ES2296974T3 - Equipo y ensayo de diagnostico rapido. - Google Patents
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Abstract
Un dispositivo de ensayo (1) de flujo descendente o vertical para determinar la presencia o ausencia de un analito diana (10) en una muestra de fluido de ensayo (9), que comprende: * una unidad de ensayo (2) que comprende una zona de reacción (5) en comunicación vertical con una zona absorbente (4), en el que la zona de reacción (5) contiene el reactivo de captura inmovilizado (6) capaz de enlazarse con un analito diana (10) de interés para formar un complejo de dos miembros de una interacción de enlace específico y la zona absorbente comprende un material absorbente colocado por debajo de la zona de reacción para facilitar el flujo de fluido descendente o vertical a través de la zona de reacción; y * una unidad de post-filtro (3) que se puede retirar que comprende una zona marcada (7) que contiene un reactivo indicador seco (8), en el que el reactivo indicador (8) es capaz de enlazarse con un miembro de la interacción de enlace específico para producir una señal visualmente detectable trasla resolubilización del anterior mediante el reactivo tampón (12); y caracterizado en que la unidad de post-filtro (3) se coloca en proximidad de la unidad de ensayo (2) tras la formación del complejo de dos miembros de forma que la zona de reacción (5) de la unidad de ensayo (2) y la zona marcada (7) de la unidad de post-filtro (3) permiten el flujo directo descendente o vertical del reactivo indicador (8) resolubilizado desde la zona marcada (7) hasta la zona de reacción (5) tras la aplicación del reactivo tampón (12) a la zona marcada (7).
Description
Equipo y ensayo de diagnóstico rápido.
Se proporcionan un dispositivo de diagnóstico
rápido mejorado, el ensayo y un tampón multifuncional, para la
detección de un analito diana en una muestra de fluido de ensayo. El
ensayo utiliza un reactivo tampón multifuncional y un dispositivo
de flujo pistón que comprende una unidad de ensayo en combinación
con una unidad de postfiltración que se puede desmontar. Se
proporcionan también un procedimiento para utilizar el dispositivo
de flujo pistón, un kit de ensayo y una formulación para generar el
tampón multifuncional.
Los ensayos diagnósticos se han convertido en
una ayuda indispensable en los campos médico y de investigación
para detectar una variedad de componentes en los fluidos biológicos
y muestras de tejidos tales como fármacos, hormonas, enzimas,
proteínas, anticuerpos, y agentes infecciosos. Un principio
fundamental subyacente a la operación de numerosos de estos ensayos
es un reconocimiento específico y la reacción de enlace que se
produce entre dos o más miembros para formar un complejo que se
puede detectar posteriormente. Normalmente, los miembros implican
un reactivo de captura (por ejemplo, un receptor) que reconocerá de
manera específica y se enlazará con un analito diana de interés
(por ejemplo, un ligando) en una muestra de fluido de ensayo (por
ejemplo, sangre total, plasma, suero, orina, saliva, etc). Además,
se incluye en la reacción un indicador visualmente detectable que
reconocerá y se enlazará con cualquier analito complejado con el
reactivo de captura para producir una señal que indique que se ha
producido una reacción positiva. En concreto, se diseñan ensayos
inmunológicos para funcionar sobre la base del reconocimiento de
anticuerpos y la reacción selectiva de enlace con el antígeno y, de
acuerdo con esto, han demostrado ser extremadamente valiosos a lo
largo de años en aplicaciones clínicas para la detección de
numerosos estados infecciosos de enfermedad.
Con el fin de conseguir resultados fiables, sin
embargo, los inmunoensayos requieren a menudo precisión en la
realización de una serie de etapas que consumen tiempo, así como un
conocimiento técnico sobre el sofisticado equipo operativo de
laboratorio. De acuerdo con estos, su uso en el diagnóstico de
enfermedades infecciosas se ha limitado esencialmente a las
instalaciones clínicas que tienen los recursos necesarios para
realizar dichas determinaciones, entre los que se incluyen personal
técnico altamente entrenado y laboratorios equipados con equipos de
diagnóstico apropiados.
Sobre esta base, tal como con muchas
tecnologías, los ensayos de inmunodiagnóstico evolucionan hacia
soluciones más simplistas en la identificación y el diagnóstico
rápido de los estados de enfermedad infecciosa. Se vuelve más
deseable la necesidad de un ensayo cualitativo simplista para
detectar el analito en una muestra biológica, debido a que podría
ofrecer una posibilidad atractiva de uso en escenarios menos
convencionales que tengan recursos limitados, por ejemplo, la
consulta del médico, o el alojamiento familiar. Tanto en una
clínica de salud pública como en un escenario rural, es preferible
que se lleve a cabo un ensayo para la detección de un analito diana
en una muestra de fluido de ensayo sin la ayuda de instrumentos
complicados y la habilidad y conocimientos necesarios de personal
profesionalmente entrenado.
Otro factor importante a considerar en la
búsqueda de un ensayo diagnóstico mejorado es la ausencia de, o la
disponibilidad limitada de, congeladores y refrigeración en muchos
países del tercer mundo. Sobre esta base, ha llegado a ser más
deseable desarrollar reactivos de ensayo que mantengan su
estabilidad e integridad a temperatura ambiente durante períodos
prolongados de tiempo. En la actualidad, algunos dispositivos y
procedimientos de diagnóstico requieren el uso de diversos
reactivos de ensayo que tienen estabilidad variable dependiendo de
la temperatura a la que se almacenan y manipulan. Algunos de estos
reactivos son estables a temperatura ambiente y pueden almacenarse
durante cortos períodos de tiempo, mientras que otros son
relativamente inestables y comienzan a deteriorarse con rapidez,
afectando por tanto de manera adversa la sensibilidad global y la
fiabilidad del ensayo. De esta manera, la mayor parte de los
dispositivos de diagnóstico comercialmente disponibles requieren
que al menos uno o más de los reactivos necesarios se mantengan a
bajas temperaturas con el fin de asegurar su estabilidad. De
acuerdo con esto, un dispositivo de diagnóstico que incorpore
reactivos que se pueden almacenar a temperaturas ambiente y
permanezcan estables durante largos períodos de tiempo reteniendo a
la vez toda, o la mayor parte, de su actividad inicial podría tener
una clara ventaja sobre los dispositivos que se emplean en la
actualidad. Sobre esta base, un factor que merece la pena considerar
hacia la simplificación del ensayo diagnóstico y de esta manera,
hacer éste más práctico y ampliamente operativo, es minimizar el
número de reactivos de ensayo (por ejemplo, mezcla, lavado,
solventes de dilución, etc) y etapas integradas en el protocolo de
ensayo.
Un ensayo inmunodiagnóstico, que sea sencillo de
usar, rápido y fiable podría ser ventajoso también en la mejora de
la selección y los servicios de diagnóstico. De acuerdo con un
informe del U. S. Center for Disease Control and Prevention, los
ensayos de diagnóstico rápido permiten a los proveedores de cuidado
sanitario suministrar en minutos los resultados del ensayo en
pacientes en el momento del ensayo, aumentando potencialmente de
esta manera la efectividad global de la asistencia y los programas
de ensayo. Podría esperarse también que la simplificación de los
dispositivos diagnósticos y los ensayos podrían hacerles
posiblemente menos costosos de fabricar y llevar a cabo en
comparación con otros dispositivos convencionales, haciéndolos de
esta manera económicamente factibles y más abordables al uso en el
ínterin. Esto es particularmente deseable en países del tercer
mundo en los que sería ideal un dispositivo y ensayo diagnóstico
sencillo, rápido, sensible, y económico.
Con este fin, se han desarrollado numerosos
dispositivos analíticos con un amplio surtido de formas,
configuraciones y formatos, para detectar la presencia de un analito
diana en una muestra de fluido de ensayo, entre las que se incluyen
tiras de ensayo cromatográfico, varillas de inmersión, sistemas de
flujo transversal y flujo pistón, por nombrar unos pocos. Muchos de
estos dispositivos emplean membranas de reacción sobre las que se
inmoviliza un reactivo de captura capaz de reconocer y enlazar con
el analito diana. En esencia, el procedimiento de realización del
ensayo implica normalmente aplicar una muestra de fluido de ensayo
sospechosa de contener el analito diana, bien de manera directa o
indirecta mediante filtración, a la membrana de reacción. Si el
analito diana está presente en la muestra, se enlazará con el
reactivo de captura. A continuación se emplean procedimientos
posteriores para determinar si el analito diana se ha enlazado con
el reactivo de captura, indicando de esta manera su presencia en la
muestra.
La Patente de los Estados Unidos Nº 4.517.288
(Giegel, y col.) describe procedimientos para llevar a cabo
ensayos de enlace de ligando usando materiales porosos inertes. De
manera concreta, la patente describe la inmovilización de un
material inmunológico de enlace (por ejemplo, un anticuerpo),
específico para el ligando de interés (por ejemplo, un antígeno)
dentro de una zona de ensayo finito del material poroso y la
aplicación del ligando a la zona de ensayo que será capturado por
el material de enlace inmovilizado. Se puede conseguir la
inmovilización del material de enlace en el material poroso mediante
cualquier número de procedimientos convencionales entre los que se
incluyen adsorción, enlace covalente, uso de un agente de
acoplamiento, etc. A continuación se aplica un reactivo indicador
marcado con enzima, que reconocerá y se enlazará también con el
ligando, a la zona de ensayo, en la que éste llegará a inmovilizarse
en una cantidad directamente proporcional a la del ligando presente
en la zona. A continuación se aplica un solvente en el centro de la
zona de ensayo para eliminar cualquier reactivo indicador sin
enlazar, permitiendo de esta manera la determinación de una señal
que se va ha hacer con o sin la ayuda de instrumentos analíticos
apropiados.
Se describe una versión más sofisticada de un
ensayo de enlace específico en las Patentes de los Estados Unidos
N^{os} 4.094.647, 4.235.601 y 4.361.537 (Deustch, y col) que
incorpora una tira de ensayo cromatográfico capaz de transportar un
líquido revelador mediante acción capilar. Se diseña la tira de
ensayo de tal manera que tiene una primera zona de recepción de una
muestra, una segunda zona impregnada con un primer reactivo capaz
de ser transportado por el líquido revelador y una tercera zona
impregnada con un tercer reactivo. De manera adicional, el
dispositivo comprende una zona de medición y un elemento retardante
que puede ser cualquiera del segundo reactivo o el material de la
tira. El primer reactivo es capaz de reaccionar con uno del grupo
constituido por (1) la muestra, (2) la muestra y el segundo
reactivo, o (3) el segundo reactivo en competición con la muestra,
para formar un producto en una cantidad dependiente de las
características que se están determinando. Se pone en contacto una
muestra con la primera zona y a continuación se moja la tira en el
líquido revelador para provocar el transporte de la muestra y el
primer reactivo para formar el producto de reacción. El elemento
retardante transporta lentamente el producto o el primer reactivo
(el reactivo de movimiento) para separar espacialmente los dos y a
continuación se mide la cantidad de elemento en movimiento en la
localización de la medida.
Se describe en la Patente de los Estados Unidos
Nº 4.960.691 (Gordon y col.) una variación del dispositivo de
Deustch, y col., para el análisis de antígenos, anticuerpos o
polinucleótidos, que también usa una longitud de un material
cromatográfico (es decir, una tira de ensayo), un vehículo solvente
y reactivos móviles. Esencialmente, la tira tiene tres zonas
separadas que comprenden una primera zona impregnada con un reactivo
móvil con el analito de interés, una segunda zona para la recepción
de una muestra de ensayo sospechosa de contener el analito, y una
tercera zona impregnada con un reactivo inmovilizado que enlaza de
manera selectiva con el analito, volviendo por tanto el analito en
forma inmovilizada. Cada zona se localiza secuencialmente
equidistante de su vecina a lo largo de un eje longitudinal de la
tira de ensayo. El dispositivo comprende de manera opcional una
cuarta y quinta zonas impregnadas con reactivos indicadores que
proporcionarán un medio para detectar la presencia del analito. El
procedimiento implica depositar la muestra de ensayo en la segunda
zona, seguido por la adición de solvente a la tira en el extremo en
el que se localiza la primera zona de tal manera que se produce de
manera eventual un movimiento secuencial y la llegada del analito y
el primer reactivo en la tercera zona. La relación del
emplazamiento entre la segunda y tercera zonas es tal que se
inmoviliza el analito frente al transporte de solvente en la tercera
zona antes de que el primer reactivo alcance la tercera zona.
Cualquier componente interferente de muestra no analito que sea
reactivo con el primer reactivo se aclara en la tercera zona
mediante el transporte del solvente antes de la llegada del primer
reactivo a la tercera zona. Se han descrito
múltiples dispositivos de rutas únicas para llevar a cabo una variedad de procedimientos de ensayo multietapas.
múltiples dispositivos de rutas únicas para llevar a cabo una variedad de procedimientos de ensayo multietapas.
La Patente de los Estados Unidos Nº 4.168.146
(Grubb, y col.) describe el uso de tiras de ensayo para llevar a
cabo inmunoensayos tipo sándwich. Las tiras están formadas por
materiales vehículo altamente absorbentes a los cuales se han
ligado anticuerpos mediante adsorción, absorción o enlace covalente.
Los materiales de tira de ensayo preferidos incluyen materiales que
contienen fibra de celulosa tales como papel de filtro, papel de
intercambio iónico y papel cromatográfico. También se describen los
usos de materiales tales como discos de celulosa para cromatografía
en capa fina, discos de acetato de celulosa, almidón y materiales
entrecruzados tridimensionales tales como Sephadex (Pharmacia Fine
Chemicals, Upsala, Suecia). Se lleva a cabo el inmunoensayo
humedeciendo la tira de ensayo con un volumen medido de una muestra
de ensayo sospechosa de contener el antígeno. Cualquier antígeno
presente en la muestra de ensayo migra por acción capilar a lo largo
de la tira de ensayo. Sin embargo, la extensión de migración del
antígeno durante un periodo fijo de tiempo se determina por la
concentración de antígeno en la muestra de ensayo debido a que los
anticuerpos de enlace retardan la migración de los antígenos para
los que son específicos. Después, las zonas del dispositivo de
diagnóstico que contienen antígeno, se indican mediante la adición
de anticuerpos marcados.
Se describe en la Patente de los Estados Unidos
Nº 4.632.901 (Valkirs, y col.) un sistema inmunodiagnóstico de
flujo pistón que comprende una serie de etapas de procedimiento. La
primera etapa implica tomar una muestra de fluido de ensayo
sospechosa de contener un primer miembro de un par de enlace
específico (por ejemplo, un antígeno) y verter éste sobre un
material poroso en el que se inmoviliza un segundo miembro del par
de enlace específico (por ejemplo, un anticuerpo). Influenciada por
las propiedades de acción capilar de un material absorbente, la
muestra de fluido de ensayo es atraída hacia abajo en dirección
vertical a través del material poroso y pasa al anticuerpo
inmovilizado. Cualquier antígeno presente en la muestra será
capturado posteriormente por el anticuerpo inmovilizado. La segunda
etapa implica para una solución separada de anticuerpo marcado a
través del material poroso de tal manera que el anticuerpo marcado
pueda enlazar con el antígeno ya capturado por el anticuerpo
inmovilizado para formar un complejo de tres miembros. Cualquier
anticuerpo marcado sin reaccionar o sin enlazar se retira con agua
del material poroso mediante una tercera etapa, denominada
normalmente como etapa de lavado, usando un reactivo adecuado que
puede seguirse a continuación por un período de incubación.
Finalmente se añade una cuarta etapa que implica añadir una solución
separada que contiene un sustrato reactivo con la marca del
anticuerpo para producir un cambio visible de color indicativo de la
presencia del antígeno de interés. Para facilitar el comportamiento
preciso de este procedimiento, se diseña el equipo de tal manera
que se canaliza la muestra a través del material absorbente que, por
acción capilar, arrastra la muestra a través del material y hasta la
parte inferior del equipo.
Un sistema inmunodiagnóstico de flujo pistón
descrito por Liotta en la Patente de los Estados Unidos Nº
4.446.232 utiliza una combinación de dos zonas diferentes de
reacción dispuestas en tres capas separadas. La primera zona de
reacción comprende dos capas fabricadas de material poroso en las
que la primera y segunda capas se impregnan con un anticuerpo
enlazado con un enzima soluble y un antígeno inmovilizado, de manera
respectiva. La tercera capa, o la segunda zona de reacción,
contienen reactivos indicadores inmovilizados que reaccionarán con
el enzima enlazado con el anticuerpo de la primera zona de reacción
para producir un color. Si una muestra líquida contiene el antígeno
de interés, entonces una vez que la muestra se ha aplicado a la
primera zona de reacción, el antígeno contenido en la anterior
enlazará con el anticuerpo enlazado con el enzima soluble y se
difundirá a través de la segunda zona de reacción tras un corto
período de incubación. Se detectará la presencia del antígeno
cuando el enzima reacciona con el reactivo indicador para producir
un color. En contraste, si una muestra líquida no contiene ningún
antígeno, entonces el anticuerpo enlazado con el enzima migrará a
la segunda capa de la primera zona de reacción, ayudado por la
difusión de la muestra de fluido de ensayo, en la que enlazará con
el antígeno inmovilizado. La reacción de enlace que se produce
evitará que cualquier anticuerpo enlazado con el enzima alcance la
segunda zona de reacción en la que podría reaccionar con el
reactivo indicador. De esta manera, en un escenario concreto, no se
observó color indicando la ausencia de antígeno en la muestra de
fluido de ensayo.
Aunque los procedimientos y dispositivos
descritos anteriormente pueden proporcionar medios compactos y
bastante fiables para llevar a cabo ensayos inmunodiagnósticos,
existen todavía diversos problemas con respecto a su uso. En
concreto, una de las desventajas encontradas en la determinación de
la presencia o ausencia de un analito diana en la mayoría de los
casos es el requerimiento de llevar a cabo diversas etapas de
adición y lavado usando un intervalo de solventes. Las etapas de
lavado son esenciales en diversas fases del protocolo de ensayo con
el fin de evitar reacciones cruzadas no deseadas, y para eliminar
cualquier exceso de reactivos y sustancias sin enlazar que pueden
interferir posteriormente con los resultados. Desafortunadamente,
esto sólo complica el procedimiento global y reduce de manera
efectiva el nivel de eficiencia deseado con el fin de desarrollar
una versión mejorada y simplificada de un ensayo inmunodiagnóstico.
De esta manera, la necesidad de adherir diversas etapas de adición,
lavado e incubación ha limitado mucho estos procedimientos a
escenarios clínicos en los que están disponibles personal experto y
equipos sofisticados para monitorizar y llevar a cabo cuidadosamente
el ensayo con precisión y fiabilidad.
De manera adicional, los ensayos
inmunodiagnósticos que emplean tiras de ensayo cromatográfico o
varillas de inmersión padecen un problema con respecto al
tratamiento secuencial con uno o más solventes en diversas fases
del procedimiento de ensayo. Como se añade cada solución al
dispositivo, o como se sumerge cada dispositivo en sucesivas
soluciones, se mejora la oportunidad de verter o poner en contacto
entre sí las soluciones y el usuario, conduciendo de esta manera a
una posible contaminación y reducción en la fiabilidad del
ensayo.
Dependiendo del ensayo y dispositivo usados, es
normalmente necesario que la muestra de ensayo se diluya con un
reactivo apropiado antes de la aplicación de tal manera que se
difunda más fácilmente a través del material poroso y/o no disperse
la concentración del reactivo marcado. Sin embargo, la dilución de
la muestra de ensayo no sólo reduce la velocidad y la facilidad de
llevar a cabo un ensayo incluyendo una etapa y un reactivo
adicionales, sino que reduce también la sensibilidad del ensayo
debido a la correlación de la concentración de analito con la señal
de detección generada.
Las Patentes de los Estados Unidos 5.879.951,
5.877.028, y los Documentos WO 01/55723 y EP 0 806 666, describen
dispositivos de flujo transversal.
Dependiendo de la movilidad relativa del analito
de interés, el tipo de reactivos y solventes usados, y la relación
de emplazamiento entre las diferentes zonas de reacción, es esencial
un tiempo adecuado con el fin de permitir la migración eficiente de
todos los diversos componentes a lo largo del material
cromatográfico de la fase sólida. Además, la técnica de flujo
transversal contribuye a menudo a una mayor incidencia de resultados
imprecisos debido a la tendencia de los reactivos móviles a
acumularse en, más bien que a aclararse, la periferia de la zona de
reacción. Como resultado, estos reactivos interactuarán a menudo en
la zona y producirán productos coloreados que pueden
malinterpretarse fácilmente como un resultado positivo o negativo
verdadero.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se conocen diversos tampones y aditivos para
dichos ensayos inmunodiagnósticos, que incluyen las composiciones y
aditivos tamponados descritos en los Documentos de los Estados
Unidos 5.185.264, 4.087.567 y 5.879.951.
De acuerdo con esto, la presente invención
proporciona un dispositivo de diagnóstico rápido mejorado, un
ensayo y un tampón multifuncional para la detección de un analito
diana en una muestra de fluido de ensayo que es eficiente, fiable y
práctico de llevar a cabo. El ensayo simplificado en 2 etapas
utiliza un reactivo tampón multifuncional y un dispositivo de flujo
pistón de dos componentes que comprende una unidad de ensayo en
combinación con una unidad desechable de postfiltración que son
capaces de recibir la muestra de fluido de ensayo y un tampón
multifuncional, de manera respectiva.
El tampón multifuncional sirve como reactivo
combinado para lavado, dilución, humectación y resolubilización,
sin sacrificar la sensibilidad o especificidad del ensayo
diagnóstico. De manera adicional, se formula el tampón para
preservar y optimizar la estabilidad de la proteína, así como
minimizar, si no eliminar, las interacciones no específicas que
pueden conducir a la generación de una señal falsa.
Un objeto de la presente invención es superar
las desventajas asociadas con los ensayos de diagnóstico rápido
existentes, proporcionando un dispositivo mejorado, un procedimiento
y un reactivo tampón multifuncional.
El objeto de la presente invención es conseguir
mediante flujo descendente o vertical a través de un dispositivo de
ensayo de acuerdo con la reivindicación 1, un procedimiento para
determinar la presencia o ausencia de un analito diana de acuerdo
con la reivindicación 51, un procedimiento para determinar la
presencia o ausencia de un analito diana de acuerdo con la
reivindicación 53 y un kit de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 55. Se describen las formas de realización
preferidas en las subreivindicaciones respectivas.
Usando el dispositivo simplificado y el reactivo
tampón único de la presente invención, (1) se puede llevar a cabo
un ensayo cualitativo y semicuantitativo y fácilmente legible, (2)
requiere un número mínimo de etapas, (3) no requiere periodos de
incubación largos, y (4) es altamente sensible, específico y fiable.
Normalmente, se necesita tan poco como una única gota (50 \muL)
de una muestra de fluido de ensayo para llevar a cabo el ensayo.
Además, el dispositivo y ensayo de la presente invención es
particularmente ventajoso en que no es sólo conveniente y sencillo
de usar, sino que el dispositivo y los reactivos se pueden almacenar
a temperatura ambiente durante largos períodos de tiempo sin
disminuir la actividad o la sensibilidad del ensayo.
La combinación de características asociadas con
la presente invención se refiere a la implementación de una técnica
de flujo pistón en la realización de ensayos diagnósticos que se
basan en reacciones de enlace específico entre dos o más miembros
complementarios. Sobre esta base, el dispositivo de diagnóstico
rápido, el ensayo y el tampón multifuncional de la presente
invención tienen una amplia aplicabilidad a una variedad de
procedimientos de ensayo de pares de enlace específico que emplean
de manera esencial un reactivo de captura que reconocerá y enlazará
con un analito diana de interés. Por ejemplo, el dispositivo de esta
invención puede usarse en un ensayo inmunodiagnóstico para la
detección de cualquier antígeno o anticuerpo en una muestra de
fluido de ensayo y es adaptable para el uso en un formato de
detección en sándwich o competitivo.
La cinética de la reacción entre el analito
diana y el reactivo indicador es extremadamente rápida y completa
debido a que el dispositivo de ensayo y el procedimiento operan
sobre la base de un formato en flujo pistón. Además, el
procedimiento de la presente invención mejora la fiabilidad del
ensayo en comparación con los ensayos convencionales debido a que
la etapa final del ensayo implica la adición del reactivo indicador
resolubilizado al analito diana una vez que el analito se ha
complejado ya con el reactivo de captura. En contraste, los ensayos
más convencionales requieren la premezcla del reactivo indicador con
una muestra de fluido de ensayo antes de la adición del reactivo de
captura. Como resultado, se reduce la sensibilidad global del
ensayo debido a la posibilidad del reactivo indicador de entrar en
contacto con los contaminantes presentes en la muestra de ensayo
durante la fase inicial del protocolo de ensayo, en vez de
únicamente el analito de interés.
El dispositivo de diagnóstico rápido mejorado se
usa en combinación con un reactivo tampón multifuncional con el
objetivo de detectar un analito diana en una muestra de fluido de
ensayo basándose en el principio de interacción del enlace
específico entre dos o más miembros complementarios. El dispositivo
de la invención comprende, como primer componente, una unidad de
ensayo capaz de recibir una muestra de fluido de ensayo, en
combinación con un segundo componente, denominado unidad postfiltro,
capaz de recibir el tampón multifuncional. La unidad de ensayo
comprende (1) una zona de reacción que contiene reactivo de captura
inmobilizado que puede reconocer de manera específica y enlazar con
el analito diana, (2) una zona absorbente que soporta la zona de
reacción, y de manera opcional, (3) una zona de separación de la
sangre en comunicación fluida transversal con la zona de reacción.
La unidad postfiltro comprende una zona de marca permeada con un
reactivo indicador seco que se resolubiliza tras la adición del
tampón multifuncional. La zona de reacción de la unidad de ensayo
se orienta de tal manera que la zona de marca de la unidad
postfiltro puede ponerse en comunicación fluida con la anterior
después que se aplica la muestra de fluido de ensayo a la unidad de
ensayo.
En el caso de un ensayo inmunodiagnóstico, por
ejemplo, en el que el analito de interés es un antígeno, un
anticuerpo, de manera preferible un anticuerpo monoclonal o un
anticuerpo policlonal purificado mediante afinidad para el
antígeno, se enlaza a la zona de reacción como el reactivo de
captura. En una forma de realización preferida, la zona de reacción
está comprendida por una membrana porosa compatible para la
inmovilización del reactivo de captura y tiene un bajo enlace no
específico para el reactivo indicador. Cualquier emplazamiento de
enlace no específico sobre la superficie de la membrana porosa de
reacción se inactiva aplicando un agente que bloquea la proteína.
La especificidad y afinidad del reactivo de captura inmovilizado es
tal que enlaza de manera eficiente y concentra cualquier analito
contenido en la muestra de fluido de ensayo dentro de una región
definida de tal manera que la muestra se difunde mediante acción
capilar desde la membrana de reacción a la zona absorbente
directamente inferior.
Puede aumentarse la sensibilidad de los
inmunoensayos de tipo reacción-membrana (es decir,
la capacidad para detectar niveles muy bajos de analito diana) si
la muestra se concentra a través de la membrana de reacción. Por
tanto, la concentración del analito sobre la membrana de reacción se
consigue teniendo un material absorbente, que define la zona
absorbente, colocada directamente debajo de la membrana de reacción
que drenará la muestra de fluido de ensayo, dejando únicamente el
analito sobre la superficie superior de la membrana de reacción.
Debido a que el material absorbente está en comunicación fluida con
la membrana de reacción, se selecciona el material basándose en las
propiedades físicas que tiene (por ejemplo, tamaño de poro, potencia
de absorción, etc) que inducirá de manera efectiva al flujo de
fluido a través de la membrana de reacción, manteniendo de manera
adecuada la muestra y el reactivo fluidos, y proporcionando soporte
para la membrana.
Para facilitar la detección en una muestra de
sangre total, una forma de realización alternativa de la presente
invención proporciona una unidad de ensayo capaz de recibir y
separar la porción de fluido de una muestra de sangre total de los
glóbulos rojos de la sangre (RBC), transportando a la vez la porción
de fluido libre de RBC de la muestra a la zona de reacción para la
detección del analito. Esta característica concreta es útil para
evitar cualquier interferencia durante la visualización de una
reacción de color para la detección del analito (es decir, el uso
de marcas "directas" que proporcionan una señal visualmente
detectable directamente sin la ayuda de instrumentos) y también
evita la necesidad de obtener una extracción preliminar de suero o
plasma en escenarios en los que no está disponible el equipo
apropiado para llevar a cabo dicho procedimiento.
