CN110308288A - 一种新型血小板交叉配型试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型血小板交叉配型试剂盒，该试剂盒包括：U型反应微板、低离子介质、指示系统、阴性对照血清、阳性对照血清。其中，U型反应微板内表面已包被聚乙烯亚胺，利用其高度吸附性和高阳离子絮凝性将血小板吸附至微板孔底；指示系统包含IgG抗‑D致敏的O型红细胞和兔或羊抗人球蛋白试剂。在已吸附血小板单层的微板孔中加入待配型血浆进行免疫反应，最后通过二步法指示系统的显示，就可以快速实现固相法血小板交叉配型。本发明通过创新性的利用聚乙烯亚胺的高絮凝吸附作用、利用高灵敏度的二步法指示系统，切实解决目前临床血小板交叉配型方法中灵敏度低、试剂盒价格偏高等难题，为临床血小板交叉配型提供一种高性价比的新型试剂盒。

Description

一种新型血小板交叉配型试剂盒

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，属于生物技术领域，具体涉及一种新型血小板交叉配型试剂盒。

背景技术

血小板输注作为一种有效的治疗手段，在临床得到了广泛应用。但由于长期输血、药物治疗和疾病本身的影响，导致患者体内容易产生针对血小板抗原的同种抗体，这些抗体作用于人体血小板后，常可导致血小板输注无效症、输血后紫癜等，从而危及患者的生命安全。鉴于此，国家卫计委在《临床输血技术规范》规定，血小板输注前，必须进行交义配型实验，以提升患者的输血质量，保证患者的生命安全。

血小板交叉配型的方法先后经历了血小板免疫荧光实验(PIFT)、流式细胞仪交叉配型(FCM)、微柱凝胶配型、固相凝集法(SPRCA)配型等阶段。PIFT法主要是将献血者的血小板和患者血清孵育后，再与标记了异硫氰酸荧光素的抗人球蛋白孵育，洗涤后在荧光显微镜下观察。该法可以避免一些细胞碎片引起的非特异性反应，缺点在于反应不灵敏。FCM技术是将献血者的血小板与患者的血清孵育后，再加入荧光素标记的抗人-IgG，避光反应后加入PBS悬浮，上机检测分析。该方法比较灵敏，缺点是实验时间较长、需要昂贵的仪器设备和荧光标记抗体，难以在医疗机构进行推广应用。微柱凝胶卡法行血小板交叉配型实验，是建立在传统血小板检测和免疫微柱凝胶基础上的一项新技术。将血小板、血清和指示红细胞加到微柱反应腔中，经孵育和离心后，观察结果。该法操作简便、快速，不需要特别昂贵的设备，缺点是假阳性率较高，结果的判别有一定难度。SPRCA法是利用已做包被处理的板条，将血小板加入板条中离心形成血小板分子单层，然后加入患者血清，经过孵育和洗涤后，加入指示红细胞，并判读结果。该法灵敏度好、特异性强，且简便、快速、不需要特殊设备即可完成，是目前血小板配型领域的主流技术。由于目前使用该方法的产品，多数采用抗血小板抗体进行包被，一方面，成本相对较高；另一方面，传统固相凝集法的包被基质对抗原物质的固定作用较差，且需要一些特殊的步骤，从而限制了其临床应用。因此，有必要对现有的固相凝集法进行改进。

血小板作为一种特殊的血液成分，其表面含有多种糖蛋白，因此，血小板表面荷载了大量的负电荷。在聚合阳离子的作用下，血小板表面所荷载的负电荷可以被中和而引起血小板的吸附性聚集。

聚乙烯亚胺是一种水溶性高分子聚合物，具有一些特殊的性能。1.高附着性和吸附性：聚乙烯亚胺由于具有极性基团(氨基)和疏水基(乙烯基)结构，能够与不同的物质相结合。利用这些综合结合力，可广泛应用于接着，油墨，涂料，粘结剂等领域。2.高阳离子絮凝性：聚乙烯亚胺在水中以聚合阳离子存在，可以中和吸附所有阴离子物质，还能螯化重金属离子。利用其高度的阳离子性，可以应用于造纸水处理，电镀液，分散剂领域。

