CN111856015A - 鸭瘟病毒抗体检测试剂盒及其应用 - Google Patents

鸭瘟病毒抗体检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗鸭瘟病毒的单克隆抗体，该单克隆抗体与鸭瘟病毒gB蛋白特异性结合。本发明还公开了包含该单克隆抗体的鸭瘟病毒抗体检测方法及其试剂盒。本发明的鸭瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法及其试剂盒，具有良好的特异性强和敏感性，在鸭瘟疫苗免疫效力评估和鸭瘟的诊断中表现出很好的应用前景。

Description

鸭瘟病毒抗体检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及免疫化学技术领域，尤其涉及一种抗鸭瘟病毒的单克隆抗体及应用该单克隆抗体检测鸭瘟病毒抗体的阻断ELISA试剂盒。
背景技术
鸭瘟(Duck Plague，DP)又名鸭病毒性肠炎(Duck virus enteritis,DVE)，俗称“大头瘟”，是由鸭瘟病毒(Duck Plague Virus，DPV)引起鸭、鹅、天鹅和雁等水禽发病的一种急性、热性和败血性传染病。鸭瘟的传播迅速，以死亡率和致死性高为主要特征，是危害我国养鸭业最为严重的一种传染病，所以都把鸭瘟视为养鸭业的大敌。
鸭瘟病毒(DPV)是疱疹病毒属，疱疹病毒科，鸭疱疹病毒Ⅰ型。病毒粒子呈球形，直径为120～180nm，有囊膜。病毒基因组为双股DNA。电镜下，在感染细胞核和胞浆均有病毒粒子。感染鸭瘟病鸭肿头流泪，两脚发软无力，排绿色稀便，体温升高，食道黏膜有小出血点，并有黄褐色加膜覆盖或溃疡，泄殖腔黏膜充血、出血、水肿和坏死，肝表面有大小不等的出血点和坏死灶。任何品种、性别和年龄的鸭均可感染发病。鸭瘟病在国内流行的确诊是在广东于1957年正式报道，随后在上海、浙江、广西、江苏、湖南及附近等地区陆续发现，并形成了较大面积的流行，给我国的养鸭业造成了巨大的经济损失。目前监测鸭瘟病毒特异性抗体是评估疫苗免疫效果和制定常规免疫程序的关键环节之一，但尚缺乏有效检测鸭瘟病毒抗体的商品化试剂盒，对鸭瘟的防控非常不利，急需开发高效的鸭瘟病毒抗体检测试剂盒。
发明内容
本发明要解决目前对鸭瘟病毒抗体的检测手段有限的技术问题，提供一种抗鸭瘟病毒gB 蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体可用于快速、灵敏地检测鸭瘟病毒，对鸭瘟的诊断及鸭瘟疫苗抗体免疫效力评价提供很好的方法和试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种抗鸭瘟病毒的单克隆抗体，所述单克隆抗体与鸭瘟病毒gB蛋白特异性结合。
优选的，所述单克隆抗体的抗体亚类为IgG2b。
更优选的，所述单克隆抗体由抗鸭瘟病毒gB蛋白小鼠杂交瘤细胞株1G1分泌产生，该杂交瘤细胞株已于2018年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：C2018118。
在本发明的另一方面，还提供了一种分泌抗鸭瘟病毒gB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC NO：C2018118。
在本发明的另一方面，还提供了一种鸭瘟病毒抗体检测试剂盒，该试剂盒包含上述抗鸭瘟病毒的单克隆抗体。
优选的，本发明试剂盒还包含ELISA酶标板、鸭瘟病毒抗原、抗原包被液、封闭液、抗体稀释液、羊抗鼠酶标抗体、TMB底物溶液、终止液、阳性对照血清、阴性对照血清、浓缩洗涤液(10×)和试剂盒说明书。其中酶标二抗为羊抗鼠酶标二抗。
优选的，所述试剂盒采用阻断ELISA方法检测鸭瘟病毒抗体，包括以下步骤：
用纯化的鸭瘟病毒抗原包被ELISA酶标板；
将待测血清与包被抗原作用后，依次加入单克隆抗体、酶标二抗和显色液；
利用酶标仪读取吸光度值OD450nm,并按公式：阻断率(％)＝(1-样品孔平均OD450nm值/阴性对照孔平均OD450nm值)×100％，计算待测血清的阻断率，并根据下述判定标准得检测结果：
阻断率≥21.6％时为阳性；阻断率≤15.4％时为阴性；15.4％＜阻断率＜21.6％时为可疑，需重复检测，若重复检测结果小于21.6％，则判定为阴性。