De esta manera, en el caso en el que la muestra
de fluido de ensayo que se va a analizar sea una muestra de sangre
total, la unidad de ensayo opcionalmente presenta una zona separada
de separación de sangre en comunicación fluida transversal con la
zona de reacción. De manera general, la zona de separación de sangre
funciona para retener de manera selectiva componentes celulares (es
decir, glóbulos rojos de la sangre) contenidos dentro de la muestra
de sangre total y libera los componentes restantes de la muestra de
sangre, que incluyen cualquier analito, en la zona de reacción. Un
primer extremo de la zona de separación de sangre, localizado a una
corta distancia transversal de la zona de reacción, define una
región para recibir la muestra de sangre total antes de la
introducción del analito en la zona de reacción. Un segundo extremo
de la zona de separación de sangre es contiguo con, y de esta
manera en comunicación fluida directa con, la zona de reacción,
promoviendo por tanto el movimiento capilar de la porción de fluido
libre de RBC de la muestra de sangre del primer extremo de la zona
de reacción para el análisis directo del analito diana. De esta
manera, en efecto, el material de separación de la sangre funciona
como un material de flujo transversal para la eliminación selectiva
de una cantidad efectiva de glóbulos rojos de la sangre de la
muestra de sangre total para evitar interferencias con la detección
visual del analito, permitiendo a la vez que otros componentes de la
muestra fluyan con movimiento relativamente desequilibrado a través
de la unidad de ensayo.
En una forma de realización preferida, la zona
de separación de la sangre es una tira alargada o rectangular de
material poroso que emplea un vehículo hidrofóbico y que tiene
propiedades intrínsecas que le permiten atrapar o retener de manera
preferente los glóbulos rojos de la sangre en la muestra dentro de
la zona de separación de la sangre. El vehículo o respaldo
proporciona soporte para el material de separación de la sangre y
reduce escapes de la muestra de sangre total cuando la porción de
fluido libre de RBC migra a lo largo del material hacia la zona de
reacción.
El segundo componente del dispositivo,
denominado unidad postfiltro, comprende una zona de marca permeada
con un reactivo indicador seco. La zona de marca de la unidad
postfiltro es capaz de colocarse en comunicación fluida transitoria
con la zona de reacción de la unidad de ensayo tras una corta
aplicación de la muestra de ensayo fluida a la unidad de ensayo.
Impregnar la zona de marca de la unidad
postfiltro con un reactivo indicador permanentemente detectable
elimina la necesidad de llevar a cabo las etapas de resolubilización
separada que implican una medida precisa, añadiendo y premezclando
con un solvente adecuado que aumenta la posibilidad de error del
usuario. En una forma de realización preferida, la zona de marca
comprende un medio de filtración seleccionado sobre la base de
tener un tamaño de poro suficientemente grande de tal manera que,
cuando se resolubiliza el reactivo indicador seco mediante la
adición del tampón multifuncional, éste fluirá con facilidad a
través de una zona expuesta del medio poroso de filtración mediante
el proceso de difusión. La forma y dimensiones de la unidad
postfiltro son tales que ésta mantendrá y canalizará de manera
efectiva el tampón multifuncional a través del medio poroso de
filtración cuando la zona de marca se coloca en comunicación fluida
transitoria con la zona de reacción de la unidad de ensayo durante
el procedimiento de ensayo.
De acuerdo con otro aspecto importante de la
invención, se proporcionan procedimientos y dispositivos que
utilizan materiales de enlace "directo" específicamente
marcados (es decir, materiales marcados con partículas coloidales
que se secan sobre un medio de filtración y por lo tanto, son
capaces de resolubilizarse y transportarse rápidamente a la zona de
reacción en presencia del tampón multifuncional. Se conocen bien en
la técnica las marcas directas y son muy ventajosas para su uso en
sistemas de diagnóstico rápido. Las marcas directas son capaces de
producir una señal visualmente detectable sin la ayuda de
instrumentación o la adición de reactivos adicionales y son
estables cuando se almacenan en estado seco. Suministrar el reactivo
indicador por medio de la incorporación de éste dentro del medio de
filtración en forma seca proporciona un medio barato y conveniente
de almacenamiento de dicho reactivo. Las marcas preferidas para
llevar a cabo los ensayos de diagnóstico son las partículas de
material coloidal, de manera preferible oro coloidal, aunque se
pueden emplear otras marcas directas que incluyen, pero no se
limitan a, soles no metálicos, soles de colorante, partículas de
látex, sol de carbono y cuerpos coloreados contenidos en
liposomas.
De acuerdo con un aspecto adicional importante
de la presente invención, se proporciona una composición acuosa
adecuada para el uso como reactivo multifuncional en un ensayo
diagnóstico, que comprende: (1) un tampón biológico para mantener
el pH entre aproximadamente 7,0 y 10,0; (2) al menos un tensioactivo
para reducir el enlace no específico de los reactivos de ensayo
evitando simultáneamente a la vez la inhibición de una interacción
de enlace específico; (3) un polímero de elevado peso molecular como
reactivo dispersante y de suspensión que tenga un peso molecular en
un intervalo de entre aproximadamente 2 x 10^{2} y aproximadamente
2 x 10^{6} D; (4) un estabilizador de pH para mantener el pH del
tampón multifuncional entre aproximadamente pH 7,0 y 10,0; (5) una
sal iónica para reducir el enlace no específico de los anticuerpos;
(6) al menos un conservante para reducir el crecimiento bacteriano
y microbiano; y (7) un quelador de calcio para evitar la
coagulación de la muestra de ensayo de sangre total; en la que el
tampón biológico, el tensioactivo, el polímero de elevado peso
molecular, el estabilizador del pH, la sal iónica, el conservante y
el quelador de calcio están todos en concentraciones efectivas.
La formulación mejorada de tampón no requiere
aditivos adicionales o el mantenimiento e inspección mediante
instrumentos de laboratorio. De manera más importante, sin embargo,
es la naturaleza multifuncional del reactivo tampón la que
posibilita que sirva como solución de lavado, diluyente, reactivo de
resolubilización y transporte de solvente, eliminando por tanto la
necesidad de diversas soluciones separadas y las etapas que se van
a llevar a cabo durante el protocolo de ensayo. El desarrollo de un
tampón multifuncional único simplifica enormemente el procedimiento
de ensayo reduciendo el tiempo y las etapas manuales requeridas para
llevar a cabo el ensayo, minimizando por tanto la probabilidad de
error del usuario. De manera adicional, la utilización del tampón
multifuncional en un formato de flujo pistón promueve la liberación
rápida y la transferencia mejorada de masa del reactivo indicador
seco desde la unidad postfiltro a la unidad de ensayo
inmediatamente después de la resolubilización. Otras propiedades
funcionales exhibidas por el tampón multifuncional son que este
mantiene la estabilidad de la proteína, preservando y optimizando
por tanto la reacción de enlace específico que se produce entre los
miembros de enlace complementarios, es decir, el reactivo de captura
y el analito diana. Además, tras la resolubilización del reactivo
indicador seco, el tampón ayuda a maximizar la generación de la
señal en el caso de una reacción de enlace específico y minimiza el
enlace no específico con la membrana de reacción que puede, de otra
manera, conducir a la generación de una señal falsa.
De acuerdo con otro aspecto adicional de la
presente invención, se proporciona un procedimiento sencillo en 2
etapas para llevar a cabo un ensayo diagnóstico que comprende (1)
depositar una muestra de fluido de ensayo sobre la zona de reacción
de la unidad de ensayo, o una muestra de sangre total, sobre un
primer extremo de una zona de separación de sangre y en seguida
después de eso, poner la unidad de ensayo y la unidad postfiltro en
asociación operativa con la misma de tal manera que la zona de marca
de la unidad postfiltro esté en comunicación fluida transitoria con
la zona de reacción de la unidad de ensayo, y (2) añadir el tampón
multifuncional a la unidad postfiltro eliminando después la unidad
postfiltro para observar el resultado del ensayo. Tras la adición
del tampón multifuncional a la unidad postfiltro, el reactivo tampón
se difunde a través de la zona de marca para reconstituir el
reactivo indicador y transportar éste a la zona de reacción en la
que reaccionara con cualquier analito capturado. Si el analito está
presente en la muestra de fluido de ensayo, aparecerá una señal
detectable en la zona de reacción, que se puede inspeccionar
visualmente para el color y, de esta manera, hacerse una
determinación de la presencia o ausencia del analito tras la
eliminación de la unidad postfiltro. Una ventaja importante
proporcionada por la presente invención es que la afinidad por el
enlace del reactivo de captura es capaz de inmovilizar y optimizar
la exposición del analito en el flujo de corriente del reactivo
indicador reconstituido de tal manera que éste se acumula en la zona
de reacción y de esta forma, se separa eficientemente de la
corriente base de reactivo indicador no concentrado.
La presente invención proporciona también un kit
de ensayo diagnóstico para uso en la detección de un analito diana
en una muestra de fluido de ensayo sospechosa de contener el
analito. Esencialmente el kit comprende en una combinación
envasada: (1) el dispositivo de ensayo de diagnóstico rápido que
comprende la unidad de ensayo y la unidad postfiltro tal como se ha
descrito anteriormente; (2) un reactivo tampón multifuncional para
la reconstitución del reactivo indicador seco; y (3) instrucciones
para llevar a cabo el ensayo diagnóstico. El kit de ensayo
comprende de manera preferible un contenedor adecuado para alojar la
unidad de ensayo y la unidad postfiltro con el fin de salvaguardar
de la contaminación los materiales de la fase sólida y el reactivo
indicador seco, así como proporcionar facilidad y conveniencia en la
manipulación del dispositivo de ensayo. De manera opcional, el kit
de ensayo incluye también un medio para aplicar la muestra d ensayo
y el tampón multifuncional de la unidad de ensayo y la unidad
postfiltro, de manera respectiva (por ejemplo, pipetas
desechables).
La Fig. 1A es un diagrama esquemático de una
primera forma de realización del dispositivo de diagnóstico en flujo
pistón de la presente invención que comprende la unidad de
ensayo y la unidad postfiltro;
La Fig. 1B es un diagrama esquemático de una
segunda forma de realización del dispositivo de diagnóstico en flujo
pistón de la presente invención para analizar una muestra de ensayo
de sangre total que comprende la unidad de ensayo y la unidad
postfiltro;
La Fig. 2A es un diagrama esquemático de una
muestra de ensayo aplicada a la zona de reacción de la unidad de
ensayo que contiene el analito diana;
La Fig. 2B es un diagrama esquemático del
analito diana complejado con el reactivo de captura una vez que se
ha difundido completamente la muestra de ensayo a través de la zona
de reacción y en la zona absorbente de la unidad de ensayo;
La Fig. 2C es un diagrama esquemático de la
unidad postfiltro en comunicación fluida con la zona de reacción de
la unidad de ensayo, a la cual se añade el tampón
multifuncional;
La Fig. 2D es un diagrama esquemático del
reactivo indicador resolubilizado que ha reaccionado con el reactivo
de captura complejado y el analito tras la adición del tampón
multifuncional a la unidad postfiltro;
La Fig. 3A es un diagrama esquemático de una
muestra de ensayo aplicada a la membrana porosa de reacción de la
unidad de ensayo que no contiene el analito diana;
La Fig. 3B es un diagrama esquemático del
reactivo de captura sin complejar una vez que se ha difundido la
muestra de ensayo a través de la membrana de reacción y en el
material absorbente de la unidad de ensayo;
La Fig. 3C es un diagrama esquemático de la
unidad postfiltro en comunicación fluida con la zona de reacción de
la unidad de ensayo, a la cual se añade el tampón
multifuncional;
La Fig. 3D es un diagrama esquemático del
reactivo indicador sin reaccionar tras la resolubilización mediante
el tampón multifuncional tras la difusión a través de la zona de
reacción y en la zona absorbente de la unidad de ensayo;
La Fig. 4 muestra una vista del despiece en
sección transversal de un ejemplo de un contenedor adecuado que
aloja la unidad de ensayo y la unidad postfiltro;
La Fig. 5 muestra una vista aumentada en sección
transversal del contenedor de la Fig. 4 en su forma ensamblada;
La Fig. 6 es un diagrama esquemático de de una
segunda forma de realización de una porción de la unidad de ensayo
que comprende un material que define la zona de separación de la
sangre en comunicación fluida con la zona de reacción; y
La Fig. 7A es un diagrama esquemático de una
vista en planta desde arriba del miembro superior de un cartucho de
ensayo de 2 depósitos para recibir y analizar una muestra de sangre
total; y
La Fig. 7B es un diagrama esquemático de una
vista en planta desde arriba del miembro inferior de un cartucho de
ensayo de 2 depósitos para recibir y analizar una muestra de sangre
total.
Aunque esta invención se satisface de muchas
formas diferentes mediante las formas de realización, se
describirán en detalle en el presente documento las formas de
realización preferidas de la invención, entendiendo que se va a
considerar como ejemplar la presente descripción de los principios
de la invención y no se pretende que limite la invención en las
formas de realización ilustradas y descritas. Se medirá el alcance
de la invención mediante las reivindicaciones adjuntas y sus
equivalentes.
A no ser que se defina de otra manera, todos los
términos técnicos y científicos usados en el presente documento
tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona
experta en la técnica a la que pertenece esta invención. Debe
señalarse también que, tal como se usa en la materia y en las
reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "uno",
"una" y "el" incluyen los consiguientes plurales a no ser
que el contexto dicte claramente otra cosa. Por ejemplo, se
pretende que la referencia a un "antígeno" o "anticuerpo"
incluya una pluralidad de moléculas de antígenos o anticuerpos.
Se pueden expresar los intervalos en el presente
documento como de "alrededor de" o "aproximadamente" un
valor concreto hasta "alrededor de" o "aproximadamente"
otro valor concreto. Cuando se expresa dicho intervalo, otra forma
de realización incluye entre un valor concreto y/o el otro valor
concreto. De manera similar, cuando se expresan valores como
aproximaciones, mediante el uso del antecedente "alrededor de"
se entenderá que el valor concreto conforma otra forma de
realización.
Tal como se ha empleado a lo largo de la
descripción, deberá entenderse que los siguientes términos, a no ser
que se indique otra cosa, tienen los siguientes significados:
Zona absorbente - Se pretende que el
término "zona absorbente" incluya una o más capas de un
material permeable (por ejemplo, poroso o fibroso), cuyas capas
pueden ser iguales o diferentes, y son capaces de arrastrar o
absorber fluido mediante acción capilar. La zona absorbente debería
también ser capaz de absorber un volumen sustancial de fluido que
sea equivalente o mayor que la capacidad de volumen total del propio
material, y de esta manera tiene una elevada capacidad
absorbente.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Analito (o analito diana) - el compuesto
o composición de interés que se va a detectar en una muestra de
fluido de ensayo derivada biológicamente. Los ejemplos de analitos
pueden incluir fármacos, hormonas, polipéptidos, proteínas que
incluyen inmunoglobulinas, polisacáridos, ácidos nucleicos, y las
combinaciones de los mismos.
Anticuerpo - una inmunoglobulina, ya sea
producida de manera natural o parcial o completamente sintética. El
término cubre también cualquier polipéptido o proteína que tenga una
región de enlace que sea, o que sea homóloga a, una región de
enlace con el anticuerpo. Se puede derivar ésta de fuentes
naturales, o se puede producir parcial o completamente sintética.
Los ejemplos de anticuerpos son los isotipos de inmunoglobulinas y
sus subclases isotópicas; los fragmentos que comprenden una región
de enlace con el antígeno tales como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; y los
diacuerpos.
Los anticuerpos útiles en la realización de los
inmunoensayos de la presente invención incluyen aquellos
específicamente reactivos con diversos analitos, la detección de
los cuales, se desea en fluidos biológicos. Dichos anticuerpos son
de manera preferible los anticuerpos IgG o IgM o las mezclas de los
mismos, que están esencialmente libres de asociación con los
anticuerpos capaces de enlazar con moléculas no analito. Los
anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales y están
comercialmente disponibles o se pueden obtener de ascitis de ratón,
cultivo de tejido u otras técnicas conocidas en la técnica. Se
puede encontrar una descripción típica del procedimiento del
hibridoma para la producción de anticuerpos monoclonales en Wands,
J. R., y V. R. Zurawski, Gastroenterology 80:225 (1981);
Marshak-Rothstein, A., y col.; J. Immunol. 122:2491
(1979); Oi, V. Y. y L. A. Herzenberg, "Immunoglobulin Producing
Hybrid", Mishell B. B. y S. M. Shiigi (eds) Selected Methods in
Cellular Immunology, San Francisco: W. H. Freeman Publishing, 1979;
y la Patente de los Estados Unidos Nº 4.515.893 otorgada a Kung, y
col. Se puede desear el uso de mezclas de anticuerpos monoclonales
de diferentes especificidades antigénicas o de anticuerpos
monoclonales y anticuerpos policlonales. Se contempla de manera
adicional que se puedan usar fragmentos de moléculas de anticuerpos
como reactivos de enlace específico de acuerdo con la invención que
incluyen moléculas de semianticuerpos y los fragmentos Fab, Fab' o
F(ab')_{2} conocidos en la técnica. Sin tener en cuenta la
fuente concreta o el tipo de anticuerpos, sin embargo, se prefiere
que estén generalmente libres de impurezas. Se pueden purificar los
anticuerpos mediante cromatografía en columna u otros medios
convencionales pero se purifican de manera preferible de acuerdo
con técnicas conocidas de purificación por afinidad. Se pueden
marcar también los materiales de anticuerpos con partículas
coloidales de acuerdo con la invención y usadas en ensayos tipo
sándwich para la detección de analitos de antígeno o en ensayos de
competición para la detección de analitos de anticuerpo.
Antígeno - los antígenos y haptenos
útiles en la realización de los inmunoensayos de la presente
invención que incluyen aquellos materiales, tanto naturales como
sintéticos, que presentan determinantes antigénicos para los cuales
los anticuerpos del analito son específicamente reactivos cuando se
usan de acuerdo con la presente invención. Los antígenos
sintetizados incluyen aquellos que se construyen de acuerdo con las
síntesis químicas convencionales así como aquellos que se
construyen de acuerdo con las técnicas de ADN recombinante. Se
pueden marcar también los materiales de antígeno con partículas
coloidales de acuerdo con la invención y usadas en ensayos tipo
sándwich para la detección de anticuerpos de los analitos o en
ensayos de competición para la detección de los antígenos de los
analitos.
Zona de separación de la sangre - Se
pretende que el término "zona de separación de la sangre"
incluya un material poroso y/o fibroso que sea capaz de retener los
glóbulos rojos de la sangre (RBC) de una muestra de sangre total
dejando el fluido libre de RBC, incluyendo cualquier analito diana,
para migrar en un flujo transversal por medio de la acción
capilar.
Acción capilar - tal como se usa en el
presente documento, el término "capilar" incluye un capilar u
otro canal o ruta que permita a un líquido atravesar un material
poroso, fibroso o absorbente. Se selecciona el material en
comunicación capilar con la membrana de reacción de la unidad de
ensayo sobre la base de tener propiedades intrínsecas que permiten
inducir el flujo de un fluido, vertical o transversalmente, sin el
uso de medios externos.
Reactivo de captura - cualquier compuesto
o composición capaz de reconocer una estructura concreta espacial
y/o química de un analito. En el caso de un analito, que es una
especie de inmunoglobulina específica, el reactivo de captura puede
ser la proteína o epitopo específico reconocido por la
inmunoglobulina. Otros tipos de reactivos de captura incluyen
receptores que se producen de manera natural, anticuerpos,
antígenos, enzimas, fragmentos Fab, lectinas, ácidos nucleicos,
avidina, proteína A y similares.
Muestra de fluido de ensayo - se evalúa
la muestra de fluido de ensayo para formar un producto de reacción
detectable sobre la membrana de reacción de la unidad de ensayo. En
formas de realización de ensayos preferidos, la muestra de fluido
de ensayo se deriva biológicamente (por ejemplo, sangre total,
plasma, suero, orina, saliva, etc) y es sospechosa de incluir como
analito diana, normalmente un antígeno, anticuerpo, o hapteno capaz
de enlazarse con el reactivo de captura inmovilizado en la membrana
de reacción.
Reactivo indicador - un conjugado
comprendido por un miembro de enlace específico con el analito diana
y un conjugado de marca con el miembro de enlace específico que sea
capaz de detectarse visualmente. De manera adicional, el reactivo
indicador puede estar comprendido por una proteína marcadora
general, por ejemplo, la Proteína A, Proteína G, o un
anti-IgG conjugad con una marca. Por ejemplo, en un
ensayo para detectar el anticuerpo como un analito diana, un
indicador preferido podría ser la proteína A marcada con oro
coloidal. Otros reactivos indicadores pueden incluir también un
anticuerpo antihumano marcado dirigido al anticuerpo de interés,
por ejemplo IgG cabra antihumano marcado con oro coloidal para la
detección del anticuerpo humano en una muestra de fluido de
ensayo.
Marca - una marca puede ser cualquier
molécula enlazada o conjugada con un miembro de enlace específico o
proteína marcadora general que pueda producir una señal. En la
invención sujeto, la marca es de manera preferible una marca
"directa" que es capaz de producir de manera espontánea una
señal detectable sin la adición de reactivos adicionales y se
detectará fácilmente por medios visuales sin la ayuda de
instrumentos. La forma de realización preferida de la invención usa
partículas de oro coloidal como marca. Otras marcas adecuadas pueden
incluir otros tipos de partículas metálicas coloidales, partículas
coloreadas diminutas, tales como soles de colorante, y partículas
de látex coloreado. Muchas de dichas sustancias serán bien conocidas
por aquellas personas expertas en la técnica.
Zona de marca - Se pretende que el
término "zona de marca" incluya un material poroso que se
impregna con un reactivo indicador seco que se puede resolubilizar
fácilmente tras la adición de un reactivo tampón a lo anterior.
Zona de reacción - se pretende que el
término "zona de reacción" incluya un material poroso al cual
se enlazan el reactivo de captura y el resto de las moléculas
empleadas en el ensayo analítico así como el material de soporte
poroso adicional, si acaso, que conforme la superficie inferior de
la zona de reacción.
Miembro de enlace específico - este
describe dos o más miembros complementarios de una interacción de
enlace específica que tienen afinidad de enlace entre sí. Los
miembros de enlace específico pueden derivarse de manera natural o
producirse sintéticamente. Un miembro de la interacción de enlace
específico tiene una zona sobre su superficie, o una cavidad, que
enlaza de manera específica a, y es por tanto complementaria de, una
estructura concreta espacial y/o química del otro miembro
complementario. Los ejemplos de tipos de pares de enlace específico
son antígeno-anticuerpo,
biotina-avidina/estreptavidina,
hormona-receptor de hormona,
receptor-ligando, enzima-sustrato, y
similares.
La presente invención proporciona un dispositivo
de diagnóstico rápido mejorado, un ensayo y un tampón
multifuncional para la detección de un analito diana en una muestra
de fluido de ensayo, por ejemplo un fluido corporal. El dispositivo
de diagnóstico rápido no solo es fácil de usar y económico de
fabricar, sino que es lo suficientemente fiable para ser utilizado
en análisis analíticos sensibles sin necesitar largos periodos de
incubación, etapas de lavado extra, o dilución de la muestra. Puesto
que el ensayo puede variar de acuerdo con el analito diana en
cuestión, la presente invención es útil para un amplio rango de
ensayos biológicos. Por ejemplo, una muestra de fluido de ensayo
(por ejemplo suero, plasma, sangre total, saliva, orina, etc.) se
pueden analizar rápidamente y con precisión en busca de antígenos,
anticuerpos, esteroides naturales o sintéticos, hormonas, y
similares.
El dispositivo de diagnóstico rápido útil en la
práctica de la invención es un sistema de dos componentes en flujo
en pistón que comprende una unidad de ensayo y una unidad de
post-filtro capaz de albergar la muestra de fluido
de ensayo y el tampón multifuncional respectivamente. La unidad de
ensayo comprende una zona de reacción que contiene el agente de
captura inmovilizado que reconoce y se enlaza de manera específica
con el analito diana y una zona absorbente que soporta una zona de
reacción que contiene el reactivo de captura inmovilizado que puede
reconocer y enlazarse de manera específica con el analito diana y
una zona absorbente que soporta la zona de reacción. La zona de
reacción de la unidad de ensayo se orienta de forma que la zona
marcada de la unidad de post-filtro se puede poner
en comunicación fluida transitoria con el mismo poco después de que
la muestra de fluido de ensayo se haya aplicado a la zona de
reacción de la unidad de ensayo. Para facilitar la detección de un
analito diana en una muestra de sangre total, una forma de
realización alternativa de la presente invención proporciona una
unidad de ensayo que comprende de manera adicional una zona de
separación de sangre en comunicación fluida transversal con la zona
de reacción, por medio del cual un primer extremo de la zona de
separación de sangre localizada a una corta distancia transversal de
la zona de reacción define una región para recibir la muestra de
sangre total. Un segundo extremo de la zona de separación de sangre
se puede solapar ligeramente con la zona de reacción de forma que se
asegure una comunicación fluida directa con la misma. La unidad de
post-filtro comprende una zona marcada que contiene
un reactivo indicador seco y es capaz de colocarse en comunicación
fluida transitoria con la zona de reacción de la unidad de ensayo
durante el procedimiento de ensayo.
El protocolo de ensayo es un procedimiento
simple en 2 etapas que implica (1) depositar una muestra de fluido
de ensayo sobre la zona de reacción de la unidad de ensayo, o si se
trata de una muestra de sangre total, sobre un primer extremo de la
zona de separación de sangre y poco tiempo después, poner la unidad
de ensayo y la unidad de post-filtro en asociación
operativa de forma que la zona marcada de la unidad de
post-filtro esté en comunicación fluida transitoria
con la zona de reacción de la unidad de ensayo, y (2) añadir el
tampón multifuncional a la unidad de post-filtro y
retirar la unidad de post-filtro para observar el
resultado del ensayo. El tampón multifuncional se difunde
pasivamente a través de la zona marcada de la unidad de
post-filtro para volver a solubilizar el reactivo
indicador, y transportarlo hasta la zona de reacción de la unidad de
ensayo donde se ligará con el correspondiente analito complejado
con el reactivo de captura. Si hay analito presente en la muestra
de fluido de ensayo, aparecerá una señal detectable en la zona de
reacción que se puede visualizar con facilidad tras retirar la
unidad de post-filtro de la unidad de ensayo. Una
ventaja proporcionada por la metodología de la presente invención
es la sensibilidad mejorada y la fiabilidad del ensayo. Esto se
consigue maximizando la oportunidad de captura completa del analito,
incluso en concentraciones bajas. Adicionalmente, la implantación
de etapas de ensayo que incrementan la posibilidad de contaminación
de la muestra y de los reactivos se elimina completamente mediante
el ensayo de la presente invención.
El equipo de ensayo de la presente invención se
usa para detectar de forma cuantitativa y
semi-cuantitativa la presencia de un analito diana
en a una muestra de fluido de ensayo. Los analitos adecuados para
detección en el equipo de ensayo son esencialmente miembros de una
interacción de enlace específica de forma que uno de los miembros
es capaz de reconoces y enlazar, normalmente de forma no covalente,
con un miembro complementario, no idéntico, de manera que formen un
complejo estable que pueda detectarse con facilidad, tanto directa
como indirectamente. Los miembros de la interacción de enlace
específica pueden denominarse como analito diana y reactivo de
captura y pueden incluir una amplia variedad de sustancias
biológicamente derivadas que pueden participar en una reacción
inmunológica, por ejemplo antígeno-anticuerpo, o una
reacción no inmunológica, avidina y biotina, receptor de la
superficie celular y agente efector, ADN y ARN, y así sucesivamente.
Para una descripción de los miembros de enlace específico, ver la
Patente de los Estados Unidos Nº 3.996.345 (Ullman, y col.).
Tal como se aplica a los ensayos de enlace, el
equipo de ensayo de la presente invención se puede diseñar para
detectar cualquier número de analitos diana, siempre que haya un
compañero de enlace específico. El analito normalmente es un
péptido, proteína, hidrato de carbono, glicoproteína, esteroide, u
otra molécula orgánica o inorgánica para la que exista un compañero
de enlace específico en un sistema biológico, o bien se pueda
sintetizar. El ensayo de enlace implica esencialmente el enlace
específico del analito (es decir, el primer miembro del enlace
específico) con un reactivo de captura (es decir, el segundo miembro
del enlace específico) inmovilizado en un material de fase sólida
y, adicionalmente, un reactivo indicador (que comprende una marca
enlazada con un segundo miembro de enlace específico auxiliar o una
proteína marcadora general). La inmovilización del reactivo de
captura con el material de la fase sólida forma un "punto de
captura" y de esta manera, facilita la separación o eliminación
del analito diana del resto de los componentes de la muestra. La
marca, que permite que el reactivo indicador produzca una señal
detectable que tenga por significado la presencia de analito en la
muestra de fluido de ensayo, se consigue mediante enlace directo o
indirecto del miembro de enlace del reactivo indicador. Por lo
general, el segundo miembro de enlace específico auxiliar se enlaza
con el analito diana en un punto en el que no interfiera con la
interacción de enlace específico entre el analito diana y el
reactivo de captura. De ejemplo, pero no exclusiva de la presente
invención, es la interacción de enlace específico que se produce
como resultado de las interacciones
anticuerpo-antígeno.
