CN116836938A - 一株产生抗iii型鸭甲型肝炎病毒vp1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

一株产生抗iii型鸭甲型肝炎病毒vp1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，所述产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株DHAV3VP1‑Mab 4B8，保藏在武汉大学保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCCNO:C202375，保藏日期为2023年4月18日。本发明还提供了一种抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体，以所述单克隆抗体建立的阻断ELISA检测方法能够快速、灵敏地检测III型鸭甲型肝炎病毒，实现对III型鸭甲型肝炎病毒的临床诊断、雏鸭母源抗体及其疫苗免疫效力评估等检测。

Description

一株产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交 瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明属于兽用诊断生物制品技术领域，涉及一株产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，尤其涉及一种抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体、其杂交瘤细胞株、以及包含其中一种基于单克隆抗体的鸭甲型肝炎病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒。
背景技术
鸭III型病毒性肝炎是由鸭III型甲型肝炎病毒(duck hepatitis Avirus，DHAV)引起的一种以肝脏肿胀、出血为主要症状的急性、烈性传染病，主要侵害3周龄内雏鸭，给养鸭业带来了巨大的经济损失。鸭甲型肝炎病毒有3个血清型(I型，II型和III型)，II型和其他两种血清型间无交叉反应性。主要流行的是I型和III型鸭甲型肝炎病毒，防控III型鸭甲型肝炎病毒是目前亟待解决的问题，建立快速、灵敏、特异性高的DHAV血清学诊断方法是防控该疾病、阻断疾病快速传播和评价疫苗免疫效果的重要手段。
CN106990247A公开了一种同时检测I型和III型鸭甲型肝炎病毒的胶体金试纸条及其制备方法，该试纸条由底板、硝酸纤维素膜、样品垫、金标垫和吸收垫组成，硝酸纤维素膜上的质控线包被抗鼠IgG，检测线包被抗I型鸭甲型肝炎病毒多抗，金标垫包被胶体金标记的同时识别I型和III型鸭甲型肝炎病毒的单克隆抗体；该试纸条具有良好的灵敏度、特异性、重复性和稳定性，从而为临床和基层单位不漏检I型或III型鸭甲型肝炎病毒提供了一种广谱、灵敏、特异、简单、快速的检测技术。上述方法能同时识别I型和III型鸭甲型肝炎病毒，但是上述方法无法区分I型和III型鸭甲型肝炎病毒。
酶联免疫吸附试验是抗体检测的普遍方法，不仅快速灵敏，而且可以进行大规模检测。现有的间接ELISA方法，使用全病毒包被，存在抗原不易纯化，且抗原含量不多等缺点，间接ELISA方法也存在非特异性高、敏感性低等缺点。因此，提供一种高敏感性的鸭肝炎病毒抗体检测产品具有重要的应用价值。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一株产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。由所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体具有较强的特异性和中和活性，鸭胚中和效价可达10-3.5。以所述单克隆抗体建立的阻断ELISA检测方法能够快速、灵敏地检测III型鸭甲型肝炎病毒，实现对III型鸭甲型肝炎病毒的临床诊断、雏鸭母源抗体及其疫苗免疫效力评估等检测。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一株产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株DHAV3 VP1-Mab 4B8，保藏在武汉大学保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC NO:C202375，保藏日期为2023年4月18日。
第二方面，本发明提供一种抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体，所述抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体由第一方面所述的杂交瘤细胞株产生。