所述试剂盒判定检测结果有效的条件为阴性对照孔OD450nm平均值≥0.8，且阳性对照孔的阻断率≥50％。
优选的，所述单克隆抗体的稀释浓度为1:500～1:4000。更优选的，所述单克隆抗体的稀释浓度为1:1000。
在本发明的另一方面，还提供了上述抗体在制备诊断或治疗鸭瘟的产品中的应用。
在本发明的另一方面，还提供了上述鸭瘟病毒抗体检测试剂盒在制备诊断鸭瘟的产品中的应用。
本发明利用抗鸭瘟病毒的单克隆抗体制备的检测鸭瘟病毒抗体的阻断ELISA试剂盒，特异性强、敏感性高，可以对鸭瘟病毒抗体进行快速定性和定量，在鸭瘟病的诊断及抗体检测方面具有很好的应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1单克隆抗体1G1与DPV(A)反应的间接免疫荧光图；
图2是本发明实施例1单克隆抗体1G1与DPV gB蛋白(A)反应的间接免疫荧光图；
图3是本发明实施例4鸭瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒的外包装示意图。
本发明抗鸭瘟病毒gB蛋白小鼠杂交瘤细胞株1G1，已于2018年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2018118。
具体实施方式
本发明研制了一株特异性抗鸭瘟病毒gB蛋白的单克隆抗体1G1，并在此基础上建立了检测鸭血清样品中鸭瘟病毒抗体的阻断ELISA方法及其试剂盒，该方法及其实际和具有良好的特异性和敏感性，在鸭瘟疾病的诊断和鸭瘟病毒疫苗免疫效力评价中表现出很好的应用前景。
实施例1鸭瘟病毒单克隆抗体的制备及鉴定
1.材料和方法
1.1病毒、细胞株及血清 鸭瘟病毒弱毒株、小鼠骨髓瘤细胞株(SP2/0)、鸭瘟病毒阴性和阳性血清由本实验室保存；鸭瘟病毒阳性血清和阴性血清由本实验室制备、保存。
1.2实验动物 6周龄和8～12周龄雌性BALB/c小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
1.3主要试剂 弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和HRP羊抗鼠IgG购自Sigma公司；PEG1450、HAT、HT购自Sigma公司；DMEM培养基、胎牛血清GIBCO公司；TMB显色液购自武汉博士德公司。
1.4病毒抗原的制备 将鸭瘟病毒弱毒株接种SPF鸡胚成纤维细胞，48～72h收集出现 70％以上CPE的细胞，并冻融3次后，2‰甲醛灭活24h，高速离心10000rpm 2h取上清，上清经30000rpm超速离心5分钟留沉淀，即得到纯化DPV，测定蛋白浓度，分装于-70℃保存，用作免疫抗原和包被抗原。
1.5 DPV单克隆抗体的制备
1.5.1小鼠免疫 用纯化的DPV抗原加入等量弗氏完全佐剂乳化后，经腹部和背部皮下注射6～8周龄雌性BAB/C小鼠，每只100μg；用纯化的DPV抗原加入等量弗氏不完全佐剂乳化后，每隔两周分别进行第二次和第三次免疫，剂量与首免相同，当小鼠的抗体效价达到1:104以上的时候，取抗体效价最高的小鼠脾脏用于细胞融合。三免两周后进行加强免疫，三天后开始细胞融合。
1.5.2间接ELISA方法的建立 采用方阵滴定法确定间接ELISA方法中包被抗原和阳性的最佳浓度。将纯化的DPV抗原、鼠阳性血清和阴性血清分别作2倍倍比稀释，选择OD450nm值在1.0左右，且P/N值最大的抗原和血清浓度作为其最佳工作浓度。
1.5.3阳性杂交瘤细胞株的建立和筛选 按常规方法制备小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养层细胞，在加强免疫后第三天，按常规淋巴细胞杂交瘤技术,脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)按 10:1的比例在融合剂PEG1450作用下融合，将融合的细胞接种在96孔板中，在次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)选择性培养基下培养。经间接ELISA筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞，按有限稀释法在96孔细胞培养板中进行3次克隆。