Aquellas personas expertas en la técnica
apreciará que aunque el equipo de ensayo diagnóstico rápido
descrito en el presente documento se anticipa a ser empleado
principalmente en el ensayo tanto de antígenos cómo de anticuerpos
a través de la formación de un inmunocomplejo, se considera que su
aplicabilidad es más amplia, y no se restringe a dichas moléculas.
Como mínimo, el equipo meramente requiere un primer miembro que
pueda reconocer y enlazarse con un segundo miembro de una reacción
de enlace específico. El primer miembro se puede denominar analito
diana de manera conveniente y el segundo miembro como reactivo de
captura. Aunque antígeno y anticuerpo son formas de realización
preferidas de analito diana y reactivo de captura, actuando en
papeles respectivos o alternativos, el dispositivo se puede usar con
una amplia variedad de reactivo de captura y moléculas de analito.
Por ejemplo, las moléculas de receptor de hormonas son un tipo de
molécula de reactivo de captura y se pueden unir a la zona de
reacción de la unidad de ensayo y usarse para ensayar la
correspondiente hormona analito. De manera alternativa, una hormona
se podría enlazar a la zona de reacción y usarse para ensayar los
receptores hormonales (Hermanson, G. T. (1996) Bioconjugate
Techniques, Academic Press).
El sistema se puede adaptar también a la
detección de secuencias de ADN. Por ejemplo, una muestra de fluido
de ensayo que supuestamente contiene una secuencia de ADN como
analito diana se deposita en la zona de reacción y se enlaza con
una secuencia de ADN complementaria conocida como reactivo de
captura en la zona de reacción. A continuación, una sonda de ADN
marcada se transporta mediante el tampón multifuncional hasta la
zona de reacción. Si se producir la hibridación, la sonda de ADN
marcada se retendrá en forma visualmente detectable en la
superficie de la zona de reacción. Este sistema está descrito en
Polsky-Cynkin, R., y col., Clin. Chem. 31/9, 1438
(1985).
De esta manera, será rápidamente evidente para
aquellas personas expertas en la técnica que existen muchas de
dichas combinaciones de parejas reactivo de
captura-analito diana que se pueden emplear de forma
adecuada en el presente equipo y procedimiento de diagnóstico.
Una forma de realización preferida de la
presente invención emplea un formato de ensayo de enlace directo
(sándwich). Lo formato está basado en el principio de una
interacción de enlace específico que se producirá entre un analito
diana que comprende el primer miembro de enlace específico, un
reactivo de captura que comprende a segundo miembro de enlace
específico que se inmoviliza en un material de la fase sólida, y un
reactivo indicador seco que comprende un segundo miembro de enlace
específico auxiliar, o un marcador proteínico general. Los miembros
anteriormente mencionados forman un complejo de tres miembros cuando
el contenido de una muestra de fluido de ensayo que contiene el
analito diana se hace reaccionar con el reactivo de captura
inmovilizado, seguido por la adición del reactivo indicador. En
general, el ensayo diagnóstico de esta manera depende de la
capacidad de un segundo miembro de enlace específico de reconocer y
enlazarse de forma específica con el primer miembro de enlace
específico. Dependiendo del tipo de analito diana a detectar, se
emplea un reactivo indicador que comprende un segundo miembro de
enlace específico auxiliar marcado con una fracción visualmente
detectable para determinar la existencia de dicho enlace. La
cantidad de reactivo indicador detectado y medido tras la reacción
se puede correlacionar con la cantidad de analito presente en la
muestra de ensayo. Por ejemplo, en el formato de inmunoensayo en
sándwich, una muestra de ensayo que contiene un antígeno, es decir
el analito diana, se pone en contacto con un anticuerpo primario
inmovilizado en un material de la fase sólida, es decir el reactivo
de captura. El material de la fase sólida se trata a su vez con el
reactivo indicador, formalmente un anticuerpo secundario que se ha
marcado con una fracción visualmente detectable. A continuación, el
anticuerpo secundario queda unido al antígeno correspondiente
inmovilizado por el anticuerpo primario inmovilizado con el
material de la fase sólida y cualquier cambio de color se detecta
visualmente a continuación, lo que es indicativo del antígeno
presente en la muestra de ensayo.
De esta manera, en su forma de realización más
sencilla, la Figura 1A proporciona un diagrama esquemático del
equipo de ensayo (1) de la presente invención que comprende dos
componentes separados, una unidad de ensayo (2) y una unidad de
post-filtro (3). La unidad de ensayo (2) está
compuesta por una zona de reacción (5) que tiene su superficie
inferior soportada por una zona absorbente(4). La zona de
reacción (5) recibe la muestra de fluido de ensayo (9) directamente
y proporciona una visualización clara del resultado del ensayo
debido a la presencia del reactivo de captura inmovilizado (6)
contenido en el anterior que es capaz de reconocer y enlazarse con
el analito diana de interés mediante una interacción de enlace
específico. En una forma de realización preferida, la zona de
reacción (5) está compuesta por una membrana porosa compatible para
la inmovilización del reactivo de captura (6) y tiene una bajo
enlace no específico con el reactivo indicador (8). La zona
absorbente(4) está fabricada preferiblemente con material
permeable que posee propiedades intrínsecas que le permiten absorber
fluido por capilaridad, mantener adecuadamente el reactivo y los
fluidos de muestra, y adicionalmente proporciona soporte para la
zona de reacción (5). La unidad de post-filtro (3)
comprende una zona marcada (7) permeada con un reactivo indicador
(8) seco. El reactivo indicador (8) seco comprende una marca y un
miembro de enlace específico que también reconocerá y se enlazará
con el analito de interés, pero en un lugar que no interfiera con la
interacción de enlace específico entre el analito diana y el
reactivo de captura. La zona marcada (7) preferiblemente comprende
un medio de filtración seleccionado sobre la base de tener un tamaño
de poro lo suficientemente grande para que cuando el reactivo
indicador (8) seco se vuelva a solubilizar por la adición del tampón
multifuncional (12), este fluirá fácilmente a través de un área
expuesta de la zona marcada (7) mediante un proceso de difusión. La
forma y dimensiones de la unidad de post-filtro (3)
son tales que contendrá y canalizará de forma efectiva el tampón
multifuncional a través de la zona marcada (7) cuando se ponga en
comunicación fluida transitoria con la zona de reacción (5) de la
unidad de ensayo (2) durante la etapa final del procedimiento de
ensayo.
La Figura 1B proporciona un diagrama esquemático
del equipo de ensayo (1) de una segunda forma de realización de la
presente invención que comprende dos componentes separados, una
unidad de ensayo (2) y una unidad de post-filtro
(3), en el que la unidad de ensayo (2) adicionalmente comprende una
zona de separación de sangre (100) capaz de albergar y separar la
porción de fluido de un muestra de sangre total (9') de los glóbulos
rojos (RBC), a la vez que transporta una porción de fluido sin RBC,
incluyendo cualquier analito, hasta la zona de reacción (5) para
análisis directo. El material preferido para la zona de separación
de sangre (100) se selecciona sobre la base de tener propiedades
intrínsecas que le permitan atrapar o retener de manera preferente
los glóbulos rojos de la muestra (9') mientras que la porción de
fluido migra en dirección transversal hacia la zona de reacción
(5).
La Figura 2 es un diagrama esquemático que
muestra el procedimiento de la invención que usa el equipo de la
Figura 1A. En este caso particular, la Figura 2A muestra una muestra
de fluido de ensayo (9) que contiene el analito diana (10), así
como otros componentes no esenciales (11), que se aplica a la zona
de reacción (5) de la unidad de ensayo (2). A medida que la muestra
de fluido de ensayo (9) se difunde a través de la zona de reacción
(5) y hacia el interior el zona absorbente (4) por debajo de esta,
el analito libre (10) entra en contacto con los puntos disponibles
de enlace en el reactivo de captura (6) y forma un complejo, a la
vez que los componentes no esenciales (11) no enlazados continúan
circulando por el interior de la zona absorbente (4) inferior
(Figura 2B). Tal como se muestra en la Figura 2C, la zona marcada
(7) de la unidad de post-filtro (3) se pone
posteriormente en comunicación fluida con la zona de reacción (5)
de la unidad de ensayo (2) antes de la adición del tampón
multifuncional (12). Inmediatamente tras la resolubilización del
reactivo indicador (8) seco mediante el tampón (12), el reactivo
indicador (8) se transporta hasta la zona de reacción (5) de la
unidad de ensayo (2), donde se enlazará con cualquier analito (10)
que se haya complejado con el reactivo de captura (6). La reacción
de enlace del reactivo indicador (8) con el analito (10) produce
una señal visualmente detectable por la que se indica un resultado
positivo que se observa fácilmente tras retirar la unidad de
post-filtro (3), tal como se muestra en la Figura
2D.
La Figura 3A es un diagrama esquemático que
muestra el procedimiento de la invención usando el dispositivo de
la Figura 1A cuando una muestra de fluido de ensayo (9) que carece
de analito diana se aplica a la zona de reacción (5) de la unidad
de ensayo (2). A medida que la muestra de fluido de ensayo (9) se
difunde a través de la zona de reacción (5) y hacia el interior de
la zona absorbente (4) inferior, los componentes no esenciales (11)
superan completamente el reactivo de captura (6), dejando
desocupados los puntos de enlace (Figura 3B). Tal como se muestra
en la Figura 3C, la zona marcada (7) de la unidad de
post-filtro (3) se pone a continuación en
comunicación fluida con la zona de reacción (5) de la unidad de
ensayo (2) antes de la adición del tampón multifuncional (12).
Inmediatamente tras la resolubilización del reactivo indicador (8)
seco mediante el tampón (12), el reactivo indicador (8) se
transporta hasta la unidad de ensayo (2), en la que se difunde a
través de la zona de reacción (5), pasa el reactivo de captura (6)
y hacia el interior de la zona absorbente (4) por debajo debido a la
ausencia de cualquier analito diana complejado con el reactivo de
captura (6). Tras la retirada de la unidad de
post-filtro (3), no se detectará una señal
coloreada en el anterior lo que indica un resultado negativo debido
a la ausencia de enlace entre el reactivo indicador (8) y el analito
complejado.
Para facilitar la detección de un analito diana
en una muestra de sangre total, una forma de realización
alternativa de la presente invención proporciona una unidad de
ensayo que tiene una zona de separación de sangre capaz de albergar
y separar la porción de fluido de un muestra de sangre total de los
glóbulos rojos (RBC), a la vez que transporta la porción de fluido
libre de RBC, incluyendo cualquier analito, hasta la zona de
reacción para análisis directo. Tal como se muestra en la Figura 6,
la zona de separación de sangre (100) es preferiblemente una tira
alargada de material poroso que se selecciona sobre la base de tener
propiedades intrínsecas que la habilitan para atrapar o retener de
manera preferible los glóbulos rojos de la muestra (9') a medida
que la porción de fluido migra en dirección transversal hacia la
zona de reacción (5). Aunque la forma y dimensiones no son
críticas, preferiblemente la zona de separación de sangre (100) es
forma rectangular que tiene dimensiones adecuadas para permitir una
eliminación eficiente de una cantidad sustancial de glóbulos rojos
de la muestra de sangre total (9') anterior prior con la porción de
fluido libre de RBC de la muestra (9') llegando hasta la zona de
reacción (5). De esta manera, en efecto, el material para la
separación de la sangre actúa como un material de flujo transversal
para la eliminación selectiva de una cantidad eficaz de leucocitos
de la muestra de sangre total (9') suficiente para evitar
interferencias con la detección visual del analito, a la vez que
permite que el resto de componentes de la muestra incluyendo
cualquier analito, fluyan con movimiento relativamente
desequilibrado hasta la zona de reacción (5). Preferiblemente, se
fija un vehículo hidrófobo (103) a la superficie inferior de la
zona de separación de sangre (100) para proporcionar soporte y
reducir la filtración de la fase fluida mientras que la porción de
fluido libre de RBC de la muestra de sangre total migra hacia la
zona de reacción (5). El vehículo (103) es preferiblemente similar
en forma y tamaño a la zona de separación de
sangre (100).
sangre (100).
Un primer extremo (101) de la zona de separación
de sangre (100), localizada a una corta distancia transversal de la
zona de reacción (5), define una región para recibir la muestra de
sangre total (9') antes de la introducción del analito en la zona
de reacción (5). Un segundo extremo (102) de la zona de separación
de sangre (100) es contigua a, y se puede solapar ligeramente con
la zona de reacción (5), de forma que está en comunicación fluida
directa con la zona de reacción (5), estimulando de esta manera el
movimiento de la porción de fluido libre de RBC de la muestra de
sangre (9') desde el primer extremo de la zona de separación de
sangre (100) hasta la zona de reacción (5). La zona de separación
de sangre (100) y la zona de reacción (5) deben estar en contacto
entre sí con el fin de asegurar una transferencia óptima de la
muestra de una zona a la otra. Por tanto, es preferible que la zona
de separación de sangre (100) y la zona de reacción (5) solapen
ligeramente entre sí, y no colindantes entre sí
De esta manera, en protocolo de ensayo en dos
etapas emplea opcionalmente una separación simultánea de glóbulos
rojos de una muestra de sangre total (9') con el fin de permitir el
ensayo de un analito deseado sin la necesidad de etapas
adicionales. Por ejemplo, en el caso en el que una muestra de sangre
total (9') contenga analito, la muestra (9') se aplica simplemente
en el primer extremo de la zona de separación de sangre (100) de la
unidad de ensayo, en lugar de en la zona de reacción (5). A medida
que la porción de fluido libre de RBC de la muestra de sangre (9')
migra en dirección transversal para llegar a la zona de reacción
(5), el analito libre eventualmente se pone en contacto con los
puntos disponibles de enlace del reactivo de captura y forma un
complejo. De esta manera, similar a las etapas de procedimiento
mostradas en la Figura 2, los componentes no esenciales no
enlazados se arrastran hacia el interior de la zona absorbente
localizada bajo la zona de reacción. La zona marcada de la unidad
de post-filtro se pone a continuación en
comunicación fluida con la zona de reacción de la unidad de ensayo
antes de la adición del tampón multifuncional. Inmediatamente tras
la resolubiliza del reactivo indicador seco mediante el tampón, el
reactivo indicador se transporta hasta la zona de reacción de la
unidad de ensayo, donde se enlazará con cualquier analito diana que
se haya complejado con el reactivo de captura. La reacción de
enlace del reactivo indicador con el analito diana produce una
señal visualmente detectable en el anterior indicando un resultado
positivo que se observa fácilmente tras la retirada de la unidad de
post-filtro.
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Las personas expertas en la técnica pueden
deducir la aplicación de la presente invención en ensayos tanto
competitivos como no competitivos (por ejemplo, sándwich), de un
analito diana de interés adecuado. En la formato competitivo, hay
un primer miembro de enlace específico auxiliar del reactivo
indicador (en oposición a un segundo miembro de enlace específico
auxiliar en el caso de la técnica "sándwich") que es capaz de
enlazarse con el segundo miembro de enlace específico, es decir el
reactivo de captura. En otras palabras, el primer miembro de enlace
específico auxiliar del reactivo indicador compite con el analito
diana, es decir el primer miembro de enlace específico, para
enlazarse con los puntos de enlace del reactivo de captura. El
primer miembro de enlace específico auxiliar comprenderá, por
ejemplo, un análogo u otra muestra auténtica del analito diana que
tenga una afinidad de enlace comparable con la del primer miembro de
enlace. Cuando la muestra de fluido de ensayo se deposita en la
zona de reacción, cualquier analito diana, si está presente, se
enlazará con los puntos disponibles de enlace del reactivo de
captura, es decir el segundo miembro de enlace, y de esta manera
bloqueará potencialmente el enlace del primer miembro de enlace
auxiliar del reactivo indicador con el reactivo de captura tras su
adición. Si la muestra de fluido de ensayo contiene el analito
diana, la ausencia de una señal coloreada indicará un ensayo
positivo debido a la incapacidad del reactivo indicador para
enlazarse con el reactivo de captura. De forma alternativa, si la
muestra de ensayo no contiene nada de analito diana, la presencia
de una señal coloreada indicará un ensayo negativo debido a la
capacidad del reactivo indicador para enlazarse con los puntos
desocupados de enlace del reactivo de captura.
Tal como se ha descrito más arriba, el
dispositivo de diagnóstico de la presente invención comprende, como
primer componente, una unidad de ensayo que tiene una zona de
reacción que contiene el reactivo de captura inmovilizado que puede
reconocer y enlazarse de forma específica con el analito diana, una
zona absorbente que soporta la zona de reacción, y opcionalmente,
una zona de separación de sangre en comunicación fluida transversal
con la zona de reacción. La zona de reacción de la unidad de ensayo
está orientada de forma que la zona marcada de la unidad de
post-filtro se puede poner en comunicación fluida
transitoria con el mismo poco después de que la muestra de fluido de
ensayo se aplica a la unidad de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
El término "zona de reacción" se pretende
que incluya el material poroso al que se enlazan el reactivo de
captura y otras moléculas empleadas en el ensayo analítico, así como
el material poroso de soporte, si existe, que conforma la superficie
inferior de la zona de reacción.
La selección del material de la zona de reacción
no es crítica para la invención. Los materiales usados para
fabricar el dispositivo de la presente invención son bien conocidos
en la técnica. Los materiales porosos, tales como los que se
describen en las patentes de los Estados Unidos N^{os} 4.670.381,
4.632.901, 4.666.863, 4.459.361, 4.517,288, y 4.552.839, pueden ser
de componente único, o en combinación de fibras de vidrio, acetatos
de celulosa, nylon, o diferentes materiales naturales o
sintéticos.
El material de la zona de reacción preferido es
una membrana que tiene un tamaño de poro que permite la separación
y filtración de otros componentes no esenciales de la muestra de
fluido de ensayo que se está sometiendo a ensayo. El flujo de los
reactivos acuoso se controla por difusión, y la membrana debería
tener un enlace bajo no específico para el reactivo indicador antes
o después del tratamiento con reactivos, tales como proteínas,
detergentes, o sales. Hay muchas membranas, películas y papeles
porosos comercialmente disponibles con hidrofobia controlada y son
adecuados para la práctica de la invención. La membrana de reacción
puede tener cualquier forma y espesor, pero normalmente es plana y
delgada. Se puede facilitar la absorción, difusión o filtración de
la fase líquida de los reactantes procedentes de las partículas de
la fase sólida en la etapa de separación del ensayo mediante la
adición de un material fibroso o hidrófilo (almohadilla absorbente)
en contacto con la parte inferior de la membrana de reacción. El
tamaño del área expuesta a las partículas de la fase sólida se
puede controlar usando un material hidrófobo tal como plástico,
plástico laminado, u otras sustancias similares que se ponen en
contacto con la membrana de reacción y sella la zona de reacción de
forma que está expuesta a la fase sólida particulada únicamente un
área superficial no superior a 150 mm^{2}.
La porosidad de la membrana tiene una gran
influencia sobre el caudal de líquido y la sensibilidad del ensayo.
Cuanto mayor sea el tamaño de poro de la membrana, más rápido será
el caudal de un líquido dado. A medida que aumenta el caudal, el
tiempo de interacción disponible entre la molécula diana en la
muestra y el receptor inmovilizado sobre la membrana de reacción
disminuye, de la misma forma disminuye la sensibilidad del ensayo.
Adicionalmente, tamaños de poro más grandes proporcionan menos área
para inmovilizar la molécula del receptor, que es otro parámetro
que se puede atribuir a una menor sensibilidad del ensayo. Para la
mayor parte de los ensayos, la porosidad de la membrana está
comprendida preferiblemente entre aproximadamente 0,1 a
aproximadamente 12,0 micrómetros, y más preferiblemente comprendida
entre aproximadamente 0,2 y 0,8 micrómetros.
El potencial de absorción de la membrana puede
afectar también a la sensibilidad del ensayo y depende del espesor
y naturaleza del material de la membrana. El potencial de absorción
se puede medir como la migración de una solución patrón a través de
una cierta distancia por unidad de tiempo. A menudo, la selección de
una membrana que tenga un potencial de absorción relativamente bajo
puede aumentar la sensibilidad del ensayo. De esta manera, además
de la porosidad, el espesor global de la membrana de reacción puede
afectar a la sensibilidad del ensayo y por tanto, debe también
tenerse en cuenta.
El espesor de la membrana de reacción, que es la
distancia entre las superficies inferior y superior de la membrana
de reacción, puede variar dependiendo de las características de
flujo necesarias para un ensayo diagnóstico dado. Típicamente, el
espesor estará comprendido entre aproximadamente 0,05 mm y
aproximadamente 3,0 mm, y más habitualmente entre aproximadamente
0,1 y aproximadamente 1,0 mm. Con algunos inmunoensayos en
particular, se ha encontrado que, cuando el espesor de la membrana
de reacción es mayor de aproximadamente 0,1 mm, y preferiblemente
en el intervalo de aproximadamente 0,2 mm a aproximadamente 1,0 mm,
se puede conseguir mayor sensibilidad. Más aún, se cree que los
dispositivos de la técnica anterior que tienen membranas de reacción
relativamente finas, tales como membranas de nitrocelulosa de menos
de 0,1 mm de espesor y que no tienen papel por detrás, tienden a
dejar que la muestra por los laterales a través de membrana de
reacción en lugar de en sentido descendente a través de la parte
central de la membrana de reacción. Por otra parte, una membrana de
reacción más gruesa permitirá que más cantidad de reactivo de
captura esté disponible para enlace con el analito diana,
proporcionando así un aumento mayor en la sensibilidad del ensayo.
De esta manera, el espesor de la membrana debería seleccionarse de
forma que una adecuada de ligante de enlace se pueda inmovilizar
para capturar el componente de la muestra. Sin embargo, si el
espesor de la membrana es demasiado grande, puede ocasionar el
retardo indebido del paso de la muestra de fluido de ensayo a través
de la membrana.
Otro factor a considerar es que el material de
la membrana de reacción se selecciona basándose en que sea
compatible para la inmovilización del reactivo de captura. La
membrana de reacción puede ser de cualquier material poroso
adecuado capaz de inmovilizar el reactivo de captura empleado en el
ensayo diagnóstico siempre que esto no afecte al rendimiento del
ensayo. Entre los materiales adecuados se incluye nitrocelulosa
(soportada o no soportada), fibra de vidrio, poliéster, nitrato de
celulosa, policarbono, nylon, y otros materiales naturales y
sintéticos que se puedan acoplar directa o indirectamente al
reactivo de captura seleccionado. Normalmente, la membrana
comprenderá cargas negativas que permitan en enlace de las moléculas
del reactivo de captura. Algunos materiales de membrana que están
cargados incluyen el nitrato de celulosa que tiene cargar negativas
parciales procedentes de los grupos nitro.
En algunos casos están disponibles filtros
comerciales que tienen inmovilizados en sus superficies interna y/o
externa un reactivo para en enlace de moléculas biológicas, tales
como anticuerpos o antígenos, con dichas superficies. Entre los
ejemplos de varios filtros se incluyen filtros de celulosa (papeles
filtro o, membranas de poliamida (por ejemplo, Pall Corporation
fabrica muchas variaciones de membranas de poliamida) y otras
diferentes membranas microporosas, tales como las que comercializan
Amicon, Geleman, y Schleicher & Schuell. Por ejemplo, se
dispone de las siguientes membranas comercializadas por Pall
Corporation: Biodyne©, una membrana microporosa de poliamida N66
(Patente de los Estados Unidos Nº 4.340.479 asignada a Pall);
Carboxydyne©, una membrana microporosa hidrófila sin piel de nylon
66 con propiedades de control superficial caracterizada por grupos
funcionales de carboxilo en sus superficies; e Immunodyne^{TM},
una membrana Carboxydyne© modificada preparada tratando una
membrana Carboxydyne© con
tricloro-s-triazina. Otras membranas
microporosas, preparadas por la Millipore Corporation, se describen
en las Patentes de los Estados Unidos N^{ros} 4.066.512 y
4.246.339.
Otros materiales pueden pretratarse para
conseguir una membrana cargada. Por ejemplo, el poliéster se puede
derivatizar con grupos carboxilo o amino para dar una membrana
cargada tanto positiva como negativamente. El nylon se puede tratar
con ácido para romper enlaces peptídicos para conseguir cargas
positivas (a partir de los grupos amino) y cargas positivas a partir
de los grupos carboxilo).
Un material preferido para uso como membrana de
reacción es una membrana de nitrocelulosa respaldada con un papel
poroso tipo papel de filtro, u otros tipos de membranas de
nitrocelulosa con similares características. Un ejemplo
representativo se comercializa con el nombre comercial
BAC-T-KOTE por Schleicher y Schuell.
Este material es sustancialmente más duradero que la nitrocelulosa
sola, y se puede emplear sin ningún otro componente soporte, lo que
permite una manipulación y ensamblado del dispositivo más fáciles.
Adicionalmente, se ha encontrado que los dispositivos analíticos
que emplean nitrocelulosa respaldada con papel en la zona de
reacción tienen sensibilidad mejorada en algunos inmunoensayos.
Otros materiales comercialmente disponibles
proceden de EY Laboratories Inc. (San Mateo, Calif.; Cat. N^{ros}
PBNC15-1, PBNC15-10,
PBNC15M-1, y PBNC15M-10).
\vskip1.000000\baselineskip
En un sistema típico, el reactivo de captura se
inmoviliza sobre la membrana porosa de la zona de reacción en la
que reconocerá y se enlazará de forma específica a cualquier analito
diana presente en la muestra de fluido de ensayo que se somete a
ensayo. Dicho reactivo, típicamente una proteína inmunológica tal
como un anticuerpo o antígeno, se puede inmovilizar directa o
indirectamente sobre dichos materiales, tal como nitrocelulosa,
mediante cualquiera de absorción, adsorción o enlace covalente.
Cuando una muestra de fluido de ensayo sospechosa de contener el
analito diana de la interacción de enlace específico se aplica a la
zona de reacción que contiene el reactivo de captura inmovilizado,
queda enlazado de manera no difusiva a la zona de reacción. De esta
manera, aplicando de manera adecuada una muestra de fluido de ensayo
sospechosa de contener el analito diana de interés, se puede
obtener una elevada concentración del analito diana en una zona
bien definida en el centro de la zona de reacción. En los casos
apropiados, el reactivo de captura puede recubrir la superficie
superior de la zona de reacción o ser un material particulado
atrapado en el interior de la matriz del material poroso de la zona
de reacción. Por tanto, tal como se usa en el presente documento,
el término "inmovilizado" se pretende que abarque cualquiera de
los medios para fijar el reactivo de captura al material poroso.
Una primera etapa del presente procedimiento es
inmovilizar el reactivo de captura en el interior de una zona
finita de la zona de reacción. La inmovilización se puede realizar
mediante procedimientos tales como adsorción, absorción, deposición
evaporativa a partir de una solución de disolvente volátil, enlace
covalente entre el reactivo de captura y la membrana de reacción, o
inmovilización inmunológica. El enlace covalente puede, por
ejemplo, implicar el enlace entre el reactivo de captura y la zona
de reacción a través de un agente de acoplamiento, tal como un
haluro de cianógeno, por ejemplo bromuro de cianógeno o mediante el
uso de glutaraldehido, tal como describen Grubb, y col. en la
Patente de los Estados Unidos Nº 4.186.146. La inmovilización
inmunológica con la membrana de reacción puede ser mediante
absorción o, por unión covalente, directamente, o a través de un
enlazante de los tipos bien conocidos por las personas expertas en
la técnica. Los procedimientos adecuados para llevar a cabo estos
procedimientos se recogen en por ejemplo, Iman y Hornby en
Biochemical Journal (Volumen 129; Página 255; Campbell, Hornby, y
Morris en Biochem. Biophys. Acta (1975), Volumen 384; Página 307; y
Mattisson y Nilsson en F.E.B.S. letters, (1977) Volumen 104, Página
78. Ver también, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos
N^{ros} 4.376.110 y 4.452.901. Además, se pueden conseguir
comercialmente materiales químicamente pretratados adecuados para el
acoplamiento de anticuerpos.
La inmovilización inmunológica se prefiere para
la práctica Por ejemplo, si se emplea un inmunoensayo sándwich en
el presente dispositivo usando un anticuerpo como reactivo de
captura, entonces la membrana de reacción se impregna con el
anticuerpo mediante absorción usando una técnica
dispensación/impresión (BioDot, Calif., Estados Unidos). Esta
implica aplicar uno o más anticuerpos distintos a la membrana
rociándolos directamente sobre la membrana de reacción. La técnica
anterior se consigue más rápidamente usando un dispositivo de
impresión comercial denominado a BIOJET QUANTI 3000, y proporciona
una corriente de la proteína inmunológica bajo diferentes
condiciones, y con diferentes anchuras de corriente. Usando esta
técnica, es posible depositar rápidamente una serie de líneas, u
otros modelos discretos, sobre la membrana de reacción, cada uno
contiene un anticuerpo con diferentes especificidades antigénicas
para enlazar con uno o más antígenos. De esta manera, el número de
antígenos que se puede ensayar es función de le número de los
diferentes anticuerpos que se pueden aplicar en diferentes
modelos.
modelos.