第三方面，本发明提供第一方面所述的产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株和/或第二方面所述的抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体在制备诊断、检测或治疗III型鸭甲型肝炎病毒的产品中的应用。
第四方面，本发明提供一种检测III型鸭甲型肝炎病毒的试剂盒，所述试剂盒中包括第二方面所述的抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体。
优选地，所述试剂盒为阻断ELISA试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括：包被酶标板、阳性血清、阴性血清、包被缓冲液、洗涤缓冲液、样品稀释液、辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体、封闭液、显色液、终止液、封板膜或说明书中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述包被酶标板以III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒(DHAV3 VLPs)作为包被抗原。
优选地，所述III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒包括III型鸭甲型肝炎病毒VLPs P1抗原和III型鸭甲型肝炎病毒VLPs 3CD抗原。
优选地，所述III型鸭甲型肝炎病毒VLPs P1抗原中包括III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白。
优选地，所述包被抗原的使用浓度为0.8-1.2μg/mL，例如可以是0.8μg/mL、0.9μg/mL、1μg/mL、1.1μg/mL或1.2μg/mL等。
优选地，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(1)将待测血清样品与包被抗原作用后，加入抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体、酶标二抗、显色液和终止液反应；
(2)采用酶标仪读取吸光度值OD450nm，并按公式：
阻断率(％)＝(阴性对照孔平均OD450nm值-样品孔平均OD450nm值)/阴性对照孔平均OD450nm值×100％，计算待测血清样品的阻断率，判定检测结果。
优选地，所述检测结果的判定标准为：
阻断率≥38.2％时为III型鸭甲型肝炎病毒抗体阳性；阻断率≤29.2％时为III型鸭甲型肝炎病毒抗体阴性；29.2％＜阻断率＜38.2％时为可疑，需重复检测，若重复检测结果阻断率仍小于38.2％，则判定为III型鸭甲型肝炎病毒抗体阴性。
本发明中，采用所述试剂盒进行检测的具体步骤如下所示：
(1)包被抗原：用包被缓冲液将III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒(DHAV-3VLPs)稀释至0.8-1.2μg/mL，向微孔中每孔加100μL，4℃过夜包被，甩掉孔内液体(尽量拍干孔里面的液体)，洗涤三次，每次5min；
(2)封闭：用洗涤液PBST配制1％ BSA作为封闭液，每孔200μL，37℃孵育60min；甩掉孔内液体，逐个孔加满洗涤缓冲液200μL，静置5min，甩掉孔内液体，拍干，洗涤缓冲液洗三次；
(3)孵育一抗：将待测血清稀释至1:32，向微孔中每孔加100μL，37℃，孵育60min，同样洗涤三次，每次5min，拍干；
(4)加单克隆抗体：DHAV-3VP1-Mab(抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体)稀释至0.5μg/mL，向微孔中每孔加100μL，37℃，孵育60min，同样洗涤三次，每次5min，拍干；
(5)酶标抗抗体：先用稀释液将酶标二抗HRP-Polyclonal Goat Anti Mouse IgG(HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体)稀释至1:7500，每孔加入100μL，置于37℃，60min，然后洗涤，拍干；
(6)加显色液：每孔加显色液TMB 50μL，置于37℃，5min；
(7)终止反应：每孔加2M H2SO4终止液50μL；
(8)判定结果：酶标仪上测定OD450nm值，根据阴阳性对照判定结果。