1.5.4单克隆抗体腹水的制备和效价测定 取8～12周龄雌性BALB/c小鼠，每只腹腔注射0.5ml灭菌液体石蜡，7～10天后腹腔注入2～5×104个杂交瘤细胞，注射后7～10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，12000rpm离心10min，收集上清液，并用建立的ELISA方法检测腹水的抗体效价，-80℃保存备用。
1.5.5抗DPV gB蛋白单克隆抗体的鉴定 将293T培养于6孔培养板，待细胞长成单层后，将重组真核表达质粒pCAGGS-DPV-gB转染293T细胞，同时设阴性对照孔。转染48h 后，弃上清，细胞用4％的多聚甲醛固定，经PBST洗涤一次，加入杂交瘤细胞培养上清，37℃孵育1小时，PBST洗涤三次，加入FITC-羊抗鼠IgG抗体，继续37℃孵育1小时，PBST 洗涤三次，最后在荧光显微镜下观察，凡有特异的绿色荧光者判为阳性；无荧光者判为阴性。
1.5.6单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定(IFA) 常规方法制备SPF鸡胚成纤维细胞(CEF 细胞)，并培养于6孔培养板，待细胞长成单层后，用DPV感染CEF細胞，同时设阴性对照孔。感染36h后，弃上清，细胞用4％多聚甲醛固定，经PBST洗涤三次，加入杂交瘤细胞培养上清，37℃孵育1小时，PBST洗涤三次，加入FITC-羊抗鼠IgG抗体，继续37℃孵育1 小时，PBST洗涤三次，最后在荧光下显微镜下观察，凡有绿色荧光者判为阳性；无荧光者判为阴性。
1.5.7单克隆抗体的抗体亚类鉴定 采用SBA ClonotypingTM System/HRP(Cat.NO5300-05)抗体亚类试剂盒，对获得的单克隆抗体1G1株进行抗体亚型鉴定，具体步骤操作过程按以包被DPV抗原的间接ELISA方法进行，以单克隆抗体1G1为一抗，37℃孵育1h，每孔100μL，PBST洗涤3次，每次3min，以1:500稀释的辣根过氧化酶(HRP)标记抗鼠抗体亚类(κ链、λ链、IgM、IgA、Ig G1、IgG2a、IgG2b、IgG3)的抗体为二抗，37℃作用1h。用TMB显色液进行显色，100μL/孔，室温避光显色10min，加入终止液，50μL/ 孔，OD450nm读取吸光值。
2.结果
2.1细胞融合和杂交瘤细胞的建立 利用淋巴细胞杂交瘤技术，通过间接ELISA检测方法检测杂交瘤细胞上清，通过间接ELISA方法对融合孔细胞进行筛选，经过鉴定和亚克隆纯化，共获得1株能够稳定分泌抗鸭瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将该细胞株命名为抗鸭瘟病毒gB蛋白小鼠杂交瘤细胞株1G1，且此杂交瘤细胞株已于2018年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：C2018118。并且该培养物的存活性已由保藏中心(CCTCC)于2018年6月15日检测完毕，结果为存活。
2.2杂交瘤细胞上清和腹水效价的测定 将阳性杂交瘤细胞培养上清和腹水分别进行10 倍倍比稀释，用建立的间接ELISA方法检测，同时设立鼠阳性和阴性血清对照。P/N值≥2.1 时抗体的最大稀释度即为其抗体效价。单克隆抗体1G1的抗体效价如下表1所示。
表1杂交瘤细胞培养上清和腹水抗体效价
Figure BDA0002038119130000051
2.3单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定(IFA) 用DPV感染CEF细胞，并用1G1单抗进行间接免疫荧光试验，设未感染CEF细胞为空白对照(MOCK)。试验结果显示：1G1单抗可与DPV结合产生特异性的绿色荧光(见图1)，并且其与病毒的gB蛋白发生特异性结合(见图2)。
2.4单克隆抗体的抗体亚类鉴定结果 采用SBA ClonotypingTM System/HRP抗体亚类试剂盒对单克隆抗体1G1进行抗体亚类鉴定，吸取杂交瘤细胞培养上清，经间接ELISA方法鉴定杂交瘤细胞1G1分泌的单克隆抗体的抗体亚类为IgG2b，且轻链为к(kappa)链，结果见表2。
表2单克隆抗体1G1的抗体亚类鉴定
