CN113391061A - 动物免疫抗体在制备用于检测动物免疫药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物免疫学技术领域，公开了一种动物免疫抗体在制备用于检测动物免疫药物中的用途，动物免疫抗体检测筛选方法包括：通过酶联免疫吸附试验筛选法，ELISA利用酶对底物的催化反应特性，通过采用2块稀释板和1块酶标反应板，将酶于抗体偶联并使之参与到抗原抗体反应中，检测血清样品，依据酶催化底物所发生的变色反应程度，筛选出阳性样品，指示和量化抗原抗体的反应水平。本发明检测方法简单，检测结果准确可靠，检测效率高，大大减少了工作量，降低了对实验人员的需求量，很好的解决基层兽医实验室检测经费紧张，检测试剂有限，检测数量大的问题。本发明适用于基层动物防疫检疫机构，大中型规模养殖场，既节约了检测试剂。

Description

动物免疫抗体在制备用于检测动物免疫药物中的用途

技术领域

本发明属于生物免疫学技术领域，尤其涉及一种动物免疫抗体在制备用于 检测动物免疫药物中的用途，具体涉及一种动物免疫抗体检测筛选方法。

背景技术

目前，在兽医免疫学实验中，免疫测定技术是应用免疫学技术测定样品的 方法。在临床诊断中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗原或抗体性物质。 在抗原或抗体上标记酶，可以提高免疫测定的敏感性。酶联免疫吸附试验作为 一种抗体监测技术，广泛应用于兽医实验室监测、兽医门诊、大中型养殖场。 实验室检验作为基层动物防疫检疫机构的必要技术手段，满足了动物防疫检疫 工作的需求。在实际应用中，酶联免疫试验可用于病毒鉴定、检测抗原抗体、 免疫鉴定等等，例如：大型规模养殖场常常将疫苗免疫后的抗体水平，作为衡 量免疫程序是否合理的依据。目前，常用的方法尽管快速、准确，但是检测大量样品时需要进行多次稀释，使用较多的试剂，试验繁杂，工作量大，对于基 层兽医实验室而言，要充分发挥动物疫病预防检测的作用，日常检测与临时检 测相结合，病原学检测和抗体检测相结合，及时准确掌握动物疫情的动态分析 规律掌握免疫抗体检测水平，分析查找原因，总结经验规律做到对动物疫病的 防控有前瞻性，对发生的动物疫病及时发现果断处置等，这种高要求、严标准 的工作性质使得基层兽医实验室在进行免疫抗体检测试验过程中出现实验室人 员不足、工作量过大的问题，同时实验经费有限，资源配置低，检测试剂有限， 难以及时高效的完成动物防疫检疫工作。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)现有动物免疫抗体检测方法在检测大量样品时需要进行多次稀释，使 用较多的试剂，试验繁杂，工作量大。

(2)基层兽医实验室在进行免疫抗体检测试验过程中出现实验室人员不 足、工作量过大的问题，同时实验经费有限，资源配置低，检测试剂有限，难 以及时高效的完成动物防疫检疫工作。

解决以上问题及缺陷的难度为：基层实验室检测经费紧张，检测数量大， 人员少，扎实做好重大动物疫病防控工作，筑牢坚固的免疫屏障，是确保不发 生重大动物疫病最有效的途径，也是促进畜牧业安全发展的关键措施。

解决以上问题及缺陷的意义为：一方面，很大程度的节省了检测试剂，降 低了检测成本。另一方面，缓解了人员少、工作量大的压力，更提高了工作效 率。同时，也提高了动物疫病防控水平，预防了动物疫病传播，维护了公共卫 生安全，降低了动物疫病对环境的危害，促进了养殖业健康持续、绿色发展。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种动物免疫抗体在制备用于检 测动物免疫药物中的用途，旨在解决基层兽医实验室在进行动物免疫抗体检测 时，所需试剂用量大，需要较多的实验人员进行试验操作，工作量大，费时费 力的问题。

本发明是这样实现的，一种动物免疫抗体在制备用于检测动物免疫药物中 的用途。

动物免疫抗体的本质是抗原侵入机体后，被吞噬细胞吞噬，吞噬细胞呈递 抗原给T细胞，再由T细胞呈递给B细胞，从而导致B细胞分裂分化为浆细胞 和记忆细胞，浆细胞产生抗体，当同种抗原再次入侵时，记忆细胞快速分裂分 化产生浆细胞，浆细胞产生抗体。