第五方面，本发明提供第四方面所述的检测III型鸭甲型肝炎病毒的试剂盒在制备诊断或检测鸭病毒性肝炎产品中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明中所述III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒为采用杆状病毒表达系统表达DHAV-3VLPs，所述病毒样颗粒含DHAV-3 3个结构蛋白(VP0，VP1，VP3)，更接近于天然蛋白，且具天然病毒粒子结构。
(2)本发明筛选到的抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体，具有较强的特异性和中和活性，鸭胚中和效价可达10-3.5。
(3)本发明筛选到的抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体作为阻断抗体建立阻断ELISA方法，所述方法可用于检测血清中的中和抗体。
附图说明
图1是Western Blot检测抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的特异性图，图中，泳道M：marker；泳道1：HBGT；泳道2：SD01；泳道3：SH。
图2是阴阳临界值的确定图。
图3是方法特异性检验图。
图4是方法敏感性检验图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备
(1)抗原制备
将分离的III型鸭甲型肝炎病毒株HBGT(GenBank：KX290465.1)接种鸭胚，收集尿囊液，蔗糖梯度密度离心获得。
(2)小鼠免疫
选用5-6周龄雌性Balb/C小鼠，进行免疫，免疫方式为小鼠腿部肌肉注射，一免时，以步骤(1)所得毒株加弗氏完全佐剂混匀为免疫原，免疫剂量为50μg/只，10天后，以步骤(1)所得毒株加弗氏不完全佐剂混匀为免疫原，进行二免，5-7天采血检测抗体效价，第三次为不加佐剂的纯化病毒为免疫原，三免后进行细胞融合。
(3)细胞融合
取步骤(2)免疫后的小鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞，按照10:1比例混合后，离心，加入PEG，加入DMEM基础培养基，37℃静置10min，离心，将融合后细胞用HAT培养基重悬铺板，并已于前一天制备好的饲养细胞铺于96孔板中。
(4)杂交瘤细胞筛选
通过阻断ELISA方法测定步骤(3)所得细胞上清，筛选阳性细胞孔，有限稀释法亚克隆确定阳性细胞株4B8。
所述阻断ELISA法筛选阳性孔的过程为：以碳酸盐缓冲液为包被液，将制备的III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒包被于ELISA板，100μL/孔，4℃过夜包被，次日拍干，洗板两次，5％脱脂乳37℃封闭1h后拍干；每孔加入100μL细胞上清，37℃作用1h，PBST洗涤3次；加入抗DHAV-3鸭阳性血清，37℃作用1h，PBST洗涤3次；依次每孔辣根过氧化物酶标记的山羊抗鸭IgG抗体，37℃作用1h，PBST洗涤3次；最后每孔加入100μL TMB显色液，避光反应15min，2MH2SO4终止反应，酶标仪OD450nm处检测吸光度值，选择OD450nm值在1.0左右，且P/N值最大的抗原和血清浓度作为其最佳工作浓度。
所述阻断ELISA方法包被抗原包含III型鸭甲型肝炎病毒VLPs P1抗原和III型鸭甲型肝炎病毒VLPs 3CD抗原。
所述III型鸭甲型肝炎病毒VLPs P1抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO:1：
MDTLTKNIEDETVKIIGSCAEKAQEAISGLGAVESVASTNSVVATANATTTQTIPDPTNGSTDDFYSCSYEVGARGDNISRLVHLHTGQWSTQHGVTTCLRWLATPGCFYTVNTQPAYGQTRYFRFIRCGYHFRLLVNAPSGAAGGLMMVWMPYPYCRVLTGSYNVDASVDRRSLLNLPYAILDLRTDTEIDLVIPYVNFRNYVEITATDSVGGAICVFVLGAFTHGSGTSNTVDYTLFGEMLETDLQCPRPFNDQGKKKPRRRPIHKPKSPPQESRIIIQPGPGAANLSNSSVVTMAESVALANEGTAVDYSTAGCASSVDDVVMVLRRWQIVGDFQWANTVTPGNRINRFQVVFNRMPTFALFFDKFQYWRGSLEVKLLTFGSQFNTGRYQMSWYPVSDGEQTLAQCQNSVFVTCDVCATPATLILPFTNTTWRKSTRENYGYITWHVVNRLTVNSTSPSTISCVILMRVGKDFQFTAPLYGALQMAANNQGDSNQLGDDEPVCFLNFETANVPIQGESHTLVKHLFGRQWLVRTVQHTNEVQELDLPVPDQGHASLLRFFAYFSGEVILTIVNNGTTPCMVAHSYTMDNLTSEYAVTAMGGILIPANSAKNINIPFYSVTPLRPTRPMPAFQGGGLTFGRLYIWTQSGSVSVFMGLHKPALFFPLPAPTYTTHTQLNNIETMNLHNQSDQPDCHLCKICKKMKKWSRNHRPFRFCLRLKTLAFELHLEIE。
