CN101382540A - 血小板抗原抗体检测和交叉配型的固相抗人球蛋白试剂盒 - Google Patents

血小板抗原抗体检测和交叉配型的固相抗人球蛋白试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN101382540A
CN101382540A CN200810051267.8A CN200810051267A CN101382540A CN 101382540 A CN101382540 A CN 101382540A CN 200810051267 A CN200810051267 A CN 200810051267A CN 101382540 A CN101382540 A CN 101382540A
Authority
CN
China
Prior art keywords
platelet
antibody
serum
antiplatelet
solid phase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN200810051267.8A
Other languages
English (en)
Inventor
李勇
段生宝
李东
童军
邰慧波
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Changchun Brother Biotech Co., Ltd.
Original Assignee
李勇
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 李勇 filed Critical 李勇
Priority to CN200810051267.8A priority Critical patent/CN101382540A/zh
Publication of CN101382540A publication Critical patent/CN101382540A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

一种血小板抗原抗体检测和交叉配型的固相抗人球蛋白试剂盒,属于生物技术领域。本发明的目的是提供一种血小板抗原抗体检测和交叉配型的固相抗人球蛋白试剂盒。包括:U型反应板、血小板、指示细胞、抗人IgG、低离子介质、抗血小板血清、阴性对照血清、阳性对照血清。本发明灵敏度高,检测过程耗时短(<1h),方法简便易行,结果易于判定,可同时对大量样本进行检测,易于自动化。