Dependiendo de los límites de detección que el
usuario desea imponer al ensayo diagnóstico, el reactivo de captura
se puede depositar en solitario o en varias combinaciones en la zona
de reacción en diferentes configuraciones para producir diferentes
formatos de detección o medida. Por ejemplo, se puede aplicar un
panel de dos o más miembros de enlace específico diferentes
seleccionados de forma que el reactivo de captura del ensayo
diagnóstico puede aplicarse a diferentes regiones de la misma
membrana de reacción de forma que se pueda analizar de forma
simultánea la presencia de diferentes analitos en una única muestra
de fluido de ensayo, por ejemplo para la detección de VIH y VCH.
Preferiblemente, el reactivo de captura se deposita en una zona de
ensayo discreta que tiene un área sustancialmente inferior a la del
área superficial total del material poroso usado en la zona de
reacción. Entre los varios modelos que son convenientes para la
distribución del reactivo de captura se pueden incluir, pero no
limitarse a, números, letras, puntos, líneas y símbolos, o
similares, que muestren la señal detectable a la finalización del
ensayo. Se prefiere que el modelo de la zona de ensayo discreta sea
una única línea para mejorar la visibilidad del resultado del
ensayo.
ensayo.
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Puesto que el presente equipo se diseña para ser
usado en un procedimiento para detectar un analito diana en una
muestra de fluido de ensayo, se debe conseguir un reactivo de
captura que reconozca y sea capaz de enlazarse de forma específica
con el analito diana. Una persona normalmente experta en la técnica
apreciará que el término "enlace específico" se refiere a la
interacción que se produce entre dos o más componentes no idénticos
complementarios para formar un complejo. Entre los ejemplos de
dichos pares de enlace se incluyen antígenos y anticuerpos,
hormonas (y otros mensajeros intracelulares) y receptores celulares,
azúcares y lectinas. Cada uno de los miembros del par de enlace
específico se puede inmovilizar en la zona de reacción con el otro
miembro, que será el analito a detectar en la muestra de ensayo. Son
de ejemplo, pero no exclusivas de la presente invención, la
interacción de enlace específico que se produce como resultado de
las interacciones anticuerpo-antígeno. Sin embargo,
se debe tener en cuenta que el uso de términos tales como antígeno y
anticuerpo no son mutuamente excluyentes, puesto que los anticuerpos
pueden actuar como antígenos de otros anticuerpos.
Debido a la facilidad relativa con la que se
pueden preparar en la actualidad anticuerpos específicos frente a
antígenos, las formas de realización preferidas de la invención
deben o pueden usar anticuerpos monoclonales enlazados a la
membrana de reacción para detectar la presencia de su antígeno
específico en una muestra de fluido de ensayo. Los anticuerpos
monoclonales pueden pertenecer a cualquiera de las clases o
subclases de anticuerpos, incluyendo IgA, IgD, IgE, IgG (subclases
1-4, si es humana; 1, 2a, 2b, 3, si es de murina), o
IgM. También se pueden emplear fragmentos activamente enlazantes de
los de anticuerpos, tales como Fab, Fv, F(ab')_{2}, o
similares. La preparación de los anticuerpos monoclonales es bien
conocida en la técnica, y se consigue fusionando células de bazo
procedentes de un huésped sensibilizado al antígeno con células de
mieloma de acuerdo con técnicas conocidas, o transformando las
células de bazo con un vector de transformación adecuado para
inmortalizar las células. Las células se pueden cultivar en un medio
de cultivo selectivo, clonarse y seleccionarse para seleccionar los
anticuerpos monoclonales que se enlacen con los antígenos
designados. Se pueden encontrar numerosas referencias acerca de la
preparación de anticuerpos monoclonales y policlonales (por ejemplo
Kohler y Milstein, (1975) Nature (Londres) 256,
495-497; Kennet, R., (1980) en Monoclonal Antibodies
(Kennet y col., Eds. pp. 365-367, Plenum Press,
N.Y.).
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Además del reactivo de captura, un área definida
de la zona de reacción expuesta puede contener también una molécula
de control. A este respecto, el revelado de color en el punto de
ensayo se puede comparar con el color de uno o más patrones de
control para determinar si los reactivos son estables y el ensayo se
ha realizado de manera adecuada. Por lo general, cuado se ensaya
buscando la presencia de un analito diana, el dispositivo de
diagnóstico tendrá como control interno un anticuerpo dirigido a la
inmunoglobulina G humana (IgG), IgM, IgE, o IgA. De esta manera
cuando una muestra de fluido de ensayo se añada al dispositivo de
diagnóstico, la inmunoglobulina se enlazará con la región de
control sin tener en cuenta si el analito diana está presente o
ausente en la muestra. Por ejemplo, se puede establecer un control
adecuado mediante el uso de la Proteína A, que se describe en la
Patente de los Estados Unidos Nº 5.541.059 (Chu). Otros controles
adecuados son bien conocidos en la técnica.
Tal como se ha apuntado más arriba, el reactivo
de captura, y el uso opcional de controles, se aplican normalmente
en regiones definidas de la superficie expuesta de la zona de
reacción. El reactivo de captura a menudo se aplicará a la región
en el interior del centro de la zona de reacción de forma que el
perímetro de la superficie expuesta de la zona de reacción no
tendrá nada de reactivo de captura enlazado en la anterior. Por
otra parte, en algunas situaciones, puede ser apropiado recubrir
toda la superficie expuesta de la zona de reacción con el reactivo
de captura. Si, sin embargo, el reactivo de captura se inmoviliza
sobre una región limitada de la superficie expuesta de la zona de
reacción, el material poroso o membrana de la que está hecha la
zona se puede tratar con una composición de bloqueo que evite que el
analito diana y el resto de componentes de la muestra se enlacen no
específicamente con la zona de reacción. En los ensayos en los que
el enlace no específico no sea un problema, la etapa de bloqueo
puede no ser necesaria. Igualmente, el unos de nitrocelulosa
respaldada con papel de buena calidad puede hacer que la etapa de
bloqueo no sea necesaria en algunos ensayos. Sin embargo, si se
necesita una etapa de bloqueo, se pueden usar soluciones de bloque
habituales que comprenden albúmina de suero bovino (BSA) u otras
proteínas que no interfieren con, o se entrecruzan con, los
materiales
de reactivo del ensayo. La BSA se usa habitualmente en cantidades comprendidas entre aproximadamente 1 y 10%.
de reactivo del ensayo. La BSA se usa habitualmente en cantidades comprendidas entre aproximadamente 1 y 10%.
El tratamiento de bloqueo se produce normalmente
una vez que el dispositivo analítico ya se ha ensamblado, y se ha
inmovilizado el reactivo de captura en la zona de reacción. Se
aplica una cantidad suficiente de composición de bloqueo que
recubrirá la superficie expuesta de la zona de reacción. Tras secado
de la composición de bloqueo, el dispositivo analítico ya está listo
para el uso.
La sensibilidad de los inmunoensayos tipo
reacción-membrana (es decir, la capacidad de
detectar niveles muy bajos de la sustancia diana) se puede
incrementar si la muestra se concentra a través de la zona de
reacción. Con algunos dispositivos, la concentración de la muestra
a través de la zona de reacción se consigue poniendo un material
absorbente, o parche, por debajo de la zona de reacción que contiene
la muestra, que se añade a la superficie de la zona de reacción, a
través del material absorbente inferior. La zona absorbente puede
generarse a partir de cualquier material capaz de absorber fluido
mediante acción capilar, tal como algodón o papel. Los
inmunoensayos basados en membrana que utilizan diferentes materiales
absorbentes para concentrar muestras se ejemplifican en las
Patentes de los Estados Unidos N^{ros} 5.185.127, 5.006.464,
4.818.677, 4.632.901, y 3.888.629.
Se sitúa un material absorbente por debajo de la
superficie inferior de la zona de reacción de forma que esté en
comunicación fluida directa con la zona de reacción. De esta manera,
la superficie superior del material absorbente está inmediatamente
adyacente a la superficie inferior de la zona de reacción. El
contacto en comunicación fluida que implica el contacto físico
directo del material absorbente con la zona de reacción puede
incluir de forma opcional la separación de una porción del material
absorbente de la zona de reacción mediante una capa separadora que
tenga en ella una abertura. De acuerdo con ello, la capa separadora
sigue permitiendo el contacto directo entre la zona de reacción y
la zona absorbente permitiendo de esta manera que los reactivos de
ensayo fluyan uniformemente desde la superficie superior a la
superficie inferior del equipo de ensayo. Aunque no es crítico para
el rendimiento del equipo, la capa separadora también sirve para
sujetar la membrana porosa de la zona de reacción. La capa
separadora puede estar hecha de cualquier material rígido o
semirrígido que no se enlace ni interactúe con los reactivos de
ensayo usados conjuntamente con la invención. Son ejemplos de
materiales para la capa separadora (25) fibra de vidrio, papel,
polipropileno hidrófilo, o celulosa. El espesor de la capa
separadora (26) estará por lo general en el intervalo comprendido
entre aproximadamente 0,1 mm y 1 mm. En formas de realización de la
invención en las que se desean facilidad de fabricación y costes
reducidos, la superficie superior del material absorbente se coloca
inmediatamente adyacente a la superficie inferior de la zona de
reacción.
La selección del material de la zona absorbente
no es crítica, y se pueden usar una variedad de materiales fibrosos
de filtración, incluyendo una o más capas de materiales iguales o
diferentes, siempre que el material seleccionado sea compatible con
el analito diana y los reactivos de ensayo. Se puede usar en la
presente invención cualquier material absorbente que sea capaz de
dirigir o absorber fluido a través de una membrana porosa, tal como
por ejemplo, mediante acción capilar. El material absorbente debería
ser capaz de absorber un volumen de una muestra de fluido de ensayo
que sea equivalente, o mayor, que la capacidad volumétrica total del
propio material. Los materiales útiles conocidos incluyen fibras de
acetato de celulosa, poliéster, poliolefina, u otros materiales de
este tipo. El material absorbente proporciona un medio para recoger
la muestra proporcionando una "succión" uniforme para retirar
la muestra del pocillo, a través de la zona de reacción, y hacia
abajo hacia el interior del material absorbente. De esta manera, el
cuerpo absorbente actúa también como un depósito para contener la
muestra y los diferentes reactivos que se usan cuando se lleva a
cabo el ensayo. De acuerdo con ello, cuando se usa en ensayos en
los que se emplean volúmenes relativamente grandes de fluido, el
material absorbente debería tener una capacidad fuertemente
absorbente con el fin de evitar o minimizar la posibilidad de flujo
de retorno de la muestra y los reactivos desde el cuerpo absorbente
a la membrana de reacción.
Así como con lo material de la zona de reacción,
el potencial de absorción del material absorbente puede ser un
parámetro importante. El tiempo de absorción se define en términos
del tiempo necesario para que el agua recorra una distancia
definida a través del material absorbente, y está relacionada con el
espesor y la porosidad del material. El potencial de absorción
puede variar fuertemente de un material a otro y, por tanto, las
propiedades del dispositivo analítico y el caudal de la muestra y de
los reactivos se pueden modificar variando el absorbente usado.
Para facilitar la detección de un analito diana
en una muestra de sangre total, una forma de realización
alternativa de la presente invención proporciona una unidad de
ensayo capaz de albergar y separar la porción de fluido de un
muestra de sangre total de los glóbulos rojos (RBC) presentando una
zona de separación de sangre en comunicación fluida transversal con
la zona de reacción. La zona de separación de sangre funciona para
retener de manera selectiva componentes celulares (es decir glóbulos
rojos) contenidos en la muestra de sangre total y suministrar el
resto de los componentes de la porción de fluido de la muestra de
sangre libre de RBC, incluyendo cualquier analito, a la zona de
reacción para análisis eventual. Esta característica particular es
útil para evitar cualquier interferencia durante la visualización de
una reacción de color para la detección de analito y evita la
necesidad de realizar una extracción preliminar de suero o plasma en
los casos en los que no está disponible el equipo adecuado para
llevar a cabo dicho procedimiento.
Se describen diferentes procedimiento para la
separación de células sanguíneas de la porción de fluido usando
recubrimientos de separación, agentes agregantes y aglutinantes de
eritrocitos, materiales que tengan tamaños de poro asimétricos,
matrices que contienen polímeros, y sistemas multicapa, para nombran
unos pocos, por ejemplo las Patentes de los Estados Unidos
N^{ros} 3.768.978 de Grubb y col., 3.902.964 de Greenspan.
4.477.575 de Vogel y col., 4.594.372 de Zuk. 4.753.776 de Hillman y
col., 4.816.224 de Vogel y col., 4.933.092 de Aunet y col.,
5.055.195 de Trasch y col., 5.064.541 de Jeng y col., 5.076.925 de
Roesink y col., 5.118.428 de Sand y col., 5.118.472 de Tanaka y
col., 5.130.258 de Makino y col., 5.135.719 de Hillman y col.,
5.209.904 de Forney y col., 5.212.060 de Maddox y col., 5.240.862
de Koenhen y col., 5.262.067 de Wilk y col., 5.306.623 de Kiser y
col., 5.364.533 de Ogura y col., y 5.397.479 de Kass y col.
En una forma de realización preferida, la zona
de separación de sangre es una tira alargada o rectangular material
poroso que tiene propiedades físicas intrínsecas que le permiten
atrapar o retener preferencial y suficientemente los glóbulos rojos
de la sangre en la muestra en el interior de la zona de separación
de sangre. Un primer extremo de la zona de separación de sangre,
localizado a una corta distancia transversal desde la zona de
reacción, define una región para recibir la muestra de sangre total
durante la primera etapa del protocolo de ensayo, y antes de la
introducción del analito diana en la zona de reacción. Un segundo
extremo de la zona de separación de sangre, en comunicación fluida
directa con la zona de reacción, ayuda a estimular el movimiento de
la porción de fluido de la muestra de sangre libre de RBC desde el
primer extremo de la zona de separación de sangre hasta la zona de
reacción para análisis eventual. La zona de separación de sangre y
la zona de reacción deben estar en contacto entre sí con el fin de
asegurar la transferencia óptima de la muestra de una zona a la
otra. De acuerdo con ello, los materiales seleccionados para la zona
de separación de sangre y la zona de reacción pueden solaparse
ligeramente entre sí con el fin de asegurar la migración adecuada de
la porción de la muestra de sangre total libre de RBC.
Se puede usar una variedad de materiales para la
zona de separación de sangre tales como fibra de vidrio, mezclas
fibra de vidrio/celulosa, celulosa, u otros materiales patentados,
incluyendo materiales sintéticos, por ejemplo, nylon.
Preferiblemente, se emplea una matriz de fibra de vidrio permeable
como material separador de la sangre para facilitar la separación
de los glóbulos rojos de la sangre total. Se comercializa una
variedad de materiales de fibra de vidrio de diferentes grados de
espesor y absorbencia para facilitar la separación de la sangre,
entre los que se incluyen, por ejemplo, GF-24,
GF-25, y #33, comercializado por Schleicher &
Schuell (Keene, N.H., Estados Unidos); G143, G144, y G167,
comercializado por Ahistrom (Mount Holly Springs, Pa., Estados
Unidos); GFQA30VA, GF/P 30, GF/DE 30, GF/SE 30, GF/CM30VA, GF/CM 30,
F 075-14, F487-09, GF DVA, GFVA 20,
y GD-2, comercializado por Whatman (Fairfield, N.J.,
Estados Unidos).
Los materiales de mezcla fibra de
vidrio/celulosa útiles incluyen F255-07 90 vidrio/10
celulosa, F255-09 70 vidrio/30 celulosa,
F255-11 50 vidrio/50 celulosa, y
F255-12 50 vidrio/50 celulosa, comercializados por
Whatman.
Los materiales de celulosa útiles incluyen 598
comercializados por Schleicher & Schuell. Materiales diversos o
otros fuera de las categorías arriba también puedem ser usados
incluyendo HemaSep V y Leukosorb; que son piezas de fabricación de
acuerdo con la presente invención comercializadas por Pall
BioSupport (Port Washington,
N.Y., USA).
N.Y., USA).
Un material de nylon útil es la Membrana de
Transferencia Nylon 6.6 que se comercializa con el nombre comercial
de Biodyne B (Pall Specialty Materials, Port Washington, N.Y.).
Además, se puede usar el material conocido como "PlasmaSep",
comercializado por Whatman.
Aunque la forma y dimensiones de la zona de
separación de sangre no son críticas, preferiblemente tiene una
forma rectangular estrecha y dimensiones adecuadas para permitir la
eliminación suficiente de una cantidad sustancial de glóbulos rojos
de la muestra de sangre total durante la migración de la porción de
fluido de la muestra desde el primer extremo al segundo extremo de
la zona. De esta manera, en efecto, aunque se prefiere una forma
rectangular estrecha para canalizar la porción de fluido de la
muestra de sangre hasta la zona de reacción, las dimensiones pueden
variar dependiendo de las propiedades intrínsecas (por ejemplo
absorbencia, velocidad de migración, etc.) del material seleccionado
para la zona de separación de sangre. En una forma de realización
preferida, la zona de separación de sangre se fabrican en el
material de fibra de vidrio F487-09, comercializado
por Whatman, que tiene dimensiones comprendidas entre
aproximadamente 4 y 7 mm de anchura, entre aproximadamente 10 y 15
mm de longitud, y entre aproximadamente 0,2 mm y 1,0 mm de espesor.
Más preferiblemente, el material para la separación de la sangre es
de aproximadamente 7 mm de anchura por aproximadamente 10 mm de
longitud y aproximadamente 0.5 mm de espesor. Estas dimensiones se
optimizan para ser capaces de albergar y separar el volumen total
de una muestra de sangre total, por ejemplo dos gotas de sangre.
El material para la separación de la sangre
preferiblemente tiene un vehículo o respaldo rígido o semirrígido
fijado a su superficie inferior para dar soporte y reducir escapes
de porción de fluido de la muestra de sangre total libre de RBC
mientras está migrando hacia la zona de reacción. Los materiales
adecuados para uso como vehículo o respaldo incluyen, por ejemplo,
materiales hidrófobos tales como policarbonato, polietileno, Mylar,
polipropileno, vinilo, celofano y poliestireno, etc. Así como
materiales cartoncillo impermeable o resistente a fluidos, o
materiales similares. El vehículo o respaldo puede fijarse tanto
directa como indirectamente con el material para la separación de
la sangre mediante un adhesivo resistente a fluidos.
Los adhesivos adecuados son bien conocidos en la
técnica. El vehículo puede tener cualquier forma, y prácticamente
cualquier tamaño que se pueda manipular de forma conveniente. Sin
embargo, se prefiere que el vehículo tenga una forma y tamaño
similar a la del material para la separación de la sangre. De esta
manera, el vehículo se conforma preferiblemente con forma de tira
alargada o rectangular similar o igual que el material para la
separación de la sangre.
Tal como se ha descrito más arriba, el
dispositivo de diagnóstico de la presente invención comprende, como
segundo miembro, una unidad de post-filtro que
comprende una zona marcada permeada con un reactivo indicador
seco.
La selección del material para la zona marcada
no es crítica y puede ser cualquier material que tenga absorbencia,
porosidad o capilaridad, a través del cual el tampón multifuncional
y el reactivo indicador resolubilizado se pueden transportar por la
acción absorbente. El criterio de selección es que el material
permita la resolubilización y mezcla del reactivo indicador seco
tras adición del tampón multifuncional, así como iniciar la
transferencia del tampón y del reactivo indicador recientemente
disuelto hacia la zona de reacción de la unidad de ensayo.
Se pueden usar como medio de filtración
materiales naturales, sintéticos o sintéticos modificados
incluyendo pero sin limitarse a materiales de celulosa tales como
papel, celulosa, y derivados de celulosa tales como acetato de
celulosa y nitrocelulosa, fibra de vidrio, tela, películas de
cloruro de polivinilo y similares. Aunque un medio de filtración
preferido es la nitrocelulosa, el material debería elegirse por su
capacidad para liberar el reactivo indicador tras reconstitución con
el tampón multifuncional. Más aún, el flujo de fluido a través del
medio filtrante debe ser laminar, en oposición a las características
de flujo turbulento, que adecuadamente permiten la mezcla inicial
del tampón con el reactivo indicador.
El uso de reactivos indicadores para detectar la
presencia de un analito diana en a muestra de ensayo es bien
conocido en la técnica. Dependiendo del tipo de ensayo diagnóstico
empleado, la marca empleada en el reactivo indicador se conjuga con
un miembro de enlace específico o marcador general de proteína (por
ejemplo Proteína A, Proteína G, anti-IgG) que
enlazará directa, o indirectamente, con el analito diana. La
formación de un reactivo indicador entre un miembro de enlace
específico y una marca puede ser de cualquiera de los tipos
convencionales incluyendo marcas de complejo metálico, marcas
radioactivas, marcas enzimáticas, marcas fluorescentes, marcas
radioactivas, marcas quimioluminiscentes, y similares.
Una consideración importante en el diseño de un
dispositivo de diagnóstico rápido es que la marca elegida en la
generación del reactivo indicador debe proporcionar una señal
fácilmente detectable, por ejemplo, una zona fuertemente coloreada
que se vea fácilmente a simple vista. De esta manera, una importante
forma de realización preferida de la invención es el uso de
"marcas directas", enlazadas a uno de los miembros de enlace
específico. Las marcas directas son bien conocidas en la técnica y
muy ventajosas para uso en sistemas de diagnóstico rápido. Ente los
ejemplos de se incluyen, pero no se limitan a soles metálicos, soles
no metálicos, soles de colorante, partículas de látex, sol de
carbono, y liposomas que contienen cuerpos coloreados. Algunas de
sus ventajas son que se pueden usar para producir una señal
visualmente detectable sin ayuda de instrumentación, y se pueden
usar de manera sencilla en un dispositivo de diagnóstico puesto que
son estables cuando se almacenan en estado seco. Con respecto a
esto último, su estabilidad y liberación inmediata tras entrar en
contacto con un reactivo tampón se puede llevar a cabo mediante el
uso de vidrios solubles. A la vista de los comentarios anteriores,
las marcas indirectas, tales como enzimas, por ejemplo, fosfatasa
alcalina y peroxidasa de rábano picante, son menos preferidas
porque normalmente requieren la adición de uno o más sustratos antes
de que se pueda detectar una señal visible.
Se pueden producir soles no metálicos, tales
como los de selenio, teluro y sulfuro, de acuerdo con los
procedimientos descritos en la Patente de los Estados Unidos Nº
4.954.452 (Yost, y col). Las partículas de sol de colorante se
pueden producir tal como se ha descrito por Gribnau y col., en la
Patente de los Estados Unidos Nº 4.373.932 y May y col., Documento
WO 88/08534, látex tintados tal como se ha descrito por May,
supra, Snyder, Documentos EP-A 0 280 559 y 0
281 327, y colorantes encapsulados en liposomas por Campbell y col.,
Patente de los Estados Unidos Nº 4.703.017. El uso de materiales
colorante polimerizados en forma coloidal para un ensayo de enlace
específico se describe también en la Patente de los Estados Unidos
Nº 4.166.105 de Hirschreid que se refiere a reactivos de enlace
específico marcados con antígenos específicos preparados enlazando
moléculas colorantes fluorescentes a anticuerpos específicos del
analito a través de polímeros que comprenden grupos funcionales
reactivos. También es de interés la Patente de los Estados Unidos Nº
4.313,734 de Leuvering que se refiere a soles metálicos; Leuvering,
y col., "Sol Particle Immunoassay (SPIA)", Abstract, Journal
of Immunoassay, 1(1), pp.77-91 (1980);
Leuvering Dissertation (1984), Sol Particle Immunoassay (SPIA): The
Use of Antibody Coated Particles as Antibodies Labeled in Various
Types of Immunoassay; Uda y col., Anal. Biochem. 218 (1994),
259-264, DE-OS 41 32 133, página 3,
líneas 16-18, para aplicaciones como marcadores y
Tang y col., Nature 356 (1992), 152-154; Eisenbraun
y col., DNA y Cell Biology 12 (1993), 791-797.
Además, se sabe también que se pueden usar partículas no metálicas
coloidales tales como las partículas de carbono (van Amerongen,
Anabiotic '92 (1993), 193-199). Moeremans, y col.,
La Solicitud EPO Nº 158.746 describe el uso de partículas de metal
coloidal como marcas en ensayos de emborronado en sándwich con
solapamiento. En la actualidad se usan muy frecuentemente partículas
de oro coloidal.
Entre las marcas directas, se prefieren los
soles metálicos, más preferidamente, partículas de soles de oro
tales como las descritas por Leuvering en la Patente de los Estados
Unidos Nº 4.313.734. Leuvering describe el uso de partículas de
soles metálicos como marcas en la determinación in vitro de
componentes inmunológicos en un medio de ensayo acuoso. Se
describen de manera específica los kits de pruebas de inmunoensayo
para la detección de antígenos o anticuerpos empleando uno o más
componentes marcados obtenidos acoplando el componente a partículas
de una dispersión acuosa tipo sol de un metal, compuesto metálico, o
núcleos poliméricos recubiertos con un metal o compuesto metálico
que tiene un tamaño de partícula de al menos 5 nm.
Las partículas de sol metálico a usar de acuerdo
con la presente invención se pueden preparar mediante
procedimientos que son bien conocidos en la técnica anterior. Por
ejemplo, la preparación de partículas de sol de oro se describe en
un artículo por G. Frens, Nature, 241, 20-22 (1973).
Adicionalmente, las partículas de sol metálico pueden ser un metal,
compuesto metálico, o núcleos poliméricos recubiertos con metales o
compuestos metálicos, todos ellos descritos en la patente de
Leuvering mencionada más arriba. A este efecto, las partículas de
sol metálico pueden ser de platino, oro, plata o cobre, o cualquier
número de compuestos metálicos que tengan colores
característicos.
Las partículas coloidales que son adecuadas como
marcas de acuerdo con la invención incluyen aquellas que se pueden
conjugar con los miembros de enlace específico o las proteínas
generales de marcado sin interferir con la actividad de dichos
reactivos o con otros reactivos o analitos.
Las partículas de metal coloidal son
particularmente adecuadas como marcas de acuerdo con la presente
invención e incluyen todas aquellas partículas que están compuestas
por metales o compuestos metálicos seleccionados entre el grupo
constituido por los metales platino, oro, plata o cobre, y los
compuestos metálicos yoduro de plata, bromuro de plata, hidróxido
de cobre, óxido de hierro, hidróxido u óxido hidroso de hierro,
hidróxido u óxido hidroso de aluminio, sulfuro de plomo, sulfuro de
mercurio, sulfato de bario, y dióxido de titanio. Las partículas de
metal coloidal preferidas incluyen aquellas fabricadas con oro.
Los marcadores de partícula de oro coloidal son
simples de usar en comparación con otros marcadores. Por ejemplo,
no requieren instrumental necesario para la detección de otros
marcadores tales como isótopos radioactivos y a diferencia de los
enzimas, no requieren la etapa adicional de añadir un sustrato.
Las partículas de oro coloidal se pueden
producir acuerdo con procedimientos por lo general conocidos en la
técnica. De interés para la presente invención son aquellas
referencias que se refieren al uso de dispersiones de partículas
coloidales en procedimientos de ensayo inmunológico.
Específicamente, Frens, Nature, 241, 20-23 (1973)
describe procedimientos para la producción de partícula de sol de
oro de diferentes tamaños a través de la reducción de cloruro de
oro con citrato sódico acuoso. Los colores de la señal visualmente
detectable procedente de la marca de partícula metálica son
dependientes de la identidad y tamaño de partícula de la partícula
de metal, que se puede controlar variando la concentración de
reactivos. Por ejemplo, las partículas de oro coloidal producen
colores comprendidos en el intervalo del rojo al violeta dependiendo
del tamaño de partícula del sol.
El reactivo de oro coloidal se selecciona por
sus propiedades inusuales, entre las que se incluyen la capacidad
de intensificar el color a simple vista cuando está concentrado
sobre superficies sólidas, por enlazar mínimamente de forma no
específica con las superficies sólidas, por prepararse con tamaños
de partícula relativamente uniformes, y por ser fácilmente
liofilizado y resolubilizado. Las partículas de oro coloidal pueden
prepararse de numerosas maneras mediante la reducción de ácido
tetracloroaúrico, lo que produce una variedad de tamaños de
partícula comprendidas entre 5 nm y 100 nm. Los con tamaños de
partícula preferidos están comprendidos entre 15 y 20 nm. Las
partículas de oro coloidal pueden tener un ligante intermediario
absorbido sobre su superficie antes de la adición de la sustancia
ligante, pero el enlace directo es satisfactorio. La absorción de
la sustancia de enlace seleccionada se consigue controlando
cuidadosamente las concentraciones, fuerza iónica, y pH de la
mezcla de reacción. La elección del procedimiento de producción de
la materia prima de oro coloidal o el procedimiento de enlace de la
sustancia ligante son bien conocidos de las personas expertas en la
técnica. Tras completar el marcado con oro coloidal, el reactivo se
somete a centrifugación diferencial o se filtra para controlar el
tamaño de partícula. Los procedimientos de dimensionado de partícula
mediante filtración en gel son bien conocidos también. El reactivo
marcado con oro coloidal se puede usar en forma de suspensión
coloidal o como agente liofilizado con o sin presencia de las
partículas de fase sólida anteriormente mencionadas como reactivo
indicador.
