）方法相同。

结果：鸭圆环病毒的DNA样品可扩增得到299—302bp的扩增产物，经测序证实，鸭圆环病毒的扩增产物大小为300bp；该扩增产物的序列为引物对L的靶序列；非鸭圆环病毒及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对L的特异性很好，可以特异检出鸭圆环病毒。

三、十二种引物对混合的特异性检测

1）将引物对A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K和L同时加入同一个PCR反应体系，分别对步骤一获得的1种H5亚型禽流感病毒毒株、1种H7亚型禽流感病毒毒株、1种H9亚型禽流感病毒毒株、鸭肝炎病毒、鸭黄病毒、番鸭呼肠孤病毒的cDNA样品以及步骤一中2获得的减蛋综合征病毒、鸭瘟病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的cDNA或DNA样品进行扩增反应，以步骤一获得的阴性鸭胚尿囊液的cDNA样品和DNA样品为阴性对照，反应体系和反应程序如下：

反应体系（20μL）：GenomeLabTM GeXP Start Kit5×PCR Buffer(含GeXP通用引物对，美国贝克曼公司，PN A85017)4μL,引物对A、B、C、D、E、F、G、H、I和J（各引物对中的每条引物在反应体系中的终浓度均为10nM）、25mM MgCl₂4μL(美国贝克曼公司,PN A25395)、JumpStart Taq DNA Polymerase1.4μL(美国SIGMA公司,D4184),模板cDNA或DNA0.5pg-0.5μg,加灭菌水至20μL。每个cDNA/DNA设置3个重复。

2）毛细管电泳：与“步骤二”中的“步骤1中2）”相同。

结果：十二种引物对A-L混合后分别对11种病原体（H5、H7和H9亚型禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒和鸭圆环病毒）的单一cDNA或DNA样品检测，分别检出了122bp和286bp、122bp和144bp、122bp和237bp、133bp、150bp、176bp、196bp、208bp、218bp、253bp和300bp的扩增产物，阴性对照无任何扩增产物。

上述结果表明：引物对A—L混合后对各引物对的特异性无影响，可用于特异地检出禽流感病毒、H5、H7和H9亚型禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒和鸭圆环病毒的每种病原体。

因此，引物对A-L、含有引物对A-L的PCR试剂或含有引物对A-L的PCR试剂盒均可用来对待测样本进行GeXP检测，从而判断待测样本是否含有禽流感病毒、H5、H7和H9亚型禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒或鸭圆环病毒；

每20μL PCR试剂由5×PCR Buffer、引物对A-L、25mM MgCl₂(终浓度为5mM/μL)4μL、Taq DNA聚合酶1.4μL(终浓度为0.175unit/μL)；模板cDNA或DNA,其余为灭菌水。

通过如下判断待测样本是否含有对应的病毒：

若引物对A的扩增产物为120—123bp且引物对B的扩增产物为285—287bp，则待测样本中含有H5亚型禽流感病毒；

若引物对A的扩增产物为120—123bp且引物对C的扩增产物为142—145bp，则待测样本中含有H7亚型禽流感病毒；

若引物对A的扩增产物为120—123bp且引物对D的扩增产物为236-239bp，则待测样本中含有H9亚型禽流感病毒；

若引物对E的扩增产物为132—135bp，则待测样本中含有鸭肝炎病毒；

若引物对F的扩增产物为150—153bp，则待测样本中含有鸭瘟病毒；

若引物对G的扩增产物为175—178bp，则待测样本中含有鸭黄病毒；

若引物对H的扩增产物为195—198bp，则待测样本中含有新城疫病毒；

若引物对I的扩增产物为207—210bp，则待测样本中含有减蛋综合症病毒；

若引物对J的扩增产物为218—221bp，则待测样本中含有番鸭呼肠孤病毒；

若引物对K的扩增产物为252—255bp，则待测样本中含有番鸭细小病毒；

若引物对L的扩增产物为299—302bp，则待测样本中含有鸭圆环病毒。

实施例3、引物对的灵敏度检测

一、制备含靶基因的单克隆质粒标准品和H7亚型禽流感病毒

分别以实施例2中步骤一获得的H5亚型禽流感病毒Duck/HK/313/78（H5N3亚型）、H7亚型禽流感病毒Duck/HK/47/76（H7N2亚型）、H9亚型禽流感病毒Duck/Guangxi/1/00（H9N2亚型）、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒和鸭圆环病毒的cDNA或DNA样品为模板，将PCR扩增获得的禽流感病毒M基因、H5亚型禽流感病毒HA基因、H7亚型禽流感病毒HA基因、H9亚型禽流感病毒HA基因、鸭肝炎病毒5'UTR区域基因、鸭瘟病毒UL6基因、鸭黄病毒E基因、新城疫病毒L基因、减蛋综合征病毒penton基因、番鸭呼肠孤病毒S1基因、番鸭细小病毒VP1基因和鸭圆环病毒REP基因的全长cDNA或DNA片段，分别与质粒pMD18-T vector连接（购自大连宝生物公司）连接，获得十二种重组质粒PA、PB、PC、PD、PE、PF、PG、PH、PI、PJ、PK、和PL，经测序证实这十二种重组质粒为质粒pMD18-T vector分别插入了一种上述基因的重组质粒，且分别可作为上述12种引物对A—L的靶基因。

利用紫外分光光度计测定各含靶基因重组质粒的浓度，并根据重组质粒的分子量和浓度计算相应的拷贝数。将高浓度的各重组质粒分别稀释成靶基因浓度为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷贝/μL的单一质粒稀释液。将各重组质粒混合，制成在混合溶液中各质粒的浓度均为10⁵拷贝/μL的混合液，再按10倍比稀释为10⁴、10³、10²拷贝/μL的混合质粒稀释液。

