CN112881710B - 一种用于检测口蹄疫病毒抗体的抑制elisa方法及应用 - Google Patents

一种用于检测口蹄疫病毒抗体的抑制elisa方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112881710B
CN112881710B CN202110154139.1A CN202110154139A CN112881710B CN 112881710 B CN112881710 B CN 112881710B CN 202110154139 A CN202110154139 A CN 202110154139A CN 112881710 B CN112881710 B CN 112881710B
Authority
CN
China
Prior art keywords
serum
foot
mouth disease
antibody
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110154139.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112881710A (zh
Inventor
周广青
马军武
邵军军
常惠芸
龚真莉
郭建宏
祁淑芸
李苗苗
何继军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Original Assignee
Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS filed Critical Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority to CN202110154139.1A priority Critical patent/CN112881710B/zh
Publication of CN112881710A publication Critical patent/CN112881710A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112881710B publication Critical patent/CN112881710B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/085—Picornaviridae, e.g. coxsackie virus, echovirus, enterovirus
    • G01N2333/09—Foot-and-mouth disease virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于检测口蹄疫病毒抗体的抑制ELISA方法及应用，属于生物技术技术领域，本发明利用将阴阳性血清及被检血清直接在已包被捕获抗体的ELISA板上稀释后紧接着加入等量的稀释至工作浓度的病毒抗原，同时设置至少4孔病毒抗原对照（预先加入等体积的血清稀释液），被检血清及阴阳性血清中口蹄疫型特异抗体抑制病毒抗原与ELISA板上的捕获抗体结合，判定参照液相阻断ELISA方法，以病毒抗原对照孔OD值平均值的50%作为病毒抗原被50%抑制的临界值，成功地建立起了抑制ELISA方法，可用于检测口蹄疫抗体。

Description

一种用于检测口蹄疫病毒抗体的抑制ELISA方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术技术领域，涉及一种用于检测口蹄疫病毒抗体的新方法，特别涉及一种用于检测口蹄疫病毒抗体的抑制ELISA方法及应用。
背景技术
口蹄疫（Foot and Mouth Disease, FMD）是由口蹄疫病毒(Foot and MouthDisease Virus, FMDV)引起的猪、牛、羊等偶蹄动物易感的一种急性、热性、高度接触性传染病，被感染动物多以在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水泡性疹为主要临床特征，该病传播途径多、速度快，每次爆发均会给当地的畜牧养殖业造成巨大经济损失。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须申报的传染病，我国也将其列在一类动物传染病的首位。口蹄疫病毒在全世界主要有七个血清型:O、A、亚洲1、C型及南非1、2、3型，疫苗免疫不能使各型之间交叉保护。现阶段我国主要针对O、A和亚洲1型口蹄疫病毒进行疫苗接种。
口蹄疫血清型特异性抗体检测是疫苗免疫效果评估及流行病学调查采用的主要血清学调查手段之一。液相阻断ELISA方法检测口蹄疫抗体是世界动物卫生组织指定的参考方法，固相竞争ELISA方法在口蹄疫抗体检测上敏感性和特异性均与之接近，所用到的关键试剂及操作程序相似；基于单克隆抗体发展起来的抗体阻断ELISA方法，操作简便、省时，具有较高的特异性。口蹄疫疫苗免疫动物抗体检测是我国每年口蹄疫防疫程序中要求必检的内容。
目前，液相阻断ELISA方法是农业部指定口蹄疫免疫抗体检测方法，被全国各级兽医诊断实验室广泛采用，由于该方法操作步骤繁琐、用时长，容易造成操作失误，给该方法的进一步推广应用带来了一定的技术障碍。固相竞争ELISA方法由于其在在方法和步骤及检测时间上与液相阻断ELISA方法接近，更由于其在猪的血清抗体检测上敏感性较低，所以一直也没有得到广泛应用。虽然抗体阻断ELISA方法检测口蹄疫抗体的敏感性和特异性不如液相阻断ELISA方法，但由于其操作步骤简便、用时短，越来越多的被用于口蹄疫抗体的检测。
口蹄疫病毒包括完整病毒粒子（146S）、空衣壳(76S)、病毒感染相关肽(45S)、小分子蛋白（12S），146S抗原是口蹄疫疫苗中使动物肌体产生保护性抗体的主要免疫成分。纯化146S抗原免疫实验动物制备的抗血清常被用作试剂材料，是液相阻断ELISA、固相竞争ELISA、间接夹心ELISA共同采用的技术方案。单克隆抗体阻断ELISA所用的捕获抗原是口蹄疫VP1 基因的表达蛋白，由于口蹄疫病毒基因不同亚型之间的变异比较大，降低了该方法检测的敏感性。
如何对现有方法进行优化创新，是建立口蹄疫抗体检测新方法需要解决的一个关键问题。
发明内容