Las partículas de metal coloidal recubiertas y
estabilizadas pueden conjugarse con diferentes proteínas. Cualquier
proteína que se pueda someter a criodesecación u otras formas de
secado tales como incubadora, secado por aire y secado por
pulverización se puede aplicar en la presente invención. Ejemplos de
proteína para uso en la presente invención incluyen, pero no se
limitan a, anticuerpos policlonales o monoclonales, antígeno,
lecitina, proteína A, proteína G, bacterianas, y similares. En
aquellos casos en los que un inmunoensayo diagnóstico es un formato
sándwich que emplea un anticuerpo como reactivo de captura para la
detección de un antígeno como el analito diana, el miembro de
enlace del reactivo indicador es normalmente un segundo anticuerpo
que tiene especificidad por el antígeno enlazado con el primer
anticuerpo, pero que se enlaza con el antígeno en un punto separado
de dónde se enlaza el primer anticuerpo. Por otra parte, el miembro
de enlace del reactivo indicador es normalmente un análogo, u otro
ejemplo auténtico, del antígeno que se puede enlazar con el reactivo
de captura en el mismo punto en el que se enlaza el analito diana en
caso de un formato competitivo.
Para detalles y principios de diseño implicados
en la síntesis de conjugados de partículas coloreadas, ver
Horisberger, Evaluation of Colloidal Gold as a Cytochromic Marker
for Transmission and Scanning Electron Microscopy, Biol.
Cellulaire, 36, 253-258 (1979); Leuvering y col, Sol
Particle Immunoassay, J. Immunoassay 1 (1), 77-91
(1980), y Frens, Controlled Nucleation for the Regulation of
Particle Size en Monodisperse Gold Suspensions, Nature, Physical
Science, 241, pp,20-22 (1973). Surek, y col.,
Biochem. And Biophys. Res. Comm., 121, 284-289
(1984) describe el uso de partículas de oro coloidal marcadas con
proteína A para la detección de antígenos específicos inmovilizados
sobre membranas de nitrocelulosa.
De acuerdo con un importante aspecto de la
invención, la zona marcada de la unidad de
post-filtro esencialmente comprende el reactivo
indicador impregnado y seco en el interior del espesor de un
material poroso que a continuación se puede resolubilizar mediante
la adición del tampón multifuncional. De esta manera, incorporando
uno de los reactivos de ensayo en el interior del dispositivo de la
presente invención, se hace posible la reducción en el número de
etapas requeridas en el protocolo de ensayo eliminando la adición
y/o anterior mezclado de un reactivo indicador.
Con el fin de ayudar a la movilidad completa del
reactivo indicador cuando la zona marcada de la unidad de
post-filtro se humedece con el tampón
multifuncional, la unidad de post-filtro se pretrata
con un material de glaseado en la región a la que se aplica el
reactivo indicador. El glaseado se puede conseguir, por ejemplo,
depositando una solución acuosa de azúcar o celulosa, por ejemplo de
sacarosa o lactosa, en la región relevante de la unidad de
post-filtro, a la vez que se evita el resto de la
unidad de filtrado y el secado por aire. El reactivo indicador puede
aplicarse a continuación a la porción glaseada.
El procedimiento de glaseado que implica el uso
de uno o más azúcares (por ejemplo glucosa, lactosa, trehalosa y
sacarosa) es muy ventajoso cuando se emplea el reactivo indicador
seco de la presente invención en que el azúcar sirve (1) como
estabilizador de proteína, (2) para mejorar la estabilidad a largo
plazo del reactivo indicador seco, y (3) actúa como un agente de
liberación rápida. De acuerdo con una forma de realización
preferida de la invención, se determinó que la sacarosa era el mejor
azúcar en comparación con los demás para el rendimiento del ensayo
debido a (1) su solubilidad, ( 2) corto periodo de secado, (3) el
resultado global sobre la sensibilidad del ensayo, (4) su uso como
conservante, y (5) es barato de usar.
Los ensayo diagnósticos convencionales
normalmente necesitan el uso de dos o más reactivos fluidos con el
fin de realizar varias etapas del protocolo de ensayo incluyendo,
por ejemplo, resolubilizando un reactivo indicador seco, diluyendo
una muestra de fluido de ensayo, bloqueando la superficie de la
membrana donde tiene lugar la reacción de ensayo, facilitando el
transporte de los reactivos críticos y/o lavado de los reactivos no
enlazados de la zona de reacción. Puesto que cada una de estas
etapas implica la mezcla o preparación de diferentes reactantes,
posiblemente se necesitan diferentes formulaciones de reactivos
líquidos debido a diferencias en pH, fuerza iónica, aditivos, tipo
y fuerza del tampón, temperatura, etc. Por ejemplo, el procedimiento
de resolubilización normalmente requiere el uso de un tampón
fisiológico tal como una solución salina tamponada o agua
doblemente destilada, el procedimiento de bloqueo usa un reactivo
líquido formulado con cualquier número de albúminas de suero
animal, gelatina, o leche desnatada, y el procedimiento de lavado
y/o dilución implica el uso de una solución salina tamponada
fosfatada que contiene diferentes cantidades de tensioactivos o
detergentes a pH neutro para eliminar cualesquiera de los
reactantes sin enlace específico. Más aún, con el fin de asegurar
que el usuario realiza cada etapa del ensayo correctamente usando el
reactivo líquido apropiado, los propios reactivos deben estar
claramente etiquetados y ser fácilmente distinguibles entre sí, para
evitar cualquier posible confusión y error del usuario.
Un aspecto importante de la presente invención
supera los distintos problemas descritos más arriba asociados con
el uso de varios reactivos de ensayo proporcionando un tampón
multifuncional de uso único en el procedimiento de ensayo en 2
etapas. El tampón multifuncional se formula para servir como una
combinación de reactivo de resolubilización del reactivo indicador
seco, reactivo facilitante de transporte del reactivo indicador
resolubilizado desde la zona marcada de la unidad de
post-filtro hasta la zona de reacción de la unidad
de ensayo, y reactivo de lavado para eliminar los reactantes no
enlazados de la zona de reacción. Con el fin de simplificar el
número de reactivos y de etapas necesarias para llevar a cabo el
ensayo, el tampón multifuncional se ha formulado especialmente para
ser usado junto con el reactivo indicador seco. Es, por tanto,
particularmente ventajoso usar el tampón multifuncional y el
reactivo indicador seco como un sistema combinado, ya que el tampón
multifuncional permite una sensibilidad óptima y alcanzar una mayor
especificidad durante la realización del ensayo, a la vez que,
adicionalmente, evitando la agregación e inactivación del reactivo
indicador seco en solución.
Tal como será evidente para una persona experta
en la técnica, la composición del tampón multifuncional puede
variar de acuerdo con los requisitos del ensayo específico tal como
el reactivo de captura concreto y el reactivo indicador empleado
para determinar la presencia de un analito diana en una muestra de
ensayo, así como de la naturaleza del propio analito. En general,
el tampón multifuncional contendrá compuestos que tienen funciones
primarias en el ensayo con respecto con respecto a sus propiedades
para servir como agente diluyente, de lavado y de resolubilización.
Sin embargo, puesto que la zona de reacción de la presente invención
ya ha sido pretratada con agentes de bloqueo convencionales tras la
inmovilización del reactivo de captura, la formulación del tampón
elimina la necesidad de incluir un agente de bloqueo no específico.
Un procedimiento para usar el tampón multifuncional según
proporciona la presente invención implica esencialmente la adición
gota a gota del tampón a la unidad de post-filtro en
la etapa final del ensayo en dos etapas para resolubilizar el
reactivo indicador seco. Se proporciona también un kit que contiene
el tampón multifuncional como un componente.
De acuerdo con ello, la presente invención
proporciona un tampón mejorado que sirve como reactivo
multifunctional sin sacrificar ni la sensibilidad ni la
especificidad del ensayo que comprende: (1) un tampón biológico
para mantener el pH entre aproximadamente 7,0 y 10,0; (2) al menos
un tensioactivo para reducir el enlace no específico de los
reactivos de ensayo evitando de manera simultánea la inhibición de
un interacción de enlace específico; (3) un polímero de alto peso
molecular como reactivo de dispersión y suspensión que tiene un
peso molecular comprendo en un intervalo entre aproximadamente 2 X
10^{2} hasta aproximadamente 2 X 10^{6} D; (4) un estabilizador
de pH para mantener el pH del tampón multifuncional entre
aproximadamente pH 7,0 y 10,0; (5) una sal iónica para reducir el
enlace no específico de los anticuerpos; (6) al menos un
conservante para reducir el crecimiento bacteriano y microbiológico;
y (7) un quelante de calcio para evitar la coagulación de una
muestra de ensayo de sangre total; en el que el tampón biológico,
tensioactivo, polímero de alto peso molecular, estabilizador de pH,
sal iónica, conservante y quelante del calcio están todos a sus
concentraciones efectivas.
La composición de tampón multifuncional mejorado
de la invención puede incluir un tampón convencional tal como un
tampón fosfato, tampones MES (ácido
morfolino-etanosulfónico), tampones
BIS-TRIS, tampones citrato, tampones
TRIS-HCl y tampones borato, a una concentración
efectiva que puede estar comprendida entre aproximadamente 5 y 100
mM, preferiblemente en el intervalo entre aproximadamente 5 y 30 mM,
y más preferiblemente aproximadamente 5 mM. El tampón preferido es
un tampón fosfato, que comprende preferiblemente fosfato de sodio,
monobásico y fosfato de sodio, dibásico, a concentraciones tales
que se alcance el pH efectivo del tampón. El pH del tampón de la
presente invención puede variar entre un pH de aproximadamente 7,0 a
un pH de aproximadamente 10,0.
Los detergentes biológicos (tensioactivos)
usados en la presente invención pueden incluir tensioactivos no
iónicos tensioactivos aniónico, tensioactivos zwitteriónicos y
tensioactivos catiónicos. Los detergentes no iónicos útiles en la
invención incluyen monolaurato de sorbitán polioxietilenado
(Tween©20), monooleato de sorbitán polioxietilenado (Tween©80),
éteres polioxietilenados (Triton©, Brij©) y octilfenel óxido de
etileno (Nonidet©). Preferiblemente, se usan los detergentes no
iónicos. El detergente no iónico más preferido es
Triton©X-100. El detergente no iónico actúa como
agente dispersante para reducir el enlace no específico de
anticuerpos/antígenos con la membrana de reacción que se puede
producir como resultado de la adherencia del analito diana a la
fase sólida debido a una reacción no específica, aumentando de esta
manera el fondo del ensayo. Aunque los detergentes biológicos
reducen la posibilidad de dicho enlace causado por interacciones
hidrófobos o no polares, se prefieren los detergentes no iónicos por
su capacidad para reducir el enlace no específico a la vez que se
evita la inhibición del enlace específico. Las concentraciones
efectivas del detergente biológico están comprendidas en el
intervalo entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 0,50% (p/v),
preferiblemente comprendidas entre aproximadamente 0,05 y
aproximadamente 0,10% (p/v), y más preferiblemente la concentración
es aproximadamente 0,07% (p/v).
Las sales iónicas proporcionan una fuente de
cationes y aniones que ayuda a reducir la frecuencia del enlace no
específico de anticuerpos, diferentes de los anticuerpos del
analito, debido a las interacciones iónicas. Las sales que son
útiles en la formulación del reactivo tampón multifuncional son NaCl
y KCl, más preferiblemente NaCl. Las concentraciones efectivas de
cloruro de sodio están comprendidas entre aproximadamente 0 y
aproximadamente 300 mM, preferiblemente comprendidas entre
aproximadamente 50 y aproximadamente 200 mM.
El polímero de alto peso molecular funciona como
reactivo de dispersión y suspensión manteniendo adicionalmente la
capacidad de enlace de los anticuerpos. Son ejemplos de polímeros de
alto peso molecular que se pueden usar en el tampón
polivinilpirrolidona (PVP), dextranos, polietilenglicol (PEG), y
alcohol de polivinilo, para nombrar unos pocos. El polímero de alto
peso molecular preferido para uso para generar el tampón es PVP;
más preferiblemente PVP-40, a una concentración
efectiva. Las concentraciones efectivas de PVP en el tampón de la
invención sodio están comprendidas entre aproximadamente 0,1 y
aproximadamente 3,0% (p/v), preferiblemente comprendidas entre
aproximadamente 0,5 y aproximadamente 2,5%, y más preferiblemente la
concentración es aproximadamente 1,4%. El polímero de alto peso
molecular seleccionado para uso en la invención puede incluir PVP
que tiene pesos moleculares comprendidos entre aproximadamente 10
kD y aproximadamente 1500 kD, dextranos con pesos moleculares
comprendidos entre aproximadamente 10 kD y aproximadamente 2000 kD,
polietilenglicoles (PEG) que tiene pesos moleculares comprendidos
en el intervalo entre aproximadamente 200 D y aproximadamente 10.000
D, y alcohol de polivinilo que tiene un peso molecular en entre
aproximadamente 10.000 D y aproximadamente 100.000 D. Otros
ejemplos de polímero de alto peso molecular también incluyen
polibreno (bromuro de hexadimetrina), metilcelulosa, goma acacia,
sulfato de protamina, merquat, celquat y magnafloc, siempre que esté
en concentración efectiva.
Es preferible incluir en la composición del
tampón multifuncional un agente quelante del calcio, tal como el
ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), o sales del mismo, para
reducir o evitar la posible coagulación de una muestra de ensayo de
sangre total obtenida pinchando un dedo debido al procedimiento de
coagulación de la sangre. También se pueden usar agentes quelantes
del calcio distintos al EDTA, tales como citrato, sales de citrato
o ácido etilenobis(oxietilenonitrilo)tetraacético.
También se pueden usar biopolímeros (es decir, agentes no
quelantes) tales como heparina y quitosán sulfatado, que inactivarán
los factores específicos de la coagulación del procedimiento de
coagulación de la sangre. El EDTA se incluye en la composición
tampón a una concentración efectiva comprendida entre
aproximadamente 5 mM y 100 mM, más preferiblemente de
aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM, y lo más preferible
aproximadamente 20 mM.
El estabilizador de pH actúa manteniendo el pH
del tampón dentro de un intervalo de aproximadamente pH 7,0 a 10,0.
Un estabilizador de pH de ejemplo incluye el clorhidrato de trizma,
aunque también otros estabilizadores conocidos pueden ser útiles en
esta composición. La concentración efectiva de clorhidrato de trizma
está preferiblemente comprendida entre20 y 30 mM.
En general, el material compuesto de ensayo que
comprende la unidad de ensayo y la unidad de
post-filtro se puede alojar en un recipiente
adecuado para conformar un equipo analítico. Preferiblemente, el
recipiente debería salvaguardar los materiales de la fase sólida y
el reactivo indicador seco de la contaminación y proporcionar una
manipulación sencilla y conveniente del equipo de ensayo. Más aún,
el recipiente debería ser antigrietas, asegurando el confinamiento
de fluidos y su eliminación segura tras el uso.
El equipo (13) ilustrado en las Figuras 4 y 5
proporciona un ejemplo representativo del tipo de recipiente que se
puede incluir en un kit de ensayo que incorpora el dispositivo de
flujo pistón de la presente invención. El equipo (13) comprende dos
componentes que se pueden separar, más exactamente el cartucho de
ensayo (14) y la tapa del post-filtro (15), que son
verticalmente y espacialmente distintos entre sí cuando se ponen en
comunicación fluida transitoria durante el protocolo de ensayo. El
alojamiento es capaz de mantener las capas de la unidad de ensayo
bajo compresión de forma que se consigue un contacto continuo y
uniforme entre ambas, y de esta manera, el líquido fluirá
uniformemente a través del equipo (13). El alojamiento estará
fabricado con un material inerte que será cualquiera de una
variedad de plásticos comerciales desechables que se puedan moldear,
por ejemplo, polietileno, polipropileno, estireno, ABS,
poliacrilato, poliestireno, o similares.
Aunque los dos componentes del equipo (13)
tienen la configuración particular y dimensiones representadas en
este, se puede emplear cualquier otro diseño o modificaciones
apropiadas, siempre que los componentes sigan siendo capaces de
estar conectados entre si transitoriamente en un único movimiento
durante el protocolo de ensayo. El medio de conectar los dos
componentes no es crítico, siempre que estén correctamente alineadas
para lograr una comunicación fluida óptima entre sí tras la
interconexión de la tapa del post-filtro (15) con
el cartucho de ensayo (14). Por ejemplo, de acuerdo con el diseño
mostrado en las Figuras 4 y 5, la tapa del
post-filtro (15) se puede ajustar por fricción con
el depósito (22) del cartucho de ensayo (14). Aunque no se ilustra
en el anterior, la tapa del post-filtro (15) se
puede unir mediante bisagras al cartucho de ensayo (14) para evitar
la posible pérdida o colocación incorrecta de ambos componentes. Por
otra parte, los dos componentes pueden desplazarse uno respecto al
otro y retirarse de forma reversible en un único movimiento
horizontal siempre que la unidad de post-filtro
está colocada en alineamiento correcto en la parte superior de la
unidad de ensayo. En este caso particular, el correcto alineamiento
de los dos componentes se puede conseguir mediante el uso de raíles
guía, o proyecciones diseñadas para alinear con rebajes formados en
el dispositivo o en el alojamiento, adicionalmente actuando como un
medio de interconexión para los dos componentes.
Las dimensiones precisas del alojamiento no son
esenciales respecto de la función del equipo de ensayo, pero en
general, el equipo tendrá un tamaño adecuado para su transporte,
manipulación y ensamblaje. El alojamiento tendrá por lo general una
longitud comprendida en el intervalo entre aproximadamente 2 y 5 cm,
preferiblemente 3,5 cm. La anchura estará en el intervalo
comprendido entre aproximadamente 1 y 3 cm, preferiblemente 2,5 cm.
La altura del alojamiento estará en el intervalo comprendido entre
aproximadamente 0,5 y 5 cm, preferiblemente 1,3 cm.
La Figura 4 proporciona una vista del despiece
del equipo (13) que comprende la unidad de ensayo (2) y la unidad
de post-filtro (3), mientras que la Figura 5
proporciona una vista en sección vertical aumentada del equipo (13)
completamente ensamblado. El equipo (13) de la presente invención
comprende dos componentes separados en su forma completamente
ensamblada, más exactamente el cartucho de ensayo (14), que contiene
la unidad de ensayo (2), y la tapa del post-filtro
(15), que contiene la unidad de post-filtro (3). El
cartucho de ensayo (14) y la tapa del post-filtro
(15) se diseñan para conectarse entre sí brevemente durante el
protocolo de ensayo. Se pretende que el equipo (13) sea sencillo de
diseño y construcción, y se puede fabricar usando materiales
fácilmente disponibles.
Tal como se muestra en la Figura 4, el cartucho
de ensayo (14) del equipo (13) aloja la unidad de ensayo (2) que
comprende tanto un miembro superior (16) y a miembro inferior (17).
El perímetro exterior del miembro inferior (17) tiene un resalte
ligeramente indentado (18) que le permite ajustarse e
interconectarse con el borde (19) que bordea el miembro superior
(16) para conformar el cartucho de ensayo (14) ensamblado. Aquellas
personas expertas en la técnica apreciará que aunque el cartucho de
ensayo (14) mostrado en las Figuras 4 y 5 tiene forma rectangular,
no se limita a esta configuración concreta siempre que se pueda
adaptar para contener el material absorbente, o tapón (20), en
contacto directo con la membrana de reacción (21).
Contenido en el interior del miembro superior
(16) del cartucho de ensayo (14) hay un depósito (22) que está
directamente alineado con la membrana de reacción (21) expuesta de
la unidad de ensayo (2). El depósito (22) (a) proporciona acceso a
la zona de reacción para introducir la muestra de fluido de ensayo,
(b) proporciona enlace operativo de la tapa del
post-filtro (15) para la introducción del reactivo
tampón multifuncional, y (c) permite visualizar el resultado del
ensayo en la membrana de reacción (21) tras la retirada de la tapa
del post-filtro (15), es decir detectar el color, o
fluorescencia, u otra señal, en la(s) zona(s)
indicador. Tal como se representa en el dibujo, la superficie
superior que rodea el depósito (22) está ligeramente curvada y
extendida hacia debajo de manera que forma un receptáculo en forma
de copa que finaliza en una porción de la membrana de reacción
(21). De esta manera, la cantidad de muestra de ensayo introducida
hacia el interior del depósito (22) no puede rodear ninguno de los
componentes del equipo (13). La configuración de la pared interior
(23) y las dimensiones del depósito se seleccionan de forma que el
depósito (22) se puede conectar con, y estar en asociación
operativa con la tapa del post-filtro (15) durante
el protocolo de ensayo. Preferiblemente, tanto el depósito (22)
como la tapa del post-filtro (15) tienen una
configuración en forma de embudo. De esta manera, cuando el
depósito (22) y la tapa del post-filtro (15) están
en posición operativa y el tampón multifuncional se aplica a la
tapa del filtro (15), esta configuración permitirá que una cantidad
adecuada del tampón entre en contacto y pase a través de una
pequeña cantidad de área superficial de la membrana de reacción
(21). De esta manera, emparejando de forma selectiva el tamaño del
depósito (22) con la tapa del post-filtro (15), la
operación del equipo (13) se puede simplificar de forma que, por
ejemplo, el tampón multifuncional (12) se puede posicionar en el
depósito (22) en una única etapa del procedimiento de ensayo.
De acuerdo con la forma de realización mostrada
en las Figuras 4 y 5, la tapa del post-filtro (15)
se fija de forma que se puede separar con el depósito (22) del
cartucho de ensayo (14) mediante un ajuste de fricción entre la
pared interna (23) del depósito (22) y la pared externa (33') de la
tapa del filtro (15). Se pueden usar otros medios parecidos para
fijar de forma que se puede separar la tapa del
post-filtro (15) al cartucho de ensayo (14).
Además, la altura de la pared externa (33') de la tapa del
post-filtro (15) es ligeramente inferior a la
altura de la pared interior (23) del depósito (22) de forma que
cuando la tapa del filtro (15) se fija al depósito (22), la base
(24) de la tapa del filtro (15) termina inmediatamente por encima,
pero sin tocar la membrana de reacción (21). Las dimensiones tanto
del depósito (22) como de la tapa del post-filtro
(15) se pueden variar sin que afecte al rendimiento del equipo
(13), aunque las siguientes dimensiones se han determinado como
satisfactorias: depósito (22) -1,0 cm de diámetro superior e
inferior y 0,6 cm de profundidad; tapa del
post-filtro (15) -0,9 cm de diámetro inferior, 1,1
cm de diámetro superior, y 0,5 cm de profundidad.
Tal como se ha descrito más arriba, la unidad de
ensayo de la presente invención comprende una membrana de reacción
(21) y un almohadilla absorbente (20), por medio del cual la
superficie inferior de la membrana de reacción (21) está soportada
por la superficie superior de la almohadilla absorbente (20). La
membrana de reacción (21), que contiene reactivo de captura capaz
de enlazar con el analito diana, esencialmente define la zona de
reacción en la que tiene lugar diferentes reacciones de enlace
específico durante el ensayo. Tal como se ha descrito
anteriormente, la membrana de reacción (21) se puede fabricar a
partir de numerosos material porosos biológicamente inertes.
Colocado directamente por debajo de la
superficie inferior de la membrana de reacción (21), y en
comunicación fluida con la misma, hay un almohadilla absorbente
(20) que define la zona absorbente. En formas de realización de la
invención en las que se desee facilidad de fabricación y costes
reducidos, la superficie superior completa de la almohadilla
absorbente (20) se encuentra normalmente inmediatamente adyacente a
la superficie inferior de la membrana de reacción (21). La unidad
de ensayo puede opcionalmente incluir un medio de separación entre
la membrana de reacción (21) y la almohadilla absorbente (20) que
por lo general serán incapaces de enlazarse con el analito diana de
interés. De acuerdo con la forma de realización mostrada en la
Figura 4, el medio de separación en forma de un capa separadora
(25) aísla una porción de la membrana de reacción (21) de la
almohadilla absorbente (20). Aunque no es crítico para el
rendimiento del equipo (13), la capa separadora (25) sirve para
asegurar la membrana de reacción (21) en su sitio y permite que los
reactivos de ensayo fluyan uniformemente desde la superficie
superior hacia abajo hacia la superficie inferior del ensayo equipo
(13).
La capa separadora (25) tiene una apertura (26)
definida por un borde (27) que tiene dimensiones perimetrales y
forma similares a las de la membrana de reacción (21) permitiendo de
esta forma que las superficies superior e inferior de la membrana
de reacción (21) sean accesibles cuando la membrana (21) y la capa
separadora (25) están selladas entre sí para formar una pieza de
compresión. Haciendo referencia a la Figura 4, que representa una
forma de realización del equipo (13), una porción de la superficie
superior de la membrana de reacción (21) está completamente
expuesta de forma que cuando el ensayo diagnóstico se lleva a cabo,
la muestra de fluido de ensayo y los reactivos de ensayo se pueden
añadir directamente a la membrana de reacción (21). La membrana de
reacción (21) se dimensiona para cubrir completamente la apertura
(26). Preferiblemente, la membrana de reacción (21) tendrá la misma
forma que la apertura (26), pero dimensionada ligeramente más ancha
que la apertura (26) de forma que se pueda sellar a la superficie
inferior de la capa separadora (25) en la periferia de la apertura
(26). Sin embargo, la forma de la membrana de reacción (21) y la
forma de la apertura (26) pueden diferir, y no se limitan a la
configuración mostrada en la Figura 4. De esta manera, en
combinación, el borde (27) rodea la apertura (26) y la superficie
superior expuesta de la membrana de reacción (21) esencialmente
define la región de ensayo. Más aún, una vez ensamblado el cartucho
de ensayo (14) del equipo (13), la almohadilla absorbente (20)
sigue siendo capaz de contactar la superficie inferior de la
membrana de reacción (21) localizada directamente por debajo de la
membrana de reacción (21). Las dimensiones de la capa separadora
(25) y la almohadilla absorbente (20) se eligen para ajustar de
forma cooperativa en el interior de la base del cartucho de ensayo
(14), asegurando de esta manera que la almohadilla absorbente (20)
está correctamente alineada y en comunicación fluida con la
superficie inferior de la membrana de reacción (21). Por lo general,
el área superficial de la superficie superior de la almohadilla
absorbente (20) será normalmente mayor que la de la membrana de
reacción (21), pero similar a la de la capa separadora (25).
La almohadilla absorbente (20) se selecciona
para tener un tamaño de poro capilar de forma que induzca el flujo
de la muestra de fluido de ensayo a través de la membrana de
reacción (21) sin el uso de medios externos. De esta manera,
convenientemente, la almohadilla absorbente (20) sirve a la vez para
promover y dirigir el caudal de reactivos a través de la membrana
de reacción (21). La almohadilla absorbente (20) es de suficiente
tamaño y composición para que sea capaz de absorber el exceso de
muestra, reactivo indicador y tampón. El material a partir del que
se fabrica la almohadilla absorbente (20) puede ser cualquier
material que se pueda humedecer que sea sustancialmente inerte con
los reactivos de ensayo usados para llevar a cabo un ensayo. La
almohadilla absorbente (20) tendrá esencialmente las mismas
dimensiones perimetrales y forma que la capa separadora (25) que
sujeta la membrana de reacción (21). El espesor preciso de la
almohadilla absorbente (20) no es esencial para el funcionamiento
de la presente invención, estará comprendida por lo general entre
aproximadamente 2 y 10 mm.
El segundo componente del equipo es la tapa del
post-filtro (15) en forma de embudo que acomoda de
manera sencilla una cantidad adecuada del tampón multifuncional
necesario para realizar el ensayo en una única aplicación. La tapa
del post-filtro (15) comprende la unidad de
post-filtro (3) y los manguitos interno (28) y
externo (29) manguitos que tienen un extremo abierto tanto en la
parte superior como en la inferior. La apertura (30, 30') de los
manguitos (28) y (29) se dimensiona para conseguir el caudal
deseado para el ensayo en cuestión. La apertura de los manguitos
puede tener convenientemente un diámetro comprendido en el intervalo
de 12,6 a 15,2 mm. Preferiblemente, el diámetro de la apertura (30,
30') es de 9,5 mm.