所述III型鸭甲型肝炎病毒VLPs 3CD抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO:2：
MNRLVNVSSENEVATGLAVGGKYVLTFGHSKFTQLDSIRDMVFNSPAKGTPITYDGLPTDLQLLDCDIPHQFKDVSKLIATDDYRGNGWLVWKDDDQYMIQEVTKIRPFGQTTTASGTTSCQTYIYNCKTGPGSCGGVLVALIGGNLKILGIHTSGNGTMGASNRIFPVFNQGAIVEKKYSG。
(5)杂交瘤细胞鉴定
培养步骤(4)得到的细胞株4B8，吸取细胞上清，通过阻断ELISA法，鉴定阳性细胞。筛选的阳性杂交瘤细胞，按优先稀释法在96孔板中进行3次克隆。
(6)单克隆抗体腹水的制备和效价测定。
取8-12周龄雌性BALB/C小鼠，每只腹腔注射0.5mL灭菌液体石蜡，7-10天后腹腔注射2-5×104个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，收腹水，12000rpm离心10min，收集上清，将腹水进行10倍倍比稀释，用建立的阻断ELISA方法检测，同时设立小鼠阳性和阴性血清对照，P/N值≥2.1时抗体的最大稀释度即为其抗体效价。
(7)抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的鉴定
用DHAV-3毒株SD01(GenBank：GQ485310.1)、DHAV-3毒株HBGT(GenBank：KX290465.1)、DHAV-3毒株SH株(GenBank：HQ232303.1)SDS-PAGE，转印封闭，用抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体孵育，显色，结果显示，III型毒株在25KD左右检测特异性条带(见图1)。
(8)单克隆抗体的抗体亚类鉴定按照SBA ClonotypingTM System/HRP(Cat.NO5300-05)抗体亚类试剂盒说明书进行，对筛选的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果显示该杂交瘤细胞产生的单克隆抗体亚类均为IgG2a，且其轻链为к(kappa)链。
(9)抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体(DHAV-3VP1-Mab)的鸭胚中和效价的测定
通过对抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体进行梯度稀释，运用鸭胚中和试验的方法，测定VP1蛋白单克隆抗体的中和效价，即能保护50％的鸭胚不发生死亡的抗体最高稀释倍数作为抗体的中和效价，表1为DHAV-3VP1-Mab中和效价测定结果。
表1
结果显示，DHAV-3VP1-Mab的中和效价为10-3.5/0.1mL。
实施例2杂交瘤细胞的保存
本实施例对实施例1中制备的杂交瘤细胞株进行保藏，命名为杂交瘤细胞株DHAV3VP1-Mab 4B8，保藏在武汉大学保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC NO:C202375，保藏日期为2023年4月18日。
实施例3III型鸭甲型肝炎病毒阻断ELISA抗体检测方法的建立
(1)蛋白、血清及主要试剂
包被蛋白为DHAV-3VLPs(本实验室制备)，产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞(实施例1中制备)。DHAV-3标准鸭阴性血清、DHAV-3标准鸭阳性血清、鸭瘟病毒(DEV)阳性血清、鸭呼肠孤病毒(DRV)阳性血清，鸭细小病毒(DPV)阳性血清、禽流感病毒(H9N2)阳性血清、新城疫病毒(NDV)阳性血清、DHAV-1阳性血清、鸭腺病毒(DADV)阳性血清、鸭坦布苏病毒(DTMUV)阳性血清均由本实验室制备和保存。
(2)III型鸭甲型肝炎病毒阻断ELISA抗体检测操作方法