发明内容

为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种灵敏度好、价格适中、不易造成假阳性或者假阴性，能为临床一线检测工作的血小板配型试剂盒。

本发明拟利用聚乙烯亚胺的高附着性将其包被于96孔微板中，利用其高度吸附性和高阳离子絮凝性将血小板吸附至微板孔底，经过洗涤后，在微板孔中加入待检测的血浆和促进反应的低离子液，就可以快速实现血小板抗原与待检测血浆抗体之间的免疫性结合，最后通过高灵敏度的指示系统进行指示，阳性反应将在微板孔底面呈现出均匀一致的指示红细胞单层；阴性反应则将在微板孔中央底面呈现出一个圆形的指示红细胞扣。本发明的创新点在于利用聚乙烯亚胺的高附着性将其包被在微板孔底，创新性的利用其吸附性和聚合阳离子的絮凝作用对血小板产生高强度吸附、利用高灵敏度的二步法指示系统替代一步法指示系统，可以切实解决目前临床血小板交叉配型方法中敏度低、价格高企等难题，为临床一线检测工作提供一种高性价比的血小板交叉配型试剂盒

一种新型血小板交叉配型试剂盒，包括：

(1)U型固相反应微板，所述U型固相反应微板孔底已包被聚乙烯亚胺；

(2)低离子介质，所述低离子介质为包含1.8％的甘氨酸和0.10％叠氮化钠的缓冲液；

(3)指示系统，所述指示系统包含IgG抗-D致敏的红细胞悬液和兔或羊抗人球蛋白试剂；

(4)不含血小板抗体的阴性对照血清，所述的阴性对照血清为与人血小板无凝集反应的人血清加入0.1％的叠氮化钠；

(5)含有血小板抗体的阳性对照血清，所述的阳性对照血清为与人血小板有凝集反应的人血清加入0.1％的叠氮化钠。

为进一步实现本发明，所述的U型反应微板由96孔U型底可拆卸式微板条制成。

为进一步实现本发明，所述的指示细胞是用IgG-抗D致敏0型RhD(+)红细胞后，再配制成0.35％的红细胞悬液。

本发明的有益效果：

本发明所述的U型反应微板，材质为聚苯乙烯，本身不参与化学反应。在其内表面包被了0.1％聚乙烯亚胺，聚乙烯亚胺属于阳离子聚合物，能够吸附血小板表面所带的负电荷。血小板接触到U型反应微板孔底的聚乙烯亚胺时，将会被吸附。与以往微板底部包被血小板抗体、利用抗原抗体反应吸附血小板的方式不同，包被了聚乙烯亚胺后，微板孔底对血小板的吸附力得到极大的增强，且不受血小板抗原的限制。将稀释到合适浓度(如100×109/mL)的血小板固定在微板条U型孔底，即可用于相关的实验。

本发明提供了一种新型血小板交叉配型试剂盒，在包被基质方面，采用聚乙烯亚胺包被96孔U型微板条，对血小板的吸附能力较强，且不受血小板抗原特异性的影响，避免了部分血小板不能铺板的现象；聚乙烯亚胺包被于U型孔底后，稳定性好，保存12个月内各抽检时间段的试剂盒检测结果没有区别；同时，本发明所设计的指示系统，采用低效价抗-D致敏O型RhD阳性红细胞，配以恰当的抗人球蛋白试剂，大大提高了指示灵敏度。本发明的配型方法简单快速，且不需要特殊设备，可单人份检测，也可规模检测，从而降低检测成本，为临床检测提供了便利，具有较好的临床应用价值。

附图说明

图1是固相凝集法试剂盒凝集强度判读标准图；

图2是试剂盒用于血小板交叉配型图；

其中，试剂盒微板条自上而下依次标记为1、2、3、4、5、6、Neg(阴性对照)、Pos(阳性对照)。其中1-6孔加入来自不同个体的血小板与同一患者的血浆，上述6个血小板中任取3个人份血小板混合后，加入Neg孔和Pos孔，再分别加入阴性对照和阳性对照血浆。结果表明：第1、2、4孔血小板与患者交叉配型阴性，第3、5孔血小板配型呈强阳性(4+)、第6孔血小板配型弱阳性 (2+)。