本发明的另一目的在于提供一种用于检测动物免疫的检测试剂盒，所述用 于检测动物免疫的检测试剂盒包含权利要求1所述的动物免疫抗体。

本发明的另一目的在于提供一种动物免疫抗体检测筛选方法，所述动物免 疫抗体检测筛选方法包括：

通过酶联免疫吸附试验筛选法，ELISA利用酶对底物的催化反应特性，通 过采用2块稀释板和1块酶标反应板，将酶于抗体偶联并使之参与到抗原抗体 反应中，检测血清样品，依据酶催化底物所发生的变色反应程度，筛选出阳性 样品，指示和量化抗原抗体的反应水平。

进一步，所述动物免疫抗体检测筛选方法包括以下步骤：

步骤一，血清稀释液配制：按每瓶标签上所示的产品规格用10倍或25倍 血清稀释液配血清稀释液，备用；

步骤二，血清稀释：以羊口蹄疫O型操作，在U型稀释板1上，以310μL/ 孔的量用PBST加10μL/孔的血清稀释血清，被检血清为1：32，即A1～A80孔；

步骤三，在U型稀释板2上以50μL/孔的量用PBST，12列的E12～H12不 加，将稀释好的血清从U型稀释板1上按次序转移至U型稀释板2上，每孔50μL 并混合均匀，弃去50μL，被稀释血清从1：32稀释至1：64，即A1～A80孔；

步骤四，在第11列稀释阳性对照血清，从1：2稀释至1：256；A12～B12 孔稀释阴性对照血清，从1：2稀释至1：4；E12～H12孔为病毒抗原对照孔。

进一步，所述动物免疫抗体检测筛选方法，还包括：

(1)加病毒抗原；

(2)将抗原抗体混合液从U型反应板2上按次序转移至已包被口蹄疫O 型兔抗的ELISA板上，50μL/孔，封板，37℃温育60min；

(3)用PBST连续洗板3～5次，拍干，按50μL/孔加口蹄疫O型豚鼠抗体 工作液，封板，37℃温育30min；

(4)同上洗板3～5次，拍干，按50μL/孔加兔抗豚鼠IgG-HRP工作液，封 板，37℃温育30min；

(5)同上洗板3～5次，拍干；将TMB底物A溶液和B溶液以1：1比例 混匀，加入混匀后的底物溶液50μL/孔，置37℃显色15min；

(6)显色反应结束后，加终止液50μL/孔，终止反应，在酶标仪上读取D450nm值；

(7)结果判定。

进一步，步骤(1)中，所述加病毒抗原，包括：

将病毒抗原用PBST稀释至工作浓度，以50μL/孔的量加入到被检血清、阴 阳性对照血清的每一稀释孔内，4孔病毒抗原对照孔仅加入100μL/孔稀释液至 工作浓度的病毒抗原；

加入等量的病毒抗原后，血清的稀释度加倍，被检血清从1：64成为1：128， 由于阳性对照血清已经预先作了8倍稀释，则变为1：32～1：4096；封板，振荡， 4℃静置过夜或37℃温育90min。

进一步，步骤(3)中，所述口蹄疫O型豚鼠抗体工作液为红色，所述兔抗 豚鼠IgG-HRP工作液为蓝色。

进一步，步骤(7)中，所述结果判定，包括：

1)试验认可标准

每块板设4孔病毒抗原对照，病毒抗原对照D450nm值应在1.0以上；阳性 对照抗体效价应在1：1024±1滴度以内，阴性对照血清抗体效价应<1：8。

2)血清抗体效价的判定

病毒抗原对照4孔，弃去最高和最低D450nm值，计算剩余2孔的平均 D450nm值，再除以2，即50％对照值，该值即为临界值，表示阻断50％反应的 对照D450nm值。

3)结果判定

抗体效价大于或等于1：128判为口蹄疫O型抗体阳性；1：64～1：128时， 判为可疑；小于1：64，判为阳性；可疑血清样品，可以重测，重测抗体效价大 于或等于1：128，判为阳性，小于1：128判为阴性。

4)ELISA抗体效价与免疫动物攻毒保护的关系

牛、羊：抗体效价≥1：128，99％以上保护；效价≤1：16，不保护；效价在 1：22～90之间，50％保护；猪：效价≥1：64，99％以上保护；效价≤1：4，不保 护；效价在1：4～45之间，50％保护。