En la forma ensamblada, la tapa del
post-filtro (15) comprende un embudo (31) que tiene
en su parte superior aletas que se extiendes hacia el exterior (32,
32') y paredes laterales dependientes (33, 33'). Las paredes
laterales dependientes (33) del manguito externo (29) terminan en
la base (24). La apertura (30') en la base (24) permite que una
corriente de fluido viaje a través del embudo (31) para fluir hacia
el interior del cartucho de ensayo (14). La unidad de
post-filtro (3) de la presente invención se mantiene
de manera segura en la base (24) de tapa del
post-filtro (15) mediante los manguitos interno (28)
y externo (29) de la tapa del post-filtro (15). Un
collar interno (34), íntegramente formado en la base (24) del
manguito externo (29), es capaz de soportar la unidad de
post-filtro (3) de forma que cuando el manguito
interno (28) se ajuste por fricción en el interior del manguito
externo (29), la unidad de post-filtro (3) se
mantendrá permanentemente en su lugar.
La unidad de post-filtro (3)
comprende un medio de filtración impregnado con reactivo indicador
seco que define la zona marcada. El reactivo indicador seco se
resolubiliza y transporta mediante tampón multifuncional hasta la
membrana de reacción (21) tras la adición del tampón a la tapa del
post-filtro (15). La selección del medio de
filtración para la unidad de post-filtro (3) no es
crítico para la invención y puede ser cualquier material adecuado
que posea absorbencia, porosidad o capilaridad a través del cual el
tampón multifuncional y el reactivo indicador resolubilizado se
pueden transportar por acción absorbente. Los criterios de selección
es que el material permita la resolubilización y mezcla del
reactivo indicador seco tras adición del tampón multifuncional así
como iniciar la transferencia del tampón y del reactivo indicador
recientemente disuelto hasta la membrana de reacción (21) de la
unidad de ensayo (2).
Para conveniencia de manipulación al usar el
equipo (13), se asegura un asa (35) a la aleta en extensión (32) de
la tapa del post-filtro (15) de forma que cuando la
tapa del filtro (15) se fije al depósito (22), se extienda
ligeramente más allá del límite del depósito (22) para facilitar la
retirada de la tapa del post-filtro (15) del
cartucho de ensayo (14).
En las Figuras 7A y 7B se ilustra un ejemplo
representativo de una versión modificada del cartucho de ensayo de
la invención incorpora una zona de separación de sangre en
comunicación fluida transversal con la zona de reacción para la
detección de analito en una muestra de sangre total
Tal como se muestra en la Figura 7A, el cartucho
de ensayo se provee de un miembro superior (16) construido y
adaptado para ajuste encajado con un miembro inferior (17). En esta
particular forma de realización, el miembro superior (16) del
cartucho de ensayo define una primera apertura o rebaje interno a su
través en forma de un depósito (22). El depósito (22) sirve para
(a) proporcionar unión operativa de la tapa del
post-filtro para la introducción del reactivo
tampón multifuncional, y (b) permitir la visualización del resultado
del ensayo en la membrana tras la retirada de la tapa del
post-filtro, es decir detectar el color o
fluorescencia, u otra señal, en la(s) zona(s)
indicador. De esta manera, la configuración y dimensiones del
depósito (22) se seleccionan basándose en que se pueda conectar de
forma operativa con la tapa del post-filtro para
permitir la comunicación fluida transitoria entre la zona marcada
de la unidad de post-filtro y la zona de reacción de
la unidad de ensayo.
Separada una corta distancia transversal
distancia del depósito (22), el miembro superior define una segunda
apertura a su través en forma de un depósito (104) que puede, como
se muestra, tener lados biselados, o puede tener cualquier forma o
configuración de conveniencia que dirija y proporcione acceso
suficiente al primer extremo de la zona de separación de sangre
tras aplicación de un muestra de sangre total. Tras introducir una
muestra de sangre total en el depósito (104) y dejar transcurrir un
corto tiempo de incubación para permitir una separación suficiente
y la migración del fluido libre de RBC fluid a lo largo de la zona
de separación de sangre hasta la zona de reacción, la tapa del
post-filtro está unida de forma operativa al
depósito (22) para permitir la finalización del protocolo de ensayo
en 2 etapas de forma que se pueda realizar la determinación final
para determinan la presencia de analito diana.
Tal como se muestra en la Figura 7B, el miembro
inferior (17) del cartucho de ensayo proporciona una primera
estructura base (105) que tiene una pluralidad de paredes de soporte
que sirven como cerramiento sólido de la almohadilla absorbente y
de esta manera, se configura para recibir y mantener la almohadilla
absorbente segura en su lugar. Se proporciona adicionalmente una
segunda estructura base (106) que tiene una pluralidad de columnas
protuberantes de la misma altura que sirve como soporte elevado de
la zona de separación de sangre. La posición de la segunda
estructura base (106) en relación con la primera estructura base
(105), así como su configuración, son tales que cuando la zona de
separación de sangre se coloca en el interior del miembro inferior
(17), la zona de separación de sangre es contigua con, y en
alineamiento plano horizontal con la zona de reacción. Aunque la
estructura base (106) representada anteriormente tiene una
pluralidad de columnas y/o paredes de soporte que sirven para
soportar el perímetro y centro de la zona de separación de sangre,
son posibles cualquier número de configuraciones o estrategias,
siempre que la zona de separación de sangre está colocada de forma
segura y correcta en relación a la zona de reacción cuando el
cartucho de ensayo está completamente ensamblado.
\vskip1.000000\baselineskip
En operación, el equipo de la presente invención
se usa ampliamente para determinar la presencia de analito diana en
una muestra de fluido de ensayo, empleando al menos un reactivo de
captura para formar un producto detectable en la membrana de
reacción como una indicación de que el analito está presente en la
muestra. El dispositivo y equipo de ensayo son aplicables en
particular a un inmunoensayo en el que el componente de la muestra
es un componente de un par inmunológico incluyendo antígenos,
anticuerpos, o haptenos. El par inmunológico incluye dos
componentes que se enlazan inmunológicamentre entre sí. Los pares
inmunológicos específicos incluyen antígenos y sus anticuerpos
(anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales purificados por
afinidad, incluyendo fragmentos de los mismos), o hapteno
biológicamente funcionales y sus anticuerpos. Aunque los anticuerpos
monoclonales tienen ventajas conocidas sobre los anticuerpos
policlonal, se puede usar cualquier tipo de reactivos inmunológicos
de acuerdo con la presente invención. De esta manera, para
simplicidad de la representación, el ensayo y dispositivo de la
presente invención se describirán con respecto a los inmunoensayos
que usan el par inmunológico antígeno-anticuerpo.
La muestra de fluido de ensayo es de origen biológico, por ejemplo
orina o suero, y el reactivo de captura y reactivo indicador pueden
comprender un anticuerpo o antígeno, dependiendo del analito de
interés y que se emplee una técnica tipo sándwich o competitiva.
Los inmunoensayos que usan el equipo analítico
de la presente invención pueden ser muy simples y rápidos, y pueden
ser cualitativos o semicuantitativos. El equipo analítico pude
adaptarse para uso en muchos tipos de ensayos. Por ejemplo, el
analito diana puede ser una a hormona, anticuerpo, antígeno,
proteína, etc. Se proporciona en la Patente de los Estados Unidos
Nº 5.006.464 (Chu, y col.) una lista no inclusiva de posibles
analitos diana. El formato del inmunoensayo dependerá del analito
diana que se desea detectar. De nuevo, estos ya son conocidos en la
técnica. Aquellas personas expertas en la técnica apreciarán que con
el fin de maximizar la sensibilidad para la detección de un analito
diana particular, se pueden modificar varios componentes del
dispositivo analítico y/o procedimiento de ensayo, tales como la
porosidad, tipo y espesor del material usado para la membrana de
reacción. El dispositivo analítico usado en los ensayos
esencialmente no requiere la manipulación de la muestra, y el
protocolo de ensayo completo se puede realizar en menos de 1
minuto.
El equipo de ensayo de la invención se contempla
para uso con cualquier tipo de procedimiento de inmunoensayo en
flujo pistón, incluyendo ensayos competitivos y preferiblemente tipo
sándwich. Tal como se ha mencionado más arriba, la membrana de
reacción se recubre con un reactivo de captura, por lo general un
anticuerpo específico, o fragmento del mismo. Alternativamente, si
el analito diana es un anticuerpo, el reactivo de captura puede ser
un antígeno específico. En cualquiera de los casos, tras aplicar el
reactivo de captura a la membrana, se prefiere rellenar cualquier
punto de enlace no ocupado con una proteína inerte para evitar el
enlace no específico de cualquier otro reactivo de ensayo, tal como
el reactivo indicador, con la membrana. En la presente descripción,
el término "proteína inerte" significa una proteína que no es
inmunológicamente reactiva frente a cualquiera de los componentes
del ensayo, y que sustancialmente no se enlaza de forma no
específica al resto de proteínas en el medio de ensayo,
comprendiendo que la proteína inerte puede claramente ser
inmunológicamente reactiva frente a otros materiales que no sean
parte del ensayo de la invención. Ejemplos representativos no
limitantes de proteínas inertes adecuadas son albúmina y
caseína.
Haciendo referencia en primer lugar a un ensayo
sándwich para la detección de un antígeno, el reactivo de captura
será un primer anticuerpo específico para el antígeno predeterminado
y el reactivo indicador comprenderá un segundo anticuerpo también
específico para el antígeno predeterminado. El primer anticuerpo,
preferiblemente un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal
purificado por afinidad, se enlaza con la membrana de reacción como
reactivo de captura. El primer anticuerpo se selecciona por su
capacidad para reconocer y enlazar un emplazamiento epitópico
específico del antígeno de interés. El segundo anticuerpo que forma
parte del reactivo indicador se seleccionará basándose en que
reconocerá y enlazará a un emplazamiento epitópico específico
alternativo del antígeno de interés y, de esta manera, no
interfiere con la interacción de enlace del primer anticuerpo con
el antígeno. Una persona experta en la técnica apreciará también que
el ensayo tipo sándwich también se puede llevar a cabo invirtiendo
los papeles del antígeno y anticuerpo. Por ejemplo, el miembro
inmovilizado del par inmunológico puede ser el antígeno para la
detección de un anticuerpo de interés en la muestra de ensayo
utilizando anticuerpo anti-humano marcado o Proteína
A como reactivo indicador.
Haciendo referencia a las Figuras 4, 5 y 7, y
usando una muestra de fluido de ensayo diferente a sangre total, el
procedimiento de la invención se lleva a cabo depositando
directamente un volumen de la muestra de fluido de ensayo sobre la
superficie superior de la membrana de reacción (21) por introducción
a través de la apertura del depósito (22). La cantidad de muestra
de fluido de ensayo y tampón multifuncional reactivo añadidos al
equipo de ensayo (13) mediante el depósito (22) puede variar en las
diferentes formas de realización de la invención sujeto. En
general, para una forma de realización específica dada, se añadirá
una cantidad predeterminada y sin diluir de la muestra de ensayo,
mientras que el reactivo tampón multifuncional normalmente se
añadirá en exceso. Un volumen predeterminado de la muestra se
añadirá preferiblemente gota a gota, usando una pipeta esterilizada
normalizada, en el centro del depósito (22) de forma que se mantenga
el contacto uniforme entre la muestra y el reactivo de captura
inmovilizado. En una forma de realización preferida de la invención,
únicamente se necesita añadir una única gota de la muestra de
fluido de ensayo al depósito. A medida que la muestra de fluido de
ensayo se induce a fluir a través de la almohadilla absorbente (20)
por capilaridad, cualquier antígeno libre que pueda estar presente
en la muestra de ensayo entra en contacto con el anticuerpo
inmovilizado sobre la superficie de la membrana de reacción (21).
El antígeno libre de esta manera queda inmovilizado por el
anticuerpo, mientras que la muestra de fluido de ensayo se difunde
hacia el interior de la el almohadilla absorbente (20) inferior. La
tapa del post-filtro (15) se conecta a continuación,
y se pone en asociación operativa con el depósito (22) del cartucho
de ensayo (14). Un volumen predeterminado de tampón multifuncional
se puede medir por un marcador situado en el depósito (22), o
preferiblemente se añade gota a gota, usando una segunda pipeta
normalizada esterilizada. La adición gota a gota del reactivo
tampón en el centro del tapón post-filtro (15)
debería estimular el contacto uniforme y la saturación de la unidad
de post-filtro (3) de forma que el reactivo
indicador seco se resolubilice completamente. Además, el volumen de
reactivo tampón debería ser suficiente para separar cualquier
reactivo indicador no enlazado de la membrana de reacción (21) tras
producirse las interacciones de enlace específico. A medida que la
corriente de reactivo tampón entra en contacto y seguidamente se
difunde a través de la membrana de reacción (21), los reactivos no
enlazados se separan de los reactivos enlazados. De acuerdo con una
forma de realización preferida de la presente invención se puede
añadir un intervalo entre 10 y 15 gotas de tampón a la tapa del
post-filtro (15). Tras la adición del tampón
multifuncional y tras la resolubilización del reactivo indicador
seco que comprende el anticuerpo marcado, el anticuerpo marcado se
transporta hasta la membrana de reacción (21) mediante tampón,
dónde se enlazará con cualquier antígeno enlazado con el anticuerpo
inmovilizado. Debido al volumen y propiedades químicas del tampón
multifuncional, no se requiere una etapa de lavado adicional con el
fin de eliminar el anticuerpo marcado no enlazado. La presencia de
anticuerpo marcado en la membrana de reacción (21) se determina a
continuación como una indicación de la presencia del antígeno diana
en la muestra. La reacción de enlace del anticuerpo marcado con el
antígeno produce una señal visualmente detectable indicativa de un
resultado positivo que se observa directamente tras la retirada de
la tapa del post-filtro (15).
La presente invención es aplicable también a la
técnica de ensayo competitivo, por ejemplo, descrita en la Patente
de los Estados Unidos Nº 4.366.241 (Tom, y col.). En dicho sistema
para la detección de antígeno en una muestra de fluido de ensayo,
el correspondiente miembro del par inmunológico, más exactamente el
anticuerpo, se inmoviliza sobre la superficie de la membrana de
reacción (21). Sin embargo, el miembro de enlace del reactivo
indicador será una muestra auténtica del antígeno diana que tiene
una afinidad de enlace comparable por el anticuerpo inmovilizado en
la membrana de reacción (21). Tras depositar la muestra de fluido de
ensayo sobre la membrana de reacción (21), la presencia de
antígeno, si hay, y el antígeno del reactivo indicador auxiliar
compiten por los puntos de enlace con el anticuerpo. Puesto que el
anticuerpo inmovilizado tiene un suministro limitado, se produce
una competición entre el antígeno de la muestra y el antígeno
marcado. Si no hay antígeno en la muestra de ensayo, el antígeno
marcado se agrega sobre la membrana de reacción (21). De esta
manera, la presencia de color significa un resultado negativo
debido a la ausencia de niveles detectables de antígeno en la
muestra. Si hay antígeno, no se revela color debido a la reducción
en la cantidad de antígeno marcado enlazado con el anticuerpo
inmovilizado que ya tiene ocupados los puntos de enlace por el
antígeno diana, indicando de esta manera un resultado positivo. De
acuerdo con ello, la señal emitida desde la marca es inversamente
proporcional a la cantidad de antígeno en la muestra. Más aún, como
en el caso del ensayo tipo sándwich, el ensayo de enlace
competitivo puede realizarse invirtiendo los papeles del antígeno y
anticuerpo. Por ejemplo, el miembro inmovilizado del par
inmunológico puede ser el antígeno para la detección de un
anticuerpo de interés en la muestra de ensayo que compite con el
anticuerpo marcado.
Como consideración adicional, este sistema se
puede expandir para incluir la detección simultánea de dos o más
analitos de interés en una muestra de fluido de ensayo usando un
número correspondiente de reactivos inmunológicos inmovilizados en
la zona de reacción. Como ejemplo, se puede seleccionar un primer
anticuerpo que sea reactivo con una subunidad concreta de un número
de diferentes anticuerpos. Si un segundo anticuerpo es específico
para una subunidad de un antígeno únicamente, dicho segundo
anticuerpo se puede usar como anticuerpo inmovilizado y se puede
usar un único y primer anticuerpo marcado como el anticuerpo marcado
universal del antígeno de interés. Por otra parte, dos tipos
diferentes de anticuerpos inmovilizados se pueden emplear si se
espera que el antígeno capaz de ser reconocido por su compañero de
enlace apropiado sea posible que esté presente en una muestra de
fluido de ensayo, por ejemplo anticuerpo anti-VCH y
anticuerpo anti-VIH encontrado en una muestra de
paciente coinfectado.
En el caso de analizar una muestra de sangre
total, el procedimiento de la invención es esencialmente idéntico
al descrito más arriba, con la excepción de que un volumen de la
muestra se deposita directamente en el interior del depósito (104)
que permite el acceso y el contacto directo con el primer extremo de
la zona de separación de sangre a través de la apertura definida en
el anterior (ver también la Figura 7A). La cantidad de muestra de
sangre total aplicada al depósito (104) y la cantidad de reactivo
tampón multifuncional añadido al depósito (22) pueden variar en las
diferentes formas de realización de la invención sujeto. En general,
para una forma de realización dada específica, se añadirá una
cantidad predeterminada no diluida de la muestra de ensayo,
mientras que el reactivo tampón multifuncional se añade en exceso.
Un volumen predeterminado de muestra se añade preferiblemente gota
a gota, usando una pipeta normalizada esterilizada, en el centro del
depósito (104) de forma que se asegure el contacto uniforma entre la
muestra y la zona de separación de sangre.
En una forma de realización preferida de la
invención, únicamente se necesita añadir dos gotas de muestra de
sangre total al depósito (104). Tras un periodo corto de incubación,
la porción de muestra de sangre total libre de RBC, incluyendo
cualquier analito, migra en dirección transversal a lo largo de la
zona de separación de sangre hasta que llega a la membrana de
reacción (21). A medida que la muestra de fluido de ensayo libre de
RBC se induce a fluir a través de la almohadilla absorbente (20) por
acción capilar, cualquier antígeno libre que pueda estar presente
en la muestra de ensayo entra en contacto con el anticuerpo
inmovilizado sobre la superficie de la membrana de reacción (21).
El antígeno libre de esta manera queda enlazado por el anticuerpo,
mientras que la muestra de fluido de ensayo, junto con los
componentes no esenciales, se difunde hacia el interior de la el
almohadilla absorbente (20) inferior. La tapa del
post-filtro (15) se conecta a continuación y se
pone en asociación operativa con el depósito (22) del cartucho de
ensayo (14). Un volumen predeterminado de tampón multifuncional se
puede medir por un marcador en el depósito (22), o preferiblemente
se añade gota a gota, usando una segunda pipeta normalizada
esterilizada. La adición gota a gota del reactivo tampón en el
centro del tapón post-filtro (15) debería estimular
el contacto uniforme y la saturación de la unidad de
post-filtro (3) de forma que el reactivo indicador
seco se resolubilice completamente. Además, el volumen de reactivo
tampón debería ser suficiente para separar cualquier reactivo
indicador no enlazado de la membrana de reacción (21) tras las
interacciones de enlace específico que han tenido lugar. A medida
que la corriente de reactivo tampón entra en contacto y
posteriormente se difunde a través de la membrana de reacción (21),
los reactivos no enlazados se separan de los reactivos enlazados.
De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente
invención se puede añadir un intervalo entre 10 y 15 gotas de tampón
a la tapa del post-filtro (15). Tras la adición del
tampón multifuncional y tras resolubilización del reactivo indicador
seco que comprende el anticuerpo marcado, el anticuerpo marcado se
transporta hasta la membrana de reacción (21) mediante el tampón,
dónde complejará cualquier antígeno que esté enlazado mediante el
anticuerpo inmovilizado. Debido al volumen y propiedades químicas y
del tampón multifuncional, no se requiere una etapa diferente de
lavado con el fin de eliminar el anticuerpo marcado no enlazado. La
presencia de anticuerpo marcado sobre la membrana de reacción (21)
se determina a continuación como indicación de la presencia del
antígeno diana en la muestra. La reacción de enlace del anticuerpo
marcado con el antígeno produce una señal visualmente detectable
indicativa de de un resultado positivo que se observa fácilmente
tras la retirada de la tapa del post-filtro
(15).
De acuerdo con la invención, se pueden producir
kits que incluyen el dispositivo de ensayo rápido, el tampón
multifuncional, así como las instrucciones que describen el
protocolo de ensayo para determinar la presencia de un analito
diana en una muestra de fluido de ensayo. El dispositivo diagnóstico
de la presente invención, que incorpora la unidad de ensayo y la
unidad postfiltro, se empaquetará normalmente en forma de un kit
diagnóstico para uso en la detección del analito diana de interés.
El kit incluirá normalmente el dispositivo de ensayo de flujo
pistón, alojado de manera preferible en un contenedor adecuado, el
tampón multifuncional, las pipetas plásticas desechables y las
instrucciones que describen el procedimiento para llevar a cabo el
protocolo de ensayo. Dependiendo del tipo de ensayo realizado, es
decir, sándwich o competitivo, y del analito diana que se va a
determinar en la muestra de fluido de ensayo, las instrucciones
incluirán también las cantidades relativas de la muestra de ensayo
y el tampón multifuncional que se va a añadir a la unidad de ensayo
y a la unidad postfiltro, de manera respectiva. De manera
adicional, se incluirán los períodos de tiempo requerido que
implican la adición secuencial de la muestra y el tampón, así como
la del tiempo requerido para la generación de un resultado.
El kit preferido de la presente invención usa el
dispositivo de diagnóstico de flujo pistón tal como se describe y
muestra en las Figuras 1 a 3. De manera preferible, el dispositivo
de diagnóstico de flujo pistón se aloja dentro de un contenedor
adecuado que se puede incluir en el kit de ensayo que comprende dos
componentes separables, conteniendo cada componente separadamente
la unidad de ensayo y la unidad postfiltro, que se disponen en un
formato vertical y espacialmente distinto. En concreto, el diseño
del contenedor debería permitir que la unidad de ensayo y a la
unidad postfiltro estén conectadas de manera operativa entre sí de
tal manera que la zona de reacción y la zona de marca puedan
colocarse en comunicación fluida transitoria entre sí durante el
protocolo de ensayo en un movimiento único. El contenedor que aloja
la unidad de ensayo debería ser capaz de mantener las capas de la
unidad de ensayo bajo compresión con el fin de proporcionar contacto
continuo y uniforme entre las anteriores de tal manera que el
líquido fluya de manera uniforme a través del equipo. Las Figuras
4, 5 y 7 proporcionan un ejemplo representativo del tipo de
contenedor que se puede incluir en el kit de ensayo que incorpora el
dispositivo de flujo pistón de la presente invención.
La invención se comprenderá de manera adicional
a partir de los siguientes ejemplos no limitantes. Se proporcionan
los siguientes ejemplos para describir en detalle algunos de los
procedimientos y materiales representativos, actualmente preferidos
de la invención. Se proporcionan estos ejemplos con objetivos de
ilustración de los conceptos de la invención, y no se pretende que
limiten el alcance de la invención tal como se define mediante las
reivindicaciones adjuntas.
Lo anterior es una descripción general del
equipo, procedimiento y reactivos de la invención. Se puede llevar
a cabo una reacción tipo sándwich para la detección de
Helicobacter pylori. De esta manera, por medio de un ejemplo
proporcionado a continuación, el reactivo de captura es una solución
de Helicobacter pylori que se aplica a la membrana de
reacción de la unidad de ensayo. Aunque se pueden enlazar soles de
colorante, soles de oro o partículas de látex coloreado a la
Proteína A para formar el reactivo indicador, la marca visual
preferida utilizada en el ejemplo de ensayo serán partículas de oro
coloidal. Usando un equipo que comprende la unidad de ensayo y la
unidad postfiltro, tal como el ilustrado en las Figuras 4 y 5, y
llevando a cabo el ensayo rápido en 2 etapas de la presente
invención, se puede realizar una determinación del anticuerpo
frente a Helicobacter pylori en una muestra de suero de
ensayo en menos de tres minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
El equipo (13), ilustrado en las Figuras 4 y 5
que comprende un cartucho de ensayo (14) y un tapón postfiltro
(15), representa un contenedor adecuado para alojar la unidad de
ensayo (2) y la unidad postfiltro (3) de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
El cartucho de ensayo, que aloja la unidad de
ensayo del dispositivo de ensayo rápido, se fabrica de plástico de
propileno blanco de calidad técnica transparente y tiene un
componente de parte superior (16) y parte inferior (17). Ambos se
fabrican en un molde de cavidad (16) sincronizada, construido
precisamente para permitir un ajuste encajado hermético cuando se
presionan los dos componentes conjuntamente. Se suministran los
componentes como encastres individuales por Top View International
Limited, Hong Kong, y se ensamblan en la planta de fabricación de
MedMira Laboratories, Halifax, Canadá. Estos componentes cumplen los
siguientes criterios:
- -
- Apariencia - una textura transparente, lisa y blanca del plástico.
- -
- Un ajuste de encaje para producir un alojamiento antigrietas para asegurar el confinamiento seguro de todos los líquidos aplicados.
- -
- Consistencia de dimensiones con las especificaciones de 2,5 cm de anchura, 3,5 cm de longitud, y 1,3 cm de altura.
- -
- Consistencia de dimensiones de la apertura del depósito (22) de 1,6 cm de diámetro y una profundidad formada en el cilindro de 0,5 cm.
- -
- Consistencia en la localización del depósito (22) en el componente superior del cartucho de ensayo (14).
\vskip1.000000\baselineskip
El material usado para la zona de reacción es
una membrana (21) tal como nitrocelulosa que tiene un tamaño
promedio de poro de 0,45 micrómetros (Whatman, Inglaterra) y cortada
a 12 mm x 12 mm. La membrana (21) es de nitrocelulosa respaldada
con papel de 0,2 mm de espesor y especialmente tratada para mejorar
el enlace de la proteína. Las especificaciones certificadas
proporcionadas por el fabricante (Whatman, Inglaterra) incluyen una
capacidad de enlace de 80-90 mg de
proteína/cm^{2}, un caudal de agua de 6 mL/min/cm^{2} y un punto
de burbuja de 3,5 bar. Se prepara la membrana de reacción (21) con
dos emplazamientos de ensayo inmunoreactivos, denominados zona
ensayo y zona control, cada zona producida en forma de línea
vertical distinta. La línea control y la línea ensayo se sitúan
perpendiculares, pero sin tocarse, entre sí para proporcionar una
diferenciación clara entre las dos. Se prepara la zona ensayo de la
membrana aplicando una solución de Helicobacter pylori en
tampón fosfato (pH 7 a 9,5) usando un dispositivo de impresión
(dispensador BioJet Quanti 3000). Se prepara de manera similar la
zona control aplicando una mezcla de preparación de antígeno
especialmente calibrada que enlaza con todos los tipos de
anticuerpos IgG ordinariamente presentes en una muestra biológica de
fluido de ensayo, sin reparar en el estado del anticuerpo IgG de
Helicobacter pylori, y de esta manera sirve como zona
control. Después que se seca la membrana a temperatura ambiente
durante 10 minutos, se trata ésta con una solución de albúmina de
suero bovino al 1% en tampón de fosfato de sodio 0,1 M y se deja
secar completamente a temperatura ambiente durante aproximadamente
24 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede producir una capa espaciadora (25) que
soporta la membrana de reacción (21) asegurando el perímetro
externo de la superficie superior de la membrana de reacción (21) a
la superficie inferior de la capa espaciadora (25) de tal manera
que se expone la superficie superior de la membrana de reacción (21)
a través de una apertura de la capa espaciadora (25). Se sella la
superficie superior de la membrana de reacción (21) con la
superficie inferior de la capa espaciadora con un adhesivo
resistente al fluido de tal manera que se forma un sello impermeable
entre el reborde (27) de la capa espaciadora (25), que define la
apertura (26), y la superficie superior sin exponer de la membrana
de reacción (21). Esta disposición ayuda a promover el flujo de
fluidos en dirección descendente, en oposición a la dirección
transversal, a través de la membrana de reacción (21) y en la
almohadilla absorbente (20) inferior. La capa espaciadora (25)
puede adquirirse con un adhesivo soluble en agua ya adherido a la
superficie inferior, o se puede aplicar el adhesivo durante el
proceso de fabricación. La capa espaciadora (25) es un material de
poliestireno inserto con una cinta de doble cara respaldada con
papel marrón (Halifax Holding Company, Nueva Escocia, Canadá). Se
asegura la membrana de reacción (21) a la capa espaciadora (25)
mediante la cinta de doble cara. La capa espaciadora ensamblada
(25) tiene aproximadamente de 29,0 mm x 25,0 mm de área y 1,0 mm de
espesor y se sitúa sobre la superficie superior de la almohadilla
absorbente (20) que se asienta sobre la base del cartucho de ensayo
(14) tal como se muestra en las Figuras 4 y 5.