Description

血小板抗原抗体检测和交叉配型的固相抗人球蛋白试剂盒
技术领域:
本发明属于生物技术领域。
背景技术:
血小板抗体是由异体或自身血小板抗原作用机体而产生的,包括同种异体抗体、自身抗体、同种抗体、药物依赖性抗体和非特异性抗体五类,这些抗体作用于人体血小板可导致血小板发生破坏并引起胎母同种异体免疫血小板减少症(FMAIT)、血小板输注无效症(PTR)、输血后紫癜(PTP)等多种血小板免疫疾病。
同检测红细胞抗体的血清学方法相比,临床检测血小板抗体的实验方法出现较晚。1987年Kiefel发明了单克隆抗体固着血小板抗原分析(MAIPA)法,凭借其高灵敏度和特异性成为检测血小板抗体的“金标准”。但该试验耗时长;技术要求高;如果待检血清中抗血小板抗体与鼠单克隆抗体识别同一抗原决定簇则出现假阴性反应,这些缺点也限制了它的广泛应用。近二十年,尽管出现了很多新方法如:单克隆抗体固相血小板抗体试验(MASPAT)、抗原捕获试验(ACE)、修饰的抗原捕获试验(MACE)和微柱凝胶免疫分析技术(MGIA)等,然而各自都有其缺陷和不足,在临床应用中尚缺乏一种灵敏度高、特异性和稳定性好的简便方法。
抗人球蛋白实验是检查不规则抗体的一种有效的检测方法。本实验分为直接和间接两种。直接实验主要检查细胞上是否结合了不规则抗体,而间接实验是检查血清中有无游离的不规则抗体。
目前采用抗人球蛋白试验检测血小板抗原抗体反应,通常是将抗人球蛋白试剂进行酶标记或荧光标记,通过显色反应或测定荧光强度来判定结果。此类方法通常存在以下缺点和不足:
1.需要反复洗涤和多次孵育过程,操作繁琐,耗时长。
2.每次只能检测少量的样本,很难开展大量样本的检测。
3.技术要求高,一般由实验室高年资技术人员操作或示范,技术普及难度大。
4.观察结果时间短,实验结果无法保存,一旦出现医疗纠纷难以判定责任。
发明内容:
本发明的目的是提供一种血小板抗原抗体检测和交叉配型的固相抗人球蛋白试剂盒。
本发明的试剂盒包括:
a、U型反应板:其内表面已包被抗血小板单克隆抗体试剂;
b、血小板:从新鲜EDTA抗凝血中提取或直接采用机采血小板;
c、指示细胞:其表面已致敏人IgG;
d、抗人IgG:用人丙种球蛋白免疫产蛋母鸡,从鸡蛋中提取抗人IgG;
e、低离子介质:能增强抗原抗体反应;
f、抗血小板血清:含已知血小板特异性抗体;
g、阴性对照血清:与上述检测试剂不发生反应的健康成年人血清,其血清中不含有抗血小板抗体;
h、阳性对照血清:与上述检测试剂发生反应的健康成年人血清,其血清中含有抗血小板抗体。
本发明用于检测血小板抗原、抗体及进行血小板输注前的交叉配型。
本发明灵敏度高,检测过程耗时短(<1h),方法简便易行,结果易于判定,可同时对大量样本进行检测,易于自动化。
附图说明:
图1是本发明反应板对照图,其中A是血小板与反应板中血小板单克隆抗体结合并形成的血小板单层,B空白反应板对照;
图2是本发明固相抗人球蛋白试验检测血小板抗体结果图,其中阳性反应为指示细胞铺满反应孔底部,而阴性反应为指示细胞在反应孔底部中间形成红细胞聚集,弱阳性反应格局介于两者之间。
具体实施方式:
本发明的试剂盒包括:
a、U型反应板:其内表面已包被抗血小板单克隆抗体试剂;
U型反应板制备:采用96孔U型反应板,用pH9.6,0.05M碳酸盐缓冲液将将纯化的血小板单克隆抗体配制成10ug/ml浓度,按100ul/孔加入反应孔中,置4℃冰箱中包被过夜,次日取出,用含有0.05%吐温的pH7.2,0.01M磷酸盐缓冲液洗涤5次,拍干,置-20℃保存备用。
b、血小板:从新鲜EDTA抗凝血中提取或直接采用机采血小板;
取新鲜EDTA抗凝全血1500rpm离心10min,取上层2/3富血小板血浆进行实验或直接用生理盐水将机采血小板作5-10倍稀释后得到血小板悬液使用。
c、指示细胞:其表面已致敏人IgG;
指示细胞的制备:
(1)取新鲜O型抗凝全血(D+),用生理盐水洗涤3次。
(2)将洗涤完的压积红细胞和效价为16~64的人IgG(抗D)等体积混合,37℃水浴孵育30分钟。
(3)用生理盐水洗涤上述致敏细胞三次后,用红细胞保护液将其配制成0.2~0.5%浓度。
d、抗人IgG:用人丙种球蛋白免疫产蛋母鸡,从鸡蛋中提取抗人IgG;
抗人IgG的制备及提取方法:用人丙种球蛋白免疫产蛋母鸡,至效价合格后收集鸡蛋,用反复冻融法从鸡蛋中提取抗人IgG。
e、低离子介质:能增强抗原抗体反应;
低离子介质的配制:称取NaCl0.875g,甘氨酸9g于500ml烧杯中,加入400ml去离子水溶解后,加入5.65ml0.15M KH2PO4和4.35ml0.15M Na2HPO4,充分混匀后,2.5ml10%NaN3,混匀后用去离子水定容至500ml,最后用NaOH调节pH至6.7。
f、抗血小板血清:含已知血小板特异性抗体;
血小板特异性抗体:血小板特异性抗原分为16个系统,特异性抗体是指针对其中的某个或某些抗原而产生的抗体。
g、阴性对照血清:经国家规定的五项指标(转氨酶、乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病)检测合格且与上述检测试剂不发生反应的健康成年人血清,表明其血清中不含有抗血小板抗体。