为了解决如何对现有方法进行优化创新以建立口蹄疫抗体检测新方法的问题，本发明的目的一在于提供一种用于检测口蹄疫病毒抗体的抑制ELISA方法，目的二在于提供基于所述抑制ELISA方法的检测试剂盒，目的三在于提供所述抑制ELISA在口蹄疫病毒抗体检测方面的应用。本发明利用将阴阳性血清及被检血清直接在已包被捕获抗体的ELISA板上稀释后紧接着加入等量的稀释至工作浓度的病毒抗原，同时设置至少4孔病毒抗原对照（预先加入等体积的血清稀释液），被检血清及阴阳性血清中口蹄疫型特异抗体抑制病毒抗原与ELISA板上的捕获抗体结合，判定参照液相阻断ELISA方法，以病毒抗原对照孔OD值平均值的50%作为病毒抗原被50%抑制的临界值，成功地建立起了抑制ELISA方法，可用于检测口蹄疫抗体。
新方法应该具有液相阻断ELISA检测同样的敏感性、特异性和稳定性，具有单克隆抗体阻断ELISA一样的操作简便性，并且能最大限度的减少操作造成的试验失败。
本发明综合分析了口蹄疫血清抗体检测的液相阻断ELISA方法、固相竞争ELISA方法、抗体阻断ELISA方法。液相阻断ELISA方法测定抗体需要被检血清和抗原首先在液相中发生充分中和反应后再移至已包被兔抗口蹄疫病毒血清作为捕获抗体的酶标板上；固相竞争ELISA方法需要将抗原首先包被或被抗体捕获在酶标板上，将被检血清、阴阳性对照血清按照要求在ELISA板上稀释后加入一种竞争性抗体；抗体阻断ELISA方法是将被检血清加入已包被抗原的ELISA板上充分反应后加入一种口蹄疫特异单克隆抗体标记的酶标二抗。笔者从中得到启发，首先将兔抗口蹄疫病毒血清包被在ELISA板上，在ELISA板上直接将被检血清、阴阳性对照血清按要求作系列稀释，紧接着加入等体积的稀释至工作浓度的口蹄疫病毒抗原。被检血清、阴阳性血清中的口蹄疫抗体就抑制病毒抗原与包被在ELISA板上的捕获抗体结合，基于此原理，本发明成功建立了一种检测口蹄疫抗体的新技术，本发明将这种ELISA方法命名为抑制ELISA方法。
本发明采用的具体方案为：
一种用于检测口蹄疫病毒抗体的抑制ELISA方法，以液相阻断ELISA方法为基础，在已包被口蹄疫型特异抗体的ELISA板上将被检血清和阴阳性对照血清进行系列稀释后紧接着加入稀释至工作浓度的口蹄疫灭活病毒抗原，在所述ELISA板上设置至少4孔病毒抗原对照；孵育洗涤后加入检测性抗体(口蹄疫豚鼠抗血清)；孵育后加入酶标抗体，TMB底物显色终止后450nm波长读取OD值。
具体地，所述抑制ELISA方法，包括以下步骤：
步骤一、包被ELISA板：用pH值9.6的0.05M碳酸盐缓冲液将血清型特异的兔抗口蹄疫病毒血清稀释并包被ELISA板，100µl/孔，室温过夜，PBST洗板5次，干燥处理后真空包装，4℃保存；
步骤二、血清稀释及抗原反应：在已包被兔抗口蹄疫病毒血清的ELISA板上按每孔100µl量加入pH值7.4的PBST，将阳性对照血清、阴性对照血清及被检血清按要求进行2倍连续稀释后紧接着加入稀释至工作浓度的病毒抗原，每孔100µl，每块ELISA板均设置至少4孔病毒抗原对照；ELISA板的反应孔内均为200µl/孔，封板，震荡， 37℃孵育30分钟；
步骤三、将经步骤二反应的ELISA板用PBST洗板3~5 次，甩干，加入豚鼠抗口蹄疫病毒血清，100µl/孔，封板，37℃ 孵育30分钟；
步骤四、将经步骤三反应的ELISA板用PBST洗板3~5 次，甩干，加入酶标抗体，100µl/孔，封板，37℃孵育30分钟；所述酶标抗体为兔抗豚鼠IgG-辣根过氧化物酶结合物；
步骤五、将经步骤三反应的ELISA板用PBST洗板3~5 次，甩干，加入单组分TMB底物溶液，100µl/孔，37℃孵育10分钟后再每孔加入100µl浓度为1.25M的H2SO4终止反应，酶标仪450nm波长下读取吸光值；
步骤六：结果判定：以病毒抗原对照4孔OD值平均值的50%作为病毒抗原被抑制50%的临界值，将阳性对照血清、阴性对照血清和被检血清相应孔的OD值与临界值相比较，某份血清抗体效价即为该份血清稀释孔中OD值略高于临界值与略低于临界值的相邻两孔对应的抗体滴度的平均值；抗体效价＞90判为口蹄疫抗体阳性。
具体地，所述病毒抗原为O型FMDV抗原，亚洲I型FMDV抗原或A型FMDV抗原。
具体地，所述病毒抗原是经口蹄疫病毒灭活得到或经口蹄疫灭活疫苗破乳后得到。
本发明还请求保护一种用于检测口蹄疫病毒抗体的抑制ELISA试剂盒，包括ELISA板、兔抗口蹄疫病毒血清、豚鼠抗口蹄疫病毒血清、酶标抗体、口蹄疫病毒抗原、阳性对照血清、阴性对照血清、PBST稀释液、单组分TMB溶液和H2SO4溶液；
所述酶标抗体为兔抗豚鼠IgG-辣根过氧化物酶结合物；
所述阳性对照血清为与兔抗口蹄疫病毒血清同源的口蹄疫灭活疫苗免疫牛制备的高免血清；
所述阴性对照血清为口蹄疫抗体阴性的新生牛血清；
所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
步骤一、包被ELISA板：用pH值9.6的0.05M碳酸盐缓冲液将血清型特异的兔抗口蹄疫病毒血清稀释并包被ELISA板，100µl/孔，室温过夜，PBST洗板5次，干燥处理后真空包装，4℃保存；
步骤二、血清稀释及抗原反应：在已包被兔抗口蹄疫病毒血清的ELISA板上按每孔100µl量加入pH值7.4的PBST，将阳性对照血清、阴性对照血清及被检血清按要求进行2倍连续稀释后紧接着加入稀释至工作浓度的病毒抗原，每孔100µl，每块ELISA板均设置至少4孔病毒抗原对照；ELISA板的反应孔内均为200µl/孔，封板，震荡， 37℃孵育30分钟；
步骤三、将经步骤二反应的ELISA板用PBST洗板3~5 次，甩干，加入豚鼠抗口蹄疫病毒血清，100µl/孔，封板，37℃ 孵育30分钟；
步骤四、将经步骤三反应的ELISA板用PBST洗板3~5 次，甩干，加入酶标抗体，100µl/孔，封板，37℃孵育30分钟；所述酶标抗体为兔抗豚鼠IgG-辣根过氧化物酶结合物；
步骤五、将经步骤三反应的ELISA板用PBST洗板3~5 次，甩干，加入单组分TMB底物溶液，100µl/孔，37℃孵育10分钟后再每孔加入100µl浓度为1.25M的H2SO4终止反应，酶标仪450nm波长下读取吸光值；
步骤六：结果判定：以病毒抗原对照4孔OD值平均值的50%作为病毒抗原被抑制50%的临界值，将阳性对照血清、阴性对照血清和被检血清相应孔的OD值与临界值相比较，某份血清抗体效价即为该份血清稀释孔中OD值略高于临界值与略低于临界值的相邻两孔对应的抗体滴度的平均值；抗体效价＞90判为口蹄疫抗体阳性。
本发明还另外请求保护所述抑制ELISA方法或所述ELISA试剂盒在口蹄疫病毒抗体检测方面的应用。