a.用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒VLPs，每孔100μL，37℃1h，再4℃过夜。次日取出后，用0.05％ Tween-20 PBS(PBST，pH7.2)洗涤3次，每次5min；
b.用5％脱脂乳封闭酶标板，37℃2h，PBST洗涤3次；
c.加入抗体稀释液稀释100倍的待测血清、阴性和阳性血清，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3次；
d.加入DHAV-3VP1-Mab，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3次；
e.加入羊抗鼠二抗，1:5000稀释，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3次；
f.加入TMB显色液，100μL/孔，室温避光显色10min；
g.加入2M H2SO4终止液，50μL/孔，OD450nm酶标仪读取吸光度值，计算阻断率，阻断率(％)＝(阴性对照的吸光度值-待测血清的吸光度值)/阴性对照的吸光度值×100％。
(3)阻断ELISA反应条件的优化
3.1DHAV-3VLPs包被浓度和检测样品稀释度的最优条件
采用方阵法确定抗原包被浓度和血清抗体最佳检测浓度。将DHAV-3VLPs稀释为0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.8μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL和10μg/mL，共12个浓度梯度，同时，分别将SPF阴性血清与阳性血清按2倍倍比稀释直到1:256。
表2和表3为方阵滴定结果，结果显示，当阳性血清OD450nm值为0.148，阴性血清OD450nm值为1.866，PI值最大(见表2和表3)，因此最佳抗原包被浓度为1μg/mL，最佳血清稀释度为1:32。
表2
表3
3.2最佳抗原包被条件确定
为确定最佳抗原包被条件，设置37℃1h、37℃2h、4℃12h和37℃1h+4℃过夜，37℃2h+4℃过夜，抗原包被条件考察结果如表4所示，表4为最佳抗原包被条件测定结果，结果显示，PI值最大是37℃2h+4℃过夜，即为抗原包被最佳条件。
表4
3.3最佳单克隆抗体浓度的确定
将单抗以1:1000、1:2000、1:3000、1:4000和1:5000稀释，以确定最佳浓度。单克隆抗体浓度考察结果如表5所示，结果显示，PI最大时的抗体稀释度是1:2000，即为最佳抗体稀释浓度。
表5
3.4封闭液的确定
为了确定最佳的封闭液，设置封闭液条件为1％ BSA、5％脱脂乳和10％ FBS。封闭液的考察结果如表6所示，结果显示，PI值最大时的封闭液为5％脱脂乳，即为最佳封闭液。
表6
3.5封闭时间的确定
为了确定最佳封闭时间，分别设置条件为37℃，分别30min、60min、90min和120min。封闭时间考察结果如表7所示，结果显示，PI值最大为37℃120min，即为最佳封闭时间。
表7
3.6血清一抗反应时间确定
为确定最佳血清反应时间，分别设置37℃30min、37℃60min、37℃90min和37℃120min。血清反应时间考察结果如表8所示，结果显示，PI值最大为37℃60min，即为最佳血清反应时间。
表8
3.7单抗反应时间确定
为确定最佳单抗反应时间，分别设置37℃30min、37℃60min和37℃90min。单抗反应时间考察结果如表9所示，结果显示，PI值最大为37℃60min，即为最佳单抗反应时间。
表9
3.8酶标二抗浓度确定
为确定酶标二抗浓度，将酶标二抗按1:3000、1:5000和1:8000稀释。酶标二抗浓度考察结果如表10所示，结果显示，PI值最大是1:5000，即为最佳二抗浓度。
表10
3.9最佳二抗反应时间确定
为确定最佳二抗反应时间，分别设置37℃30min、37℃60min和37℃90min。二抗反应时间考察结果如表11所示，结果显示，PI值最大为37℃60min，即为最佳二抗反应时间。
表11
3.10显色液反应时间确定
为确定最佳显色反应时间，分别设置5min、10min和15min，显色反应时间考察结果如表12所示，结果显示，PI值最大时的显色时间是15min，即为最佳显色时间。
表12
3.11阻断ELISA方法的临界值判定
利用优化的阻断ELISA方法对100份不含DHAV抗体的鸭阴性血清进行检测，测得个血清样品OD450nm，计算阻断率。然后计算出100份阴性血清的平均阻断率和标准偏差(SD)，以确定结果判定的临界值(见图2)。
利用阻断ELISA对100份DHAV鸭阴性血清检测数据计算可得阻断率平均值X为11.09％，标准差S为9.04％，根据公式X+2S＝29.17％，X+3S＝38.21％，确定本方法的判定标准为：PI≥38.21％判为阳性；PI≤29.17％时判为阴性；29.17％＜PI＜38.21％时判为可疑，需再次复检一次，若仍为PI＜29.17％判为阴性，否则判为阳性。