h、阳性对照血清:经国家规定的五项指标(转氨酶、乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病)检测合格的健康成年人,且与上述检测试剂发生反应的人血清,表明其血清中含有抗血小板抗体。
制备及提取包被用抗血小板单克隆抗体的方法:采用全血小板免疫小鼠并制备鼠抗人血小板单克隆抗体,经硫酸铵沉淀及亲和层析提纯得到包被用抗人血小板单克隆抗体。
抗血小板单克隆抗体的包被量为1ug/孔。
本发明的原理:血小板经离心洗涤后可与反应板中的血小板单抗结合并形成血小板单层。加入血清在板中经过孵育后,若血清中不含有血小板抗体则经过洗涤可去除,若含有血小板抗体则此抗体与反应板中的血小板结合,加入抗人IgG及指示细胞,经离心后指示细胞结合到血小板单层上。因此阳性反应为指示细胞铺满反应孔底部,而阴性反应为指示细胞在反应孔底部中间形成红细胞聚集。从而可检测血小板抗体及进行血小板交叉配型。
本发明用于检测血小板抗原、抗体及进行血小板输注前的交叉配型。
实施例1:
血小板抗原检测:
前提是用户准备含血小板特异性抗体的抗血清。
1、将试剂盒平衡至室温(18-25℃)。30×浓缩洗涤液用蒸馏水按1:29稀释成工作洗涤液。
2、根据实验量取出反应板条,标记阳性对照、阴性对照及待检样品孔,未使用的板条应储存于自封袋中,加入干燥剂密封后,2-8℃储存。
3、向反应孔中加入1滴(50ul)待检血小板悬液,轻摇反应板(约10秒)使反应孔中的保护剂充分溶解。
4、用平板离心机将反应板以50g离心5分钟,使血小板固定在微孔底部。
5、轻轻倒出未结合的血小板,并用滴管滴加工作洗涤液清洗3次,洗涤过程中轻摇微孔板,然后再轻轻甩掉洗涤液。最后一次洗涤后将反应板倒置于吸水纸上吸干残余液体。
6、立即向每个反应孔中加入2滴(100ul)低离子强度溶液(1分钟内),并向相应孔中加入1滴(50ul)含血小板特异性抗体的抗血清,阳性对照及阴性对照。7、将反应孔用封口胶纸封好,轻摇混匀后置于湿盒中37℃水浴孵育30分钟或气浴孵育35分钟。
8、取出已孵育完毕的反应板,弃去封口胶纸。按步骤5洗涤反应板5次。
9、立即加入1滴(50ul)抗人IgG试剂及1滴(50ul)指示红细胞,轻轻振荡混匀。
10、将反应板以200g离心5分钟。
11、将待检孔与对照孔的结果进行比较,判读并记录试验结果。
指示细胞平铺在反应板的底部为阳性,说明待检血小板上具有与已知抗血清相应的抗原;在反应孔的底部形成细胞聚集为阴性,说明待检血小板上无与已知抗血清相应的抗原。
实施例2:
血小板抗体检测:
1、将试剂盒平衡至室温(18-25℃)。30×浓缩洗涤液用蒸馏水按1:29稀释成工作洗涤液。
2、根据实验量取出反应板条,标记阳性对照、阴性对照及待检样品孔,未使用的板条应储存于自封袋中,加入干燥剂密封后,2-8℃储存。
3、向反应孔中加入1滴(50ul)三人份混合O型血小板悬液,轻摇反应板(约10秒)使反应孔中的保护剂充分溶解。
4、用平板离心机将反应板以50g离心5分钟,使血小板固定在微孔底部。
5、轻轻倒出未结合的血小板,并用滴管滴加工作洗涤液清洗3次,洗涤过程中轻摇微孔板,然后再轻轻甩掉洗涤液。最后一次洗涤后将反应板倒置于吸水纸上吸干残余液体。
6、立即向每个反应孔中加入2滴(100ul)低离子强度溶液(1分钟内),并向相应孔中加入1滴(50ul)待检者血清或血浆,阳性对照及阴性对照。
7、将反应孔用封口胶纸封好,轻摇混匀后置于湿盒中37℃水浴孵育30分钟或气浴孵育35分钟。
8、取出已孵育完毕的反应板,弃去封口胶纸。按步骤5洗涤反应板5次。
9、立即加入1滴(50ul)抗人IgG试剂及1滴(50ul)指示红细胞,轻轻振荡混匀。
10、将反应板以200g离心5分钟。
11、将待检孔与对照孔的结果进行比较,判读并记录试验结果。
指示细胞平铺在反应板的底部为阳性,说明待检血清中含有抗血小板抗体;指示细胞在反应孔的底部形成细胞聚集为阴性,说明待检血清中不含有抗血小板抗体。反应格局介于二者之间的为弱阳性。
实施例3:
血小板交叉配型:
1、将试剂盒平衡至室温(18-25℃)。30×浓缩洗涤液用蒸馏水按1:29稀释成工作洗涤液。
2、根据实验量取出反应板条,标记阳性对照、阴性对照及待检样品孔,未使用的板条应储存于自封袋中,加入干燥剂密封后,2-8℃储存。
3、向反应孔中加入1滴(50ul)供者血小板悬液,轻摇反应板(约10秒)使反应孔中的保护剂充分溶解。
4、用平板离心机将反应板以50g离心5分钟,使血小板固定在微孔底部。
5、轻轻倒出未结合的血小板,并用滴管滴加工作洗涤液清洗3次,洗涤过程中轻摇微孔板,然后再轻轻甩掉洗涤液。最后一次洗涤后将反应板倒置于吸水纸上吸干残余液体。
6、立即向每个反应孔中加入2滴(100ul)低离子强度溶液(1分钟内),并向相应孔中加入1滴(50ul)受血者血清或血浆,阳性对照及阴性对照。7、将反应孔用封口胶纸封好,轻摇混匀后置于湿盒中37℃水浴孵育30分钟或气浴孵育35分钟。
8、取出已孵育完毕的反应板,弃去封口胶纸。按步骤5洗涤反应板5次。
9、立即加入1滴(50ul)抗人IgG试剂及1滴(50ul)指示红细胞,轻轻振荡混匀。
10、将反应板以200g离心5分钟。
11、将待检孔与对照孔的结果进行比较,判读并记录试验结果。
指示细胞平铺在反应板的底部为阳性,介于二者之间的为弱阳性,这说明供受者血小板不合;若指示细胞在反应孔的底部形成细胞聚集为阴性,说明供受者血小板相合。