作为口蹄疫抗体检测的抑制ELISA 方法，它继承了液相阻断ELISA方法用于测定血清抗体时可定性、定量、稳定、敏感、特异、可批量检测等方面的所有优点，又减少了液相阻断ELISA方法需要抗原抗体预先反应的步骤；与抗体阻断ELISA方法一样简便、省时，全部操作可在2个小时内完成，试验中除抗原之外所用到的其他关键试剂均以工作液的形式提供，减少了操作人员自行配制的步骤，极大的降低了试验操作过程中的人为失误。利用该项技术发明笔者已经初步建立起口蹄疫O型、亚洲1型和A型抗体检测的抑制ELISA方法。
有益效果：
1、本发明创造性的解决了被检血清及捕获抗体同时与病毒抗原感作的难题，采用从口蹄疫灭活疫苗破乳得到检测用病毒抗原，通过上述检测方法解决了试验操作过程中各种试剂需要临时配制、操作繁琐、不稳定、费时的难题。因此，本发明成功的建立了与常规液相阻断ELISA方法相比较，在检测口蹄疫抗体时操作更为简便、省时、稳定的抑制ELISA方法，为口蹄疫免疫抗体监测、疫苗免疫效果评估、流行病学调查、免疫指导等提供了新的技术支持。
2、本发明所述抑制ELISA方法与液相阻断ELISA方法测定血清抗体相比，虽然所用的关键试剂（兔抗口蹄疫病毒血清、豚鼠抗口蹄疫病毒血清、酶标抗体）相同，但是液相阻断ELISA方法测定抗体需要将抗原、抗体预先在反应板上充分作用后再转移至ELISA板上；而抑制ELISA方法只需要将被检血清直接在ELISA板上稀释后加入病毒抗原。反应时间上抑制ELISA方法完整操作过程可以在2小时内完成，而液相阻断ELISA方法则需要2天。
3、本发明将被检血清直接在包被有捕获抗体的ELISA板上稀释后加入病毒抗原，被检血清中的口蹄疫型特异抗体抑制病毒抗原与捕获抗体结合，或者说，被检血清中的特异抗体和捕获抗体对病毒抗原发生竞争反应，相比于将抗原抗体预先充分反应后再与捕获抗体作用，反应过程和原理均不相同，而且，采用的关键试剂用量较小，减少了成本。
4、本发明在国内外率先突破了液相阻断ELISA、固相竞争ELISA和抗体阻断ELISA方法的利用，克服了液相阻断ELISA方法操作繁琐、费时、容易造成人为试验失败等方面的不足，检测敏感性与液相阻断ELISA一致，提高了检测特异性，是口蹄疫抗体检测更为理想、适用的ELISA方法。
具体实施方式
本发明所采取的技术方案步骤如下：
1． 通过利用破乳的方法对口蹄疫灭活疫苗破乳后得到口蹄疫病毒抗原，作为抗血清制备抗原和检测用到的病毒抗原；
2．口蹄疫病毒146S抗原纯化（蔗糖密度梯度离心法） ；
3．兔抗口蹄疫病毒血清、豚鼠抗口蹄疫病毒血清及阳性参考血清制备；
4． 阳性对照血清抗体效价测定（液相阻断ELISA方法）；
5．操作步骤优化；
6．结果判定；
7．敏感性和特异性分析；
8．与液相阻断ELISA方法符合性（敏感性、特异性）。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1利用抑制ELISA测定O型口蹄疫抗体方法的建立和应用
1材料和方法
1.1口蹄疫病毒抗原、抗血清制备
1.1.1 FMDV抗原制备及146S抗原纯化：将口蹄疫灭活疫苗（O/Mya98株）与破乳剂按一定比例混合，震荡分层后经3000rpm，4℃，离心10分钟，小心吸取下层抗原液。取100ml抗原液，45000rmp, 4℃超速离心1h，将离心管底壁的沉淀用pH值7.6PBS重悬至2ml，经蔗糖密度梯度（45%、35%、25%、15%）35000rpm,4℃离心2.5小时，按0.5ml取样并合并同一级峰，并经260nm紫外分光光度仪检测，收集含口蹄疫完整病毒粒子146S抗原的吸收峰（第二峰）合并。
1.1.2 O型兔抗口蹄疫病毒血清：选取健康2.0kg左右的健康兔子，将纯化的146S抗原与等量的佐剂乳化后免疫兔子，于第30天颈部动脉放血并分离血清，分装，贴签，-70℃冻存。
1.1.3 O型豚鼠抗口蹄疫病毒血清：以与兔抗血清同源的FMDV纯化的146S抗原免疫豚鼠，第30天心脏采血并分离血清，分装，贴签，-70℃冻存。
1.1.4酶标抗体：即兔抗豚鼠IgG-辣根过氧化物酶结合物，sigma公司购买，-70℃冻存。
1.1.5 O型口蹄疫抗体阳性血清：由与兔抗血清同源的口蹄疫灭活疫苗免疫牛制备的高免血清，首次免疫后第30天加强免疫一次，二免后2周采血并分离血清，分装，贴签，-70℃冻存。
1.1.6口蹄疫抗体阴性血清：为购买口蹄疫抗体阴性的新生牛血清。
1.2方法
2.1 O型口蹄疫抗体阳性血清效价测定
用口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒（兰州兽医研究所）测定。
2.2抗血清工作浓度的确定
兔抗口蹄疫病毒血清、豚鼠抗口蹄疫病毒血清、酶标抗体，以阳性血清抗体效价为参照，依次确定各试剂的工作浓度。
2.3抗原工作浓度的确定
设置O型阳性血清对照、A型及亚洲1型高免血清对照，阳性对照抗体效价与已知相符合，测定A型和亚洲1型高免血清抗体效价不大于64，选择合适的病毒抗原的稀释滴度。
2.4 操作步骤优化
2.4.1血清稀释及抗原反应
在已包被O型口蹄疫病毒兔抗血清的ELISA板上，按每孔100µl量加入pH值7.4的PBST，将阴性、阳性对照血清及被检血清按要求进行2倍连续稀释，紧接着加入稀释至工作浓度的O型口蹄疫病毒抗原，每孔100µl，每块反应板均设置至少4孔病毒抗原对照（预先加入100µl的PBST），最终ELISA反应板内液体量均为200µl/孔，封板膜封板，震荡， 37℃孵育30分钟。
2.4.2 O型口蹄疫病毒豚鼠抗血清工作液
将上步反应的ELISA板用PBST洗板3~5 次，甩干，加入豚鼠抗血清，100µl/孔，封板，37℃ 孵育30分钟。
2.4.3酶标抗体（兔抗豚鼠IgG-辣根过氧化物酶结合物）
同上洗板3~5次，加入酶标抗体，100µl/孔，封板，37℃孵育30分钟。
2.4.4底物及终止反应
同上洗板3~5次，加入单组分TMB底物溶液，100µl/孔，37℃孵育10分钟后再每孔加入100µl的1.25%H2SO4终止反应，酶标仪450nm波长下读取吸光值。
2.4.5结果判定
以病毒抗原对照4孔OD值平均值的50%作为病毒抗原被抑制50%的临界值，将阴、阳性对照血清和被检血清相应孔的OD值与临界值相比较，某份血清抗体效价即为该份血清稀释孔OD值略高于临界值与略低于临界值孔（相邻两孔）对应的抗体滴度的平均值。抗体效价＞90判为O型口蹄疫抗体阳性，≤32判为O型口蹄疫抗体阴性，32~64之间判为可疑。
2.5与液相阻断ELISA方法的符合性（敏感性和特异性）
O型口蹄疫灭活疫苗免疫动物血清60份（牛20份，羊20份，猪20份），亚洲1型口蹄疫灭活疫苗免疫牛血清30份，A型口蹄疫灭活疫苗免疫牛血清30份，口蹄疫抗体阴性动物30份（牛15份，猪15份）。与液相阻断ELISA方法作平行检测。