Figure BDA0002038119130000052
实施例2鸭瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法的建立
1.鸭瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法的建立
1.1鸭瘟病毒阻断ELISA抗体检测操作方法 ⑴用PH9.6的碳酸盐缓冲液包被DPV抗原，每孔3μg/孔，4℃过夜。次日取出后，用0.05％Tween-20PBS(PBST)洗涤三次，每次3min；⑵用5％脱脂乳的PBS封闭酶标板，37℃2h，洗涤3次，方法同上；⑶加入抗体稀释液稀释10倍的待测血清、阴性和阳性对照，每孔100μL 37℃孵育1小时，洗涤方法同上。⑷每孔100μL1G1单克隆抗体(20×)，37℃孵育1小时，洗涤3次；⑸每孔加入抗体稀释液稀释到1×的酶标二抗100微升，37℃1小时，洗涤3次；⑹每孔加入TMB底物显色液100微升，室温避光显色10分钟；⑺每孔加入2M H2SO4 50uL终止反应，酶标仪读取吸光度值OD450nm, 计算抑制率，抑制率(％)＝(阴性对照的吸光度值-待测血清的吸光度值)/阴性对照的吸光度值×100％。
1.2最适抗原包被浓度和血清稀释度的优化 将检验合格的纯化抗原(≥0.5mg/mL)用包被液稀释，然后进行2倍倍比稀释。依次按16、8、4、2、1、0.5ug/mL进行稀释,共2个稀释度的抗原，分别加入到96孔ELISA酶标板中，每个稀释度2孔，每孔0.1ml。4℃下放置15～18小时；弃去包被液，加入洗涤液，放置3分钟，弃去洗涤液，洗涤3次后，弃去洗涤液；加入封闭液，每孔0.1ml，20～25℃放置1小时，弃去封闭液。将阳性血清稀释为1:5、 1:10和1:20，阴性血清稀释10倍，分别加入到不同抗原浓度包被的酶标板孔中，每种血清在同一抗原浓度下设置3个重复孔，每孔0.1ml。血清加入后在37℃放置1小时，弃去血清稀释液，同上洗涤3次；弃去洗涤液，加入1:500稀释的单克隆抗体1G1，每孔0.1ml，37℃下放置1小时，同上洗涤3次；弃去洗涤液，加入1:2000稀释的羊抗鼠IgG酶标二抗(0.8mg/ml)，每孔0.1ml，37℃下放置1小时，同上洗涤3次后，弃去洗涤液，加入TMB底物溶液，每孔 0.1ml，室温避光放置10分钟，每孔加入0.05ml终止液。在酶标仪上测定各孔的OD450nm 值。当阴性血清的OD450nm值约为1.5、阴性血清OD450nm值和阳性血清OD450nm比值最大时的抗原浓度确定为最佳抗原包被浓度。
1.3最佳封闭液与封闭时间的确定 以1.2确定的最适浓度的抗原包被酶标板(100μl/ 孔)，置于4℃，作用15～18小时，洗涤3次，分别加入3％脱脂乳、5％脱脂乳、0.1％明胶、1％牛血清封闭和商品化封闭液，封闭1小时，按上述操作程序，确定最适封闭液。
1.4单抗最佳稀释度和工作时间的确定 按照1.2确定的最适浓度的抗原包被酶标板，用1.3确定的封闭液和条件进行封闭。取阳性血清和阴性血清按1.2确定的稀释度和时间进行作用，单抗分别做1:500、1:1000、1:2000和1:4000稀释，每孔加入0.1ml，37℃孵育1小时，按照1.1操作程序，确定单抗最佳稀释度。
1.5酶标抗体最佳工作浓度和工作时间的确定 按照1.2确定的最适浓度的抗原包被酶标板，用1.3确定的封闭液和条件进行封闭，血清的稀释度和作用时间按照1.2确定的进行，单抗按照1.4确定的条件进行，羊抗鼠酶标抗体分别作1:1000、1:2000、1:4000、1:8000倍稀释，37℃1小时，按照上述操作程序，确定酶标抗体最佳工作浓度和工作时间。
1.6底物显色时间的确定 按照1.2确定的最适浓度的抗原包被酶标板，用1.3确定的封闭液和条件进行封闭，血清的稀释度和作用时间按照1.2确定的进行，单抗按照1.4确定的条件进行，酶标抗体按照1.5确定的条件进行，加入底物TMB，室温避光显色，显色时间分别为5、10、15和20分钟，按照1.1操作程序，确定最佳显色时间。
1.7阻断ELISA方法的临界值判定 在阻断ELISA方法建立后，检测200份来自于临床的阴性血清，计算阻断率和临界值，确定方法的结果有效性成立条件和判断标准。临界值＝阴性样品平均抑制率+2倍或3倍标准偏差。
2.结果
2.1阻断ELISA反应条件的确定