由上考察结果可知：III型鸭甲型肝炎病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒在使用中的最优参数为：DHAV VLPs抗原包被浓度为1μg/mL、单克隆抗体DHAV3VP1-Mab按1:2000稀释、III型鸭甲型肝炎病毒标准阴阳性血清按1:32稀释、羊抗鼠酶标二抗按1:5000稀释、采用的包被缓冲液的pH为9.6、采用的洗涤缓冲液为pH7.4的PBST、采用的显色液为TMB显色液、采用的终止液为2MH2SO4、采用的封闭液为5％脱脂乳。
实施例4一种检测III型鸭甲型肝炎病毒的试剂盒
本发明提供一种检测III型鸭甲型肝炎病毒的试剂盒，所述试剂盒包括：包被酶标板、阳性血清、阴性血清、样品稀释液、辣根过氧化物酶、显色液、终止液、封板膜和说明书。
实施例5检测III型鸭甲型肝炎病毒的试剂盒的使用方法
(1)包被抗原：用包被缓冲液将DHAV-3VLPs稀释至1μg/mL，向微孔中每孔加100μL，37℃2h，再4℃过夜进行包被。甩掉孔内液体(尽量拍干孔里液体)，洗涤三次，每次5min，拍干。
(2)封闭：用洗涤液PBST配制1％ BSA作为封闭液，加满，37℃，孵育120min，洗涤三次，每次5min，拍干。
(3)孵育一抗：将待测血清稀释至1:32，向微孔中每孔加100μL，37℃，孵育60min，洗涤三次，每次5min，拍干。
(4)加单克隆抗体：将DHAV-3VP1-Mab按1:2000稀释，向微孔中每孔加100μL，37℃，孵育60min，洗涤三次，每次5min，拍干。
(5)酶标抗体：将酶标二抗HRP-polyclonal goat anti mouse IgG稀释至1:5000，每孔加100μL，37℃，孵育60min，洗涤三次，每次5min，拍干。
(6)显色液：每孔加显色液TMB 50μL，37℃，15min。
(7)终止液：每孔加2M H2SO4终止液50μL。
(8)结果判定：酶标仪测定OD450nm值，根据阴阳性对照判定结果。
实施例6方法特异性检验
用已建立的阻断ELISA方法，对DRV、DPV、RA、PM、PM、AIV、NDV和DHAV阳性血清进行检测，根据抑制率(PI)临界值判断该方法的特异性。以DHAV阴阳性血清为对照，用建立的阻断ELISA法对DRV、DPV、RA、PM、PM、AIV和NDV常见鸭病毒病和细菌病阳性血清进行检测，检测结果显示，除DHAV阳性血清为阳性反应外，其他几种鸭病血清均为阴性反应(见图3)，证明该阻断ELISA方法可特异性检测DHAV抗体，并于其他几种鸭病血清无交叉反应。表明该方法具有较强的特异性。
实施例7方法敏感性检验
通过将阴阳性血清(阳性血清1号、阳性血清2号和阳性血清3号)分别1:100、1:200、1:300至1:1000稀释后，测得每个稀释度下的OD450nm值，完成对阻断ELISA的敏感性检验。结果如图4所示，结果显示，当血清稀释至1:600时，仍为阳性，当血清稀释至1:700时，为阴性，因此，该方法对血清的检测限度可达到1:600。
实施例8重复性试验
同一批次包被封闭的ELISA板中，随机取出1块，检测2份不同阻断率的阳性血清样品和3份阴性血清样品，每个血清样本设置3个重复，在同一条件下进行检测，计算各血清样本的批内变异系数；3个不同批次的阻断ELISA板中，各随机取出1块，在同一条件下对5份血清样本进行检测，计算各血清的批间变异系数。
取5份鸭血清样品进行阻断ELISA检测方法的重复性试验，结果如表13所示，5份鸭血清在批内重复性试验的变异系数为1.04％-4.56％。批间重复试验的结果如表14所示，批间重复试验的变异系数为1.06％-4.98％，均小于5％，表明建立的阻断ELISA检测方法具有良好的重复性。
表13
表14
实施例9采用临床鸭血清进行检测
取100份临床鸭血清，分别用鸭胚中和试验、间接ELISA结果和本研究所建立的阻断ELISA方法进行对比检测，依据检测结果计算本方法与中和试验、间接ELISA的检测符合率。所述阻断ELISA方法与间接ELISA的对比检测结果如表15所示，结果显示本发明所述阻断ELISA方法与间接ELISA的阳性符合率为90％，阴性符合率100％，总符合率为93％，所述阻断ELISA方法与血清中和实验的对比检测结果如表16所示，结果显示本发明所述阻断ELISA方法与血清中和实验的阳性符合率为100％，阴性符合率为90.24％，总符合率为96.096％。
表15
表16