2.6重复性
30份口蹄疫O型灭活疫苗免疫动物血清利用抑制ELISA方法重复测定3次。
3结果
3.1 O型口蹄疫阳性血清抗体效价测定结果
O型口蹄疫阳性血清经液相阻断ELISA方法检测确定为720（512~1024），作为抑制ELISA的阳性对照血清，其抗体效价同样控制在720（512~1024）。
3.2抗血清工作浓度测定结果
经液相阻断ELISA方法测定，O型兔抗血清的工作浓度为1：1000，O型豚鼠抗血清的工作浓度为1：1000，酶标抗体的工作浓度为1：1000。O型兔抗血清以工作浓度包被ELISA板，4℃保存；豚鼠抗血清和酶标抗体均稀释至工作浓度，4℃保存。
3.3病毒抗原浓度测定结果
病毒抗原对照4孔的OD值应不小于1.0，阳性血清的抗体效价为720，与其A型和亚洲1型口蹄疫高免血清的交叉反应均不大于64。若病毒抗原的工作浓度过高，则阳性血清的抗体效价会减小，敏感性降低；若病毒抗原的工作浓度过低，则阳性血清的抗体效价会升高，与其它型高免血清的交叉反应增大，特异性降低。
3.4操作步骤的优化结果
以满足抗原、抗体能充分反应为原则，血清、抗原在ELISA板上反应的时间为30分钟；豚鼠抗血清和酶标抗体的孵育时间以满足抗原对照OD值应不小于1.0 之间为原则，反应时间均为30分钟，TMB底物显色反应为10分钟。
3.5与液相阻断ELISA方法的符合结果（敏感性和特异性）
兰州兽医研究所生产的口蹄疫O型液相阻断ELISA方法抗体检测试剂盒，抗体效价≥128判为O型口蹄疫抗体阳性；抑制ELISA方法，抗体效价＞90判为O型口蹄疫抗体阳性（与OIE液相阻断ELISA检测试剂盒判定一致）。30份口蹄疫抗体阴性动物和60份O型口蹄疫灭活疫苗免疫动物的血清抗体效价测定：抑制ELISA方法与液相阻断ELISA方法测定的抗体效价的差异均在1个滴度以内，敏感性符合率为100%；30份A型灭活疫苗免疫动物（A型抗体效价均＞1024）和30份亚洲1型灭活疫苗免疫动物（亚洲1型抗体效价均＞1024），液相阻断ELISA方法的假阳性检出率为10%，抑制ELISA方法的假阳性检出率为5%，即检测特异性方面抑制ELISA方法比液相阻断ELISA高。
3.6重复性
对30份O型口蹄疫灭活疫苗经抑制ELISA方法重复检测3次，抗体效价完全一致的为24份，相差一个滴度内的为4份，相差超过1个滴度为2份，说明本方法重复性很好。
4结论
4.1本研究建立的测定O型口蹄疫免疫抗体的抑制ELISA方法，与液相阻断ELISA具有很好的符合性；敏感性一致的情况下，提高了检测特异性。抑制ELISA方法，抗体效价＞90判为O型口蹄疫抗体阳性，与OIE液相阻断ELISA方法的阳性判定相一致。
4.2抑制ELISA方法测定O型口蹄疫抗体，完整操作用时小于2个小时，与液相阻断ELISA方法抗原、抗体反应需要过夜，在不过夜的情况下也需要5个小时以上相比，极大提高了检测速度。
4.3抑制ELISA方法检测O型口蹄疫抗体在开发试剂盒的过程中，兔抗口蹄疫病毒血清已经预先包被在ELISA板上，豚鼠抗血清和酶标抗体均以工作液的形式提供，并以单组分TMB作为显色底物，减少了使用者在操作过程中关键试剂需要自己配制的环节，减少了人为操作不当造成的试验失败。该试剂盒的操作与液相阻断ELISA试剂盒相比更为便捷。
4.3经口蹄疫灭活疫苗破乳获得检测用抗原，扩大了口蹄疫病毒抗原的来源，并保证了口蹄疫病毒抗原是安全的。少量口蹄疫病毒抗原通过连续超速离心再经蔗糖密度梯度离心纯化的方式，减少了病毒抗原预浓缩造成的抗原损失，解决了在有限抗原量的情况下纯化制备抗血清的难题。
4.4本研究为测定O型口蹄疫免疫抗体检测提供了快速、敏感、特异、稳定的检测新技术。
实施例2 利用抑制ELISA测定亚洲1型口蹄疫抗体方法的建立和应用
1材料和方法
1.1口蹄疫病毒抗原、抗血清制备
1.1.1 FMDV抗原制备及146S抗原纯化：将口蹄疫灭活疫苗（JSL2006株）与破乳剂按一定比例混合，震荡分层后经3000rpm，4℃，离心10分钟，小心吸取下层抗原液。取100ml抗原液，45000rmp, 4℃超速离心1h，将离心管底壁的沉淀用pH值7.6PBS重悬至2ml，经蔗糖密度梯度（45%、35%、25%、15%）35000rpm离心2.5小时，按0.5ml取样并合并同一级峰，并经260nm紫外分光光度仪检测，收集含口蹄疫完整病毒粒子146S抗原的吸收峰（第二峰）合并。
1.1.2 亚洲1型兔抗口蹄疫病毒血清：选取健康2.0kg左右的健康兔子，将纯化的146S抗原与等量的佐剂乳化后免疫兔子，于第30天颈部动脉放血并分离血清，分装，贴签，-70℃冻存。
1.1.3 亚洲1型豚鼠抗口蹄疫病毒血清：以与兔抗血清同源的FMDV纯化的146S抗原免疫豚鼠，第30天心脏采血并分离血清，分装，贴签，-70℃冻存。
1.1.4酶标抗体：即兔抗豚鼠IgG-辣根过氧化物酶结合物，sigma公司购买，-70℃冻存。
1.1.5亚洲1型口蹄疫抗体阳性血清：由与兔抗血清同源的口蹄疫灭活疫苗免疫牛制备的高免血清，首次免疫后第30天加强免疫一次，二免后2周采血并分离血清，分装，贴签，-70℃冻存。
1.1.6口蹄疫抗体阴性血清：为购买口蹄疫抗体阴性的新生牛血清。
1.2方法
2.1亚洲1型口蹄疫抗体阳性血清效价测定
用口蹄疫亚洲1型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒（兰州兽医研究所）测定。
2.2抗血清工作浓度的确定
兔抗口蹄疫病毒血清、豚鼠抗口蹄疫病毒血清、酶标抗体，以阳性血清抗体效价为参照，依次确定各试剂的工作浓度。
2.3抗原工作浓度的确定
设置亚洲1型阳性血清对照、O型及A型高免血清对照，阳性对照抗体效价与已知相符合，测定O型和A型高免血清抗体效价不大于64，选择合适的病毒抗原的稀释滴度。
2.4 操作步骤优化
2.4.1血清稀释及抗原反应
在已包被亚洲1型口蹄疫病毒兔抗血清的ELISA板上，按每孔100µl量加入pH值7.4的PBST，将阴性、阳性对照血清及被检血清按要求进行2倍连续稀释，紧接着加入稀释至工作浓度的亚洲1型口蹄疫病毒抗原，每孔100µl，每块反应板均设置至少4孔病毒抗原对照（预先加入100µl的PBST），最终ELISA反应板内液体量均为200µl/孔，封板膜封板，震荡， 37℃孵育30分钟。
2.4.2亚洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清
将上步反应的ELISA板用PBST洗板3~5 次，甩干，加入豚鼠抗血清，100µl/孔，封板，37℃ 孵育30分钟。