2.1.1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定 将检验合格的DPV纯化病毒抗原用包被液稀释，然后进行2倍倍比稀释。依次按16、8、4、2、1、0.5ug/mL进行稀释,共6个稀释度的抗原，阳性血清与阴性血清分别以1:2、1:5、1:10、1:20稀释进行阻断ELISA试验，各个稀释度包被病毒与被检血清的OD450nm值和阻断率见表3。从表3的结果可以看出纯化病毒2ug/mL稀释进行包被，血清10倍稀释作为被检对象时，阳性和阴性血清的OD450nm值都比较理想，阻断率比较高。因此，纯化病毒的包被浓度为2ug/mL，待测血清的工作浓度为 1:10。
表3抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的选择
Figure BDA0002038119130000071
注：“P”代表阳性血清；“N”代表阴性血清；“PI”代表阻断率。
2.1.2待检血清作用时间的确定 使用最佳条件包被和封闭板ELISA板后，加入最佳稀释浓度的阴阳性血清，37℃分别作用0.5h、1h、1.5h和2h，对阴阳性血清进行阻断ELISA试验，各个时间阴阳性血清阻断结果见表4。从表的结果可以看出，血清作用时间为1h时，阳性对照血清的阻断率最高，所以选择1h为最佳血清作用时间。
表4血清最佳作用时间选择
Figure BDA0002038119130000072
Figure BDA0002038119130000081
2.1.3单克隆抗体工作浓度的确定 使用最佳条件包被和封闭板ELISA板后，加入最佳稀释浓度的阴阳性血清，37℃分别作用1h，将单克隆抗体1G1进行1:500、1:1000、1:2000和 1:4000倍稀释后进行阻断ELISA试验，试验结果见表5。从结果可以看出，单抗1G1进行1:1000 稀释时，阻断率最高，所以选择1:1000作为单抗最佳稀释浓度。
表5单抗(腹水)最佳稀释浓度的选择
Figure BDA0002038119130000082
2.1.4底物显色时间的确定 按照最适浓度的抗原包被酶标板，用确定的封闭液和条件、血清的稀释度、单抗稀释度和酶标抗体按进行，加入底物TMB，室温避光显色，显色时间分别为5、10、15和20分钟时，室温显色10分钟时阻断率最高，因而确定最佳显色时间为室温10分钟。
表6 TMB底物溶液最佳显色时间的确定
Figure BDA0002038119130000083
2.2阻断ELISA判定标准的确定 对200份临床的阴性鸭血清样品进行阻断ELISA检测，经统计学分析，计算出血清样品的平均阻断率(X)为3.0％，标准差(S)为6.2％，X+ 2S＝15.4％，X+3S＝21.6％；当PI≥21.6％时判该血清为鸭瘟病毒抗体阳性，PI≤15.4％时判为该血清鸭瘟病毒抗体阴性，15.4％<PI<21.6％时判为可疑，需重复检测1次，如果结果仍低于21.6％判为抗体阴性。同时确定了该方法成立的条件为：当阴性对照孔OD450nm平均值≥0.8，且阳性对照孔的阻断率(PI值)≥50％，判定检测结果有效。
实施例3鸭瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法的评估
1.评估试验
1.1特异性试验 用建立的阻断ELISA检测方法对Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHAV-Ⅰ)、Ⅲ型鸭肝炎病毒(DHAV-Ⅲ)、H9亚型禽流感病毒(AIV)、新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)阳性血清、鸭瘟病毒(DPV)阳性血清和2份鸭阴性血清1:10稀释进行检测，根据PI值确定其特异性，是否对上述病毒的阳性血清有交叉反应性。
1.2敏感性试验 将鸭瘟病毒阳性血清做1:2～1:128倍比稀释，用建立的方法和中和试验方法进行检测，根据实验结果比较其敏感性。
1.3批内批间重复性试验 用同一批制备的鸭瘟病毒抗原包被不同的ELISA板，取3份不同抗体水平的血清和3份阴性血清，在同一条件中按阻断ELISA方法测定，每份血样做5孔平行试验，对结果进行统计学分析。用3个不同批次制备并纯化的病毒包被不同的ELISA板，取6份上述血清，在同一条件按阻断ELISA方法测定，对结果进行统计学分析。