综上所述，本发明成功制备了1株DHAV-3VP1-Mab，所述单克隆抗体具有较强的特异性和中和活性，鸭胚中和效价可达10-3.5。本发明建立了一种以杆状病毒表达系统表达的DHAV-3VLPs作为包被抗原，DHAV-3VP1-Mab作为检测抗体的阻断ELISA的试剂盒，所述试剂盒能特异性地识别DHAV-3阳性血清，而与其它鸭中常见病毒抗体阳性血清无交叉反应；重复性实验表明，批间和批内的变异系数均小于5％；敏感性结果显示该方法的检测限度可达1:600；符合性试验显示该阻断ELISA方法与间接ELISA的阳性符合率为90％，阴性符合率100％，总符合率为93％，与血清中和实验的阳性符合率为93.65％，阴性符合率为100％，总符合率为96％。表明所述试剂盒在临床应用中具有良好的可行性。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一株产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株DHAV3 VP1-Mab 4B8，保藏在武汉大学保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCCNO:C202375，保藏日期为2023年4月18日。
2.一种抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体由权利要求1中所述的杂交瘤细胞株产生。
3.权利要求1所述的产生抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株和/或权利要求2所述的抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体在制备诊断、检测或治疗III型鸭甲型肝炎病毒的产品中的应用。
4.一种检测III型鸭甲型肝炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求2所述的抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的检测III型鸭甲型肝炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为阻断ELISA试剂盒。
6.根据权利要求4或5所述的检测III型鸭甲型肝炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：包被酶标板、阳性血清、阴性血清、包被缓冲液、洗涤缓冲液、样品稀释液、辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体、封闭液、显色液、终止液、封板膜或说明书中任意一种或至少两种的组合。
7.根据权利要求6所述的检测III型鸭甲型肝炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述包被酶标板以III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒作为包被抗原；
优选地，所述III型鸭甲型肝炎病毒样颗粒包括III型鸭甲型肝炎病毒VLPs P1抗原和III型鸭甲型肝炎病毒VLPs 3CD抗原；
优选地，所述III型鸭甲型肝炎病毒VLPs P1抗原中包括III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白；
优选地，所述包被抗原的使用浓度为0.8-1.2μg/mL。
8.根据权利要求7所述的检测III型鸭甲型肝炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(1)将待测血清样品与包被抗原作用后，加入抗III型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体、酶标二抗、显色液和终止液反应；
(2)采用酶标仪读取吸光度值OD450nm，并按公式：
阻断率(％)＝(阴性对照孔平均OD450nm值-样品孔平均OD450nm值)/阴性对照孔平均OD450nm值×100％，计算待测血清样品的阻断率，判定检测结果。
9.根据权利要求8所述的检测III型鸭甲型肝炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述检测结果的判定标准为：
阻断率≥38.2％时为III型鸭甲型肝炎病毒抗体阳性；阻断率≤29.2％时为III型鸭甲型肝炎病毒抗体阴性；29.2％＜阻断率＜38.2％时为可疑，需重复检测，若重复检测结果阻断率仍小于38.2％，则判定为III型鸭甲型肝炎病毒抗体阴性。
10.权利要求4-9中任一项所述的检测III型鸭甲型肝炎病毒的试剂盒在制备诊断或检测鸭病毒性肝炎产品中的应用。
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