2.4.3酶标抗体（兔抗豚鼠IgG-辣根过氧化物酶结合物）
同上洗板3~5次，加入酶标抗体，100µl/孔，封板，37℃孵育30分钟。
2.4.4底物及终止反应
同上洗板3~5次，加入单组分TMB底物溶液，100µl/孔，37℃孵育10分钟后再每孔加入100µl的1.25%H2SO4终止反应，酶标仪450nm波长下读取吸光值。
2.4.5结果判定
以病毒抗原对照4孔OD值平均值的50%作为病毒抗原被抑制50%的临界值，将阴、阳性对照血清和被检血清相应孔的OD值与临界值相比较，某份血清抗体效价即为该份血清稀释孔OD值略高于临界值与略低于临界值孔（相邻两孔）对应的抗体滴度的平均值。抗体效价＞90判为亚洲1型口蹄疫抗体阳性，≤32判为亚洲1型口蹄疫抗体阴性，32~64之间判为可疑。
2.5与液相阻断ELISA方法的符合性（敏感性和特异性）
亚洲1型口蹄疫灭活疫苗免疫动物血清60份（牛30份，羊30份），O型口蹄疫灭活疫苗免疫牛血清30份，A型口蹄疫灭活疫苗免疫牛血清30份，口蹄疫抗体阴性动物30份（牛15份，羊15份）。与液相阻断ELISA方法作平行检测。
2.6重复性
30份口蹄疫亚洲1型灭活疫苗免疫动物血清利用抑制ELISA方法重复测定3次。
3结果
3.1亚洲1型口蹄疫阳性血清抗体效价测定结果
亚洲1型口蹄疫阳性血清经液相阻断ELISA方法检测确定为720（512~1024），作为抑制ELISA的阳性对照血清，其抗体效价同样控制在720（512~1024）。
3.2抗血清工作浓度测定结果
经液相阻断ELISA方法测定，亚洲1型兔抗血清的工作浓度为1：1000，亚洲1型豚鼠抗血清的工作浓度为1：1000，酶标抗体的工作浓度为1：1000。亚洲1型兔抗血清以工作浓度包被ELISA板，4℃保存；豚鼠抗血清和酶标抗体均稀释至工作浓度，4℃保存。
3.3病毒抗原浓度测定结果
病毒抗原对照4孔的OD值应不小于1.0，阳性血清的抗体效价为720，与其O型和A型口蹄疫高免血清的交叉反应均不大于64。若病毒抗原的工作浓度过高，则阳性血清的抗体效价会减小，敏感性降低；若病毒抗原的工作浓度过低，则阳性血清的抗体效价会升高，与其它型高免血清的交叉反应增大，特异性降低。
3.4操作步骤的优化结果
以满足抗原、抗体能充分反应为原则，血清、抗原在ELISA板上反应的时间为30分钟；豚鼠抗血清和酶标抗体的孵育时间以满足抗原对照OD值应不小于1.0为原则，反应时间均为30分钟，TMB底物显色反应为10分钟。
3.5与液相阻断ELISA方法的符合结果（敏感性和特异性）
兰州兽医研究所生产的口蹄疫亚洲1型液相阻断ELISA方法抗体检测试剂盒，抗体效价≥128判为亚洲1型口蹄疫抗体阳性；抑制ELISA方法，抗体效价＞90判为亚洲1型口蹄疫抗体阳性（与OIE液相阻断ELISA检测试剂盒判定一致）。30份口蹄疫抗体阴性动物和60份亚洲1型口蹄疫灭活疫苗免疫动物的血清抗体效价测定：抑制ELISA方法与液相阻断ELISA方法测定的抗体效价的差异均在1个滴度以内，敏感性符合率为100%；30份O型灭活疫苗免疫动物（O型抗体效价均＞1024）和30份A型灭活疫苗免疫动物（A型抗体效价均＞1024），液相阻断ELISA方法的假阳性检出率为15%，抑制ELISA方法的假阳性检出率为10%，即检测特异性方面抑制ELISA方法比液相阻断ELISA高。
3.6重复性
对30份亚洲1型口蹄疫灭活疫苗经抑制ELISA方法重复检测3次，抗体效价完全一致的为22份，相差一个滴度内的为7份，相差超过1个滴度为1份，说明本方法重复性很好。
4结论
4.1本研究建立的测定亚洲1型口蹄疫免疫抗体的抑制ELISA方法，与液相阻断ELISA具有很好的符合性；敏感性一致的情况下，提高了检测特异性。抑制ELISA方法，抗体效价＞90判为亚洲1型口蹄疫抗体阳性，与OIE液相阻断ELISA方法的阳性判定相一致。
4.2抑制ELISA方法测定亚洲1型口蹄疫抗体，完整操作用时2个小时内，与液相阻断ELISA方法抗原、抗体反应需要过夜，在不过夜的情况下也需要5个小时以上相比，极大提高了检测速度。
4.3抑制ELISA方法检测亚洲1型口蹄疫抗体在开发试剂盒的过程中，兔抗口蹄疫病毒血清已经预先包被在ELISA板上，豚鼠抗血清和酶标抗体均以工作液的形式提供，并以单组分TMB作为显色底物，减少了使用者在操作过程中关键试剂需要自己配制的环节，减少了人为操作不当造成的试验失败。该试剂盒的操作与液相阻断ELISA试剂盒相比更为便捷。
4.3经口蹄疫灭活疫苗破乳获得检测用抗原，扩大了口蹄疫病毒抗原的来源，并保证了口蹄疫病毒抗原是安全的。少量口蹄疫病毒抗原通过连续超速离心再经蔗糖密度梯度离心纯化的方式，减少了病毒抗原预浓缩造成的抗原损失，解决了在有限抗原量的情况下纯化制备抗血清的难题。
4.4本研究为测定亚洲1型口蹄疫免疫抗体检测提供了快速、敏感、特异、稳定的检测新技术。
实施例3 利用抑制ELISA测定A型口蹄疫抗体方法的建立和应用
1材料和方法
1.1口蹄疫病毒抗原、抗血清制备
1.1.1 FMDV抗原制备及146S抗原纯化：将口蹄疫灭活疫苗（AF72株）与破乳剂按一定比例混合，震荡分层后经3000rpm，4℃，离心10分钟，小心吸取下层抗原液。取100ml抗原液，45000rmp, 4℃超速离心1h，将离心管底壁的沉淀用pH值7.6PBS重悬至4ml，经蔗糖密度梯度（45%、35%、25%、15%）35000rpm离心2.5小时，按0.5ml取样并合并同一级峰，并经260nm紫外分光光度仪检测，收集含口蹄疫完整病毒粒子146S抗原的吸收峰（第二峰）合并。
1.1.2 A型兔抗口蹄疫病毒血清：选取健康2.0kg左右的健康兔子，将纯化的146S抗原与等量的佐剂乳化后免疫兔子，于第30天颈部动脉放血并分离血清，分装，贴签，-70℃冻存。
1.1.3 A型豚鼠抗口蹄疫病毒血清：以与兔抗血清同源的FMDV纯化的146S抗原免疫豚鼠，第30天心脏采血并分离血清，分装，贴签，-70℃冻存。
1.1.4酶标抗体：即兔抗豚鼠IgG-辣根过氧化物酶结合物，sigma公司购买，-70℃冻存。
1.1.5 A型口蹄疫抗体阳性血清：由与兔抗血清同源的口蹄疫灭活疫苗免疫牛制备的高免血清，首次免疫后第30天加强免疫一次，二免后2周采血并分离血清，分装，贴签，-70℃冻存。
1.1.6口蹄疫抗体阴性血清：为购买口蹄疫抗体阴性的新生牛血清。
1.2方法
2.1 A型口蹄疫抗体阳性血清效价测定
用口蹄疫A型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒（兰州兽医研究所）测定。
2.2抗血清工作浓度的确定