进一步，步骤2)中，所述血清抗体效价的判定，还包括：

被检血清D450nm值大于临界值的孔为阴性孔，小于等于临界值的孔为阳 性孔；若临界值与稀释倍数最高阳性孔D450nm值相同，则以被检血清阳性孔 的最高稀释倍数作为该份血清的抗体效价；若临界值处于两个稀释孔D450nm 值之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提 供的动物免疫抗体检测筛选方法，属于血清学技术里的标记抗体技术，通过血 清的稀释，液相阻断试验，酶联免疫吸附试验筛选法，并通过采用2块稀释板 和1块酶标反应板，一次性检测80份血清样品，筛选出阳性样品，最终判定免 疫抗体水平，相较传统方法可节省试剂3倍。

本发明利用酶联免疫吸附试验，特点是ELISA利用酶对底物的催化反应特 性，将酶于抗体偶联并使之参与到抗原抗体反应中，依据酶催化底物所发生的 变色反应程度，来指示和量化抗原抗体的反应水平，灵敏度高，特异性强。

本发明检测80份血清只需1块反应板，2块稀释板，相较传统方法可节省 试剂3倍，实现用较少的试剂检测较多的样品，达到检测抗体水平高低的目的， 检测方法简单，检测结果准确可靠，很好的解决基层实验室检测经费紧张，检 测试剂有限，检测数量大的问题，尤其是在基层农村，免疫抗体水平较低，实 验人员不足，检测抗体工作量过大，费时费力，使用本发明筛选方法非常实用， 既节约了检测试剂，又加快了检测速度，检测效率高，大大减少了工作量，降 低了对实验人员的需求量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所 需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明 的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下 还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的动物免疫抗体检测筛选方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种动物免疫抗体检测筛选方法， 下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的动物免疫抗体检测筛选方法包括以下步 骤：

S101，血清稀释液配制：按每瓶标签上所示的产品规格用10倍或25倍血 清稀释液配血清稀释液，备用；

S102，血清稀释：以羊口蹄疫O型操作，在U型稀释板1上，以310μL/ 孔的量用PBST加10μL/孔的血清稀释血清，被检血清为1：32，即A1～A80孔；

S103，在U型稀释板2上以50μL/孔的量用PBST，12列的E12～H12不加， 将稀释好的血清从U型稀释板1上按次序转移至U型稀释板2上，每孔50μL 并混合均匀，弃去50μL，被稀释血清从1：32稀释至1：64，即A1～A80孔；

S104，在第11列稀释阳性对照血清，从1：2稀释至1：256；A12～B12孔稀 释阴性对照血清，从1：2稀释至1：4；E12～H12孔为病毒抗原对照孔。

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。

本发明实施例提供的动物免疫抗体检测筛选方法包括以下步骤：

1.血清稀释液配制：按每瓶标签上所示的产品规格用10倍或25倍血清稀 释液配血清稀释液，备用；

2.稀释血清：以羊口蹄疫O型为例操作，在U型稀释板1板上，以310μL/ 孔的量用PBST加10μL/孔的血清稀释血清，被检血清为1：32(即A1～A80孔)。

3.在U型稀释板2板上以50μL/孔的量用PBST(12列的E12～H12不加)， 将稀释好的血清从U型稀释板1上按次序转移至U型稀释板2上，每孔50μL 并混合均匀，弃去50μL，被稀释血清从1：32稀释至1：64(即A1～A80孔)； 在第11列稀释阳性对照血清，从1：2稀释至1：256；A12～B12孔稀释阴性对 照血清，从1：2稀释至1：4；E12～H12孔为病毒抗原对照孔。

3.1加病毒抗原：将病毒抗原用PBST稀释至工作浓度，以50μL/孔的量加 入到被检血清、阴阳性对照血清的每一稀释孔内，4孔病毒抗原对照孔仅加入 100μL/孔稀释液至工作浓度的病毒抗原。加入等量的病毒抗原后，血清的稀释 度加倍，被检血清从1：64成为1：128，由于阳性对照血清已经预先作了8倍 稀释，则变为1：32～1：4096。封板，振荡，4℃静置过夜或37℃温育90分钟。