Claims (2)

1、一种血小板抗原抗体检测和交叉配型的固相抗人球蛋白试剂盒,其特征是:
a、U型反应板:其内表面已包被抗血小板单克隆抗体试剂;
b、血小板:从新鲜EDTA抗凝血中提取或直接采用机采血小板;
c、指示细胞:其表面已致敏人IgG;
d、抗人IgG:用人丙种球蛋白免疫产蛋母鸡,从鸡蛋中提取抗人IgG;
e、低离子介质:能增强抗原抗体反应;
f、抗血小板血清:含已知血小板特异性抗体;
g、阴性对照血清:与上述检测试剂不发生反应的健康成年人血清,其血清中不含有抗血小板抗体;
h、阳性对照血清:与上述检测试剂发生反应的健康成年人血清,其血清中含有抗血小板抗体。
2、根据权利要求1所述的血小板抗原抗体检测和交叉配型的固相抗人球蛋白试剂盒用于检测血小板抗原、抗体及进行血小板输注前的交叉配型。
CN200810051267.8A 2008-10-15 2008-10-15 血小板抗原抗体检测和交叉配型的固相抗人球蛋白试剂盒 Pending CN101382540A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200810051267.8A CN101382540A (zh) 2008-10-15 2008-10-15 血小板抗原抗体检测和交叉配型的固相抗人球蛋白试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200810051267.8A CN101382540A (zh) 2008-10-15 2008-10-15 血小板抗原抗体检测和交叉配型的固相抗人球蛋白试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101382540A true CN101382540A (zh) 2009-03-11

Family

ID=40462488

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200810051267.8A Pending CN101382540A (zh) 2008-10-15 2008-10-15 血小板抗原抗体检测和交叉配型的固相抗人球蛋白试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101382540A (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103344755A (zh) * 2013-07-19 2013-10-09 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种磁化醛化羊红细胞的制备方法
CN106950385A (zh) * 2017-05-23 2017-07-14 北京乐普医疗科技有限责任公司 一种血小板抗体检测试剂盒及其使用方法
CN108519483A (zh) * 2018-05-26 2018-09-11 江苏力博医药生物技术股份有限公司 基于固相凝集法的血小板抗体检测试剂盒及其检测方法和应用
CN110082526A (zh) * 2019-05-20 2019-08-02 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 免疫复合物的排阻层析检测新方法
CN110308288A (zh) * 2019-04-16 2019-10-08 广州血液中心 一种新型血小板交叉配型试剂盒
CN112379100A (zh) * 2020-10-13 2021-02-19 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 血小板抗人球蛋白实验免疫区带分布检测方法
CN113391061A (zh) * 2021-06-16 2021-09-14 王婷楠 动物免疫抗体在制备用于检测动物免疫药物中的用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1282871A (zh) * 2000-03-29 2001-02-07 长春生物制品研究所 微柱凝胶法血小板血型抗原抗体检测技术和试剂盒