\vskip1.000000\baselineskip
La zona absorbente comprende una almohadilla
(20) colocada directamente por debajo de la membrana de reacción
(21) asegurada en el interior del miembro inferior (17) del cartucho
de ensayo (14). La almohadilla (20) está compuesta por acetato de
celulosa espeso comprimido con una porosidad de 40 mL/min (Filtrona,
Richmond Inc., Richmond, VA). Se fabrica ésta de fibras sintéticas
sin el uso de resinas o adhesivos y proporciona un nivel excelente
de compatibilidad con el fluido acuoso. Se especifica el espacio
hueco al 80 a 85% y la absorción de líquidos en 6 veces el peso de
la unidad seca y hasta un 90% del volumen hueco total. Es resistente
al pH en el intervalo de 2,5 a 9,5. La almohadilla (20) se troquela
con una especificación de 2,2 cm de ancho, 3,2 cm de longitud y 0,5
cm de altura. La almohadilla (20) ajusta con seguridad en el
interior del miembro inferior (17) del cartucho de ensayo (14) de
tal manera que se crea un material compuesto comprimido de la
membrana de reacción (21) con la almohadilla absorbente (20) para
asegurar un continuum de comunicación fluida entre los materiales
porosos para mejorar la hidrodinámica y completar la absorción
cuando se aplican las muestras de ensayo a la membrana de reacción
(21).
\vskip1.000000\baselineskip
El tapón postfiltro (15), que aloja la unidad
postfiltro (3) del equipo de ensayo rápido (13), está comprendido
por un manguito exterior (29) que tiene un collar interno (34) en su
base, un manguito interior del (28) que tiene un asa (35) que se
extiende desde el anterior, y la unidad postfiltro (3). Los
manguitos del embudo (28, 29) y el asa (35) se moldean a partir de
un material plástico. Un material plástico preferido es resina de
poliestireno (Fouzhou Chimoplus Chemical Company Ltd., China). Los
manguitos del embudo externo (29) e interno (28) tienen forma
cilíndrica con un diámetro externo de 15,0 mm y 12,5 mm, de manera
respectiva, y el tapón ensamblado (15) encaja ajustado en el
depósito (22) del cartucho de ensayo (14). Se diseña el tapón
postfiltro (15) para conectarse con el depósito (22) del cartucho
de ensayo (14) tras la aplicación posterior de la muestra de ensayo
al depósito (22), y se retira poco tiempo después que se ha añadido
el tampón multifuncional y se ha difundido a través de la unidad de
postfiltro (3) del tapón del filtro (15). En la forma ensamblada, la
capacidad volumétrica del tapón postfiltro (15) es
aproximadamente
de 0,5 mL.
de 0,5 mL.
La zona de marca de la unidad postfiltro (3)
está comprendida por una capa de filtro permeada con reactivo
indicador que estará en comunicación fluida directa con la zona de
reacción de la unidad de ensayo (2) para mejorar la reactividad
posterior entre los anticuerpos del conjugado de oro coloidal y la
membrana de reacción recubierta con antígeno (21). El filtro está
comprendido por microfibras de vidrio con ligante OVA (Whatman,
GF/AVA) que es blanco y tiene un peso base de 48 g/m^{2}, un
espesor de 0,303 mm, un caudal de 150 s/1,5 cm, resistencia a la
tensión en seco de 640 g/1,5 cm, resistencia a la tensión en húmedo
de 324 g/1,5 cm y una porosidad de 3 s/100 mL/pulgada^{2}. Una
vez ensamblado, el conjugado de oro coloidal criocongelado se
reconstituye con una solución que comprende 0,1-0,15
mL de tampón PBS (cloruro de potasio 0,6-0,7 mM,
cloruro de sodio 0,03 M, hidrógeno ortofosfato de disodio anhidro
2-2,1 mM, monofosfato de potasio
0,3-0,4 mM) que contiene azúcar al 10%. La solución
del conjugado de oro coloidal se dispensa (0,1 a 0,15 mL) sobre cada
filtro y a continuación se seca a una temperatura de 37 a 40ºC. Se
troquela la capa de filtro de acuerdo con las siguientes
especificaciones: espesor, 790 a 830 micrómetros; porosidad, 1,6 a
2,0 s/100 mL/pulgada^{2}, resistencia a la tensión 14,5 N/55 mm;
caudal, 67 s/7,5 cm; absorbancia, 76,4%; tamaño de poro, 4,3
micrómetros; absorción 1,00 min:s; y diámetro, 0,42 mm.
\vskip1.000000\baselineskip
Cloruro de sodio 10% en agua DDI
\vskip1.000000\baselineskip
BSA al 1% en agua DDI, pH 5,00 a 9,00 (óptimo
6,00).
\vskip1.000000\baselineskip
Preparado hasta la etapa del pH.
\vskip1.000000\baselineskip
Concentración original diluida en DDI hasta una
concentración final de 0,1-2 mg/ml (óptimo 0,1
mg/mL)
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Preparar 9 diluciones en serie de Proteína A (PA).
- -
- A la PA, añadir la dilución de oro coloidal con el pH ya ajustado en una relación 1:10 (por ejemplo, a 0,1 mL de una dilución de PA añadir 1 mL de oro coloidal).
- -
- Incubar durante 10 minutos.
- -
- A cada tubo de dilución añadir cloruro de sodio a un 8-10% hasta una concentración final del 1% (óptimo 0,9%).
- -
- Incubar durante 5 minutos.
- -
- A cada tubo, añadir de nuevo albúmina de suero bovino a un 0,07-0,1% hasta una concentración final del 0,1% (óptimo 0,08%).
- -
- Leer la absorbancia a 520 nm.
- -
- La concentración correcta de proteína es la cantidad mínima que inhibirá la floculación.
Hughes D. A & J. E. Beesley (1998)
Preparation of Colloidal Gold Probes in (ed) J. D. Pound. Methods in
Molecular Biology vol 80: Immunochemical Protocols, 2ª edición.
Humana Press Inc, Totowa, N. J.
\vskip1.000000\baselineskip
- Citrato de sodio
- 0,3 mM en agua DDI
- BSA
- BSA al 1% en agua DDI, pH 5,00 a 9,00
- PEG
- Polietilenglicol al 1% (PM 15.000 a 20.000) en agua DDI, pH hasta 6,00
- Tampón fosfato
- Mezcla 0,04 M (en agua DI) de NaH_{2}PO_{4} en KH_{2}PO_{4} 0,07 M (en agua) en una relación 1:4,4; pH hasta 6,00
- Proteína A en tampón Hepes
- Proteína A en tampón Hepes (Hepes 0,025 M y Timerosal 0,25 mM) pH 7,00 en agua DDI) para dar una concentración final de 1 mg/mL
- Tampón borato
- 0,05 M de borato de sodio en agua DDI pH 8,50
\vskip1.000000\baselineskip
- Hidrógeno ortofosfato de disodio anhidro 8 mM
- Albúmina de suero bovino al 1%
- Azida de sodio 3 mM
- Polietilén glicol al 0,02%
- Cloruro de sodio 0,14-0,16 M
- Dihidrógeno ortofosfato de potasio 1,5 mM
- Cloruro de potasio 2,7 mM
- Ortofosfato de trisodio 4,3 mM
- Mezcla de los ingredientes anteriores en 1000 mL de agua DDI, pH 7,30 a 7,50.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Añadir ácido tetracloroáurico al 1% en agua para una concentración final de 0,01%.
- -
- Dejar que la solución alcance un punto de ebullición máximo.
- -
- Añadir 15 mL de citrato de sodio 0,3 mM y mantener a reflujo durante 30 minutos.
- -
- Retirar el matraz y dejar enfriar los contenidos hasta alrededor de 40ºC o menos.
- -
- Añadir 60 mL de tampón fosfato (mezcla 0,04 M de NaH_{2}PO_{4} (en agua DI) en KH_{2}PO_{4} 0,07 M (en agua) en una relación 1:4,4; pH hasta 6,00) o 50 mM de tampón borato (pH 8,50); ajustar el pH del oro coloidal a 6,00-9,00 (el óptimo es 6,00), si el pH es demasiado bajo, añadir gotas de K_{2}CO_{3} 2 mM.
- -
- Se elimina una parte de la solución para llevar a cabo un ensayo de agregación para conocer la concentración del ligando para añadir a la solución de oro.
- -
- Añadir la Proteína A con una concentración final de 5-9 \mug/mL + 5% (óptimo 6 + 0,3 = 6,3 \mug/mL)
\frac{[PA \
final + 5%](mg/L) \ x \ Volumen \ total \ en \ el \ matraz \
(L)}{[PA \
inicial](mg/mL)}
\vskip1.000000\baselineskip
- es decir,
- Volumen total = 500 mL de CG y dH2O + 15 mL de citrato de sodio + 60 mL de fosfato
- tampón - 3 mL de ensayo para el pH = 572 mL = 0,572 L
- \frac{(6 + 0,3)mg/L \ x \ 0.572L}{1 \ mg/mL} = 3,60 mL de Proteína A que se van a añadir
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Se deja proceder a la solución durante 15-30 minutos (óptimo 20 minutos)
- -
- Se detiene la absorción del ligando añadiendo albúmina de suero bovino al 10%, pH 5,00 a 9,00 concentración final de 0,1% agitar durante 5-15 minutos (óptimo 10 minutos).
- -
- Se centrifugó el oro coloidal marcado a una velocidad de 46.500 g (20.000 rpm) a una temperatura de 4-5 C durante 50 a 80 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Aspirar el sobrenadante con la ayuda de un
matraz de vacío, tener cuidado de no alterar el residuo. Volver a
suspender en tampón de resuspensión (o PBS-BSA)
hasta una densidad óptica final de 1,180 a 4,500 (óptimo 2,000) a
520 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de alcanzar la densidad óptica
apropiada, se relleno la solución en alícuotas de 0,6 mL en viales
de vidrio de 3 mL. Se insertaron tapones ranurados (1 mm de
diámetro) hasta la mitad en los viales y se transfirieron a las
bandejas del liofilizador. Se mantuvo una temperatura de -40 C
durante aproximadamente 5 horas. El secado primario se llevó a cabo
a vacío de menos de 100 mTorr con una temperatura en bandeja de -30
C durante aproximadamente 3 horas y una temperatura del condensador
de -80 C. Tras mantener esta temperatura en bandeja de -10 C
durante aproximadamente 5 horas, a continuación una temperatura en
bandeja de 0 C, vacío de 0 mTorr durante aproximadamente 2 horas.
Se lleva a cabo un secado secundario a +20 C durante aproximadamente
4 horas. Al final del proceso, se sellaron los viales bajo vacío
con los tapones ranurados. A continuación se retiró el producto de
las bandejas y se llevó a cabo el ensayo funcional para asegurar la
calidad del producto. Se mantuvieron las muestras para una
referencia posterior.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Preparar sacarosa al 1%, 2%, 5% y 10% en solución de PBS, pH 7,0-7,5.
- -
- Reconstituir el conjugado de oro coloidal criocongelado con a) 5 gotas (150 \muL) b) 10 gotas (350 \muL) y c) 15 gotas (650 \muL) con cada porcentaje de sacarosa.
- -
- Aplicar 5 gotas (150 \muL) de cada reconstitución al medio de filtración.
- -
- Dejar secar al aire completamente.
Una de las metas en el ensayo diagnóstico es
desarrollar un dispositivo de ensayo que requiera pocas etapas de
manipulación. Por tanto, asociando el reactivo indicador con el
medio de filtración de la unidad postfiltro (3), es posible
eliminar las etapas extra en las que se añaden los reactivos de
manera separada al dispositivo de diagnóstico durante el protocolo
de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Conjugado de oro coloidal, preparado y previamente criocongelado tal como se ha descrito anteriormente.
- -
- Azúcar, por ejemplo, trehalosa, lactosa, sacarosa, glucosa, maltosa, manosa, fructosa, etc.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Reconstituir el oro coloidal criocongelado con 0,1-0,15 mL de tampón PBS (cloruro de potasio 0,6-0,7 mM, cloruro de sodio 0,03 M, hidrógeno ortofosfato de disodio anhidro 2 -2,1 mM, monofosfato de potasio 0,3-0,4 mM) que contiene sacarosa al 10%.
- -
- Dispensar 0,1 a 0,15 mL de solución de oro coloidal sobre cada filtro.
- -
- Dejar secar el filtro al aire completamente a 37-40 C.
\vskip1.000000\baselineskip
- EDTA 0,01-0,1 M
- Azida de sodio 0,02 M
- Cloruro de sodio 0,05-0,1 M
- Hidrógeno ortofosfato de disodio anhidro 6 mM
- Timerosal 0,1-0,25 mM
- Triton®X-100 al 0,05-0,1%
- Clorhidrato de Trizma 0,02-0,03 M
- Tween-20 al 0,2-0,3%
- PVP-40 al 0,5-2,5%
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- Añadir todos los ingredientes conjuntamente (EDTA 0,01-0,1 M, azida de sodio 0,02 M, cloruro de sodio 0,05-0,1 M, hidrógeno ortofosfato de disodio anhidro 6 mM, Timerosal 0,1-0,25 mM, Triton®X-100 al 0,05-0,1%, Clorhidrato de Trizma 0,02-0,03 M, Tween-20 al 0,2-0,3%, PVP-40 al 0,5-2,5%).
- -
- Rellenar con agua DDI.
- -
- Ajustar el pH a 7,00 a 10,00.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando una pipeta limpia, se añadió una gota de
una muestra de suero o plasma al centro de la membrana de reacción
y se dejó absorber la muestra completamente a través de la membrana
y en la almohadilla de material absorbente. Se conectó el tapón
postfiltro al depósito del cartucho de ensayo de tal manera que la
unidad postfiltro estuvo en comunicación fluida con la unidad de
ensayo. Se añadieron posteriormente diez a quince gotas del tampón
multifuncional al embudo del tapón postfiltro. Después de una breve
incubación, aproximadamente 1 minuto, durante cuyo tiempo se hizo
pasar el conjugado de oro coloidal resolubilizado a través de la
unidad postfiltro, se retiró el tapón postfiltro del cartucho de
ensayo. Una(s) línea(s) coloreada(s)
distinta(s), una línea control vertical y una línea ensayo,
se desarrollaron en el centro de la membrana de reacción indicando
la presencia de Helicobacter pylori en la muestra de ensayo.
Los resultados del ensayo se revelaron en aproximadamente tres (3)
minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
El dispositivo de diagnóstico rápido, el ensayo
y el tampón multifuncional, así como el procedimiento, el kit de
ensayo y la formulación para generar el tampón multifuncional
mostrado en el presente documento proporcionan medios diagnósticos
mejorados para la detección de un analito diana en una muestra de
fluido.
\vskip1.000000\baselineskip
La lista de referencias citadas en la
solicitud es para conveniencia del lector, únicamente. No forman
parte del Documento de Patente Europea. Aunque se ha prestado
atención en la compilación de las referencias, no se pueden excluir
errores u omisiones, y la EP rechaza cualquier responsabilidad a
este respecto.
- \bullet US 4517288 A [0008] [0064]
- \bullet US 3902964 A, Greenspan [0088]
- \bullet US 4094647 A [0009]
- \bullet US 4477575 A, Vogel [0088]
- \bullet US 4235601 A [0009]
- \bullet US 4594372 A, Zuk [0088]
- \bullet US 4361537 A, Deutsch [0009]
- \bullet US 4753776 A, Hillman [0088]
- \bullet US 4960691 A, Gordon [0010]
- \bullet US 4816224 A, Vogel [0088]
- \bullet US 4168146 A, Grubb [0011]
- \bullet US 4933092 A, Aunet [0088]
- \bullet US 4632901 A, Valkirs [0012] [0064] [0083]
- \bullet US 5055195 A, Trasch [0088]
- \bullet US 4446232 A [0013]
- \bullet US 5064541 A, Jeng [0088]
- \bullet US 5879951 A [0017] [0019]
- \bullet US 5076925 A, Roesink [0088]
- \bullet US 5877028 A [0017]
- \bullet US 5118428 A, Sand [0088]
- \bullet WO 0155723 A [0017]
- \bullet US 5118472 A, Tanaka [0088]
- \bullet EP 0806666 A [0017]
- \bullet US 5130258 A, Makino [0088]
- \bullet US 5185264 A [0019]
- \bullet US 5135719 A, Hillman [0088]
- \bullet US 4087567 A [0019]
- \bullet US 5209904 A, Forney [0088]
- \bullet US 4515893 A, Kung [0044]
- \bullet US 5212060 A, Maddox [0088]
- \bullet US 3996345 A, Ullman [0048]
- \bullet US 5240862 A, Koenhen [0088]
- \bullet US 4670381 A [0064]
- \bullet US 5262067 A, Wilk [0088]
- \bullet US 4666863 A [0064]
- \bullet US 5306623 A, Kiser [0088]
- \bullet US 4459361 A [0064]
- \bullet US 5364533 A, Ogura [0088]
- \bullet US 4552839 A [0064]
- \bullet US 5397479 A, Kass [0088]
- \bullet US 4340479 A [0070]
- \bullet US 4954452 A, Yost [0102]
- \bullet US 4066512 A [0070]
- \bullet US 4373932 A, Gribnau [0102]
- \bullet US 4246339 A [0070]
- \bullet WO 8808534 A, May [0102]
- \bullet US 4186146 A [0075]
- \bullet EP 0280559 A [0102]
- \bullet US 4376110 A [0075]
- \bullet EP 0281327 A [0102]
- \bullet US 4452901 A [0075]
- \bullet US 4703017 A, Campbell [0102]
- \bullet US 5541059 A, Chu [0080]
- \bullet US 4166105 A [0102]
- \bullet US 5185127 A [0083]
- \bullet US 4313734 A [0102] [0103]
- \bullet US 5006464 A [0083] [0146]
- \bullet DE 4132133 [0102]
- \bullet US 4818677 A [0083]
- \bullet EP 158746 A, Moeremans [0102]
- \bullet US 3888629 A [0083]
- \bullet US 4366241 A, Tom [0150]
\bullet US 3768978 A, Grubb [0088]
\vskip1.000000\baselineskip
\bulletWANDS, J. R.; V. R.
ZURAWSKI. Gastroenterology, 1981, vol. 80, 225
[0044]
\bulletMARSHAK-ROTHSTEIN, A. y col. J.
Immunol., 1979, vol. 122, 2491 [0044]
\bullet Immunoglobulin Producing Hybrid.
OI, V. Y.; L. A. HERZENBERG. Selected Methods in
Cellular Immunology. W.H. Freeman Publishing, 1979
[0044]
\bulletHERMANSON, G.T. Bioconjugate
Techniques. Academia Press, 1996 [0050]
\bulletPOLSKY-CYNKIN,
R. y col. Clin. Chem., 1985, vol. 31 (9), 1438
[0051]
\bulletIMAN; HORNBY. Biochemical
Journal, vol. 129, 255 [0075]
\bulletTANG y col. Nature,
1992, vol. 356, 152-154 [0102]
\bulletEISENBRAUN y col. DNA and
Cell Biology, 1993, vol. 12, 791-797
[0102]
\bullet G. FRENS. Nature,
1973, vol. 241, 20-22 [0104]
\bulletFRENS. Nature,
1973, vol. 241, 20-23 [0108]
\bulletHORISBERGER. Evaluation of
Colloidal Gold as a Cytochromic Marker for Transmission and Scanning
Electron Microscopy. Biol. Cellulaire, 1979, vol. 36,
253-258 [0111]
\bulletLEUVERING y col. Sol Particle
Immunoassay. J. Immunoassay, 1980, vol. 1 (1),
77-91 [0111]
\bulletCAMPBELL; HORNBY; MORRIS.
Biochem. Biophys. Acta, 1975, vol. 384, 307 [0075]
\bulletMATTISSON; NILSSON. F.E.B.S.
letters, 1977, vol. 104, 78 [0075]
\bulletKOHLER; MILSTEIN.
Nature, 1975, vol. 256, 495-497
[0079]
\bulletKENNET, R. y col. Monoclonal
Antibodies. Plenum Press, 1980,
365-367 [0079]
\bulletLEUVERING y col. Sol Particle
Immunoassay (SPIA. Journal of Immunoassay, 1980, vol.
1 (1), 77-91 [0102]
\bulletUDA y col. Anal.
Biochem., 1994, vol. 218, 259-264
[0102]
\bulletFRENS. Controlled Nucleation
for the Regulation of the Particle Size in Monodisperse Gold
Suspensions. Nature, Physical Science, 1973, vol. 241,
20-22 [0111]
\bulletSUREK y col. Biochem, and
Biophys. Res. Comm., 1984, vol. 121,
284-289 [0111]
\bullet Preparation of Colloidal Gold Probes.
HUGHES D.A; J. E. BEESLEY. Methods in Molecular
Biology. Humana Press Inc, 1998, vol. 80 [0170]
Claims (58)
1. Un dispositivo de ensayo (1) de flujo
descendente o vertical para determinar la presencia o ausencia de un
analito diana (10) en una muestra de fluido de ensayo (9), que
comprende:
- -
- una unidad de ensayo (2) que comprende una zona de reacción (5) en comunicación vertical con una zona absorbente (4), en el que la zona de reacción (5) contiene el reactivo de captura inmovilizado (6) capaz de enlazarse con un analito diana (10) de interés para formar un complejo de dos miembros de una interacción de enlace específico y la zona absorbente comprende un material absorbente colocado por debajo de la zona de reacción para facilitar el flujo de fluido descendente o vertical a través de la zona de reacción; y
- -
- una unidad de post-filtro (3) que se puede retirar que comprende una zona marcada (7) que contiene un reactivo indicador seco (8), en el que el reactivo indicador (8) es capaz de enlazarse con un miembro de la interacción de enlace específico para producir una señal visualmente detectable tras la resolubilización del anterior mediante el reactivo tampón (12); y
caracterizado en que la unidad de
post-filtro (3) se coloca en proximidad de la unidad
de ensayo (2) tras la formación del complejo de dos miembros de
forma que la zona de reacción (5) de la unidad de ensayo (2) y la
zona marcada (7) de la unidad de post-filtro (3)
permiten el flujo directo descendente o vertical del reactivo
indicador (8) resolubilizado desde la zona marcada (7) hasta la zona
de reacción (5) tras la aplicación del reactivo tampón (12) a la
zona marcada (7).
2. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado en que la interacción de
enlace específico es una interacción
anticuerpo-antígeno.
3. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado en que el reactivo indicador
(8) es capaz de enlazarse con un analito diana (10) en un punto en
el que no interfiere con la interacción de enlace específico entre
el analito diana (10) y el reactivo de captura (6).
4. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado en que el reactivo indicador
(8) es capaz de enlazarse con el reactivo de captura (6) en un punto
en que interfiere con la interacción de enlace específico entre el
analito diana (10) y el reactivo de captura (6).
5. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 2, caracterizado en que el analito diana (10)
es un antígeno y el reactivo de captura (6) es un anticuerpo
monoclonal o un anticuerpo policlonal purificado por afinidad para
el antígeno.
6. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado en que la zona de reacción
(5) está compuesta por un material que tiene un tamaño de poro que
permite la separación y filtración de los componentes no enlazados
de la muestra de fluido de ensayo (9) y un espesor que permite que
una cantidad adecuada de reactivo de captura (6) se inmovilice en el
anterior.
7. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 6, caracterizado en que el material tiene un
tamaño de poro comprendido entre aproximadamente 0,1 y 12,0
micrómetros.
8. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 7, caracterizado en que el material tiene un
tamaño de poro comprendido entre 0,2 y 0,8 micrómetros.
9. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 6, caracterizado en que el espesor del
material está comprendido entre 0,05 mm y 3,0 mm.
10. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 9, caracterizado en que el espesor del
material está comprendido entre 0,1 y 1,0 mm.
11. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 6, caracterizado en que el material es una
membrana de nitrocelulosa.
12. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado en que la zona de reacción
(5) contiene dos o más reactivos de captura (6) diferentes
inmovilizados en el anterior en zonas distintas y discernibles de
forma que
se puedan analizar de manera simultánea múltiples analitos diana (10) en una única muestra de fluido de ensayo (9).
se puedan analizar de manera simultánea múltiples analitos diana (10) en una única muestra de fluido de ensayo (9).
13. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado en que la zona de reacción
(5) comprende además un reactivo de control en una zona discernible
y separada de la del reactivo de captura (6).
14. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado en que la zona absorbente (4)
está separada de la zona de reacción (5) por una capa separadora
intermedia (25) que tiene una o más aperturas definidas en la
anterior para permitir la comunicación fluida entre la zona de
reacción (5) y la zona absorbente (4).
15. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 14, caracterizado en que la capa separadora
(25) es un material rígido o semirrígido resistente a fluidos.
16. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado en que la zona absorbente (4)
comprende una o más capas de un material que es capaz de absorber un
fluido por capilaridad y absorber un volumen sustancial de
fluido.
17. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 16, caracterizado en que dos o más capas
comprenden materiales idénticos o diferentes.
18. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 16, caracterizado en que el material es
acetato de celulosa.
19. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado en que la zona marcada (7)
comprende un material de filtro que tiene un tamaño de poro capaz de
permitir que el reactivo indicador (8) seco se resolubilice de forma
efectiva mediante el reactivo tampón y transferirse a la zona de
reacción (5) mediante flujo laminar del
fluido.
fluido.
20. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 19, caracterizado en que el material del
filtro es un material de fibra de vidrio.
21. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado en que el reactivo indicador
(8) comprende una marca directa.
22. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 21, caracterizado en que la marca directa es
oro coloidal.
23. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado en que dicha unidad de ensayo
(2) y dicha unidad de post-filtro (3) están
contenidas en un alojamiento adecuado.
24. El dispositivo (1) de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado en
que dicha unidad de ensayo (2) se adapta para determinar la
presencia o ausencia de un analito diana (10) en una muestra de
ensayo de sangre total (9N) y que comprende además una zona de
separación de sangre (100) en comunicación transversal con la zona
de reacción (5) en la que la zona de separación de sangre (100)
tiene un primer extremo (101) que define una región para recibir la
una muestra de ensayo de sangre total (9N) y un segundo extremo
(102) en comunicación directa con la zona de reacción (5).
25. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 24, caracterizado en que la zona de separación
de sangre (100) comprende un material capaz de retener de manera
selectiva una cantidad efectiva de glóbulos rojos (RBC) de la
muestra de ensayo de sangre total (9N) para generar una porción de
fluido sustancialmente libre de RBC que puede fluir con movimiento
desequilibrado desde el primer extremo (101) de la zona de
separación de sangre (100) hasta la zona de reacción (5).
26. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 25, caracterizado en que el material es una
matriz de fibra de vidrio.
27. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 25, caracterizado en que el material comprende
un vehículo hidrófobo capaz de reducir las pérdidas de la muestra de
ensayo de sangre total (9N) y de la porción de fluido libre de RBC a
medida que migra a lo largo de la zona de separación de sangre
(100).
28. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 24, caracterizado en que la unidad de ensayo
(2) y la unidad de post-filtro (3) se alojan en un
recipiente adecuado.
29. El dispositivo (1) de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, caracterizado en
que dicho reactivo tampón (12) es un tampón multifuncional que
comprende: un tampón biológico para mantener el pH entre 7,0 y 10,0;
al menos un tensioactivo para reducir el enlace no específico de los
reactivos de ensayo mientras que a la vez evita la inhibición de la
interacción de enlace específico; un polímero de alto peso molecular
como reactivo de dispersión y suspensión que tiene un peso molecular
comprendido en el intervalo entre 2 X 10^{2} y 2 X 10^{6} D; un
estabilizador de pH para mantener el pH entre el intervalo de pH 7,0
a 10,0; una sal iónica para reducir el enlace no específico de
anticuerpos; al menos un conservante para reducir el crecimiento
biológico y microbiano, y un quelante del calcio para evitar la
coagulación de la muestra de ensayo de sangre total; en el que el
tampón biológico, el tensioactivo, el polímero de alto peso
molecular, el estabilizador de pH, la sal iónica, el conservante y
el quelante del calcio están todos en concentraciones efectivas.
30. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 29, caracterizado en que la concentración del
tampón biológico está comprendida entre 5 y 100 mM.
31. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 30, caracterizado en que la concentración del
tampón biológico está comprendida entre 5 y 30 mM.
32. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 31, caracterizado en que la concentración del
tampón biológico es de 5 mM.
33. El dispositivo (1) de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, caracterizado en
que el tampón biológico es un tampón fosfato.
34. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 29, caracterizado en que la concentración del
tensioactivo está comprendida entre 0,01 y 0,50% (p/v).
35. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 34, caracterizado en que la concentración del
tensioactivo está comprendida entre 0,05 y 0,10% (p/v).
36. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 35, caracterizado en que la concentración del
tensioactivo es 0,07% (p/v).
37. El dispositivo (1) de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 29 y 34 a 36,
caracterizado en que el tensioactivo es
Triton^{7}X-100.
38. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 29, caracterizado en que la concentración de
sal iónica está comprendida entre 0 a 300 mM.
39. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 38, caracterizado en que la concentración de
sal iónica está comprendida entre 50 a 200 mM.