图3是试剂盒稳定性测试图；

其中，将保存于4℃冰箱的试剂盒每隔2月用同一个患者的标本(含HLA抗体和HPA抗体)进行血小板交叉配型。试剂盒微板条自上而下依次标记为1、2、 3、4、5、6、Neg(阴性对照)、Pos(阳性对照)。其中1-6孔加入来自不同个体的血小板与同一患者的血浆，上述6个血小板中任取3个人份血小板混合后，加入Neg孔和Pos孔，再分别加入阴性对照和阳性对照血浆。结果显示：在保存期12个月内，试剂盒对该阳性患者的血小板交叉配型结果没有差异，各阶段的配型结果均为强阳性(4+)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释。应当理解所举的实施例仅用于解释本发明，而不是限于本发明的保护范围。

实施例1血小板配型试剂盒的制备

U型反应微板的制备

用0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲液配置0.1％的聚乙烯亚胺溶液，按50uL/孔加入96孔U型(12×8)反应板孔中，置于4℃冰箱内过夜，次日取出，用1× PBS缓冲液洗涤3次后，甩去洗涤液，最后一次用吸水纸吸干孔中残留的液体，用铝箔袋装好反应板，加热密封后，置于4℃冰箱保存备用。

血小板的获取

血小板可直接采用机采血小板或富血小板血浆制备。采用富血小板血浆制备血小板时，取新鲜采集的EDTA抗凝全血若干毫升，1500rpm离心10分钟后，吸取上2/3富血小板血浆。将血小板计数后，用PBS稀释至100×109/ml，备用。

指示系统的制备

致敏红细胞的制备：在洗涤后的O型压积红细胞中加入等体积

的IgG抗-D，37℃孵育50分钟，制得IgG抗-D致敏的红细胞，生理盐水洗涤5次后，用红细胞保存液配制成0..2-0.6％的悬浮液，即为致敏红细胞；

抗人球蛋白试剂：兔或羊抗人球蛋白试剂用抗体稀释液进行梯

度倍比稀释(如：1:8、1:16、1:32、1:64、1:128等)，与上述的致敏红细胞反应，以离心后显微镜下观察至不凝集管作为抗人球蛋白试剂的稀释倍数，该稀释倍数的抗人球试剂与已致敏的O型红细胞构成本发明的指示系统；

低离子介质的制备

称取甘氨酸1.8g、叠氮钠0.1g放入量筒中，加入少量纯水进行溶解后，再加入纯水定容至100mL，用2N的NaOH溶液调节pH值至6.80。

阴性对照血清的制备

收集经检测不含血小板抗体的健康献血者血清，定容后加入终浓度为0.1％叠氮钠，混匀即可

阳性对照血清制备

筛选出含血小板抗体的健康献血者血清，定容后加入终浓度为0.1％叠氮钠，混匀即可。

实施例2血小板交叉配型

从冰箱中取出试剂盒平衡至室温，根据检测的数量抽取其中的板条。

将抽出的微板条进行标记，如实验孔、阴性对照孔、阳性对照孔等。

自上而下向6个反应孔中分别加入来源于不同献血者的计数为100×109/ml 血小板悬液，每孔50uL，轻拍板条侧面，进行混匀。

将反应板条放入平板离心机中，50g离心5分钟后，取出板条，倒扣轻甩去未结合的血小板悬液，用1×PBS洗涤3次，每次均倒扣轻甩去洗涤液，最后一次轻甩干后，将反应板条倒扣于吸水纸上，吸干孔中的残留液体。

向反应孔中加入低离子介质，100uL/孔，随后在实验孔中加入患者血清或血浆，50uL/孔，阴性和阳性照孔中分别加入阴性对照血清和阳性对照血清，50uL/孔。

置于平板振荡器中900rpm轻振10秒，或用手轻轻拍击反应板边缘，使孔中液体充分混匀。

封口膜将板条封好后，置于37℃水浴30分钟，也可置于空气浴35分钟后，取出，撕去封口膜，倒扣轻甩孔中液体后，用1×PBS洗涤5次，最后一次轻甩干后，将反应板条倒扣于吸水纸上，吸干孔中的残留液体。