3.2将抗原抗体混合液从U型反应板2上按次序转移至已包被口蹄疫O型 兔抗的ELISA板上，50μL/孔，封板，37℃温育60分钟。

3.3用PBST连续洗板3～5次，拍干，按50μL/孔加口蹄疫O型豚鼠抗体工 作液(红色)，封板，37℃温育30分钟。

3.4同上洗板3～5次，拍干，按50μL/孔加兔抗豚鼠IgG-HRP工作液(蓝色)， 封板，37℃温育30分钟。

3.5同上洗板3～5次，拍干。将TMB底物A溶液和B溶液以1：1比例混 匀，加入混匀后的底物溶液50μL/孔，置37℃显色15分钟。

3.6显色反应结束后，加终止液50μL/孔，终止反应，在酶标仪上读取 D450nm值。

3.7结果判定

3.7.1试验认可标准

每块板设4孔病毒抗原对照，病毒抗原对照D450nm值应在1.0以上。阳性 对照抗体效价应在1：1024±1滴度以内，阴性对照血清抗体效价应<1：8。

3.7.2血清抗体效价的判定

病毒抗原对照4孔，弃去最高和最低D450nm值，计算剩余2孔的平均 D450nm值，再除以2，即50％对照值，该值即为临界值，表示阻断50％反应的 对照D450nm值。被检血清D450nm值大于临界值的孔为阴性孔，小于等于临 界值的孔为阳性孔。若临界值与稀释倍数最高阳性孔D450nm值相同，则以被 检血清阳性孔的最高稀释倍数作为该份血清的抗体效价；若临界值处于两个稀 释孔D450nm值之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间 值，如处于1：64(反对数值为1.8)与1：128(反对数值为2.1)之间，则判 定该份血清的抗体效价为1：90(反对数值为1.95)，具体判定可见抗体效价计 算对照表(见表1)。

表1抗体效价计算对照表

3.7.3结果判定

抗体效价大于或等于1：128判为口蹄疫O型抗体阳性；1：64～1：128时， 判为可疑；小于1：64，判为阳性。可疑血清样品，可以重测，重测抗体效价大 于或等于1：128，判为阳性，小于1：128判为阴性。

3.7.4 ELISA抗体效价与免疫动物攻毒保护的关系

牛、羊：抗体效价≥1：128，99％以上保护；效价≤1：16，不保护；效价在 1：22～90之间，50％保护。

猪：效价≥1：64，99％以上保护；效价≤1：4，不保护；效价在1：4～45之 间，50％保护。

血清稀释板操作布局图如表2所示。

表2 1：32U型稀释板筛选检测80份样品布局图(1板)

加阳性、阴性、抗原对照操作布局图如表3所示。

表3 1：128U型稀释板筛选检测80份样品布局图(2板)

移板后酶标反应板布局图如表4所示。

表4 1：128U型酶标反应板筛选检测80份样品布局图

传统采用的动物免疫抗体检测筛选方法中检测80份血清最少需要4块反应 板，试验繁杂，工作量大，而本发明检测80份血清只需1块反应板，2块稀释板， 相较传统方法可节省试剂3倍，很好的解决基层实验室检测经费紧张，检测试剂 有限，检测数量大的问题，尤其是在基层农村养殖场，免疫抗体水平较低，同 时实验人员较少，使用本发明筛选方法非常实用，检测准确性高，既节约了检 测试剂，又加快了检测速度。

1个能检测100-200份样品的试剂盒(10块酶标板)，按2500元计算，对比 液相阻断法数据可以得出：常规方法检测1份样品耗费试剂总成本最少为12.5 元，筛选法1个目标滴度试剂成本为3.125元，2个目标滴度试剂成本为6.25元。 在同样检测样品1份情况下，节约成本6.25元-9.375元。筛选法所耗费成本为 常规方法的33.6-67.2％，农村基层检测免疫抗体合格与否是为了检查防疫效果， 所以可以直接使用是否达到合格的目标滴度，没有必要检测多个滴度，再一个， 基层经费有限，检测数量巨大，人员有限，为了解决既能节约检测成本，又能 增加检测数量，还能缓解人员少的压力，在实验室工作中探索出这一筛选法。

在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上； 术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、 “头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关 系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元 件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明 的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不 能理解为指示或暗示相对重要性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于 此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明 的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的 保护范围之内。

Claims (9)

1.一种动物免疫抗体在制备用于检测动物免疫药物中的用途。

2.一种用于检测动物免疫的检测试剂盒，其特征在于，所述用于检测动物免疫的检测试剂盒包含权利要求1所述的动物免疫抗体。

3.一种动物免疫抗体检测筛选方法，其特征在于，所述动物免疫抗体检测筛选方法包括：

通过酶联免疫吸附试验筛选法，ELISA利用酶对底物的催化反应特性，通过采用2块稀释板和1块酶标反应板，将酶于抗体偶联并使之参与到抗原抗体反应中，检测血清样品，依据酶催化底物所发生的变色反应程度，筛选出阳性样品，指示和量化抗原抗体的反应水平。