二、十种引物对混合的灵敏度检测

1.以引物对A—L混合为引物，不同浓度的不同单一质粒稀释液为模板，按照实施例2中步骤三的方法进行PCR扩增和电泳检测；结果，检测禽流感病毒的灵敏度为10拷贝/μL，检测H5亚型禽流感病毒的灵敏度为10拷贝/μL，检测H7亚型禽流感病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测H9亚型禽流感病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测鸭肝炎病毒的灵敏度为10拷贝/μL，检测鸭瘟病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测鸭黄病毒的灵敏度为10拷贝/μL，检测新城疫病毒的灵敏度为10拷贝/μL，检测减蛋综合症病毒的灵敏度为10拷贝/μL，检测番鸭呼肠孤病毒的灵敏度为10拷贝/μL，检测番鸭细小病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测鸭圆环病毒的灵敏度为100拷贝/μL。

2.以引物对A—L混合为引物，不同浓度的混合十种质粒稀释液为模板，按照实施例2中步骤三的方法进行PCR扩增和电泳检测；结果，检测禽流感病毒的灵敏度为10拷贝/μL，检测H5亚型禽流感病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测H7亚型禽流感病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测H9亚型禽流感病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测鸭肝炎病毒的灵敏度为10拷贝/μL，检测鸭瘟病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测鸭黄病毒的灵敏度为10拷贝/μL，检测新城疫病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测减蛋综合症病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测番鸭呼肠孤病毒的灵敏度为10拷贝/μL，检测番鸭细小病毒的灵敏度为100拷贝/μL，检测鸭圆环病毒的灵敏度为100拷贝/μL。

实施例4、引物对检测的准确率

一、十二种引物对混合检测的准确率

分别取经HA基因测序鉴定为H5亚型禽流感病毒Duck/HK/313/78（H5N3亚型）和H7亚型禽流感病毒Duck/HK/47/76（H7N2亚型）的cDNA样品；经病毒分离、血凝抑制试验、中和试验等常规实验方法分别鉴定为H9亚型禽流感病毒Duck/Guangxi/1/00（H9N2亚型）、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒和鸭圆环病毒（按照实施例2中步骤一的方法分别提取cDNA或DNA），按照实施例2中步骤三的方法分别对上述单一病原体的cDNA或DNA样品、上述病原体模拟临床感染的样品、上述11种病原体cDNA或DNA样品的混合模板进行PCR扩增和电泳检测，具体结果如下：

1、11种单一病毒的cDNA或DNA样品均可检出相应病毒的目的峰，无其他杂峰，与上述测序、病毒分离、血凝抑制试验、中和试验和PCR等常规实验方法的检测结果相符合。

2、模拟临床感染

从上述11种病原体的cDNA或DNA样品中随机选择若干种病原体的cDNA或DNA混合，分如下两组试验：

第1组：H5N3亚型、H7N2亚型和H9N2亚型禽流感病毒的cDNA混合作为模板，

第2组：鸭瘟病毒的DNA、鸭黄病毒的cDNA、新城疫病毒的cDNA、减蛋综合症病毒的DNA和H5N3亚型禽流感病毒的cDNA混合作为模板；

经实施例2中步骤三的方法检测，第1组可检出122.14bp和144.92、122.14bp和237.21、122.14bp和285.73四个目的峰（图1），表明样品中含有H5、H9和H7亚型禽流感病毒的模板，与实际相符；第2组可检出122.13bp和285.75bp、150.53bp、176.43bp、196.68bp和208.91bp五个目的峰，无其他杂峰，表明样品中含有H5亚型禽流感病毒的cDNA、鸭瘟病毒的DNA、鸭黄病毒的cDNA、新城疫病毒的cDNA和减蛋综合症病毒的DNA的模板（图2），与实际相符。

3、11种病原体混合

可检出12个目的峰（图3），无其他杂峰，表明检测样品中含有H5亚型禽流感病毒、H7亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒和鸭圆环病毒的全部病原体的cDNA或DNA模板，与实际相符。

Claims

1.鉴定或辅助鉴定鸭传染病病原体的GeXP检测引物组，由单独使用的引物对A、引物对B、引物对C、引物对D、引物对E、引物对F、引物对G、引物对H、引物对I、引物对J、引物对K和引物对L组成；

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：所述引物对A、引物对B、引物对C、引物对D、引物对E、引物对F、引物对G、引物对H、引物对I、引物对J、引物对K和引物对L中的各条引物为等摩尔混合；

3.鉴定或辅助鉴定鸭传染病病原体的GeXP检测PCR试剂，包括权利要求1或2所述的引物组。

4.根据权利要求3所述的PCR试剂，其特征在于：

所述PCR试剂由PCR扩增缓冲液、权利要求1或2所述的引物组中的引物对A-L、MgCl₂、DNA聚合酶和水组成；

所述引物对A-L中的各条引物在所述PCR试剂中的浓度为10nM。

5.根据权利要求3或4所述的PCR试剂，其特征在于：

6.鉴定或辅助鉴定鸭传染病病原体的GeXP检测试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物组或权利要求3-5中任一所述的PCR试剂。

7.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述鸭传染病病原体为H5亚型禽流感病毒、H7亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒和/或鸭圆环病毒。

8.权利要求1或2所述的引物组或权利要求3-5中任一所述的PCR试剂或权利要求6或7所述的试剂盒在制备利用GeXP检测鉴定或辅助鉴定待测样本是否含有鸭传染病病原体的产品中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述鸭传染病病原体为H5亚型禽流感病毒、H7亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭黄病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒和/或鸭圆环病毒。