兔抗口蹄疫病毒血清、豚鼠抗口蹄疫病毒血清、酶标抗体，以阳性血清抗体效价为参照，依次确定各试剂的工作浓度。
2.3抗原工作浓度的确定
设置A型阳性血清对照、O型及亚洲1型高免血清对照，阳性对照抗体效价与已知相符合，测定O型和亚洲1型高免血清抗体效价不大于64，选择合适的病毒抗原的稀释滴度。
2.4 操作步骤优化
2.4.1血清稀释及抗原反应
在已包被A型口蹄疫病毒兔抗血清的ELISA板上，按每孔100µl量加入pH值7.4的PBST，将阴性、阳性对照血清及被检血清按要求进行2倍连续稀释，紧接着加入稀释至工作浓度的A型口蹄疫病毒抗原，每孔100µl，每块反应板均设置至少4孔病毒抗原对照（预先加入100µl的PBST），最终ELISA反应板内液体量均为200µl/孔，封板膜封板，震荡， 37℃孵育30分钟。
2.4.2 A型口蹄疫病毒豚鼠抗血清
将上步反应的ELISA板用PBST洗板3~5 次，甩干，加入豚鼠抗血清，100µl/孔，封板，37℃ 孵育30分钟。
2.4.3酶标抗体（兔抗豚鼠IgG-辣根过氧化物酶结合物）
同上洗板3~5次，加入酶标抗体，100µl/孔，封板，37℃孵育30分钟。
2.4.4底物及终止反应
同上洗板3~5次，加入单组分TMB底物溶液，100µl/孔，37℃孵育10分钟后再每孔加入100µl的1.25%H2SO4终止反应，酶标仪450nm波长下读取吸光值。
2.4.5结果判定
以病毒抗原对照4孔OD值平均值的50%作为病毒抗原被抑制50%的临界值，将阴、阳性对照血清和被检血清相应孔的OD值与临界值相比较，某份血清抗体效价即为该份血清稀释孔OD值略高于临界值与略低于临界值孔（相邻两孔）对应的抗体滴度的平均值。抗体效价＞90判为A型口蹄疫抗体阳性，≤32判为A型口蹄疫抗体阴性，32~64之间判为可疑。
2.5与液相阻断ELISA方法的符合性（敏感性和特异性）
A型口蹄疫灭活疫苗免疫动物血清60份（牛20份，羊20份，猪20份），亚洲1型口蹄疫灭活疫苗免疫牛血清30份，O型口蹄疫灭活疫苗免疫牛血清30份，口蹄疫抗体阴性动物30份（牛15份，猪15份）。与液相阻断ELISA方法作平行检测。
2.6重复性
30份口蹄疫A型灭活疫苗免疫动物血清利用抑制ELISA方法重复测定3次。
3结果
3.1 A型口蹄疫阳性血清抗体效价测定结果
A型口蹄疫阳性血清经液相阻断ELISA方法检测确定为720（512~1024），作为抑制ELISA的阳性对照血清，其抗体效价同样控制在720（512~1024）。
3.2抗血清工作浓度测定结果
经液相阻断ELISA方法测定，A型兔抗血清的工作浓度为1：1000，A型豚鼠抗血清的工作浓度为1：1000，酶标抗体的工作浓度为1：1000。O型兔抗血清以工作浓度包被ELISA板，4℃保存；豚鼠抗血清和酶标抗体均稀释至工作浓度，4℃保存。
3.3病毒抗原浓度测定结果
病毒抗原对照4孔的OD值应处于1.0~2.0之间，阳性血清的抗体效价为720，与其O型和亚洲1型口蹄疫高免血清的交叉反应均不大于64。若病毒抗原的工作浓度过高，则阳性血清的抗体效价会减小，敏感性降低；若病毒抗原的工作浓度过低，则阳性血清的抗体效价会升高，与其它型高免血清的交叉反应增大，特异性降低。
3.4操作步骤的优化结果
以满足抗原、抗体能充分反应为原则，血清、抗原在ELISA板上反应的时间为30分钟；豚鼠抗血清和酶标抗体的孵育时间以满足抗原对照OD值应不小于1.0为原则，反应时间均为30分钟，TMB底物显色反应为10分钟。
3.5与液相阻断ELISA方法的符合结果（敏感性和特异性）
兰州兽医研究所生产的口蹄疫A型液相阻断ELISA方法抗体检测试剂盒，抗体效价≥128判为A型口蹄疫抗体阳性；抑制ELISA方法，抗体效价＞90判为A型口蹄疫抗体阳性（与OIE液相阻断ELISA检测试剂盒判定一致）。30份口蹄疫抗体阴性动物和60份A型口蹄疫灭活疫苗免疫动物的血清抗体效价测定：抑制ELISA方法与液相阻断ELISA方法测定的抗体效价的差异均在1个滴度以内，敏感性符合率为100%；30份O型灭活疫苗免疫动物（A型抗体效价均＞1024）和30份亚洲1型灭活疫苗免疫动物（亚洲1型抗体效价均＞1024），液相阻断ELISA方法的假阳性检出率为10%，抑制ELISA方法的假阳性检出率为6.7%，即检测特异性方面抑制ELISA方法比液相阻断ELISA高。
3.6重复性
对30份A型口蹄疫灭活疫苗经抑制ELISA方法重复检测3次，抗体效价完全一致的为20份，相差一个滴度内的为9份，相差超过1个滴度为1份，说明本方法重复性很好。
4结论
4.1本研究建立的测定A型口蹄疫免疫抗体的抑制ELISA方法，与液相阻断ELISA具有很好的符合性；敏感性一致的情况下，提高了检测特异性。抑制ELISA方法，抗体效价＞90判为A型口蹄疫抗体阳性，与OIE液相阻断ELISA方法的阳性判定相一致。
4.2抑制ELISA方法测定A型口蹄疫抗体，完整操作用时2个小时内，与液相阻断ELISA方法抗原、抗体反应需要过夜，在不过夜的情况下也需要5个小时以上相比，极大提高了检测速度。
4.3抑制ELISA方法检测A型口蹄疫抗体在开发试剂盒的过程中，兔抗口蹄疫病毒血清已经预先包被在ELISA板上，豚鼠抗血清和酶标抗体均以工作液的形式提供，并以单组分TMB作为显色底物，减少了使用者在操作过程中关键试剂需要自己配制的环节，减少了人为操作不当造成的试验失败。该试剂盒的操作与液相阻断ELISA试剂盒相比更为便捷。
4.3经口蹄疫灭活疫苗破乳获得检测用抗原，扩大了口蹄疫病毒抗原的来源，并保证了口蹄疫病毒抗原是安全的。少量口蹄疫病毒抗原通过连续超速离心再经蔗糖密度梯度离心纯化的方式，减少了病毒抗原预浓缩造成的抗原损失，解决了在有限抗原量的情况下纯化制备抗血清的难题。
4.4本研究为测定A型口蹄疫免疫抗体检测提供了快速、敏感、特异、稳定的检测新技术。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.抑制ELISA试剂在制备用于检测口蹄疫病毒抗体的试剂盒中的应用，其特征在于：在已包被口蹄疫型特异抗体的ELISA板上将被检血清和阴阳性对照血清进行系列稀释后紧接着加入稀释至工作浓度的病毒抗原，在所述ELISA板上设置至少4孔病毒抗原对照；孵育洗涤后加入检测性抗体；孵育后加入酶标抗体，TMB底物显色终止后450nm波长读取OD值；
所述口蹄疫型特异抗体为兔抗口蹄疫病毒血清；所述检测性抗体为豚鼠抗口蹄疫病毒血清；
所述抑制ELISA方法，包括以下步骤：
步骤一、包被ELISA板：用pH值9.6的0.05M碳酸盐缓冲液将兔抗口蹄疫病毒血清稀释并包被ELISA板，100µl/孔，室温过夜，PBST洗板5次，干燥处理后真空包装，4℃保存；