1.4临床样品检测 用建立的阻断ELISA试验和中和试验(NT)进行比较，对山东等地区共100份临床样品进行检测，应用建立的阻断ELISA方法检测相同待测血清所得的阴阳性判定结果与传统的中和试验进行比较，分析其两者的阳性检出率和符合率。
2.结果
2.1特异性检验 用建立的阻断ELISA检测方法对鸭瘟病毒(DPV)、Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHAV-Ⅰ)、Ⅲ型鸭肝炎病毒(DHAV-Ⅲ)、禽流感病毒(AIV)、新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)阳性血清和2份鸭阴性血清1:10稀释进行检测，根据试验结果(见表6)，该方法与上述病毒(DHAV-Ⅰ、DHAV-Ⅲ、AIV、NDRV、 MDRV和DTMUV)的阳性血清没有交叉反应性，只有特异性的检测鸭瘟病毒(DPV)抗体，具有很好的特异性。
表6阻断ELISA特异性试验结果
Figure BDA0002038119130000091
注：“+”表示抗体阳性，“—”表示抗体阴性。
2.2敏感性检验 将鸭瘟病毒阳性血清进行1:2～1:128倍比稀释，用建立的阻断ELISA 方法和中和试验平行进行检测。结果显示：待检血清中和效价为1:8，而阻断ELISA的抗体效价为1:64(见表7)，阻断ELISA抗体效价比中和试验敏感8倍，具有很好的敏感性。
表7阻断ELISA敏感性试验结果
Figure BDA0002038119130000092
Figure BDA0002038119130000101
注：“+”表示抗体阳性，“—”表示抗体阴性。
2.3批内批间重复性试验 用同批次抗原对3份阳性血清和3份阴性血清进行检测。统计学分析其检测结果，结果显示其批内变异系数在0.939％～7.706％之间(见表8)，小于10.0％，说明同一样品在同一批试验中的变异程度很小，具有良好的重复性。用3个不同批次制备 ELISA板进行批间重复性试验，其批间变异系数在1.305％～8.500％之间(见表9)，说明同一样品在不同批次抗原试验中的变异程度很小，具有很好的重复性。综上，本方法具有良好的批内批间重复性。
表8批内重复性试验
Figure BDA0002038119130000102
表9批间重复性试验
Figure BDA0002038119130000103
2.4临床样品检测结果 用建立的阻断ELISA试验和中和试验进行比较，对江苏、安徽等地区共100份临床样品进行检测，结果见下表10，阻断ELISA方法的阳性检出率为45％(45/100)，中和试验阳性检出率为13％(13/100)，建立的阻断ELISA的敏感性显著高于中和试验，具有很好的现地应用性。
表10阻断ELISA方法和中和试验方法检测现地临床样品
Figure BDA0002038119130000104
*指在阻断ELISA实验与中和试验平行检测结果相同的数值
实施例4鸭瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒的组成和应用
1.试剂盒的组成
本发明试剂盒用于检测鸭血清中鸭瘟病毒抗体。按表11所列的试剂盒成分，装配成试剂盒，试剂盒的外包装如图3所示，组装后置于2～8℃保存。图3中，A:样品稀释液；B:单克隆抗体；C:阴性对照血清；D:阳性对照血清；E:羊抗鼠IgG酶标抗体；F:TMB底物溶液；G:终止液；H:10倍浓缩洗涤液；I:10倍浓缩洗涤液。
表11鸭瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒的成分和含量
Figure BDA0002038119130000111
2.本发明试剂盒的使用方法：
2.1试剂准备 使用前，将试剂盒中的抗原包被板、样品稀释液、10倍浓缩洗涤液、阳性对照血清、阴性对照血清、单克隆抗体、羊抗鼠酶标抗体、TMB底物溶液和终止液等恢复至室温(20～25℃)并混匀待用。10倍浓缩洗涤液在使用前用去离子水或蒸馏水稀释10倍。
2.2样品准备 将待测血清用样品稀释液按1:10稀释后进行测定；若测定待测血清的抗体滴度，则先用样品稀释液按1:5稀释血清后，再进行2倍倍比稀释，对各稀释度进行测定。