40. El dispositivo (1) de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 29, 38 y 39, caracterizado
en que la sal iónica es cloruro de sodio.
41. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 29, caracterizado en que el polímero es
polivinilpirrolidona que tiene un peso molecular comprendido en el
intervalo entre aproximadamente 10 kD y aproximadamente 1500 kD.
42. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 41, caracterizado en que la concentración de
polímero de polivinilpirrolidona es de 0,1 a 3,0% (p/v).
43. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 42, caracterizado en que la concentración de
polímero de polivinilpirrolidona es de 0,5 a 2,5% (p/v).
44. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 43, caracterizado en que la concentración de
polímero de polivinilpirrolidona es de 1,4% (p/v).
45. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 29, caracterizado en que el quelante del
calcio es EDTA.
46. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 45, caracterizado en que la concentración de
EDTA está comprendida entre 5,0 a 100,0 mM.
47. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 46, caracterizado en que la concentración de
EDTA está comprendida entre 10,0 a 50,0 mM.
48. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 47, caracterizado en que la concentración de
EDTA es 20,0 mM.
49. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 29, caracterizado en que el estabilizador de
pH es tampón tris.
50. El dispositivo (1) de acuerdo con la
reivindicación 49, caracterizado en que la concentración del
estabilizador de pH está comprendida entre 20 a 30 mM.
51. Un procedimiento para determinar la
presencia o ausencia de un analito diana (10) en una muestra de
fluido de ensayo (9), que comprende las etapas de:
- -
- depositar la muestra de fluido de ensayo (9) sobre la zona de reacción (5) de la unidad de ensayo (2) del dispositivo (1) de flujo descendente o vertical definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23;
- -
- dejar que la muestra de fluido de ensayo (9) fluya a través de la zona de reacción (5) hasta la zona absorbente (4);
- -
- ajustar la unidad de post-filtro (3) a la unidad de ensayo (2) de forma que la zona marcada (7) de la unidad de post-filtro (3) y la zona de reacción (5) de la unidad de ensayo (2) se dispongan en cercanía de forma que se permita el flujo descendente o vertical directo desde la zona marcada (7) hasta la zona de reacción (5);
- -
- aplicar el reactivo tampón (12) a la unidad de post-filtro (3) para reconstituir el reactivo indicador (8) seco;
- -
- dejar que el reactivo indicador reconstituido fluya a través de la zona de reacción (5) hasta la zona absorbente (4), lavando cualquier reactivo no enlazado de la zona de reacción (5) hasta la zona absorbente (4); y
- -
- retirando la unidad de post-filtro (3) para observar el resultado del ensayo representado por la presencia o ausencia de una señal visualmente detectable en la zona de reacción (5).
52. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 51, caracterizado en que el reactivo tampón
(12) es un tampón multifuncional que comprende: un tampón biológico
para mantener el pH entre 7,0 a 10,0; al menos un tensioactivo para
reducir el enlace no específico de los reactivos de ensayo mientras
que a la vez evita la inhibición de la interacción de enlace
específico; un polímero de alto peso molecular como reactivo de
dispersión y suspensión que tiene un peso molecular comprendido en
el intervalo entre 2 X 10^{2} a 2 X 10^{6} D; un estabilizador
de pH para mantener el pH entre el intervalo de pH 7,0 a 10,0; una
sal iónica para reducir el enlace no específico de anticuerpos; al
menos un conservante para reducir el crecimiento biológico y
microbiano, y un quelante del calcio para evitar la coagulación de
la muestra de ensayo de sangre total; en el que el tampón biológico,
el tensioactivo, el polímero de alto peso molecular, el
estabilizador de pH, la sal iónica, el conservante y el quelante del
calcio están todos en concentraciones
efectivas.
efectivas.
53. Un procedimiento para determinar la
presencia o ausencia de un analito diana (10) en una muestra de
ensayo de sangre total (9N), que comprende las etapas de:
- -
- depositar la muestra de ensayo de sangre total (9N) sobre el primer extremo (101) de la zona de separación de sangre (100) del dispositivo (1) definido en una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28;
- -
- dejar que la muestra de ensayo de sangre total (9') fluya transversalmente a lo largo de la zona de separación de sangre (100) con la muestra libre de glóbulos rojos alcanzando la zona de reacción (5);
- -
- dejar que la muestra libre de glóbulos rojos fluya verticalmente o de forma descendente a través de la zona de reacción (5) hasta la zona absorbente (4);
- -
- ajustar la unidad de post-filtro (3) a la unidad de ensayo (2) de forma que la zona marcada (7) de la unidad de post-filtro (3) y la zona de reacción (5) de la unidad de ensayo (2) se dispongan en cercanía de forma que se permita el flujo descendente o vertical directo desde la zona marcada (7) hasta la zona de reacción (5);
- -
- aplicar el reactivo tampón (12) a la unidad de post-filtro (3) para reconstituir el reactivo indicador (8) seco;
- -
- dejar que el reactivo indicador reconstituido fluya a través de la zona de reacción (5) hasta la zona absorbente (4), lavando cualquier reactivo no enlazado de la zona de reacción (5) hasta la zona absorbente (4); y
- -
- retirando la unidad de post-filtro (3) para observar el resultado del ensayo representado por la presencia o ausencia de una señal visualmente detectable en la zona de reacción.
54. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 53, caracterizado en que el reactivo tampón
(12) es un tampón multifuncional que comprende: un tampón biológico
para mantener el pH entre 7,0 a 10,0; al menos un tensioactivo para
reducir el enlace no específico de los reactivos de ensayo mientras
que a la vez evita la inhibición de la interacción de enlace
específico; un polímero de alto peso molecular como reactivo de
dispersión y suspensión que tiene un peso molecular comprendido en
el intervalo entre 2 X 102 a 2 X 106 D; un estabilizador de pH para
mantener el pH entre el intervalo de pH 7,0 a 10,0; una sal iónica
para reducir el enlace no específico de anticuerpos; al menos un
conservante para reducir el crecimiento biológico y microbiano, y un
quelante del calcio para evitar la coagulación de la muestra de
ensayo de sangre total; en el que el tampón biológico, el
tensioactivo, el polímero de alto peso molecular, el estabilizador
de pH, la sal iónica, el conservante y el quelante del calcio están
todos en concentraciones
efectivas.
efectivas.
55. Un kit de ensayo para uso en la detección de
un analito diana (10) en una muestra de fluido de ensayo (9) o una
muestra de ensayo de sangre total (9N) sospechosa de contener el
analito (10), caracterizado por:
- -
- Un dispositivo (1) definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28; y
- -
- Un reactivo tampón (12) para reconstituir el reactivo indicador (8) seco y lavar cualesquiera reactantes no ligados de la zona de reacción (5).
56. El kit de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 55, caracterizado en que el reactivo tampón es
un tampón multifuncional que comprende: un tampón biológico para
mantener el pH entre 7,0 a 10,0; al menos un tensioactivo para
reducir el enlace no específico de los reactivos de ensayo mientras
que a la vez evita la inhibición de la interacción de enlace
específico; un polímero de alto peso molecular como reactivo de
dispersión y suspensión que tiene un peso molecular comprendido en
el intervalo entre 2 X 102 a 2 X 106 D; un estabilizador de pH para
mantener el pH entre el intervalo de pH 7,0 a 10,0; una sal iónica
para reducir el enlace no específico de anticuerpos; al menos un
conservante para reducir el crecimiento biológico y microbiano, y un
quelante del calcio para evitar la coagulación de la muestra de
ensayo de sangre total (9N); en el que el tampón biológico, el
tensioactivo, el polímero de alto peso molecular, el estabilizador
de pH, la sal iónica, el conservante y el quelante del calcio están
todos en concentraciones efectivas.
57. El kit de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 55, que comprende además:
- -
- Instrucciones para llevar a cabo el ensayo diagnóstico; y
- -
- Un par de pipetas para aplicar de manera separada la muestra de ensayo (9) y el reactivo tampón (12) a la unidad de ensayo (2) y a la unidad de post-filtro (3), respectivamente.
58. El kit de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 55, caracterizado en que la unidad de ensayo
(2) y la unidad de post-filtro (3) se alojan en un
recipiente adecuado.
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|---|---|---|---|
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Families Citing this family (103)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1334349B1 (en) * | 2000-10-18 | 2012-03-07 | Art & Science, Inc. | Method for diluting a fluid and detecting analytes within a diluted fluid |
| US7531362B2 (en) * | 2001-06-07 | 2009-05-12 | Medmira Inc. | Rapid diagnostic assay |
| US7205159B2 (en) * | 2001-08-20 | 2007-04-17 | Proteome Systems Intellectual Property Pty Ltd. | Diagnostic testing process and apparatus |
| AU2002350271B2 (en) * | 2001-12-12 | 2008-07-31 | Proteome Systems Ltd | Diagnostic testing process |
| ATE358274T1 (de) * | 2001-12-12 | 2007-04-15 | Proteome Systems Intellectual | Diagnostisches testverfahren |
| US7556660B2 (en) | 2003-06-11 | 2009-07-07 | James Kevin Shurtleff | Apparatus and system for promoting a substantially complete reaction of an anhydrous hydride reactant |
| DE10330983A1 (de) * | 2003-07-09 | 2005-01-27 | Prisma Diagnostika Gmbh | Vorrichtung für Lateral-Fluss-Tests |
| US7723099B2 (en) * | 2003-09-10 | 2010-05-25 | Abbott Point Of Care Inc. | Immunoassay device with immuno-reference electrode |
| US7378451B2 (en) * | 2003-10-17 | 2008-05-27 | 3M Innovative Properties Co | Surfactant composition having stable hydrophilic character |
| DE10350880A1 (de) * | 2003-10-31 | 2005-06-02 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren zur Bestimmung eines Analyten mittels einer Extraktionsschicht |
| US7410808B1 (en) * | 2003-12-08 | 2008-08-12 | Charm Sciences, Inc. | Method and assay for detection of residues |
| AU2003300109A1 (en) * | 2003-12-30 | 2005-08-03 | Calypte Biomedical Corporation | Rapid test for antibodies against hiv in urine |
| EP1566640A1 (en) * | 2004-02-18 | 2005-08-24 | Ani Biotech Oy | Sampling device, the method and use thereof |
| US20050186110A1 (en) * | 2004-02-20 | 2005-08-25 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Multilayer analysis element |
| FI20040825A0 (fi) * | 2004-06-15 | 2004-06-15 | Ani Biotech Oy | Suodatinväline, sen käyttö, menetelmä ja kitti |
| CA2583406A1 (en) * | 2004-09-20 | 2007-01-04 | Boston Microfluidics | Microfluidic device for detecting soluble molecules |
| NZ555339A (en) * | 2004-11-24 | 2010-03-26 | Techlab Inc | Device and method for detection of analytes |
| US8148057B2 (en) * | 2005-06-21 | 2012-04-03 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Methods, immunoassays and devices for detection of anti-lipoidal antibodies |
| CN101243321A (zh) * | 2005-06-21 | 2008-08-13 | 美国政府健康及人类服务部，疾病控制和预防中心 | 用于检测抗-类脂抗体的方法、免疫测定法和装置 |
| US20080020260A1 (en) * | 2005-11-12 | 2008-01-24 | Brydon Chris A | Apparatus, system, and method for manifolded integration of a humidification chamber for input gas for a proton exchange membrane fuel cell |
| GB2435510A (en) * | 2006-02-23 | 2007-08-29 | Mologic Ltd | Enzyme detection product and methods |
| GB2435512A (en) | 2006-02-23 | 2007-08-29 | Mologic Ltd | A binding assay and assay device |
| GB2435511A (en) | 2006-02-23 | 2007-08-29 | Mologic Ltd | Protease detection |
| US7651542B2 (en) | 2006-07-27 | 2010-01-26 | Thulite, Inc | System for generating hydrogen from a chemical hydride |
| EP1882939A1 (en) * | 2006-07-27 | 2008-01-30 | The Jordanian Pharmaceutical Manufacturing Co. | Urinary immunochromatographic antigen detection cup |
| US7648786B2 (en) | 2006-07-27 | 2010-01-19 | Trulite, Inc | System for generating electricity from a chemical hydride |
| US7749775B2 (en) * | 2006-10-03 | 2010-07-06 | Jonathan Scott Maher | Immunoassay test device and method of use |
| EP1933145B1 (en) * | 2006-12-11 | 2011-09-28 | AraGen Biotechnology Co. Ltd. | Rapid immunochromatographic detection by amplification of the colloidal gold signal |
| NL1033365C2 (nl) * | 2007-02-09 | 2008-08-12 | Medavinci Dev B V | Inrichting en werkwijze voor scheiden en analyseren van bloed. |
| US8357214B2 (en) | 2007-04-26 | 2013-01-22 | Trulite, Inc. | Apparatus, system, and method for generating a gas from solid reactant pouches |
| US8178353B2 (en) * | 2007-05-31 | 2012-05-15 | General Electric Company | Method for determination of polymer concentration in water systems |
| CN101855769A (zh) | 2007-07-25 | 2010-10-06 | 特鲁丽特公司 | 管理混合电力的产生及应用的装置、系统和方法 |
| US20090029227A1 (en) * | 2007-07-25 | 2009-01-29 | John Patton | Apparatus, system, and method for securing a cartridge |
| US8021873B2 (en) * | 2008-07-16 | 2011-09-20 | Boston Microfluidics | Portable, point-of-care, user-initiated fluidic assay methods and systems |
| US20110117673A1 (en) * | 2008-07-16 | 2011-05-19 | Johnson Brandon T | Methods and systems to collect and prepare samples, to implement, initiate and perform assays, and to control and manage fluid flow |
| WO2010011860A1 (en) * | 2008-07-23 | 2010-01-28 | Diabetomics, Llc | Methods for detecting pre-diabetes and diabetes |
| US8053239B2 (en) * | 2008-10-08 | 2011-11-08 | The Governing Council Of The University Of Toronto | Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation from heterogeneous mixtures |
| WO2010043044A1 (en) * | 2008-10-17 | 2010-04-22 | Medmira Inc. | Downward or vertical flow diagnostic device and assay |
| WO2010074265A1 (ja) | 2008-12-25 | 2010-07-01 | ユニバーサル・バイオ・リサーチ株式会社 | 検体の前処理方法、および生体関連物質の測定方法 |
| WO2010132447A2 (en) | 2009-05-11 | 2010-11-18 | Diabetomics, Llc | Methods for detecting pre-diabetes and diabetes using differential protein glycosylation |
| US8012770B2 (en) | 2009-07-31 | 2011-09-06 | Invisible Sentinel, Inc. | Device for detection of antigens and uses thereof |
| MX2012004105A (es) | 2009-10-09 | 2012-09-07 | Invisible Sentinel Inc | Dispositivo para deteccion de antigenos y usos del mismo. |
| US8105843B2 (en) * | 2009-11-04 | 2012-01-31 | Buchanan Thomas M | Methods and devices to enhance sensitivity and evaluate sample adequacy and reagent reactivity in rapid lateral flow immunoassays |
| KR101271022B1 (ko) * | 2009-11-24 | 2013-06-04 | 주식회사 인포피아 | 다공성 필름이 부착되어 있는 멤브레인 바이오센서 및 이를 이용한 면역반응 또는 효소반응 측정방법 |
| JP4578570B1 (ja) * | 2010-01-08 | 2010-11-10 | 田中貴金属工業株式会社 | イムノクロマトグラフィー用試薬組成物 |
| WO2013040142A2 (en) | 2011-09-16 | 2013-03-21 | Iogenetics, Llc | Bioinformatic processes for determination of peptide binding |
| EP2550529B1 (en) | 2010-03-23 | 2021-11-17 | Iogenetics, LLC. | Bioinformatic processes for determination of peptide binding |
| PT2566949T (pt) | 2010-05-06 | 2023-05-18 | Charm Sciences Inc | Aparelho leitor e incubador |
| WO2011156687A1 (en) * | 2010-06-11 | 2011-12-15 | Serigene, Llc | Apparatus for fluidic sample processing |
| US8956859B1 (en) | 2010-08-13 | 2015-02-17 | Aviex Technologies Llc | Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines |
| US9575084B1 (en) * | 2010-08-25 | 2017-02-21 | Thomas W. Astle | Dried specimen storage slide |
| US9150983B1 (en) | 2012-05-02 | 2015-10-06 | Thomas W. Astle | Automated dried blood spot system and method |
| US9546935B1 (en) | 2010-08-25 | 2017-01-17 | Thomas W. Astle | Dried specimen storage slides, systems and methods |
| JP5694726B2 (ja) * | 2010-09-30 | 2015-04-01 | 富士フイルム株式会社 | 検査方法および装置 |
| FR2967497B1 (fr) * | 2010-11-17 | 2014-12-12 | Biomerieux Sa | Dispositif et procede pour immunoessais |
| US20120302456A1 (en) * | 2010-11-23 | 2012-11-29 | President And Fellows Of Harvard College | Vertical flow-through devices for multiplexed elisa driven by wicking |
| EP2668501B1 (en) | 2011-01-27 | 2019-06-12 | Invisible Sentinel, Inc. | Analyte detection devices, multiplex and tabletop devices for detection of analytes, and uses thereof |
| DE102011082716A1 (de) * | 2011-09-14 | 2013-03-14 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Indikatorelement mit einer von einer in kontakt zu bringenden substanz abhängigen farbgebung |
| BR112014010718B1 (pt) | 2011-11-16 | 2020-12-22 | Becton, Dickinson And Company | métodos, sistemas, dispositivos e kits para detecção de analito em amostra |
| EP3418397B1 (en) | 2012-01-24 | 2020-10-07 | CD Diagnostics, Inc. | System for detecting infection in synovial fluid |
| EP3415919B1 (en) | 2012-02-07 | 2020-07-29 | Intuitive Biosciences Inc. | Mycobacterium tuberculosis specific peptides for detection of infection or immunization in non-human primates |
| US20130224770A1 (en) * | 2012-02-29 | 2013-08-29 | General Electric Company | Antibody Diluent Buffer |
| EP2823308B1 (en) | 2012-03-09 | 2019-05-22 | Invisible Sentinel, Inc. | Methods and compositions for detecting multiple analytes with a single signal |
| US9480966B2 (en) | 2012-04-30 | 2016-11-01 | General Electric Company | Substrates and methods for collection, stabilization and elution of biomolecules |
| US9044738B2 (en) | 2012-04-30 | 2015-06-02 | General Electric Company | Methods and compositions for extraction and storage of nucleic acids |
| US9040675B2 (en) | 2012-04-30 | 2015-05-26 | General Electric Company | Formulations for nucleic acid stabilization on solid substrates |
| US9040679B2 (en) | 2012-04-30 | 2015-05-26 | General Electric Company | Methods and compositions for extraction and storage of nucleic acids |
| GB201302292D0 (en) * | 2013-02-08 | 2013-03-27 | Whatman Gmbh | Medical diagnostic test systems,and a matrix therefor |
| US9506904B2 (en) | 2013-04-03 | 2016-11-29 | Halliburton Energy Services, Inc. | Device for measuring the amount of free fluid in a colloid in a horizontal position |
| CA2915149C (en) * | 2013-06-12 | 2019-02-05 | The Governing Council Of The University Of Toronto | Catalytic nucleic acid and gold nanoparticles for detection of biomolecules |
| GB201405770D0 (en) | 2014-03-31 | 2014-05-14 | Whatman Gmbh | Improvements in and relating to lateral flow testing |
| WO2016122986A1 (en) * | 2015-01-26 | 2016-08-04 | Polymer Technology Systems, Inc. | Systems, compositions, and methods of lipid panel test controls utilizing particles that mimic hematocrit |
| US20160313320A1 (en) * | 2015-04-23 | 2016-10-27 | Ted Titmus | Mechanical attachment of test pads to a diagnostic test strip |
| CA2983732A1 (en) | 2015-04-23 | 2016-10-27 | Board Of Regents Of The Nevada System Of Higher Education, On Behalf Of The University Of Nevada, Reno | Fungal detection using mannan epitope |
| CN107923913A (zh) * | 2015-07-23 | 2018-04-17 | 根蒂安诊断公司 | 评估血细胞的细胞表面受体的方法 |
| AU2016301231A1 (en) | 2015-08-04 | 2018-02-22 | Cd Diagnostics, Inc. | Methods for detecting adverse local tissue reaction (ALTR) necrosis |
| ES2818569T3 (es) | 2015-09-09 | 2021-04-13 | Drawbridge Health Inc | Métodos para la recopilación, estabilización y conservación de muestras |
| EP3387154A4 (en) | 2015-12-09 | 2019-05-15 | Intuitive Biosciences, Inc. | AUTOMATED SILVER ENHANCEMENT SYSTEM |
| US11119102B1 (en) | 2016-02-16 | 2021-09-14 | Charm Sciences, Inc. | Test device, method, and assembly |
| WO2017147186A1 (en) | 2016-02-22 | 2017-08-31 | Ursure, Inc. | System and method for detecting therapeutic agents to monitor adherence to a treatment regimen |
| EP3427049A4 (en) * | 2016-03-07 | 2019-10-16 | Nanodx Healthcare Pvt. Ltd. | DOSAGE AND KIT FOR ENDOTOXIN DETECTION |
| US20190120838A1 (en) | 2016-04-13 | 2019-04-25 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Methods and kits for the rapid detection of the escherichia coli o25b-st131 clone |
| CN105785050A (zh) * | 2016-04-18 | 2016-07-20 | 石河子大学 | 一种利用胶体免疫金免疫渗滤法检测布鲁氏菌病的综合缓冲液 |
| MX2019001016A (es) * | 2016-07-25 | 2019-07-04 | Gentian As | Dispositivo de ensayo y metodo para la evaluacion de celulas sanguineas. |
| CN109477835B (zh) * | 2016-07-25 | 2022-08-16 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 侧流装置及使用方法 |
| JP6366025B2 (ja) * | 2016-10-03 | 2018-08-01 | セルスペクト株式会社 | 血漿分離装置及び血漿分離方法 |
| CA2949634C (en) | 2016-11-25 | 2024-02-13 | Medmira Inc. | Analyte detection using raman spectroscopy |
| KR20190116979A (ko) | 2017-01-10 | 2019-10-15 | 드로브릿지 헬스, 인크. | 샘플 수집을 위한 장치, 시스템, 및 방법 |
| WO2018148729A1 (en) * | 2017-02-08 | 2018-08-16 | Essenlix Corporation | Qmax card-based assay devices and methods |
| CN115634721A (zh) * | 2017-02-16 | 2023-01-24 | Essenlix 公司 | 基于qmax卡的测定装置和方法 |
| EP3642625A4 (en) * | 2017-06-20 | 2021-06-09 | Salus Discovery, LLC | SIDE DRAINAGE DEVICES AND METHODS |
| JP2021520482A (ja) | 2018-03-30 | 2021-08-19 | アリゾナ ボード オブ リージェンツ オン ビハーフ オブ ザ ユニバーシティー オブ アリゾナ | 垂直フロー分子アッセイ装置 |
| US20190383807A1 (en) * | 2018-06-13 | 2019-12-19 | Tokitae Llc | Methods and systems for concentration of samples for lateral flow assays |
| CN109374900B (zh) * | 2018-09-25 | 2022-05-31 | 邱灵冰 | 基于检测卡的疫苗抗体检测方法 |
| US20220065768A1 (en) * | 2019-01-07 | 2022-03-03 | 1866402 Ontario Limited | Blood separation and analysis device and methods |
| US11300576B2 (en) | 2019-01-29 | 2022-04-12 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | DARPin reagents that distinguish Alzheimer's disease and Parkinson's disease samples |
| US11712177B2 (en) | 2019-08-12 | 2023-08-01 | Essenlix Corporation | Assay with textured surface |
| WO2021127664A1 (en) * | 2019-12-20 | 2021-06-24 | Essenlix Corporation | Rapid intra-cellular assay |
| CN111650368B (zh) * | 2020-02-14 | 2024-02-02 | 北京纳百生物科技有限公司 | 一种免疫胶体金均相标记用受体分散剂及其应用 |
| CN114280312B (zh) * | 2020-09-27 | 2023-09-15 | 河北特温特生物科技发展有限公司 | 一种用于免疫荧光层析检测的全血分离膜及其制备方法和应用 |
| WO2023177694A1 (en) * | 2022-03-14 | 2023-09-21 | University Of Houston System | Systems and methods for detecting cytokines |
| CN114942329A (zh) * | 2022-03-24 | 2022-08-26 | 艾康生物技术(杭州)有限公司 | 一种检测试剂板和制备方法 |
| WO2024038338A1 (en) | 2022-08-15 | 2024-02-22 | Solventum Intellectual Properties Company | Functionalized porous substrates and their use for detecting analytes |
Family Cites Families (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE388694B (sv) * | 1975-01-27 | 1976-10-11 | Kabi Ab | Sett att pavisa ett antigen exv i prov av kroppvetskor, med utnyttjande av till porost berarmaterial bundna eller adsorberande antikroppar |
| US4087567A (en) * | 1976-04-22 | 1978-05-02 | Corning Glass Works | Anticoagulant coating method |
| US4094647A (en) * | 1976-07-02 | 1978-06-13 | Thyroid Diagnostics, Inc. | Test device |
| US4361537A (en) * | 1979-01-12 | 1982-11-30 | Thyroid Diagnostics, Inc. | Test device and method for its use |
| US4235601A (en) * | 1979-01-12 | 1980-11-25 | Thyroid Diagnostics, Inc. | Test device and method for its use |
| US4517288A (en) * | 1981-01-23 | 1985-05-14 | American Hospital Supply Corp. | Solid phase system for ligand assay |
| US4446232A (en) * | 1981-10-13 | 1984-05-01 | Liotta Lance A | Enzyme immunoassay with two-zoned device having bound antigens |
| US4632901A (en) * | 1984-05-11 | 1986-12-30 | Hybritech Incorporated | Method and apparatus for immunoassays |
| US4826759A (en) * | 1984-10-04 | 1989-05-02 | Bio-Metric Systems, Inc. | Field assay for ligands |
| US4616056A (en) * | 1985-05-16 | 1986-10-07 | Raychem Corporation | Poly(aryl ether ketones) containing sulfur |
| TW203120B (es) * | 1985-10-04 | 1993-04-01 | Abbott Lab | |
| US5160701A (en) * | 1986-02-18 | 1992-11-03 | Abbott Laboratories | Solid-phase analytical device and method for using same |
| US4916056A (en) * | 1986-02-18 | 1990-04-10 | Abbott Laboratories | Solid-phase analytical device and method for using same |
| US5763262A (en) * | 1986-09-18 | 1998-06-09 | Quidel Corporation | Immunodiagnostic device |
| US4960691A (en) * | 1986-09-29 | 1990-10-02 | Abbott Laboratories | Chromatographic test strip for determining ligands or receptors |
| US4943522A (en) * | 1987-06-01 | 1990-07-24 | Quidel | Lateral flow, non-bibulous membrane assay protocols |
| US4912034A (en) * | 1987-09-21 | 1990-03-27 | Biogenex Laboratories | Immunoassay test device and method |
| US5459078A (en) * | 1988-01-29 | 1995-10-17 | Abbott Laboratories | Methods and reagents for performing ion-capture digoxin assays |
| US5670381A (en) * | 1988-01-29 | 1997-09-23 | Abbott Laboratories | Devices for performing ion-capture binding assays |
| EP0437435A4 (en) | 1988-05-16 | 1991-08-14 | Anand Akerkar | Synthetic matrices and derived assay calibrators |
| US5185264A (en) * | 1990-11-09 | 1993-02-09 | Abbott Laboratories | Diluent buffer and method for diluting an assay component |
| US5877028A (en) * | 1991-05-29 | 1999-03-02 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Immunochromatographic assay device |
| US5726010A (en) * | 1991-07-31 | 1998-03-10 | Idexx Laboratories, Inc. | Reversible flow chromatographic binding assay |
| US5821073A (en) | 1996-05-09 | 1998-10-13 | Syntron Bioresearch, Inc. | Method and apparatus for single step assays of whole blood |
| US5879951A (en) * | 1997-01-29 | 1999-03-09 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Opposable-element assay device employing unidirectional flow |
| US6057165A (en) * | 1997-02-07 | 2000-05-02 | Becton, Dickinson And Company | Quality control procedure for membrane flow-through diagnostic assay devices |
| US5885526A (en) | 1997-03-25 | 1999-03-23 | Chu; Albert E. | Analytical device for membrane-based assays |
| US6087184A (en) * | 1997-11-10 | 2000-07-11 | Beckman Coulter, Inc. | Opposable-element chromatographic assay device for detection of analytes |
| US6316205B1 (en) | 2000-01-28 | 2001-11-13 | Genelabs Diagnostics Pte Ltd. | Assay devices and methods of analyte detection |
| US7531362B2 (en) * | 2001-06-07 | 2009-05-12 | Medmira Inc. | Rapid diagnostic assay |
-
2002
- 2002-06-06 US US10/163,675 patent/US7531362B2/en not_active Expired - Lifetime
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2008
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| US7531362B2 (en) | 2009-05-12 |
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