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1282871A (zh) * 2000-03-29 2001-02-07 长春生物制品研究所 微柱凝胶法血小板血型抗原抗体检测技术和试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李川晟等: "简易致敏红细胞血小板血清学技术检测血小板抗体", 《中华医学检验杂志》 *
林芳: "特异性鸡卵黄抗体(IgY)的制备及其用于去除人血浆部分高丰度蛋白的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》 *
段宝生等: "血小板抗体的固相Coomb"s试验检测试剂盒研制", 《第三次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会论文集》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103344755A (zh) * 2013-07-19 2013-10-09 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种磁化醛化羊红细胞的制备方法
CN103344755B (zh) * 2013-07-19 2015-06-24 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种磁化醛化羊红细胞的制备方法
CN106950385A (zh) * 2017-05-23 2017-07-14 北京乐普医疗科技有限责任公司 一种血小板抗体检测试剂盒及其使用方法
CN108519483A (zh) * 2018-05-26 2018-09-11 江苏力博医药生物技术股份有限公司 基于固相凝集法的血小板抗体检测试剂盒及其检测方法和应用
CN110308288A (zh) * 2019-04-16 2019-10-08 广州血液中心 一种新型血小板交叉配型试剂盒
CN110082526A (zh) * 2019-05-20 2019-08-02 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 免疫复合物的排阻层析检测新方法
CN110082526B (zh) * 2019-05-20 2022-06-17 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 免疫复合物的排阻层析检测新方法
CN112379100A (zh) * 2020-10-13 2021-02-19 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 血小板抗人球蛋白实验免疫区带分布检测方法
CN112379100B (zh) * 2020-10-13 2024-01-23 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 血小板抗人球蛋白实验免疫区带分布检测方法
CN113391061A (zh) * 2021-06-16 2021-09-14 王婷楠 动物免疫抗体在制备用于检测动物免疫药物中的用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Voller et al. Enzyme immunoassays in diagnostic medicine: theory and practice
CN101382540A (zh) 血小板抗原抗体检测和交叉配型的固相抗人球蛋白试剂盒
CN102798725B (zh) 血清总IgE测定诊断试剂盒及制备和使用方法
SU1496643A3 (ru) Способ определени человеческого гемоглобина в фекали х
CN101196518B (zh) 丙型肝炎病毒抗体化学发光法诊断试剂盒及其制备方法
Leikola et al. Enzyme‐linked antiglobulin test: an accurate and simple method to quantify red cell antibodies
CN101377504A (zh) 一种检测弓形虫IgM抗体的化学发光免疫分析测定试剂盒
CN107643409A (zh) 一种血型抗原芯片及其在红细胞意外抗体检测中的应用
CN108680756A (zh) 一种不完全抗体检测试剂盒及检测方法
US5384240A (en) Base dissociation assay
CN103033611A (zh) 致敏性变应原化学发光法诊断试剂盒及其制备方法
CN1877331B (zh) 口蹄疫病毒定型试纸条及其制备方法
CN103235120A (zh) 一种复合检测戊型肝炎病毒抗体谱的试剂盒及其应用
CN102879560A (zh) 一种精确、快速和微量检测人血清中抗原和抗体的方法
CN103063841B (zh) 一种流行性出血热病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒及其制备和使用方法
CN101571542A (zh) 一种检测齐帕特罗的直接竞争法酶联免疫试剂盒
CN101957365B (zh) 检测抗环瓜氨酸肽和抗免疫球蛋白g双特异性抗体的试剂盒
CN101109755A (zh) 一种用于筛查血清中不规则抗体的试剂盒及其制备方法
CN108519483A (zh) 基于固相凝集法的血小板抗体检测试剂盒及其检测方法和应用
CN101368964A (zh) 一种检测巨细胞病毒IgG抗体的化学发光法免疫分析诊断试剂盒
Fritz et al. Hepatitis-associated antigen: detection by antibody-sensitized latex particles
Buakaew et al. Platelet antibody screening by flow cytometry is more sensitive than solid phase red cell adherence assay and lymphocytotoxicity technique: a comparative study in Thai patients
CN101368965A (zh) 一种检测巨细胞病毒IgM抗体的化学发光法免疫分析诊断试剂盒
CN107202890A (zh) 用于轻中度脑损伤的快速诊断试剂及含有该试剂的试剂盒及该试剂盒的制备和检测方法
Richard-Lenoble et al. Human hydatidosis: evaluation of three serodiagnostic methods, the principal subclass of specific immunoglobulin and the detection of circulating immune complexes

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: CHANGCHUN BLOOD BIO-TECH CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: LI YONG

Effective date: 20110707

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 130012 NO. 433, CHENGUANG STREET, HIGH-TECH. DEVELOPMENT ZONE, CHANGCHUN CITY, JILIN PROVINCE TO: 130012 NO. 3255, QIANJIN STREET, CHANGCHUN CITY, JILIN PROVINCE

TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20110707

Address after: 130012 No. 3255 Qianjin Street, Jilin, Changchun

Applicant after: Changchun Brother Biotech Co., Ltd.

Address before: 130012 No. 433 Chenguang street, hi tech Development Zone, Jilin, Changchun

Applicant before: Li Yong

C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20090311