加入1滴(50μL)羊/兔抗人IgG后，即刻加入1滴(50μL)指示红细胞，轻轻振荡混匀后，放入平板离心机，200g离心5分钟。

取出板条，进行结果判读。指示细胞平铺在反应板条微孔的整个底部，判为阳性，说明血小板交义配型不合；若指示细胞聚集在反应板条微孔的中央底部，形成细胞扣，判为阴性，说明血小板交又配型相合；若指示细胞在微板条孔底的形态介于上述两者之间，判为弱阳性，说明血小板交叉配型不合(图2)。

实施例3试剂盒稳定性测试

实施例1中制备的U型反应微板放置于2～8℃冰箱保存，分别在保存期的 2个月、4个月、6个月、8个月、10个月、12个月取样进行稳定性研究；另留取有血小板抗体的患者标本，分装后储存于-20℃冰箱。每次测试时从冰箱中取出1支解冻后使用。结果发现，本发明制备的U型反应微板在保存12个月内，交叉配型的使用性能没有差异，体现了较好的稳定性，结果见图3。

1.从冰箱中取出试剂盒平衡至室温，根据检测的数量抽取其中的板条。

将抽出的微板条进行标记，如实验孔、阴性对照孔、阳性对照孔等。

2.自上而下向6个反应孔中分别加入来源于不同献血者的计数为100× 109/ml血小板悬液，每孔50uL，轻拍板条侧面，进行混匀。

3.将反应板条放入平板离心机中，50g离心5分钟后，取出板条，倒扣轻甩去未结合的血小板悬液，用1×PBS洗涤3次，每次均倒扣轻甩去洗涤液，最后一次轻甩干后，将反应板条倒扣于吸水纸上，吸干孔中的残留液体。

4.向反应孔中加入低离子介质，100uL/孔，随后在实验孔中加入患者血清或血浆，50uL/孔，阴性和阳性照孔中分别加入阴性对照血清和阳性对照血清， 50uL/孔。

5.置于平板振荡器中900rpm轻振10秒，或用手轻轻拍击反应板边缘，使孔中液体充分混匀。

6.封口膜将板条封好后，置于37℃水浴30分钟，也可置于空气浴35分钟后，取出，撕去封口膜，倒扣轻甩孔中液体后，用1×PBS洗涤5次，最后一次轻甩干后，将反应板条倒扣于吸水纸上，吸干孔中的残留液体。

7.加入1滴(50μL)羊/兔抗人IgG后，即刻加入1滴(50μL)指示红细胞，轻轻振荡混匀后，放入平板离心机，200g离心5分钟。

8.取出板条，进行结果判读。指示细胞平铺在反应板条微孔的整个底部，判为阳性，说明血小板交义配型不合；若指示细胞聚集在反应板条微孔的中央底部，形成细胞扣，判为阴性，说明血小板交又配型相合；若指示细胞在微板条孔底的形态介于上述两者之间，判为弱阳性，说明血小板交叉配型不合(图3)。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式，本发明并不局限于上述实施方式，在实施过程中可能存在局部微小的结构改动，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，且属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型。

Claims (4)

1.一种新型血小板交叉配型试剂盒，包括：

(1)U型反应微板，所述U型反应微板的孔底已包被聚乙烯亚胺；

(2)低离子介质，所述低离子介质为包含1.8％的甘氨酸和0.10％叠氮化钠的缓冲液；

(3)指示系统，所述指示系统包含IgG抗-D致敏的红细胞悬液和兔或羊抗人球蛋白试剂；

(4)阴性对照血清，所述的阴性对照血清为与人血小板无凝集反应的人血清加入0.1％的叠氮化钠；

(5)阳性对照血清，所述的阳性对照血清为与人血小板有凝集反应的人血清加入0.1％的叠氮化钠。

2.根据权利要求1所述的血小板交叉配型试剂盒，其特征在于，所述U型反应微板的孔底已包被了对血小板具有高强度吸附作用的0.1％聚乙烯亚胺。

3.根据权利要求1所述的血小板交叉配型试剂盒，其特征在于，所述的指示细胞是IgG-抗D致敏0型RhD(+)红细胞，并用红细胞保存液配制成0.35％的红细胞悬液。

4.根据权利要求1所述的血小板交叉配型试剂盒，其特征在于，所述的U型反应微板由96孔U型底可拆卸式微板条制成。