步骤二、血清稀释及抗原反应：在已包被兔抗口蹄疫病毒血清的ELISA板上按每孔100µl量加入pH值7.4的PBST，将阳性对照血清、阴性对照血清及被检血清按要求进行2倍连续稀释后紧接着加入稀释至工作浓度的病毒抗原，每孔100µl，每块ELISA板均设置至少4孔病毒抗原对照；ELISA板的反应孔内均为200µl/孔，封板，震荡， 37℃孵育30分钟；
步骤三、将经步骤二反应的ELISA板用PBST洗板3~5 次，甩干，加入豚鼠抗口蹄疫病毒血清，100µl/孔，封板，37℃ 孵育30分钟；
步骤四、将经步骤三反应的ELISA板用PBST洗板3~5 次，甩干，加入酶标抗体，100µl/孔，封板，37℃孵育30分钟；所述酶标抗体为兔抗豚鼠IgG-辣根过氧化物酶结合物；
步骤五、将经步骤四反应的ELISA板用PBST洗板3~5 次，甩干，加入单组分TMB底物溶液，100µl/孔，37℃孵育10分钟后再每孔加入100µl浓度为1.25M的H2SO4终止反应，酶标仪450nm波长下读取吸光值；
步骤六：结果判定：以病毒抗原对照4孔OD值平均值的50%作为病毒抗原被抑制50%的临界值，将阳性对照血清、阴性对照血清和被检血清相应孔的OD值与临界值相比较，某份血清抗体效价即为该份血清稀释孔中OD值略高于临界值与略低于临界值的相邻两孔对应的抗体滴度的平均值；抗体效价＞90判为口蹄疫抗体阳性；
以上步骤中，所述兔抗口蹄疫病毒血清的工作浓度、豚鼠抗口蹄疫病毒血清和酶标抗体的工作浓度均为1:1000，所述病毒抗原对照4孔的OD值不小于1.0。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述病毒抗原为O型FMDV抗原，亚洲I型FMDV抗原或A型FMDV抗原。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述病毒抗原是经口蹄疫病毒灭活得到或经口蹄疫灭活疫苗破乳后得到。
CN202110154139.1A 2021-02-04 2021-02-04 一种用于检测口蹄疫病毒抗体的抑制elisa方法及应用 Active CN112881710B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110154139.1A CN112881710B (zh) 2021-02-04 2021-02-04 一种用于检测口蹄疫病毒抗体的抑制elisa方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110154139.1A CN112881710B (zh) 2021-02-04 2021-02-04 一种用于检测口蹄疫病毒抗体的抑制elisa方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112881710A CN112881710A (zh) 2021-06-01
CN112881710B true CN112881710B (zh) 2022-04-22

Family

ID=76057153

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110154139.1A Active CN112881710B (zh) 2021-02-04 2021-02-04 一种用于检测口蹄疫病毒抗体的抑制elisa方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112881710B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113391061A (zh) * 2021-06-16 2021-09-14 王婷楠 动物免疫抗体在制备用于检测动物免疫药物中的用途

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007008092A2 (en) * 2005-07-08 2007-01-18 Panstwowy Instytut Weterynaryjny - Panstwowy Instytut Badawczy W Pulawach Diagnostic kit for the examination of animal sera for the presence of anti-rhd antibodies and a diagnostic kit for detecting the rhd virus
CN103884839A (zh) * 2012-12-19 2014-06-25 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种用于定量检测fmdv有效抗原的反向液相阻断elisa方法
CN104792990A (zh) * 2015-03-31 2015-07-22 洛阳莱普生信息科技有限公司 一种a型口蹄疫竞争elisa抗体检测试剂盒
CN108333352A (zh) * 2018-01-29 2018-07-27 江苏拜明生物技术有限公司 一种o型口蹄疫抗体的高通量检测方法
CN109682980A (zh) * 2019-03-05 2019-04-26 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种检测口蹄疫病毒o型保护性抗体的试剂盒和检测方法
CN110161237A (zh) * 2018-04-17 2019-08-23 云南省畜牧兽医科学院 一种延长保存期的口蹄疫病毒cELISA抗体检测试剂盒

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007008092A2 (en) * 2005-07-08 2007-01-18 Panstwowy Instytut Weterynaryjny - Panstwowy Instytut Badawczy W Pulawach Diagnostic kit for the examination of animal sera for the presence of anti-rhd antibodies and a diagnostic kit for detecting the rhd virus