2.3操作步骤
2.3.1加样与孵育 取抗原包被板，分别将稀释好的待检血清、阴性和阳性对照血清加入到抗原包被板孔中，阴性和阳性对照血清各2孔，0.1ml/孔。轻轻振匀孔中样品，用封板膜密封包被板，置37℃孵育1小时。
2.3.2洗涤 去除封板膜，弃去孔中液体，每孔加入0.3ml洗涤液，作用3分钟，弃去洗涤液，重复洗涤3次。
2.3.3与单克隆抗体作用 每孔加入单克隆抗体0.1ml，用封板膜密封包被板，置37℃孵育1小时。
2.3.4洗涤 按2.3.2中方法洗涤。
2.3.5与酶标抗体作用 每孔加入羊抗鼠酶标抗体0.1ml，用封板膜密封包被板，置37℃孵育1小时。
2.3.6洗涤 按2.3.2中方法洗涤。
2.3.7显色 每孔中加入TMB底物溶液0.1ml，轻摇2秒，室温(20～25℃)下避光显色10分钟。
2.3.8终止 每孔加入终止液0.05ml，置酶标仪上测定各孔OD450nm值。
3判定
3.1结果有效性 当阴性对照孔OD450nm平均值≥0.8，且阳性对照孔的阻断率(PI值)≥50％，判定检测结果有效。
3.2阻断率的计算 阻断率(PI)用以下公式计算：
PI＝(1-样品孔平均OD450nm值/阴性对照孔平均OD450nm值)×100％
3.3结果判定
当样品的阻断率(PI)≥21.6％，判为鸭瘟病毒抗体阳性；
当样品的阻断率(PI)≤15.4％，判为鸭瘟病毒抗体阴性；
当样品的阻断率15.4＜PI＜21.6％，判为可疑；应再重复检测1次，若PI值仍＜21.6％，则判为鸭瘟病毒抗体阴性。
ELISA判定为阳性样品的最高稀释倍数，即为该血清样品的ELISA抗体滴度。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种抗鸭瘟病毒的单克隆抗体，所述单克隆抗体与鸭瘟病毒gB蛋白特异性结合。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的抗体亚类为IgG2b。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为CCTCCNO：C2018118的杂交瘤细胞株分泌。
4.一种分泌抗鸭瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC NO：C2018118。
5.一种鸭瘟病毒抗体检测试剂盒，包含权利要求1或2所述的单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的鸭瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，还包含鸭瘟病毒抗原包被的ELISA酶标板、样品稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标二抗、显色液和终止液。
7.根据权利要求6所述的鸭瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用阻断ELISA方法检测鸭瘟病毒抗体，包括以下步骤：
用纯化的鸭瘟病毒抗原包被ELISA酶标板；
将待测血清与包被抗原作用后，依次加入单克隆抗体、酶标二抗、显色液和终止液；
利用酶标仪读取吸光度值OD450nm,并按公式：阻断率(％)＝(1-样品孔平均OD450nm值/阴性对照孔平均OD450nm值)×100％，计算待测血清的阻断率，并根据下述判定标准得检测结果：
阻断率≥21.6％时为鸭瘟病毒抗体阳性；阻断率≤15.4％时为鸭瘟病毒抗体阴性；15.4％＜阻断率＜21.6％时为可疑，需重复检测，若重复检测结果阻断率仍小于21.6％，则判定为鸭瘟病毒抗体阴性。
8.根据权利要求7所述的鸭瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒判定检测结果有效的条件为阴性对照孔OD450nm平均值≥0.8，且阳性对照孔的阻断率≥50％。
9.权利要求1-3任一项所述单克隆抗体在制备诊断或治疗鸭瘟的产品中的应用。
10.权利要求5-8任一项所述鸭瘟病毒抗体检测试剂盒在制备诊断鸭瘟的产品中的应用。
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