4.如权利要求3所述动物免疫抗体检测筛选方法，其特征在于，所述动物免疫抗体检测筛选方法包括以下步骤：

步骤一，血清稀释液配制：按每瓶标签上所示的产品规格用10倍或25倍血清稀释液配血清稀释液，备用；

步骤二，血清稀释：以羊口蹄疫O型操作，在U型稀释板1上，以310μL/孔的量用PBST加10μL/孔的血清稀释血清，被检血清为1：32，即A1～A80孔；

步骤三，在U型稀释板2上以50μL/孔的量用PBST，12列的E12～H12不加，将稀释好的血清从U型稀释板1上按次序转移至U型稀释板2上，每孔50μL并混合均匀，弃去50μL，被稀释血清从1：32稀释至1：64，即A1～A80孔；

步骤四，在第11列稀释阳性对照血清，从1：2稀释至1：256；A12～B12孔稀释阴性对照血清，从1：2稀释至1：4；E12～H12孔为病毒抗原对照孔。

5.如权利要求4所述动物免疫抗体检测筛选方法，其特征在于，所述动物免疫抗体检测筛选方法，还包括：

(1)加病毒抗原；

(2)将抗原抗体混合液从U型反应板2上按次序转移至已包被口蹄疫O型兔抗的ELISA板上，50μL/孔，封板，37℃温育60min；

(3)用PBST连续洗板3～5次，拍干，按50μL/孔加口蹄疫O型豚鼠抗体工作液，封板，37℃温育30min；

(4)同上洗板3～5次，拍干，按50μL/孔加兔抗豚鼠IgG-HRP工作液，封板，37℃温育30min；

(5)同上洗板3～5次，拍干；将TMB底物A溶液和B溶液以1：1比例混匀，加入混匀后的底物溶液50μL/孔，置37℃显色15min；

(6)显色反应结束后，加终止液50μL/孔，终止反应，在酶标仪上读取D450nm值；

(7)结果判定。

6.如权利要求4所述动物免疫抗体检测筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述加病毒抗原，包括：

将病毒抗原用PBST稀释至工作浓度，以50μL/孔的量加入到被检血清、阴阳性对照血清的每一稀释孔内，4孔病毒抗原对照孔仅加入100μL/孔稀释液至工作浓度的病毒抗原；

加入等量的病毒抗原后，血清的稀释度加倍，被检血清从1：64成为1：128，由于阳性对照血清已经预先作了8倍稀释，则变为1：32～1：4096；封板，振荡，4℃静置过夜或37℃温育90min。

7.如权利要求4所述动物免疫抗体检测筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，所述口蹄疫O型豚鼠抗体工作液为红色，所述兔抗豚鼠IgG-HRP工作液为蓝色。

8.如权利要求4所述动物免疫抗体检测筛选方法，其特征在于，步骤(7)中，所述结果判定，包括：

1)试验认可标准

每块板设4孔病毒抗原对照，病毒抗原对照D450nm值应在1.0以上；阳性对照抗体效价应在1：1024±1滴度以内，阴性对照血清抗体效价应<1：8；

2)血清抗体效价的判定

病毒抗原对照4孔，弃去最高和最低D450nm值，计算剩余2孔的平均D450nm值，再除以2，即50％对照值，该值即为临界值，表示阻断50％反应的对照D450nm值；

3)结果判定

抗体效价大于或等于1：128判为口蹄疫O型抗体阳性；1：64～1：128时，判为可疑；小于1：64，判为阴性；可疑血清样品，可以重测，重测抗体效价大于或等于1：128，判为阳性，小于1：128判为阴性；

4)ELISA抗体效价与免疫动物攻毒保护的关系

牛、羊：抗体效价≥1：128，99％以上保护；效价≤1：16，不保护；效价在1：22～90之间，50％保护；猪：效价≥1：64，99％以上保护；效价≤1：4，不保护；效价在1：4～45之间，50％保护。

9.如权利要求8所述动物免疫抗体检测筛选方法，其特征在于，步骤2)中，所述血清抗体效价的判定，还包括：

被检血清D450nm值大于临界值的孔为阴性孔，小于等于临界值的孔为阳性孔；若临界值与稀释倍数最高阳性孔D450nm值相同，则以被检血清阳性孔的最高稀释倍数作为该份血清的抗体效价；若临界值处于两个稀释孔D450nm值之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值。

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