CN103884839A (zh) * 2012-12-19 2014-06-25 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种用于定量检测fmdv有效抗原的反向液相阻断elisa方法
CN104792990A (zh) * 2015-03-31 2015-07-22 洛阳莱普生信息科技有限公司 一种a型口蹄疫竞争elisa抗体检测试剂盒
CN108333352A (zh) * 2018-01-29 2018-07-27 江苏拜明生物技术有限公司 一种o型口蹄疫抗体的高通量检测方法
CN110161237A (zh) * 2018-04-17 2019-08-23 云南省畜牧兽医科学院 一种延长保存期的口蹄疫病毒cELISA抗体检测试剂盒
CN109682980A (zh) * 2019-03-05 2019-04-26 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种检测口蹄疫病毒o型保护性抗体的试剂盒和检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112881710A (zh) 2021-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103076451B (zh) 一种o型口蹄疫146s抗原定量elisa检测试剂盒及其使用方法
US8114408B2 (en) Peptide fragments reacting specifically with antibodies against highly pathogenic newcastle disease virus and uses thereof
Malirat et al. Detection of cattle exposed to foot‐and‐mouth disease virus by means of an indirect ELISA test using bioengineered nonstructural polyprotein 3ABC
Yang et al. Development of a quick and simple detection methodology for foot-and-mouth disease virus serotypes O, A and Asia 1 using a generic RapidAssay Device
RU2689143C1 (ru) Усовершенствованный диагностический тест для csfv антител
Jiang et al. A simple and rapid colloidal gold-based immunochromatogarpic strip test for detection of FMDV serotype A
Watson et al. A multiplexed immunoassay for detection of antibodies against avian influenza virus
Yoon et al. Comparison of a commercial H1N1 enzyme-linked immunosorbent assay and hemagglutination inhibition test in detecting serum antibody against swine influenza viruses
JP2009537013A6 (ja) フラビウイルス特異的抗体の検出のための抗原捕捉抗デングＩｇＡ ＥＬＩＳＡ（ＡＣＡ−ＥＬＩＳＡ）
CN109851671B (zh) 检测口蹄疫o型广西株抗原的单克隆抗体及其应用
CN103884839A (zh) 一种用于定量检测fmdv有效抗原的反向液相阻断elisa方法
CN103091490B (zh) 一种a型口蹄疫146s抗原定量elisa检测方法及其试剂盒和应用
CN112881710B (zh) 一种用于检测口蹄疫病毒抗体的抑制elisa方法及应用
CN109682980B (zh) 一种检测口蹄疫病毒o型保护性抗体的试剂盒和检测方法
CN116840475A (zh) 夹心阻断elisa试剂在制备口蹄疫病毒抗体检测试剂盒中的应用
CN111398585B (zh) 一种特异性检测基孔肯雅病毒nsp1抗原的免疫诊断试剂盒
Florent et al. Enzyme linked immunosorbent assay used to monitor serum antibodies to bovine respiratory disease viruses
Alonso et al. Foot-and-mouth disease virus typing by complement fixation and enzyme-linked immunosorbent assay using monovalent and polyvalent antisera
CN116836938A (zh) 一株产生抗iii型鸭甲型肝炎病毒vp1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN103091270A (zh) 一种亚洲ⅰ型口蹄疫146s抗原定量elisa检测方法及其试剂盒和应用
Ukkonen et al. Detection of poliovirus antigen by enzyme immunoassay
CN107064488B (zh) 一种猪瘟病毒血清总抗体固相阻断elisa试剂盒所用抗原的制备方法
Chen et al. Differentiation of foot-and-mouth disease-infected pigs from vaccinated pigs using antibody-detecting sandwich ELISA
Du et al. Development and application of an indirect ELISA for the detection of gp45 antibodies to equine infectious anemia virus
CN111398594B (zh) 一种特异性检测黄热病毒ns1抗原的免疫诊断试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant