MXPA01001384A - Dispositivo y metodo para prueba analitica. - Google Patents

Abstract

Se describe un dispositivo de prueba analitica para determinar mediante inmunocromatografia la presencia de uno o mas analitos en muestras fluidas; el dispositivo esta configurado de tal manera que se permite que la muestra entre a la zona de deteccion en forma simultanea desde muchas direcciones diferentes eliminando el estancamiento del flujo de la muestra; mediante seleccion del substrato poroso se permite tambien que el dispositivo provea la separacion de los globulos rojos a partir del plasma, brindando una prueba rapida para uno o mas analitos en una muestra de sangre entera; el dispositivo de la presente invencion puede medir, en forma simultanea, mas de un analito a partir de una muestra individual, ya sea alimentando trayectorias inmunocromatograficas multiples mediante una muestra individual o detectando analitos multiples en la misma trayectoria mediante anticuerpos de captura multiples.

Description

DISPOSITIVO Y MÉTODO PARA PRUEBA ANALÍTICA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a dispositivos y métodos para pruebas / analíticas útiles para ensayos analíticos para determinar la presencia de analitos en muestras de fluidos. Es especialmente útil para determinar la presencia de analitos cardíacos en sangre entera, aunque no está limitada de esa manera.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El producto y los procedimientos de e3ta invención se pueden utilizar para muchos propósitos de diagnóstico así como para seguir el curso de enfermedades en mamíferos y tratamientos terapéuticos. Es aplicable a muchos fluidos corporales de mamíferos tales como sangre entera, suero, plasma y orina. Aunque esta invención se discutirá principalmente como aplicada para detectar analitos cardíacos, también puede ser aplicable a otros campos en donde se utilizan antígenos/anticuerpos o reacciones equivalentes. Muchos procedimientos de análisis relacionados, especialmente aquellos que incluyen inmunoanálisis se pueden realizar utilizando el dispositivo de la presente invención y las modificaciones que se describen. Por ejemplo, se pueden utilizar los formatos de prueba de inmunoanálisis o no de inmunoanálisis que utilizan separación de glóbulos rojos del plasma y una trayectoria de fluido lateral. Los analitos tales como hormonas para determinar el embarazo u ovulación, micro organismos infecciosos virales, bacteriales o fúngicas, incluyendo H pylori para úlceras gástricas, fármacos de uso y abuso y marcadores de tumor son ejemplos no limitativos. Los análisis enzimáticos tales como aquellos que determina los niveles de glucosa y otros analitos en la sangre mediante la formación de un cromogen también están contemplados por la presente invención. Un número de procedimientos de inmunoanálisis han sido desarrollados recientemente los cuales utilizan reacciones que tienen lugar sobre portadores porosos secos tales como membranas celulares a través de las cuales las muestras que se van a analizar pueden fluir mediante acción capilar, los productos de reacción siendo detectables ya sea visualmente o con un instrumento tal como un reflectómetro. Aunque no están limitados de esta manera, esos procedimientos generalmente involucran reacciones de antígeno/anticuerpo en las cuales un miembro del par reactivo es marcado con una marca detectable. Típicamente, la marca es una marca de enzima o una marca directa de partículas, por ejemplo una marca de sol tal como oro. La técnica está muy consiente de muchas marcas útiles y sus métodos de operación. Los dispositivos inmunocromatogáficos típicos de esta naturaleza se describen en varias patentes de E.U.A. y extranjeras. Por ejemplo, la patente de E.U.A. 4,861 ,71 1 describe un dispositivo en el cual se detecta un analito mediante reacciones de antígeno/anticuerpo que tienen lugar en unas series de membranas co-planas en contacto de borde a borde. Otros dispositivos se describen en las patentes de E.U.A. 4,774,192, 4,753,776, 4,933,092, 4,987,065, 5,075,078, 5,120,643, 5,079,142, 5,096,809, 5,110,724, 5,144,890, 5,591 ,645, 5,135,716. Todas esas patentes describen estructuras laminadas. Los dispositivos que incluyen membranas porosas celulares tales como aquellas que se describen en las patentes identificadas anteriormente, son con frecuencia difíciles de fabricar debido a que son de capas múltiples y requieren varias capas de materiales porosos y tiras de filtración para asegurar resultados exactos. Para detección de analitos cardíacos en sangre entera, es necesario remover los glóbulos rojos de manera que no interferirán con la visualización o de otra manera con la detección de los productos de reacción de color que normalmente se producen en dichas reacciones de inmunoanálisis. Los dispositivos de ¡nmunoanálisis cuando se utilizan para detectar analitos cardíacos en sangre entera utilizan anticuerpos que reaccionan con esos antígenos para producir productos detectables. Un método utilizado ampliamente para dicho diagnóstico o procedimientos analíticos que utilizan reacciones de antígeno/anticuerpo utiliza anticuerpo detector marcado que reacciona con un epítope sobre el antígeno para formar un complejo de anticuerpo/antígeno marcado formado en una zona de detección de una tira de membrana porosa. El complejo se mueve a lo largo de la membrana mediante acción capilar hasta que hace contacto con una línea fija que contiene un anticuerpo de captura con el cual reacciona en otro epítope sobre el antígeno para concentrar y formar un producto de reacción detectable. Típicamente, el producto es detectable de manera visible debido a que está coloreado. Con algunas construcciones, el color es evidente a simple vista. En dispositivos más sofisticados, la presencia o concentración del antígeno se puede determinar midiendo la intensidad del color producido u otra propiedad del producto con un instrumento adecuado, por ejemplo, un sensor óptico. El método se utiliza en varios dispositivos que se utilizan para detectar analitos cardíacos en sangre entera. En todos esos dispositivos, es necesario evitar que los glóbulos rojos entren al área de desarrollo de color o de captura debido a que interfieren con la visualización adecuada del producto de reacción coloreado debido al intenso matiz de las células. Se ha hecho mucho esfuerzo para evitar dicha interferencia. Como resultado, los productos de esta naturaleza propuestos hasta la fecha para análisis de sangre entera incluyen algunos medios, tales como un tipo de filtro para remover los glóbulos rojos y formar un plasma, de manera que no hay interferencia con la visibilidad del color que se produce. La patente de E.U.A. No. 5,135,716 utiliza un agente aglutinante para auxiliar en la separación de los glóbulos rojos. Otras patentes describen el uso de papel o filtros de plástico. El uso de lana de fibra de vidrio se describe en la patente de E.U.A. 4,477,575 para filtrar los glóbulos rojos. Sin embargo, la lana de fibra de vidrio, simplemente añade otra capa al dispositivo. Las dificultades principales surgen de los problemas de colocar de manera exacta varias capas de tiras flexibles delgadas en registro adecuado en una estructura laminar mientras que al mismo tiempo retienen las zonas de colocación de muestra, las zonas de reacción y otras áreas de las tiras de membrana en comunicación adecuada una con otra. Los problemas se complican además por las dificultades de colocar la membrana completada en o sobre una plataforma adecuada que es con frecuencia una cubierta hueca con miembros separables superior e inferior que incluye pilares fijos y ranuras para evitar que la membrana se mueva y para retener áreas de membrana seleccionadas en posición adecuada en relación con las ventanas de visualización y otras aberturas en la cubierta. Como regla general, los dispositivos de diagnóstico, tales como aquellos que se discuten anteriormente se describen con frecuencia como que tienen una zona de aplicasión a la cual se añade la muestra que se analizará. La muestra fluye mediante acción capilar a lo largo de una trayectoria predeterminada en un substrato, normalmente una membrana de nitrocelulosa, a una zona de detección. La zona de detección porta un anticuerpo móvil, marcado, al analito buscado. Si el analito está presente, se forma un complejo de anticuerpo/antígeno que reacciona con un anticuerpo de captura fijo, es decir, inmovilizado en una zona de captura, corriente debajo de la zona de detección, para formar un producto detectable, normalmente uno que está coloreado y visible a simple vista. Algunas veces sucede que el complejo de anticuerpo/antígeno marcado se forma algo rápidamente, pero no se combina lo suficiente con el anticuerpo de captura para producir una señal fácilmente detectable. Esto puede suceder si ninguna cantidad suficiente de complejo contacta a los anticuerpos de captura o los contacta en una configuración que no es óptima para formar un producto de reacción detectable. Otros problemas posibles son tiempo de incubación insuficiente o baja afinidad de anticuerpo. Esas dificultades se pueden evitar aprovechando la reacción de biotin/avidin o de biotin/streptavidin o reacciones análogas bien conocidas para el experto en la técnica. Esas reacciones se utilizan con frecuencia para incrementar la sensibilidad del procedimiento de diagnóstico. En una aplicación de este procedimiento, dos anticuerpos se depositan de manera removible en la zona de detección y streptavidina es inmovilizada en la zona de captura. El anticuerpo detector está marcado, preferiblemente cen un metal tal como oro. y reacciona con un epítope sobre el analito. El otro anticuerpo que está marcado con biotina reacciona con otro epítope sobre el analito. La mezcla de anticuerpos se puede considerar como un sistema reactivo para utilizarse para detectar la presencia del analito. Si el analito está presente, se formará un complejo que contiene anticuerpo detector marcado detector de anticuerpo/analito/biotina marcado con oro en la zona de detección. El complejo se moverá a través de una membrana celular mediante acción capilar hacia la zona de captura. Cuando el complejo alcanza la streptavidina inmovilizada en la zona de captura, la streptavidina se une a la biotina y concentra el complejo en un área pequeña para formar un producto de reacción detectable. Existen varias variaciones conocidas de esta reacción. Por ejemplo, la zona de detección puede contener un anticuerpo marcado con biotina junto con streptavidina marcada con una marca de color tal como oro. El complejo que se forma y se mueve hacia la zona de captura es un complejo de anticuerpo marcado con analito/biotina y streptavidina marcada con oro el cual se moverá hacia la zona de captura y se concentrará en la zona de captura mediante reacción con un anticuerpo de captura para formar un producto de reacción detectable. Los procedimientos identificados anteriormente han sido descritos en general como que involucran reacciones que tienen lugar sobre dispositivos laminados alargados, rectangulares, con la zona de aplicación de muestra en un extremo asociada con algún tipo de capa de filtro. La muestra, después de la filtración, hace contacto con un reactivo de enlace específico marcado, móvi!, en una zona de detección para formar un complejo que se mueve a lo largo de le membrana celular hacia un reactivo de enlace específico colocado de manera distante, es decir, el reactivo de captura que está inmovilizado en una línea a través de la membrana. El complejo reacciona con el reactivo y se concentra a lo largo de la línea de reactivo para volverse visible. Típicamente, la muestra que será analizada se coloca en la zona de aplicación mediante la adición de varias gotas al centro de la zona o sumergiendo la zona de aplicación en un volumen pequeño de la muestra. Existen un número de problemas con esas configuraciones, especialmente cuando el objetivo es alta sensibilidad y el resultado debe ser visible dentro de solamente unos cuantos minutos.

La alta sensibilidad se puede lograr, por ejemplo, mediante una línea de captura en una zona de captura que tiene un ancho pequeño, en comparación con el ancho de la zona de detección, de manera que la cantidad de producto de reacción marcado se captura dentro de un área pequeña de captura y por lo tanto da un color de señal más intenso. Adicionalmente, la sensibilidad se puede incrementar conforme más volumen marcado se mueve a través de la línea de captura durante el procedimiento de prueba. Sin embargo, mientras se necesite más volumen marcado, deberá ser más grande el área de detección. Si esta área tiene la forma de un canal alargado y se incrementa simplemente incrementando la longitud del mismo, la consecuencia ^s un incemento considerable en tiempo de prueba, debido a que la velocidad del líquido que se mueve al frente se hace más lenta de manera exponencis; con la distancia total humedecida. Otras formas de esta área, (por ejemplo, cen una relación más elevada de ancho a longitud) conducen a una zona de detección de ancho grande y un canal de zona de captura de ancho pequeño que tiene la desventaja de crear regiones de estancamiento en donde hay poco o ningún flujo. En casos extremos puede que nunca se involucren cantidades significantes de la muestra en las reacciones que forman el producto detectable. Esta invención soluciona muchos de los problemas mencionados anteriormente al proveer un dispositivo que puede ser suficientemente pequeño para ser sostenido a mano, aunque no necesariamente de esa manera, y provee flujo rápido y eficiente del fluido que será analizado. Aunque su utilidad presente más importante es para el análisis de sangre entera para diagnosticar la presencia de analitos cardíacos, se puede adaptar para probar la presencia de otros componentes en un fluido tal como un fluido corporal que porta un antígeno que formará un complejo con un anticuerpo el cual a partir de entonces puede ser detectado, por ejemplo en un análisis de emparedado con otro anticuerpo. Los analitos cardíacos como los que se describen en varias d,e las patentes mencionadas anteriormente se pueden utilizar en la sala de emergencias para auxiliar a un médico a diagnosticar la causa de dolor de pecho y para determinar si el dolor surge de un evento cardíaco. Es hacia varias mejoras en las características de la invención descrita anteriormente hacia donde la presente solicitud está dirigida.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La solución a esos problemas como se explica en la presente, es que, de acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, la muestra se permite entrar a la zona de detección de manera simultánea desde muchas direcciones diferentes y la zona de detección está diseñada en una manera que el flujo resultante de las diferentes direcciones apunta todo al canal de la zona de captura y todas las distancias desde la entrada de la zona de detección a dicha entrada son esencialmente las mismas. Esta invención soluciona muchos de los problemas mencionados anteriormente al proveer un dispositivo que puede ser suficientemente pequeño para ser sostenido a mano, aunque no necesariamente de esa manera, y provee flujo rápido y eficiente del fluido que será analizado. Aunque su utilidad presente más importante es para el análisis de sangre entera para diagnosticar la presencia de analitos cardíacos, se puede adaptar para probar la presencia de otros componentes en un fluido tal como un fluido corporal que porta un antígeno que formará un complejo con un anticuerpo el cual a partir de entonces puede ser detectado, por ejemplo en un análisis de emparedado con otro anticuerpo. Se puede lograr el flujo rápido y eficiente del fluido que será analizado configurando los canales porosos de manera que hay poca o ninguna oportunidad para estancamiento, de manera que el fluido, ontra a una zona de detección desde un canal de circulación de muestra desde una multitud de puntos. La zona de detección está diseñada de manera que la parte frontal resultante del fluido se mueve en la dirección del extremo de entrada de la zona de captura. Un aspecto particularmente ventajoso de la invención cuando se utiliza para sangre entera es la selección de un substrato poroso que separa de manera cromatográfica los glóbulos rojos del plasma. La separación cromatográfica es de particular importancia comparada con la filtración del material en partículas debido a que la filtración real puede obstruir las células del medio e impedir y aún detener el flujo. Más aún, como se discute anteriormente, la filtración requiere normalmente capas adicionales. Sin embargo, en la separación cromatográfica, el material en partículas continúa fluyendo aunque a una velocidad más lenta que el fluido portador de manera que hay poco o ningún impedimento de flujo. Con otras muestras biológicas la separación cromatográfica puede no ser necesaria. Otra característica importante de la invención, como se explicará enseguida, es que todo el flujo se detiene en un punto pre seleccionado debido a que todo el volumen de la trayectoria de la muestra en el portador poroso está humedecida, y el material en partículas tal como glóbulos rojos no interfiere con la detección del producto de reacción detectable. El dispositivo de acuerdo con un primer aspecto de esta invención efectúa varias mejoras de los dispositivos iniciales, es decir, provee solución a los problemas como se explican en la presente en que se permite entrar a la muestra hacia la zona de detección de manera simultánea desde muchas direcciones diferentes y la zona de detección está diseñada en una manera que el flujo resultante de las diferentes direcciones apunta todo a la entrada del canal de la zona de captura y todas las distancias desde la entrada de la zona de detección a dicha entrada son esencialmente las mismas. Se puede lograr el flujo rápido y eficiente del fluido que será analizado configurando los canales porosos de manera que hay poca o ninguna oportunidad para estancamiento, de manera que el fluido entra a una zona de detección desde un canal de circulación de muestra desde una multitud de puntos. La zona de detección está diseñada de manera que la parte frontal resultante del fluido se mueve en la dirección del extremo de entrada de la zona de captura. Se pueden lograr mejoras adicionales con el siguiente dispositivo de acuerdo con un segundo aspecto de la invención. Por ejemplo, utiliza menos membrana porosa, se puede hacer más pequeño de manera que se utiliza menos material en su construcción, y actúa más rápido. Una de sus ventajas más importantes, como será evidente a partir de la siguiente explicación, es que aún cuando una pluralidad de analitos van a ser identificados, el único cambio en estructura requerido es la estructura de la membrana porosa, y no de las capas de soporte. Las mejoras en la presente están dirigidas a la configuración del dispositivo y a la interacción entre la membrana porosa, sobre la cual ocurre la separación de plasma de los glóbulos rojos, y las capas superior e ¡nferior que cooperan para sostener la membrana en la oosición correcta. Adicionalmente, las capas superior e ¡nferior proveen canales para conducir la muestra desde el hoyo de aplicación a y a través de la membrana a los anticuerpos de captura mientras lleva a cabo la separación cromatográfica de plasma de los glóbulos rojos. La primera mejora es una reconfiguración del canal de suministro de muestra de manera que el fluido se conduce desde el hoyo de aplicación a la membrana a través de un canal que comprende las capas superior e ¡nferior del dispositivo. En contraste con el dispositivo de acuerdo con un primer aspecto de la invención, no hay membrana presente en el canal de suministro de muestra. La ausencia de membrana en esta ubicación es una mejoría en que reduce la cantidad de membrana porosa que se requiere para el dispositivo, y evita preocupaciones con relación a la necesidad de eliminar la porosidad de la membrana localizada en el canal de suministro de muestra o cualesquier preocupaciones con relación al contacto de la muestra de fluido con un material diferente al que comprende las piezas superior e inferior (capas) del dispositivo. El producto resultante es menos costoso en materiales y trabajo para fabricación. El grado de membrana porosa requerida se confina a la zona de detección y a la zona de captura. Se provee una interfaz configurada entre la porción del dispositivo que comprende el canal de suministro de muestra, y la que contiene la membrana y el canal de circulación de muestra, para formar un conducto capilar para que la muestra de sangre se canalice a la membrana de acuerdo con el dispositivo, sin provocar distribución errante de la muestra. Una ventaja adicional de esta invención es que los mismos componentes de la capa superior e inferior se utilizan en la fabricación de un número de diferentes pruebas analíticas. Solamente la membrana necesita ser hecha a la medida para la detección de analito específico o analitos que serán medidos. Por ejemplo, los analitos depositados o sueltos en la membrana y sus ubicaciones, y la forma de las trayectorias de fluido sobre la membrana, se pueden individualizar para cada análisis. Las capas superior e ¡nferior con el canal de suministro de muestra y el canal de circulación de muestra son los mismos para todos los análisis. El canal de suministro de muestra también se puede configurar para contener un volumen predeterminado de muestra, y además, por medio de una ventana o transparencia opcional, indicar al usuario cuándo el canal de suministro de muestra está lleno y por lo tanto la muestra adecuada ha sido aplicada. Una mejora adicional es una configuración del canal de suministro de muestra de manera que cuando el canal está lleno, la muestra contenida en el mismo se suministra al canal de circulación de muestra y por lo tanto se inicia el inmunoanálisis. En una modalidad adicional, se pueden proveer reactivos tales como los anticuerpos detectores marcados dentro de los canales del dispositivo en la trayectoria de fluido antes de la membrana, de manera que los reactivos se mezclan con la muestra. Los reactivos se pueden proveer como esferas, microesferas o polvo liofilizado, a manera de ejemplos no limitativos en los canales mencionados anteriormente. Una característica principal de los dispositivos de esta invención es que la membrana no se extiende a toda la longitud del canal de suministro de muestra. Otra es que 3l canal de suministro de muestra está diseñado de manera que un volumen predeterminado conocido de muestra se puede suministrar a la sección de operación del dispositivo. Es por lo tanto un objeto de esta invención proveer un dispositivo de prueba analítica como se describe anteriormente con un canal de suministro de muestra formado en la superficie inferior de la capa superior y con paredes definidas por el canal y la superficie superior de la capa inferior. Casi no hay membrana presente en la región del canal de suministro de muestra. En una modalidad, el canal de suministro de muestra está configurado con lados paralelos, y está en comunicación operativa con el canal de circulación de muestra. En otra modalidad de la invención, el canal de suministro de muestra está configurado para contener el volumen de muestra necesario para llevar a cabo el análisis en el dispositivo. En esta modalidad, el extremo del canal de suministro de muestra está formado para proveer un estrechamiento del canal de suministro de muestra en donde coincide con el canal de circulación de muestra. En esta modalidad, cuando el canal de suministro de muestra se ha llenado con fluido hasta el punto en donde el fluido hace contacto con la sección angosta, la acción capilar canalizará el fluido desde el canal de suministro de muestra al canal de circulación de muestra, y después hacia la membrana del dispositivo. La mezcla fluye después hasta que el canal de suministro de muestra se drena de su volumen predeterminado, y el análisis se lleva a cabo. Como se mencionó anteriormente, una ventana de observación opcional en la unión del canal de suministro de muestra y el canal de circulación de muestra se puede proveer para indicar al operador que la muestra adecuada ha sido añadida al dispositivo para conducir la prueba, como cuando el canal de suministro de muestra se ha llenado completamente con sangre y la muestra se canaliza al canal de circulación de muestra, la ventana de observación indicará la presencia de la muestra. Como en el caso del dispositivo de acuerdo con un primer aspecto de la invención, el dispositivo de acuerdo con un segundo aspecto de la invención soluciona los problemas con los dispositivos de la técnica anterior debido a que la muestra se permite entrar a la zona de detección de manera simultánea desde muchas direcciones diferentes y la zona de detección está diseñada en una manera que el flujo resultante de las diferentes direcciones apunta todo al canal de la zona de captura y todas las distancias desde la entrada de la zona de detección a dicha entrada son esencialmente las mismas. Se puede lograr el flujo rápido y eficiente del fluido que será analizado configurando el substrato poroso (membrana) de manera que hay poca o ninguna oportunidad para estancamiento, de manera que el fluido entra a una zona de detección desde un canal de circulación de muestra desde una multitud de puntos. La zona de detección o canal está diseñada de manera que la parte frontal resultante del fluido se mueve en la dirección del extremo de entrada del canal de la zona de captura. Se pueden lograr aún mejoras adicionales con el siguiente dispositivo de acuerdo con un tercer aspecto de la invención. Las mejoras de este dispositivo de acuerdo con un tercer aspecto de la invención también están dirigidas a la configuración del dispositivo y a la interacción entre la membrana porosa, sobre :a cual ocurre la separación de plasma de los glóbulos rojos, y la capas superior e ¡nferior que cooperan para sostener la membrana en la posición correcta. La presente solicitud está dirigida a dispositivos en los cuales el canal de suministro de muestra está localizado sobre la superficie superior de la capa superior, cubierto por una cubierta, y la muestra se conduce al canal de circulación de muestra a través de un canal que se extiende desde el extremo del canal de suministro de muestra en la superficie superior de la capa superior al canal de circulación de muestra. Cuando la muestra entra y llena el canal de circulación de muestra, se mueve después cromatográficamente hacia la membrana simultáneamente desde una pluralidad de puntos e inicia la separación cromatográfica del plasma de los glóbulos rojos y la entrada del fluido hacia la zona de detección desde una multitud de puntos. El canal de suministro de muestra de la presente invención, por virtud de su ubicación sobre la superficie superior de la capa superior, ofrece varias ventajas. Una ventaja es la reducción en la cantidad de membrana que se requiere en el dispositivo. La ausencia de membrana en esta ubicación es una mejora en que reduce la cantidad de membrana porosa que se requiere para el dispositivo, y evita preocupaciones con relación a la necesidad de eliminar la porosidad de la membrana localizada en el canal de suministro de muestra o cualquier preocupación en relación al contacto de la muestra de fluido con un material diferente al que comprende las piezas superior e inferior (capas) del dispositivo. El producto resultante es menos costoso tanto en materiales como en trabajo de fabricación. Una segunda ventaja es que la ubicación del canal permite que el usuaric vea el llenado del canal. La prueba no iniciará hasta que el canal esté lleno, y de esta manera, no se requiere dispositivo de medición de muestra externo. Si el volumen del canal de suministro de muestra es igual a la cantidad de muestra requerida para llevar a cabo la prueba, cuando el canal está lleno, se puede detener la aplicación adicional de muestra. De manera adicional, la porción de recolección de muestra del dispositivo se puede formar para permitir el acceso conveniente de una muestra de sangre obtenida mediante pinchazo en un dedo, llenando el suministro de muestra con un volumen pequeño de sangre, en general de 30 a 50 µl, e iniciar el análisis. Una ventaja adicional del dispositivo de acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, es que se puede colocar un reactivo en el canal de suministro de muestra, en forma de una capa aplicada o una o más partículas sólidas, las cuales se pueden disolver en la muestra conforme pasa a través del canal. La aplicación de los reactivos en esta ubicación provee un medio más fácil para la fabricación del dispositivo, así como permite que el reactivo se mezcle con la muestra de manera temprana antes de que la muestra alcance la membrana. Aún otra ventaja adicional del dispositivo de acuerdo con un tercer aspecto de la invención, es que los mismos componentes de capa superior e inferior del dispositivo se utilizan en la fabricación de un número de diferentes pruebas analíticas. Solamente la membrana necesita ser hecha a !a medida para Ir detección de un analito específico o analitos que serán medidos.* Por ejemplo, los reactivos depositados o sueltos en la membrana y sus ubicaciones, y la -.orina de las trayectorias de fluido sobre la membrana, se pueden individualizar para cada análisis. Las capas superior e ¡nferior con el canal de suministro de muestra y el canal de circulación de muestra son los mismos para todos los análisis. El canal de suministro de muestra también se puede configurar para contener un volumen predeterminado de muestra, y además, por medio de una ventana o transparencia opcional, indicar al usuario cuándo el canal de suministro de muestra está lleno y por lo tanto la muestra adecuada ha sido aplicada. Una mejora adicional es una configuración del canal de suministro de muestra de manera que cuando el canal está lleno, la muestra contenida en el mismo se suministra al canal de circulación de muestra y por lo tanto se inicia el inmunoanálisis. Una característica adicional, opcional, es un indicador de fin de prueba que indica que la prueba está completa y que se puede leer, y evita la necesidad de un medidor de tiempo. Las ventanas que permiten que el usuario vea los resultados de la prueba y el indicador de fin de prueba pueden ser aberturas en la capa superior del dispositivo, o todo el dispositivo se puede construir de un material transparente que se opaca mediante impresión o tratamiento de superficie en las áreas que no se van a observar. Una característica principal de los dispositivos de este tercer aspecto de la invención es la ubicación del canal de suministro de muestra sobre la superficie superior de la capa superior del dispositivo, de manera que la membrana no se extiende a toda la longitud del canal de suministro de muestra. Otra característica es que el canal de suministro de muestra está diseñado de manera que un volumen predeterminado conocido de muestra se puede suministrar en la sección de operación del dispositivo. Una característica adicional es la colocación de reactivos sobre el canal de suministro de muestra para disolución en la muestra. Es por lo tanto un objeto de esta invención proveer un dispositivo para prueba analítica como se describe anteriormente con un canal de suministro de muestra formado en la superficie superior de la capa superior. El canal de suministro de muestra está cubierto por una cubierta, preferiblemente transparente. No está presente membrana en la región del canal de suministro de muestra. En una modalidad, el canal de suministro de muestra está configurado con lados paralelos, y está en comunicación operativa con el canal de circulación de muestra. En otra modalidad de la invención, el canal de suministro de muestra está configurado para contener el volumen de muestra necesario para llevar a cabo el análisis en el dispositivo. En esta modalidad, el extremo del canal de suministro de muestra que está en comunicación operativa con el canal de circulación de muestra está formado para proveer una formación más angosta del canal de suministro de muestra en donde encuentra al canal de circulación de muestra. En esta modalidad, cuando el canal de suministro de muestra ha sido llenado con fluido hasta el punto en donde el fluido hace contacto con la sección angosta, la acción capilar canalizará el fluido desde el canal de suministro de muestra al canal de circulación de muestra, y después hacia la membrana del dispositivo. La muestra fluye después hasta que el canal de suministro de muestra se drena de su volumen predeterminado, y se realiza el análisis Como se describe en la presente, el dispositivo de acuerdo con un tercer aspecto soluciona los problemas de la técnica anterior porque la muestra se permite entrar a la zona de detección de manera simultánea desde muchas direcciones diferentes y la zona de detección está diseñada en una manera que el flujo resultante de las diferentes direcciones apunta todo a la entrada del canal de la zona de captura y todas las distancias desde la entrada de la zona de detección a dicha entrada son esencialmente las mismas. Se logra el flujo rápido y eficiente del fluido que será analizado configurando el substrato poroso (membrana) de manera que hay poca o ninguna oportunidad para estancamiento, de manera que ei fluido entra a una zona de detección desde un canal de circulación de muestra desde una multitud de puntos. La zona de detección está diseñada de manera que la parte frontal resultante del fluido se mueve en la dirección del extremo de entrada del canal de la zona de captura.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1 , 2 y 3 son representaciones de la técnica antecedente. Las figuras 1 y 2 representan intentos de configuraciones para incrementar el volumen marcado o, respectivamente, para incrementar la relación de anchos de la zona de detección sobre la zona de captura. La figura 3 es la configuración estándar habitual en la cual el ancho del portador poroso, es decir la membrana, es uniforme a través de toda su longitud. La figura 4 muestra una configuración de membrana de un dispositivo de la invención adecuado para detectar uno o varios analitos con una zona de detección semi circular y un canal angosto de zona de captura. El borde de la zona de detección semi circular se conectará con un canal de circulación de muestra. La figura 5 muestra la configuración de la superficie más baja de la capa superior de un dispositivo de la invención adecuado para utilizarse con la membrana de la figura 4. Las figuras 6, 7 y 8 son vistas en sección a lo largo de las líneas A-A, B-B y C-C de la figura 5. La figura 9 muestra una configuración de membrana de un dispositivo de la invención para detectar uno o varios analitos con una zona de detección rectangular y un canal angosto de zona de captura. La figura 10 muestra la configuración de la superficie más baja de la capa superior de un dispositivo de la invención adecuado para utilizarse con una membrana de la figura 9. La figura 11 muestra la configuración de la membrana de la invención actualmente preferida adecuada para la detección de tres analitos diferentes a través de la ruta de biotina/streptavidina. Las figuras 12 y 13 muestran las configuraciones de membranas porosas alternas con una y tres trayectorias de fluido, respectivamente. La figura 14 muestra una modalidad de la invención con dos trayectorias y un canal de circulación arqueado en una capa superior. La figura 15 es una vista en perspectiva de un dispositivo de la invención. Las figuras 16A, 16B y 16C representan una vista despiezada de un dispositivo de la invención con un miembro superior, y miembro de soporte, y un portador poroso en una configuración de la figura 11. La figura 17 A-D es una representación de un dispositivo de la invención que tiene un canal de circulación de muestra diferente del que se muestra en las figuras 15 y 16 A-C. La figura 18 muestra una configuración de membrana para utilizarse en un dispositivo de esta invención que es adecuado para detectar uno o varios analitos con una zona de detección semi circular y un canal angosto de zona de captura. El borde de la zona de detección semi circular se conectará con un canal de circulación de muestra. La figura 19 A-B muestra la configuración de la superficie más baja de la capa superior y la superficie superior de la capa inferior, respectivamente, de un dispositivo de esta invención adecuado para utilizarse con la membrana de la figura 18. Las líneas en sección transversal A-A, B-B, C-C y D-D se muestran en figuras subsecuentes, representando las secciones transversales a través del dispositivo ensamblado. Las figuras 20-23 son vistas en sección a lo largo de las líneas A-A, B-B, C-C y D-D, respectivamente, de la figura 19A. La porción superior sombreada en cruz representa la porción en sección transversal de la capa superior del dispositivo, la porción ¡nferior abierta representa la porción en sección transversal de la capa inferior. La figura 24 muestra una configuración de membrana de un dispositivo de esta invención para detectar uno o varios analitos con una zona de detección rectangular y un canal angosto de zona de captura. La figura 25 muestra la configuración de la membrana de la invención actualmente preferida adecuada para la detección de tres analitos diferentes a través de la ruta de biotina/streptavidina. Las figuras 26 y 27 muestran las configuraciones de membranas porosas alternas con una y tres trayectorias de fluido, respectivamente. La figura 28 A-B muestra una configuración de la superficie ¡nferior de la capa superior de un dispositivo de esta invención que incluye un canal de suministro de muestra de un volumen predeterminado con una ventana para indicar que el canal está lleno, y una construcción que canaliza el fluido desde el canal de suministro de muestra al canal de circulación de muestra. Una sección transversal de la capa superior del dispositivo en las líneas de sección E-E se muestra en la figura 28B. La figura 29 es una vista en perspectiva de un dispositivo de esta invención. Las figuras 30A, 30B y 30 C representan una vista despiezada de un dispositivo de esta invención con un miembro superior, un miembro de soporte, y un portador poroso en una configuración de la figura 25. La figuro 31 muestra una configuración de membrana para utilizarse en un dispositivo de esta invención que es adecuado para detectar uno o varios analitos con una zona de detección semi circular y un canal angosto de zona de captura. El borde de la zona de detección semi circular se conectará con un canal de circulación de muestra. Las figuras 32-34 muestran la configuración de un ejemplo de un dispositivo de la presente invención, y sus piezas componentes, incluyendo el sostenedor de membrana, la pieza de fondo, la pieza superior, y la cubierta del canal de suministro de muestra. Las figuras 35-36 muestran vistas despiezadas de ejemplos de dispositivos de la presente invención, incluyendo vistas en sección transversal. La figura 37 muestra la configuración de una membrana de esta invención adecuada para la detección de tres analitos diferentes a través de la ruta de biotina/streptavidina, con tres trayectorias de fluido. Las figuras 38-40 ilustran dispositivos de la invención con reactivo de prueba depositado en el canal de suministro de muestra.

GLOSARIO Los siguientes términos tienen el siguiente significado general como se utiliza en esta especificación y reivindicaciones. "Portador poroso seco" y "capa de portador poroso seco" se refieren a un producto celular a través del cual la muestra que será analizada se puede mover mediante acción capilar. Como se podrá observar por las figuras y como se entenderá mediante la descripción de la invención, la (capa de) portador poroso seco, que en esta técnica es referido con frecuencia como una membrana, está configurada cerrando algunas de las áreas porosas de manera que el fluido que será analizado se mueve a lo largo de trayectorias definidas a través de canales seleccionados. "Capa superior o pieza superior" es una capa en el dispositivo de prueba analítico que está configurada para cooperar con una capa de fondo o pieza de fondo para sostener la (capa de) portador poroso seco (membrana) cuando las capas superior e inferior se colocan en registro para proveer, en cooperación con la capa porosa seca, trayectorias que controlan la dirección de flujo de la muestra que será analizada a través del dispositivo. "Antígeno" es una molécula que, en un animal, induce la formación de un anticuerpo. Los dispositivos de esta invención son útiles para determinar la presencia de antígenos en un fluido. Son especialmente útiles para analizar fluidos corporales, particularmente sangre entera, suero, plasma y orina. Los antígenos son referidos comúnmente como "analitos". Los "analitos cardiacos" son analitos que se liberan en la sangre como resultado de deterioro de tejido cardiaco. "Canal" es cualquier conducto formado a través del cual la muestra de fluido bajo análisis fluye en el dispositivo de prueba analítica. Un canal se puede formar en la capa superior o en la capa de portador poroso en sí. Debido a que !a capa superior es generalmente un plástico rígido tal como un poüacrilato o poli etacrilato, se puede formar un canal mediante moldeo, estampado, troquelado o cualquier procedimiento equivalente. En la capa porosa, los canales se pueden formar mediante estampado de la configuración deseada en la capa. También se pueden diseñar en la capa porosa formando bordes no porosos con cera c tinta. Se dice que los canales están en comunicación operativa cuando un fluido en un canal fluye directamente hacia otro. "Semicircular", como se utiliza la palabra en la presente no está limitada a la mitad de un círculo, sino que se refiere en general a un área de círculo en donde se ha removido un sector o a este sector en sí. "Circunscrito", como se utiliza la palabra en la presente no está limitada a un canal arqueado que rodea y se conforma a un área semicircular de una membrana porosa. El término incluye, como será evidente conforme prosiga esta descripción, otras configuraciones en las cuales un canal de circulación de muestra se conforma con el borde de una o más zonas de detección de otras configuraciones, por ejemplo cuando el área del portador es poligonal o forma parte de un polígono. "Esencialmente" es un término que se utiliza en conexión con las distancias entre los puntos de entrada de la muestra hacia la zona de detección y el extremo de entrada del canal de zona de captura. Esas distancias deben ser tan similares como sea posible. Obviamente, un área semi circular sobre el portador a la cual se conforma un canal de circulación de muestra arqueado es una configuración altamente preferida debido a que todas las distancias resultantes entre el borde arqueado de la zona de detección y el extremo de entrada del canal de zona de captura son las mismas. "Rápido" significa que un producto detectable s'-i forma dentro de un período de tiempo suficientemente corto, por ejemplo dentro de d a 15 minutos, para permitir que el médico que atiende extraiga conclusiones con mucho sentido y útiles. "Eficiente" significa que un producto detectable se puede formar con un bajo volumen de fluido, por ejemplo unas cuantas gotas de sangre entera (por ejemplo de 10 µl a 80 µl) utilizando pequeñas cantidades de reactivos incluso cuando el antígeno está presente en concentraciones muy bajas como es normalmente el caso con los analitos cardiacos tales como troponina I. Las figuras 1 , 2 y 3 son dispositivos de la técnica antecedente. En las figuras, números similares tienen significados similares. La figura 1 es una vista de un dispositivo de la técnica antecedente configurado en un intento para evitar los problemas que se describen anteriormente. En la figura, 1 es una membrana porosa celular tal como nitrocelulosa. La muestra que será analizada se añade en el área 2. La zona de detección 3 contiene un reactivo que reacciona de manera móvil, por ejemplo un anticuerpo 4 de detección para troponina I en un portador de plasma. El anticuerpo 4 está marcado con una marca 5 tal como oro. Por conveniencia, los dispositivos de las figuras 1 , 2 y 3 se muestran como membranas de una sola capa. Sin embargo, en la práctica la mayoría de ellas tendría una serie de capas de filtración sobre el área 2 de manera que solamente plasma que lleva analito alcanzaría el área 2. De manera alternativa, los glóbulos rojos en la muestra se pueden remover mediante coagulación para formar un suero. Sin embargo, esto es un paso por separado que se realiza de manera exterior al dispositivo, y normalmente requiere filtración por separado de la mezcla de glóbulos coagulados con el suero antes de llevar a cabo la prueba. Si el analito está presente, reaccionará con el anticuerpo 4 marcado para formar un complejo de anticuerpo marcado/analito, el cual se moverá con el plasma mediante acción capilar hacia la zona de captura 6 en donde reaccionará con el anticuerpo 7 de captura fijo e inmovilizado en la zona de captura 6. Como resultado, el complejo de anticuerpo marcado/analito formará un producto de reacción detectable en el área de anticuerpo 7 de captura. Normalmente, el anticuerpo 7 se fija en la línea que atraviesa la zona de captura 6 y el producto de reacción será visible a simple vista. Si la marca es oro la línea será de rojo a purpura. El problema que surge con una configuración como la que se muestra en la figura 1 es que el plasma que lleva el analito viaja en todas las direcciones lejos de la zona 2. Una porción viajará hacia la zona de detección 3 y la zona de captura 6. Sin embargo, otra porción viajará en la dirección opuesta y por lo tanto nunca alcanzará la zona de captura 6. La figura 2 muestra un dispositivo de la técnica antecedente que utiliza medios 8 de barrera de flujo para incrementar la longitud de la trayectoria a través de la cual la muestra debe fluir. El problema con este dispositivo es que los puntos muertos en la periferia superior de la zona de detección 3 crean áreas de estancamiento de flujo. La figura 3 muestra un substrato poroso en forma rectangular alargada sobre el cual tienen lugar las mismas reacciones como en las figuras 1 y 2. No hay estancamiento de fluido y nada de fluido está atrapado. El problema principal con este dispositivo estándar de ¡a figura 3 es que si el dispositivo es demasiado corto, no hay suficiente volumen marcado para hacer contacto y reaccionar con el anticuerpo de captura para producir una cantidad suficiente de producto de reacción que sea detectable. Si el dispositivo es demasiado grande, pasará mucho tiempo antes de que el resultado de la prueba esté disponible.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Lo siguiente describe un primer aspecto de la invención. Como se discutió anteriormente, el dispositivo de esta invención se puede utilizar para analizar una variedad de muestras de líquidos biológicos para la presencia de un antígeno. Está contemplado actualmente que el dispositivo encontrará su utilidad x principal para diagnosis de sangre entera para la presencia de analitos cardiacos tales como troponina I, troponina T, mioglobina, CK-MB, cadena ligera de miosina, anhidrasa carbónica, proteína de unión a ácido graso, BB glicogen " fosforilasa, actina y cualquiera de un hospedero de otros analitos conocidos que se encuentran en la sangre conforme el tejido cardiaco se deteriora después de un evento isquémico tal como angina c infarto al miocardio. De acuerdo con esto, como una ilustración de su alcance, la invención se describirá principalmente como se utiliza en la diagnosis de eventos cardiacos. La técnica antecedente y sus deficiencias se han discutido anteriormente en general y también en conexión con las figuras 1 , 2 y 3. La figura 4 ilustra una capa de portador poroso seco 1 de la invención configurada para el análisis de sangre entera para un analito o una pluralidad de analitos mediante reacciones entre el analito(s) y pares de anticuerpos que reaccionan con diferentes epítopes sobre el analito en la clásica reacción de antígeno/anticuerpo utilizando pares de anticuerpos policlonales o monoclonales, estando marcado un miembro del par seleccionado. La figura muestra la capa de portador 1 en la cual la porosidad de una porción seleccionada de la capa ha sido destruida, por ejemplo por medios de barrera de flujo, para dejar solamente un área porosa que define a la zona de detección 3 semicircular con un borde 11 y el canal 6 de zona de captura el cual está cerrado en el extremo terminal 12. Esta membrana 1 que es preferiblemente de nitrocelulosa o material equivalente separa cromatograficamente los glóbulos rojos para formar un frente 13 de glóbulos rojos y un frente 14 de plasma corriente abajo de la misma. La zona de detección 3 contiene anticuerpo de detección 4 y 5 marcado que reacciona con el analito, si está presente, para formar un complejo de anticuerpo marcado/antígeno. Aunque, por conveniencia, solamente se muestra un anticuerpo, la zona de detección 3 puede contener varios tipos diferentes de anticuerpos marcados. El anticuerpo marcado 4 es movible, es decir, está depositado de manera movible en la zona de detección 3 mediante cualquiera de varios medios conocidos de manera que el complejo de anticuerpo marcado/analito una vez formado es libre de moverse corriente abajo hacia el canal 6 de zona de captura para reacción con el anticuerpo de captura 7 fijo de manera transversal al canal 6 de la zona de captura para formar un producto de reacción detectable. Nuevamente, por conveniencia, solamente se muestra una línea de anticuerpo de captura 7, pero puede existir una pluralidad de tales líneas, una para cada analito que será detectado.

El canal 6 de la zona de captura puede contener opcionalmente un producto 15 que reacciona con cualquier substancia que esté normalmente presente en sangre, plasma, suero u otra muestra para producir un producto de control visible. El uso de una reacción de control es opcional, pero se prefiere. La figura 5 muestra la configuración de la superficie inferior de la capa superior 16 que se pondrá en registro con la membrana 1 de la figura 4 para proveer un dispositivo de la invención. La capa superior 16 tiene un "agujero que atraviesa" o "agujero de aplicación" 17 para aplicación de la muestra. Está en comunicación operativa con el canal de suministro de muestra 18 el cual comunica con el canal de circulación de muestra 19. E' canal de circulación de muestra 19 se muestra en una configuración arqueada con el fin de conformarse con el borde 1 1 de la zona de detección semicircular 3 de la figura 4. El canal de circulación de muestra 19. está cerrado en ambos extremos 20. Está formado con la pared interior 21 y la pared exterior 22 y está rodeado por un separador capilar 23 el cual funciona para asegurar que el flujo de la muestra es hacia la zona de detección 3 de la figura 4 en todos los puntos del borde 11 , y después hacia el canal de captura 6 en su extremo de entrada 6 Las figuras 6, 7 y 8 son vistas en sección a lo largo de las líneas A- A, B-B, y C-C, respectivamente, de la figura 5. Números similares tienen el mismo significado. Las dimensiones (mm) son simplemente para ilustración. Las dimensiones no ajustan a escala.

Las figuras 9 y 10 son similares a las figuras 4 y 5 excepto que la zona de detección 3 es de configuración rectangular y el canal de circulación de muestra 19 que circunscribe el borde 11 es similarmente rectangular. Como con las figuras 4 y 5 el dispositivo se muestra con un anticuerpo de detección 4 y 5, marcado, móvil, y una línea fija de anticuerpo de captura 7. El dispositivo de la figura 9 y 10 se puede utilizar para detectar uno o más de un analito con la condición de que no hay cantidad sustancial de reacción cruzada. La figura 11 muestra la configuración de una membrana 1 actualmente preferida de la invención en la cual se utiliza la reacción de biotina/streptavidina para diagnosticar una muestra de sangre entera para la presencia de tres analitos. La configuración de los canales en la capa superior se puede diseñar fácilmente a partir de la explicación anterior y de la siguiente explicación. En la figura números similares tienen el mismo significado que en las ctras figuras. El diseño se puede utilizar para determinar la presencia de los analitos mioglobina, troponina I o T y CK-MB en una muestra pequeña. La membrana 1 está formada con tres trayectorias distintas, una para cada analito que conduce desde los bordes 11a, 11 b y 11c de tres zonas de detección separadas 3a, 3b y 3c. Las zonas de detección están separadas mediante segmentos de bloqueo 24. Toda el área operativa está configurada como para proveer tres zona de detección 3a, b y c en comunicaciones operativas en sus bordes 11a, 11b y 11c con el canal de circulación de muestra 19 sobre la superficie inferior de la capa superior 16 del dispositivo (no se muestra en la figura). Las zonas de detección 3a, 3b y 3c están en comunicación operativa con los extremos de entrada 6a, 6b y 6c correspondientes de los canales de zona de captura respectivos. La zona de detección 3a contiene dos anticuerpos marcados, por ejemplo un anticuerpo marcado de biotina para CK-MB y un anticuerpo marcado con oro para CK-MB. En general, en la figura 11 los círculos negros representan anticuerpos marcados con oro mientras que los círculos blancos representan anticuerpos marcados con biotina. No se dan números de referencia para esos anticuerpos detectores con el fin de no aglomerar esta figura. Como un ejemplo de la separación del plasma de los glóbulos rojos durante la operación del dispositivo de la figura 11 , el frente de glóbulos rojos en cada una de las tres zonas de detección 3a, 3b y 3c se muestra como 13a, 13b y 13c, respectivamente, y la ubicación de los frentes de plasma respectivos se muestra como 14a, 14b y 14c, respectivamente. Si CK-MB está presente en la muestra, el complejo que se forma entrará al canal de captura en la entrada 6a para finalmente reaccionar con streptavidina en la línea de 7a de streptavidina para producir un producto visible. Reacciones análogas tienen lugar con otros analitos tales como troponina I o troponina T y con mioglobina en las trayectorias separadas que se muestran en la figura. Las figuras 12 a 16c se proveen para explicar adicionalmente la invención y mostrar su versatilidad.

Se pueden detectar de manera similar los mismos u otros analitos con reacciones de anticuerpo de antígeno convencionales. La figura 12 ilustra una capa de portador poroso 1 de la invención configurada para el análisis de sangre entera para un analito tal como troponina I. La figura muestra la capa de portador poroso 1 en la cual la porosidad de la capa ha sido destruida en algunas áreas para definir la zona de detección 3 y el canal 6 de zona de captura el cual está cerrado en el extremo terminal 12. La membrana 1 que es preferiblemente nitrocelulosa o material equivalente separa cromatograficamente los glóbulos rojos para formar ur frente 13 de glóbulos rojos y un frente 14 de plasma. En esta modalidad de la invención, la zona de detección contiene un anticuerpo 4 de detección marcado el cual está construido con la marca 5. El anticuerpo reacciona conr el analito, si está presente, para formar un complejo de anticuerpo marcado/antígeno. Los anticuerpos marcados 4, 5 son movibles, es decir, están depositados de manera movible mediante cualquiera de varios medios conocidos en la zona de detección 3 de manera que el complejo de anticuerpo marcado/analito una vez formado es libre de moverse corriente abajo hacia el canal 6 de zona de captura para reacción con un anticuerpo de captura en la línea 7 fijo de manera transversal al canal 6 de la zona de captura para formar un producto de reacción detectable.

El canal 6 de la zona de captura puede contener opcionalmente un producto 15 que reacciona con cualquier substancia que esté normalmente presente en sangre, plasma, suero u otra muestra para producir un producto visible. El uso de una reacción de control es opcional, pero se prefiere, de manera que el operador sabrá que se ha aplicado suficiente sangre u otro fluido al dispositivo para permitir que tengan lugar reacciones de diagnóstico. Se notará que la zona de detección 3 y el canal 6 de la zona de captura están en comunicación operativa, es decir, el fluido en la zona de detección 3 fluirá mediante acción capilar directamente hacia el canal 6 de la zona de captura a través del extremo de entrada 6a. También se notará que la zona de detección 3 tiene ' a geometría semicircular y por lo tanto un borde arqueado 11. El cenxro de este arco en donde la zona de detección 3 está en comunicación operativa con el canal 6 de zona de captura se puede considerar un segundo extremo u opuesto de la zona de detección 3 a través del cual el fluido puede fluir hac'a e! extremo de entrada 6a del canal de captura 6. Como resultado de esta configuración, todos los puntos sobre el borde 11 están esencialmente equidistantes del extremo de entrada 6 a del canal 6 de zona de captura y todo el fluido en la zona de detección fluye de manera uniforme hacia el canal 6 de zona de captura con segmentos sucesivos de la muestra alcanzando el extremo de entrada 6a a sustancialmente el mismo tiempo. Esta uniformidad de flujo desde varias direcciones se entenderá más claramente en conexión con la descripción de la capa superior que aparece enseguida.

Una característica principal del dispositivo de esta invención es que la corriente de plasma que fluye a través de la zona de detección 3 y el canal 6 de zona de captura alcanza la línea 7 de anticuerpo de captura. Existe poco o nada de anticuerpo marcado/antígeno atrapado en la zona de detección 3 como en las construcciones de la técnica anterior. En cambio, hay un flujo capilar rápido y eficiente del fluido desde la zona de detección 3 al canal 6 de zona de captura. El anticuerpo de captura 7 reacciona con y concentra el complejo de anticuerpo marcado/analito para formar el producto detectable con máxima eficiencia. Un resultado ventajoso de esta nueva configuración es que el tamaño del dispositivo de diagnóstico se puede reducir a un mjnimo. Se puede utilizar cualquiera de una variedad de marcas disponibles para el experto en la técnica en los dispositivos de esta invención. Se prefieren las marcas de metal y enzima. Los marcadores de metal se prefieren especialmente debido a su notable sensibilidad. Entre los metales, el oro es el más preferido debido a que se utiliza ampliamente para este tipo de reacción y sus características están muy bien entendidas. Además, una señal de oro se puede mejorar para volverse fácilmente visible mediante el uso de una sal de plata soluble y un agente reductor de acuerdo con procedimientos conocidos. La marca de oro actúa como un catalizador para reducir la sal de plata a plata metálica, la cual se deposita como un producto visible. Un par reactivo típico es lactato de plata, que sirve como la fuente de iones de plata reducibles, y hidroquinona como un agente reductor. La plata metálica forma un depósito * negro fácilmente distinguible alrededor de cada partícula de oro.

El tamaño de partícula preferido para anticuerpos marcados con oro que se utilizan en la invención es de 35 a 65 nm, aunque se puede tolerar variación apreciable dependiendo de factores bien entendidos tales como la concentración del analito y la afinidad de los reactivos. Si se utiliza una marca de enzima, tal como peroxidasa de rábano picante, la reacción se puede detectar mediante la adición de peróxido de hidrógeno y un colorante tal como orto fenilenediamina de acuerdo con procedimientos estándar. Puede haber una zona de pre incubación en la zona de detección aunque no es una característica necesaria de la invención. La zona de pre incubación se utiliza para remover productos presentes en la sangre que pueden interferir con las reacciones deseadas o hacerlas difíciles de detectar. Por ejemplo, si el dispositivo se va a utilizar para detectar analitos cardiacos, un interferente típico es la isoforma de creatina cinasa, CK-MM. Los anticuerpos a la isoforma CK-MB pueden reaccionar de manera cruzada con CK-MM y dar lecturas falsas. Esto se puede evitar proveyendo suficiente anticuerpo inmovilizado para CK-MM en una zona de pre incubación corriente arriba del anticuerpo movible para CK-MB de manera que todo el CK-MM se remueve antes de que la muestra en movimiento alcance el anticuerpo de detección. El dispositivo de la figura 12 puede utilizar uno o una pluralidad de anticuerpos detectores marcados y anticuerpos de captura en líneas de anticuerpos de captura inmovilizadas. Cuando se utilizan varios detectores marcados, se debe tener cuidado para evitar reacciones cruzadas que interfieren. Con frecuencia es mejor que los anticuerpos estén dispuestos en más de una zona de detección para reaccionar con sus analitos específicos como se explica enseguida en conexión con las otras figuras. El dispositivo de las figuras 12 y 13 también se puede preparar para utilizar la reacción de biotina/avidina utilizando variaciones tales como las que se describen anteriormente. En la variación actualmente preferida como se aplica al dispositivo de la figura 12, un anticuerpo marcado con biotina y un anticuerpo marcado con oro se colocan de manera movible en la zona de detección 3, en donde cada uno de ellos reacciona con un epítope diferente sobre el analito para formar un complejo terciario compuesto de anticuerpo marcado con biotina/analito/anticuerpo marcado con oro el cual se mueve mediante acción capilar hacia y a través del canal 6 de zona de captura en donde reacciona con avidina o streptavidina para concentrarse y formar un producto de reacción detectable. Por supuesto, los anticuerpos utilizados en esta invención pueden ser monoclonales o policlonales. Se pueden utilizar equivalentes similares de la reacción de biotina/avidina. Todos los reactivos mencionados en la presente se pueden reemplazar con equivalentes y son ilustrativos y no limitantes de la invención. El experto en la técnica reconocerá que cualquier substrato poroso que separa cromatográficamente los glóbulos rojos y el plasma de la sangre entera se puede utilizar en esta invención. Sin embargo, se prefiere nitrocelulosa porque está fácilmente disponible a un costo razonable. La nitrocelulosa se ha utilizado en cromatografía y campos relacionados durante tantos años que los científicos y los técnicos están familiarizados con sus propiedades. Las láminas de nitrocelulosa disponibles comercialmente se pueden formar fácilmente en cualquier formación seleccionada con cualquier configuración de canales seleccionada. Las membranas de nitrocelulosa de la invención se pueden caracterizar como tipo esponja con una pluralidad de micro poros de varios tamaños y dimensiones interconectados dando surgimiento a fuerzas capilares dentro de la membrana. Esto permite que el fluido biológico bajo investigación se mueva a lo largo de la trayectoria seleccionada. Para la separación de plasma de glóbulos rojos en la práctica de esta invención, el área, geometría y dimensiones de los varios dispositivos se seleccionan de tal manera que las reacciones deseadas tienen lugar en áreas pre seleccionadas conforme la muestra líquida se mueve a lo largo de trayectorias pre diseñadas. Para diagnóstico cardiaco de sangre entera, esas áreas se seleccionan en base a las velocidades relativas de los frentes de la corriente de glóbulos rojos y la corriente de plasma, las cinéticas de las reacciones deseadas, la afinidad de los anticuerpos para sus epítopes respectivos y otros factores que son bien conocidos para el experto en la técnica o que se determinan fácilmente mediante procedimientos de prueba convencionales. Aunque está disponible una amplia variedad de materiales de nitrocelulosa en varios tamaños de celda, los portadores porosos actualmente preferidos son aquellos que, si se utilizan como un filtro, es decir para filtrar partículas de una corriente de líquido que fluye verticalmente a la superficie horizontal de la membrana, evitará el paso de partículas más grandes de 3 a 12(m. En la práctica de la invención, se prefieren membranas con un tamaño de poro de 5 a 12(m, preferiblemente de 3 a 8(m. Es posible alguna variación. Sin embargo, conforme disminuye el tamaño de poro, disminuye la capacidad de moverse de un fluido dentro de la membrana, incrementando por lo tanto el tiempo que se requiere para el diagnóstico. Si los poros son demasiado grandes, el tiempo del paso se reduce con el resultado de que los reactivos no están en contacto uno con otro por un período de tiempo suficiente para que ocurran las reacciones de diagnóstico, o que ocurran a un grado tan limitado que no provean la información deseada. Las membranas de nitrocelulosa están disponibles comercialmente con soporte de poliéster u otras películas. Se prefieren estas para utilizarse en esta invención debido a que las membranas sin soporte tienden a ser bastante frágiles, susceptibles a fracturas y difíciles de manejar en un entorno de producción en masa. Además, las películas son impermeables a los fluidos que fluyen de manera que no interfieren con el flujo de muestras líquidas a través de las trayectorias seleccionadas de los dispositivos de esta invención. Una de dichas membranas está disponible en una variedad de tamaños de poro de Gerbermembrane de Gerbershausen, Alemania. Los anticuerpos que se utilizan en esta invención se preparan mediante técnicas estándar. Consultar, por ejemplo, Falfre, Howe, Milstein et al, Nature vol. 266, 7, 550-552, Abril de 1977. La descripción pertinente de este artículo respecto a la preparación de anticuerpos monoclonales está incorporada a la presente por referencia. Los procedimientos para fijar anticuerpos a substratos tales como nitrocelulosa son conocidos y utilizables en la producción de los dispositivos de esta invención. La nitrocelulosa es un aglutinante ávido por proteínas. De aquí que, el anticuerpo de captura inmóvil solo necesita^ aplicarse en la zona de captura en un área predeterminada. El anticuerpo detector marcado se puede fijar a la membrana de manera movible saturando primero la zona de detector con otra proteína tal como albúmina de suero bovino. La figura 13 muestra la configuración de una membrana porosa alterna con tres trayectorias de fluido, para utilizarse con tres analitos. La configuración y la operación de la membrana será evidente a partir de la explicación de la operación de los otros dispositivos. La figura 14 muestra una modalidad de la invención con la capa superior 16 y el portador poroso debajo de la misma, con dos trayectorias para detectar dos analitos, que se muestran como las zonas de detección 3a y 3b, y los canales 6a y 6b de la zona de captura, respectivamente, en la capa de portador poroso. El canal de circulación 19 arqueado se muestra en la capa superior 16. Este dispositivo muestra una abertura 17, opcionalmente biselada, en la capa superior que corre desde su superficie superior a la superficie interior que comunica con el canal de suministro de muestra 18, angosto, poco profundo, el cual comunica después con el canal de circulación de muestra 19 formado en su superficie de fondo. La abertura biselada se ilustra adicionalmente en las figuras 15 y 16a, como se describe enseguida. La figura 15 es una vista en perspectiva y las figuras 16A, 16B y 16C una vista despiezada de un dispositivo de la invención que muestra una capa superior 16, una "capa de soporte" (o "capa de fondo" o "pieza de fondo") 28, con un portador poroso 1 que tiene una capa de respaldo de plástico 29 emparedada entre ellas. El agujero que atraviesa 17 corre desde la superficie superior 30 a través hasta la superficie de fondo 31 en registro con un canal de suministro 18 formado en la superficie de fondo 31 de la capa superior 16. Con referencia adicional a las figuras 15 y 16, el canal de suministro de muestra 18 está en comunicación operativa con el canal d circulación 19 formado también en la superficie de fondo 31 de la capa superior 16. El canal de circulación 19, que tiene un diseño diferente del que se muestra en la figura 5, está cerrado en ambos extremos como se muestra mediante el número 20. El canal de circulación 19 está formado con las paredes internas 21 y las paredes exteriores 22. Como se muestra en la figura 16 a, las paredes interiores forman el borde de una ¡ndentación formada en la superficie de fondo 31 de la capa superior 16, referida como un separador capilar 23. El separador capilar 23 se muestra extendiéndose hacia el área 33, pero no es necesario que lo haga así. Con referencia a las figuras 16A y 16B, la capa superior 16 está adherida a la capa de soporte 28 mediante pasadores 34 que se pueden ajustar mediante fuerza en los agujeros 35 correspondientes. Se puede utilizar cualquier otro medio de adhesión equivalente y las dos capas 16 y 28 se pueden fijar de manera permanente o removible. El portador poroso 1 se muestra en la figura 16B con un respaldo 29 tal como una película de poliéster. Se mantiene entre las capas 16 y 28. El portador 1 puede tener las mismas dimensiones exteriores que las capas 16 y 28 en tanto exista una trayectoria operativa a través de la cual el fluido añadido a través del agujero que atraviesa 17 pueda pasar a través del canal de suministro, el canal de circulación, los canales de la zona de detección y de la zona de captura a los extremos cerrados 12 y 20 respectivamente, de los canales 27a, 27b y 27c de la zona de captura, y del canal de circulación 19, respectivamente. La membrana porosa 1 que se muestra en la figura 16C está configurada de manera similar al portador poroso de la figura 11 para la detección de esos anali-os. De acuerdo con esto contiene tres zonas de detección 24, 25 y 26 que comunican con tres canales 27a, 27b y 27c de zona de captura, respectivamente. (Se debe notar que los números 24, 25 y 26 como se utilizan en la presente corresponden respectivamente a los números 3 a, 3b y 3c de la figura 11 anterior, y los números 27 a, b, c corresponden al número 6 de la figura 4 anterior). El borde arqueado 11 de las zonas de detección se extiende sobre las paredes interiores 21 del canal de circulación 19 de manera que cuando se detiene el flujo de fluido en los extremos 20, fluirá mediante acción capilar hacia las zonas de detección 24, 25 y 26. Ahora es evidente el propósito del separador capilar 23. Si, en ausencia del separador capilar 23, el portador poroso 1 estuviera en contacto con una superficie de fondo plano de la capa superior 16, el fluido en el canal de circulación 19 fluiría entre esa superficie y el portador poroso 1 en vez de a través de la membrana en su trayectoria preseleccionada desde el agujero que atraviesa 17 a los extremos de los canales de la zona de captura. El flujo se detiene en los extremos del canal de circulación para que sea posible controlar el tamaño de la muestra. Se puede proveer una ventana 39 opcional sobre una extensión opcional del canal de circulación de muestra, se muestra como una estructura punteada en las figuras 15 y 16 a, para indicar que la muestra adecuada se ha aplicado para llenar el canal. Si la capa superior 16 es transparente, será evidente fácilmente la formación de un producto de reacción visible. Si la capa superior 16 es opaca se construirá con una o más ventanas de observación que se muestran como 36, 37, 38. Esas ventanas como se muestra en la figura 15 estarán en registro con los canales de la zona de captura de manera que el operador puede ver la formación de productos coloreados o ajustar un instrumento tal como un reflectómetro para determinar si se ha formado un producto de reacción detectable. El dispositivo de la figura 15 tiene tres ventanas separadas para propósitos de ilustración. En dispositivos preferidos, habrá una ventana que se extiende transversalmente de la superficie superior 30 de manera que los resultados de todas las reacciones se pueden ver al mismo tiempo. Una de las ventajas de esta invención es que aunque los dispositivos estén diseñados para medir uno, dos o tres antígenos, pueden tener las mismas dimensiones. Por supuesto, la capa de portador poroso 1 estará diseñada de diferente manera en cada caso. Sin embargo, la capa superior 16 no requiere ningún cambio para ajustar con capas de portador 1 diseñadas de diferente manera. La figura 17 A es una vista en perspectiva y las figuras 17A, 17B y 17C una vista despiezada de un dispositivo de la invención que muestra una capa superior 16, una capa de soporte 28, con un portador poroso 1 que tiene una capa de respaldo de plástico 29 emparedada entre ellas. El agujero que atraviesa 17 corre desde la superficie superior 30 a través hasta la superficie de fondo 31 de ia capa superior 16 en registro con un canal de suministro de muestra 18 formado en la superficie de fondo 31 de la capa superior 16. El canal de suministro de muestra 18 está en comunicado, i operativa con un canal de circulación de muestra 19 formado también en la superficie de fondo 31 de la capa superior 16. El canal de circulación 19 está cerrado en ambos extremos como se muestra mediante el número 20. El canal de circulación 19 está formado con las paredes internas 21 y las paredes exteriores 22. Como se muestra en la figura 17B, las paredes interiores 21 forman el borde de una indentación formada en la superficie de fondo 31 de la capa superior 16, referida como un separador capilar 23. El separador capilar 23 se muestra extendiéndose hacia el área 33, pero no es necesario que lo haga así. Con referencia adicional a las figuras, la capa superior 16 está adherida a la capa de soporte 28 mediante pasadores 34 que se pueden ajustar mediante fuerza en los agujeros 35 correspondientes. Se puede utilizar cualquier otro medio de adhesión equivalente y las dos capas 16 y 28 se pueden fijar de manera permanente o removible. El portador poroso 1 se muestra en la figura 17C con un respaldo 29 tal como una película de poliéster. Se mantiene entre las capas de soporte 16 y 28. El portador 1 puede tener las mismas dimensiones exteriores que las capas 16 y 28 en tanto exista una trayectoria operativa a través de la cual el fluido añadido a través del agujero que atraviesa 17 pueda pasar a través del canal de suministro 18, el canal de circulación 19, los canales 50, 51 y 52 de la zona de detección y los canales 27a, 27b y 27c de la zona de captura a los extremos cerrados 20 y 12 respectivamente, del canal de circulación 19, y de los canales 27a, 27b y 27c de la zona de captura, respectivamente. (Se debe notar que los números 50, 51 y 52 como se utilizan en la presente corresponden respectivamente a los números 3a, 3b y 3c de la figura 11 anterior, y los números 27a, b, c corresponden al número 6 de la figura 4 anterior). La porosidad de la porción del portador poroso 1 situada en contacto con el canal de suministro de muestra 18 se destruye con el fin de evitar el flujo de muestra en la membrana. La membrana porosa 1 que se muestra en la figura 17C está configurada para la detección de tres analitos. De acuerdo con esto contiene tres zonas de detección o canales 50, 51 y 52 que comunican con tres canales de zona de captura 27a, 27b y 27c, respectivamente. El borde arqueado 11 contiguo a las zonas de detección 50, 51 y 52 se extiende sobre las paredes interiores 21 del canal de circulación 19 de manera que cuando se detiene el flujo de fluido en los extremos 20, fluirá mediante acción capilar hacia las zonas de detección 50, 51 y 52. Con referencia adicional a la figura 17, el flujo se detiene en los extremos 20 del canal de circulación para que sea posible controlar el tamaño de la muestra. Se puede proveer una ventana 39 opcional sobre una extensión opcional del canal de circulación de muestra, se muestra como una estructura punteada 53 en las figuras 17A y 17B, para indicar que la muestra adecuada se ha aplicado para llenar el canal. La porción correspondiente del portador 1 está bloqueada para limitar el flujo al canal opcional, así como a la porción correspondiente del portador abajo del canal de suministro de muestra. Una ventaja adicional del diseño del dispositivo de la invención es que las mismas piezas de capa superior e ¡nferior se pueden utilizar para una variedad de dispositivos diferentes. Si la capa superior 16 es transparente, será evidente fácilmente la formación de un producto de reacción visible. Si la capa superior 16 es opaca se construirá con una o más ventanas de observación, que se muestran en este ejemplo como una sola ventana 37, y una ventana 38 de indicador de fin de prueba. Esas una o más ventanas como se muestran en la figura 17A estarán en registro con los canales de la zona de captura de manera que el operador puede ver la formación de productos coloreados o ajustar un instrumento tal como un reflectómetro para determinar si se ha formado un producto de reacción detectable. Se provee una ventana 38 opcional de indicador de fin de prueba para indicar cuando ha terminado la prueba mediante, por ejemplo, la presencia de un colorante en el portador poroso 1 corriente arriba de la ventana 38 de indicador de fin de prueba pero corriente debajo de la porción del portador poroso 1 debajo de la ventana 37 y la zona de captura 7. El colorante se lleva a la ventana del indicador de fin de prueba cuando la muestra ha pasado a la zona de captura. En otra modalidad, como se muestra en la figura 18, el canal 6 de la zona de captura puede contener opcionalmente un producto 15 el cual reacciona con cualquier substancia que normalmente está presente en sangre, plasma, suero u otro fluido corporal para producir un producto visible. Esta configuración se puede proveer sobre el portador poroso 1 ya sea en la ventana 37 o en la ventana 38 del indicador de fin de prueba. El dispositivo que se ilustra en la figura 17A tiene una sola ventana para observar la zona de captura y una ventana de indicador de fin de prueba para propósitos de ilustración. En dispositivos preferidos, habrá una ventana que se extiende transversalmente de la superficie superior 30 de manera que los resultados de todas las reacciones se pueden ver al mismo tiempo. Se notará a partir de las figuras 17 A-17D que las dimensiones del canal de suministro de muestra 18 son uniformes a través de su longitud y que la membrana 1 se extiende bien hacia el canal de suministro. También se nota que la porosidad de la porción de la membrana situada abajo del canal de suministro de muestra 18 está destruida para evitar que la muestra se extienda a lo largo de la porosidad de la membrana. Lo siguiente describe un segundo aspecto de la invención. Como se mencionó anteriormente, los dispositivos de esta invención se pueden utilizar para analizar una variedad de muestras líquidas, especialmente muestras biológicas que se pueden analizar mediante reacciones convencionales de antígeno/anticuerpo de la variedad competitiva o de emparedado utilizando reactivos marcados que emiten una señal detectable. El experto en la técnica reconocerá que existen varias aplicaciones del dispositivo de la invención. Está contemplado actualmente que la invención encontrará su principal utilidad para el diagnóstico de sangre entera para la presencia de analitos cardiacos tales como troponina I, troponina T, mioglobina, CK-MB, cadena ligera de miocina, proteína de unión a ácido graso, glicogen fosforilasa BB, actina y cualquiera de un hospedero de otros analitos conocidos que se encuentran en la sangre conforme el tejido cardiaco se deteriora después de un evento isquémico tal como angina o infarto al miocardio. De acuerdo con esto, la invención se describirá principalmente como se utiliza en el diagnóstico de eventos cardiacos. Sin embargo, el dispositivo se puede adaptar para utilizarse para detectar una amplia variedad de analitos mediante análisis inmunológico y otros formatos de análisis que aprovechan la separación de plasma de glóbulos rojos en un flujo de fluido cromatográfico del dispositivo de la presente invención. De hecho, y como se verá enseguida, se puede configurar un solo dispositivo para realizar una pluralidad de análisis de más de un formato, por ejemplo un inmunoanálisis y un análisis basado en enzima, al proveer los componentes de análisis particulares en cada una de las trayectorias de fluido separadas en el dispositivo. Las estructuras de la invención son especialmente útiles para analizar sangre, suero y plasma para CK-MB, mioglobina, cadena ligera de míocina, troponina I, troponina C, troponina T, y complejos de troponina I, troponina C y troponina T que contengan al menos dos sub unidades de troponina como se describe en las patentes de E.U.A. 5,747,274, 5,290,678, y 5,710,008, el contenido pertinente de las cuales está incorporado a la presente por referencia. Se notará a partir de las figuras 17A, 17B, 17C y 17D que el canal de suministro 18 del dispositivo anterior está en ángulo justo debajo de la entrada hacia el canal de circulación 19. Esto hace posible acortar la longitud total de la membrana 1. También se notará que hay una extensión del portador poroso 1 que se extiende a todo lo largo del canal de suministro de muestra 18. Ahora se ha descubierto que la longitud del portador poroso 1 (membrana) se puede reducir para extenderse solamente desde la porción abajo del canal de circulación de muestra tan lejos como sea necesario para definir una trayectoria de fluido desde el canal de suministro de muestra 18, al canal de circulación do muestra 19 y hacia la membrana. Cualquier extensión pequeña 105 de la membrana 1 necesaria para extenderse hacia el canal de suministro de muestra tiene su porosidad destruida de manera que la muestra no fluya a través de la membrana, y que la trayectoria de fluido sea desde el canal de suministro de muestra al canal de circulación de muestra y después hacia la membrana. El canal de suministro de muestra 18 puede ser recto o contener un ángulo. Otra ventaja del dispositivo de esta invención es que la sección del canal de suministro 18 que entra al canal de circulación 19 se puede reducir en sección transversal de manera que existirá movimiento capilar de la muestra hacia esa sección del canal de suministro de muestra 18 que tiene la dimensión más pequeña. La ventaja particular de esta configuración es que la sección del canal de suministro de muestra 18 que tiene el volumen más grande puede diseñarse, de hecho, para contener el volumen exacto de muestra necesario para conducir el análisis. La colocación acertada de las ventanas de observación como se explica enseguida permitirá que el operador esté en completo control de toda la operación. Como se anotó anteriormente, una mejora de esta invención es um reducción en el tamaño del portador poroso 1 del dispositivo, reduciendo el costo y evitando la necesidad de eliminar la porosidad de la porción de la membrana en contacto con la muestra en el área del canal de suministro de muestra 18, por ejemplo, mediante impresión con una tinta especial. Una mejora adicional es un canal de suministro de muestra con un medio de suministro de volumen como se describe anteriormente, en el cual una vez que el canal de suministro de muestra 18 está lleno con muestra a su volumen predeterminado, el volumen completo de muestra se vacía hacia el canal de circulación de muestra 19 para iniciar el inmunoanálisis. Una ventana opcional 91 en o cerca de la unión del canal de suministro de muestra y el canal de circulación de muestra 19 sirve para indicar que se ha aplicado la muestra adecuada al dispositivo. La figura 18 ilustra una capa de portador poroso seco 1 (también referida como membrana) de la invención configurada para el análisis de sangre entera para un analito o una pluralidad de analitos mediante reacciones entre el analito(s) y pares de anticuerpos que reaccionan con diferentes epítopes sobre el analito en la clásica reacción de antígeno/anticuerpo utilizando pares de anticuerpos policlonales o monoclonales, estando marcado un miembro del par seleccionado. La figura muestra la capa de portador 1 en la cual la porosidad de una sección seleccionada o borde demarcado de la capa ha sido destruida para dejar un área porosa definida que comprende una zona de detección semicircular 3 con un borde 11 y el canal 6 de la zona de captura el cual está cerrado en el extremo terminal 12. El borde 11 incluye una pequeña extensión ^05 la cual, en el dispositivo ensamblado, está en registro con la unión arriba del mismo entre el canal de suministro de muestra 18 y el canal de circulación de muestra 19, como se observará claramente en la vista en sección transversal en la figura 21. Esta extensión 105 estará en contacto con e! fluido que será analizado. Su porosidad está destruida. La porción de la membrana, una extensión auxiliar 105 que se extiende más allá del canal de circulación de muestra hacia el canal de suministro de muestra se pueden reducir a un tamaño muy pequeño, o eliminarse completamente, con la condición de que los canales y las estructuras correspondientes que sostienen la membrana en posición definan la trayectoria de fluido desde el canal de suministro de muestra al canal de circulación de muestra y después hacia la membrana. Los varios separadores y cavidades capilares que se describen en la presente cooperan para mantener esta trayectoria de fluido definida. Otras variaciones de esas partes que logran la trayectoria de fluido mencionada anteriormente están abarcadas dentro de la presente invención. Esta membrana 1 que para análisis de sangre entera es preferiblemente nitrocelulosa o material equivalente separa cromatográficamente los glóbulos rojos para formar un frente 13 de glóbulos rojos y un frente 14 de plasma corriente debajo de la misma. Para el análisis de otras muestras líquidas, pueden ser preferibles otros materiales. La zona de detección 3 contiene anticuerpo de detección 4 con marca detectable 5 que reacciona con el analito, si está presente, para formar un complejo de anticuerpo marcado/antígeno. , Aunque, por conveniencia, solamente se muestra un anticuerpo, la zona de detección 3 puede contener varios anticuerpos marcados. El anticuerpo marcado 4 es movible, es decir, está depositado de manera movible en la zona de detección 3 mediante cualquiera de varios medios conocidos de manera que el complejo de anticuerpo marcado/analito una vez formado es libre de moverse corriente abajo hacia el canal 6 de zona de captura para reacción con el anticuerpo de captura 7 fijo de manera transversal al canal 6 de la zona de captura para formar un producto de reacción detectable. Nuevamente, por conveniencia, solamente se muestra una línea de anticuerpo de captura 7, pero puede existir una pluralidad de tales líneas, una para cada analito que será detectado. El canal 6 de la zona de captura puede contener opcionalmente un producto 15 que reacciona con cualquier substancia que está normalmente presente en el fluido que será analizado para producir un producto de control visible. El uso de una reacción de control es opcional, pero se prefiere. Esta reacción indica que el fluido ha pasado la zona de captura, y funciona como un indicador de fin de prueba. La capa de portador poroso seco 1 (también referida como la membrana 1) necesita ser solamente suficientemente grande para comprender los componentes que se muestran en la figura 18, y no necesita extenderse a la porción del dispositivo que comprende el canal de suministro de muestra. Como se verá enseguida, el dispositivo presente puede configurarse para acomodar la capa de portador poroso seco 1 más pequeña, y aún lograr los objetos de la invención. Al reducir la cantidad de membrana porosa seca que se requiere para el dispositivo, se reduce el costo de materiales. Enseguida se anotarán ventajas adicionales de reducir el tamaño de la capa de portador poroso seco, en particular, en ausencia de membrana en el canal de suministro de muestra. La figura 19A muestra la configuración de la superficie inferior 23 de la capa superior 16 que se pondrá en registro con la superficie superior de la capa ¡nferior 28, que se muestra en la figura 19B, con la membrana 1 de la figura 18 entre las mismas en el área 103, para proveer una modalidad de la invención. La capa superior 16 tiene un agujero que atraviesa 17 para aplicación de la muestra. Está en comunicación operativa con el canal de suministro de muestra 18 el cual comunica con el canal de circulación de muestra 19. El canal de suministro de muestra 18 tiene paredes que definen el canal, y un separador capilar 23 más allá de las paredes para confinar la muestra al canal y evitar que la muestra fluya entre la superficie inferior opuesta de la capa superior y la superficie superior de la capa ¡nferior. Esto se muestra en sección transversal en la figura 20. El canal de circulación de muestra 19 se muestra en una configuración arqueada con el fin de conformarse con el borde 11 de la zona de detección semicircular 3 de la figura 18. El canal de circulación de muestra 19 está cerrado en ambos extremos 20. Está formado con la pared interior 21 y la pared exterior 22 y está rodeado por un separador capilar 23 el cual funciona para asegurar que el flujo de la muestra es hacia la zona de detección 3 de la figura 18 en todos los puntos del borde 11 , y después hacia el canal de captura 6 en su extremo de entrada 6 a. La figura 19B muestra la configuraaón de la superficie superior de la capa inferior 28. Un área plana rectangular 103 hundida en la superficie superior 98 de la capa inferior 28 sostiene la membrana 1. La profundidad del área 103 desde la superficie 98 es suficiente de manera que la superficie superior de la membrana 1 está al mismo nivel que la superficie superior 98. Están contempladas por la presente invención otras configuraciones del área 103, tales como si se extendiera a los bordes de la sección superior 28. En otra modalidad, no se provee receso pero la capa superior 16 y la capa inferior 28 están configuradas para sostener la membrana 1 en la orientación correcta. Solamente es necesario que las capas superior e inferior estén juntas con la membrana en medio para definir la trayectoria de fluido desde el agujero que atraviesa 17 al extremo del canal de membrana 12. El grosor de los varios canales se puede ajustar de acuerdo con esto. La membrana 1 está colocada para hacer contacto con la superficie 99 de una cavidad 102 localizada en la interfaz entre el canal de suministro de muestra 18 y el canal de circulación de muestra 19. La figura 30C muestra esta cavidad en una representación tridimensional para ayudar a transmitir la relación entre las partes del dispositivo, así como su función. Cuando la capa superior 16 y la capa ¡nferior 28 están alineadas para operación del dispositivo, el canal de suministro de muestra en la superficie inferior de la capa superior 16 pasa a lo largo de la extensión 101 hasta que encuentra al canal de circulación 19. Las posiciones relativas de la cavidad 102, la unión de la membrana con la orilla 99, y la unión del canal de suministro de muestra 18 y el canal de circulación de muestra 19 arriba de ellos forman un conducto de tal manera que el fluido fluye desde el canal de suministro de muestra 18 hacia el canal de circulación de muestra 19 arriba de la membrana. El flujo de fluido está confinado al canal de circulación de muestra 19 y hacia la membrana 1 debido a que el contacto entre la membrana 1 y la orilla 99 está aislado por aire de otros contactos de superficie que pueden proveer conductos capilares alternos para el fluido. Las paredes del canal de suministro de muestra 18, rodeadas por un separador capilar 23 y extendiéndose desde el agujero que atraviesa 17 hacia el canal de circulación de muestra 19, se extienden a lo largo de la extensión 101 de manera que el separador capilar 23 de la superficie ¡nferior de la capa superior 16 corresponde con la porción de la cavidad 102 de la superficie superior de la capa ¡nferior 28.

Esas relaciones se explicarán adicionalmente mediante referencia a las vistas en sección transversal y a las figuras 20-23 enseguida. Como tales, las paredes y el separador capilar terminan en una unión de aire, evitando también que el fluido fluya más allá de las paredes del canal de suministro de muestra 18, dejando que el fluido siga fluyendo mediante acción capilar al canal de circulación de muestra 19. Las figuras 20, 21 , 22 y 23 son vistas en sección a lo largo de las líneas A-A, B-B, C-C y D-D respectivamente, de la figura 19 A. Números similares tienen el mismo significado. Las dimensiones (mm) son simplemente para ilustración. Las dimensiones no ajustan a escala. La figura 20 muestra el canal de suministro de muestra 18, formado como un receso capilar en la capa superior 16, definido además por una pared de fondo formada de la porción opuesta de la superficie superior de la capa de fondo 28 del dispositivo, y definido además por paredes sobre cada lado que están rodeadas además por un separador capilar 23 para contener el flujo de fluido dentro del canal. El grado de las dimensiones del separador capilar sobre cualquier lado del canal es opcional, y se puede extender a o casi al perímetro de la capa superior. La figura 21 muestra una sección longitudinal a lo largo de la dirección del canal de suministro de muestra 18 en donde se une al canal de circulación de muestra 19, y muestra además la posición de la membrana bajo los mismos y su contacto con la orilla 99 de la cavidad 102 (como se le hace referencia en la figura 19B). Como se describe anteriormente, la membrana está colocada de tal manera que el único conducto desde el canal de suministro de muestra es hacia el canal de circulación de muestra y después hacia la membrana, ya que ningún otro conducto posible desde la muestra se extiende desde esta área, excepto los grosores de las paredes del canal de circulación de muestra 19, definido por los separadores capilares 23 en ambos lados, como se describe adicionalmente enseguida. La parte ¡nferior del canal de suministro de muestra está en contacto con la orilla de la membrana solamente en la orilla 99 como se muestra en la figura 19B, y por lo tanto la membrana está aislada mediante aire del contacto con cualquier otra parte del dispositivo por virtud de la cavidad 102 que se extiende abajo y a los lados de la extensión 101 de la superficie superior de la capa inferior 28. De esta manera, el flujo de fluido se limita a los canales definidos La extensión pequeña 105 del canal de circulación de muestra como se muestra en la figura 18 corresponde a la porción de la membrana 1 que se extiende abajo del canal de suministro de muestra en su unión con el canal de circulación de muestra 19 y se apoya en la orilla 99 de la cavidad 102. Esta extensión puede estar abierta, o preferiblemente bloqueada, al tener su porosidad destruida, por ejemplo, mediante impresión con una tinta especial. Su propósito es evitar que la sangre se mueva fuera de la trayectoria de muestra definida sobre la membrana 1 , y definir la trayectoria de fluido desde el canal de suministro de muestra al canal de circulación de muestra y después hacia la membrana. La figura 22 representa una vista en sección transversal a través del dispositivo al nivel del canal de suministro de muestra 18 en la posición en donde se extiende sobre la extensión 101 hacia la cavidad 102 (como se le hace referencia en la figura 19B). La cavidad 102 en combinación con el separador capilar coopperan de tal manera que el conducto de fluido está confinado al canal de suministro de muestra 18, en donde subsecuentemente se une al canal de circulación de muestra 19 sobre la membrana 1. Los anchos de las paredes del canal de suministro de muestra 18 están confinados dentro del ancho de la extensión 101 , de manera que la orilla más exterior de las paredes se une al separador capilar 23 y la cavidad 102, evitando que nada de fluido fluya más allá de los grosores de las paredes del canal de suministro de muestra 18. El ancho de los separadores capilares 23 sobre el exterior del canal de suministro de muestra 18 se puede variar en la construcción del dispositivo. La figu a 23 muestra una sección transversal del canal de circulación de muestra 1. En operación, la muestra entra al canal de circulación de muestra 19 y se mueve rápidamente mediante acción capilar a los extremos 20 del canal de circulación de muestra 19. Una vez que el canal está lleno, la muestra hace contacto con la membrana 1 a todo lo largo del canal de circulación de muestra 19 y pasa hacia la membrana esencialmente de manera simultánea desde todo el arco del canal de circulación de muestra 19 hacia el borde 11 y hacia la zona de detección 3. La figura 24 es similar a la figura 18 excepto que la zona de detección 3 es de configuración rectangular y el canal de circulación de muestra 19 que circunscribe el borde 11 es rectangular de manera similar. Como con la figura 18 el dispositivo se muestra con un anticuerpo de detección 4 y 5, marcado, móvil, y un anticuerpo de captura fijo 7. El dispositivo de la figura 24 se puede utilizar para detectar uno o más de un analito con la condición de que no hay cantidad sustancial de reacción cruzada. La figura 25 muestra la configuración de una membrana 1 actualmente preferida de la invención en la cual se utiliza la reacción de biotina/streptavidina para diagnosticar una muestra de sangre entera para la presencia de tres analitos. Se ha descrito aquí anteriormente en la figura 11 , con la excepción de la pequeña extensión 105 en la porción de la membrana 1 en contacto con la unión entre el canal de suministro de muestra 18 y el canal de circulación de muestra 19. La configuración de los canales en la capa superior se puede entender fácilmente a partir de la explicación anterior y de la siguiente explicación. Fn la figura números similares tienen el mismo significado como en las otras figuras. El diseño se puede utilizar para determinar la presencia de varios analiiús tales como mioglobina, troponina I o T y CK-MB en una muestra pequeña. La membrana 1 está formada con tres trayectorias distintos, una para cada analito que conduce desde los bordes 11 a, 11b y 11c de tres zonas de detección separadas 3a, 3b y 3c. Las zonas de detección están separadas mediante segmentos de bloqueo 24. Toda el área operativa está configurada como para proveer tres zonas de detección 3a, b y c en comunicaciones operativas en sus bordes 11 a, 11 b y 11c con el canal de circulación de muestra 19 sobre la superficie ¡nferior de la capa superior 16 del dispositivo. Las zonas de detección 3a, 3b y 3c están en comunicación operativa con los extremos de entrada 6a, 6b y 6c correspondientes, de los canales de zona de captura respectivos. - La zona de detección 3a contiene dos anticuerpos marcados, por ejemplo un anticuerpo marcado de biotina para CK-MB y un anticuerpo marcado con oro para CK-MB. En general, en la figura 25 los círculos negros representan anticuerpos marcados con oro mientras que los círculos negros representan anticuerpos marcados con biotina. No se dan números de referencia para esos anticuerpos detectores con el fin de no aglomerar esta figura. Como un ejemplo de la separación del plasma de los glóbulos rojos durante la operación del dispositivo de la figura 25, el frente de glóbulos rojos en cada ?:?a de las tres zonas de detección 3a, 3b y 3c se muestra como 13a, 13b y 13c, respectivamente, y la ubicación de los frentes de plasma respectivos se muestra como 14a, 14b y 14c, respectivamente. Si CK-MB está presente en la muestra, el complejo que se forma entrará al canal de captura en la entrada 6a para finalmente reaccionar con streptavidina en la línea de 7a de streptavidina para producir un producto visible. Reacciones análogas tienen lugar con otros analitos tales como troponina I o troponina T y con mioglobina en las trayectorias separadas que se muestran en la figura. Se pueden detectar similarmente los mismos u otros analitos con reacciones de antígeno/anticuerpo convencionales. Las figuras 26 a 30c se proveen para explicar adicionalmente la invención y para mostrar su versatilidad. La figura 26 ilustra una capa de portador poroso 1 de la invención configurada para el análisis de sangre entera para un analito tal como troponina I. La figura muestra la capa de portador poroso 1 en a cual la porosidad de la capa ha sido destruida en algunas áreas para definir la zona de detección 3 y el canal 6 de zona de captura el cual está cerrado en el extremo terminal 12. La membrana 1 que es preferiblemente de nitrocelulosa o material equivalente separa cromatograficamente los glóbulos rojos para formar un frente 13 de glóbulos rojos y un frente 14 de plasma. En esta modalidad de la invención, la zona de detección contiene un anticuerpo 4 de detección marcado el cual está construido con la marca 5. El anticuerpo reacciona con el analito, si está presente, para formar un complejo de anticuerpo marcado/antígeno. Los anticuerpos marcados 4 son movibles, es decir, están depositados de manera movible mediante cualquiera de varios medios conocidos en la zona de detección 3 de manera que el complejo de anticuerpo marcado/analito una vez formado es libre de moverse corriente abajo hacia el canal 6 de zona de captura para reacción con un anticuerpo de captura en la línea 7 fijo de manera transversal al canal 6 de la zona de captura para formar un producto de reacción detectable. El canal 6 de la zona de captura puede contener opcionalmente un producto 15 que reacciona con cualquier substancia que esté normalmente presente en sangre, plasma, suero u otra muestra para producir un producto visible. El uso de una reacción de control es opcional, pero se prefiere, de manera que el operador sabrá que se ha aplicado suficiente sangre u otro fluido al dispositivo para permitir que tengan lugar reacciones de diagnóstico.

Se notará que la zona de detección 3 y el canal 6 de la zona de captura están en comunicación operativa, es decir, el fluido en la zona de detección 3 fluirá mediante acción capilar directamente hacia el canal 6 de la zona de captura a través del extremo de entrada 6a. También se notará que la zona de detección 3 tiene una geometría semicircular y por lo tanto un borde arqueado 11. El centro de este arco en donde la zona de detección 3 está en comunicación operativa con el canal 6 de zona de captura se puede considerar un segundo extremo u opuesto de la zona de detección 3 a través del cual el fluido puede fluir hacia el extremo de entrada 6a del canal de captura 6. Como resultado de esta configuración, todos los puntos sobre el borde 11 están esencialmente equidistantes del extremo de entrada 6a del canal 6 de zona de captura y todo el fluido en el canal 3 de la zona de detección fluye de manera uniforme hacia el canal 6 de zona de captura con segmentos sucesivos de la muestra alcanzando el extremo de entrada 6a a sustancialmente el mismo tiempo. Esta uniformidad de flujo desde varias direcciones se entenderá más claramente en conexión con la descripción de la capa superior que aparece en la presente. Una característica principal del dispositivo de esta invención es que cuando la corriente de plasma fluye a través de la zona de detección 3 y el canal 6 de zona de captura y alcanza la línea 7 de anticuerpo de captura, hay poco o nada de anticuerpo marcado/antígeno atrapado en la zona de detección 3 como en las construcciones de la técnica anterior. En cambio, hay un flujo capilar rápido y eficiente del fluido desde la zona de detección 3 al canal 6 de zona de captura. El anticuerpo de captura 7 reacciona con y concentra el complejo de anticuerpo marcado/analito para formar el producto detectable con máxima eficiencia. Un resultado ventajoso de esta nueva configuración es que el tamaño del dispositivo de diagnóstico se puede reducir a un mínimo. Se puede utilizar cualquiera de una variedad de marcas disponibles para el experto en la técnica en los dispositivos de esta invención. Se prefieren las marcas de metal y enzima. Los marcadores de metal se prefieren especialmente debido a su notable sensibilidad. Entre los metales, el oro es el más preferido debido a que se utiliza ampliamente para este tipo de reacción y sus características están muy bien entendidas. Además, una señal de oro se puede mejorar para volverse fácilmente visible mediante el uso de una sal de plata soluble y un agente reductor de acuerdo con procedimientos conocidos. La marca de oro actúa como un catalizador para reducir la sal de plata a plata metálica, la cual se deposita como un producto visible. Un par reactivo típico es lactato de plata, que sirve como la fuente de ¡ones de plata reducibles, y hidroquinona como un agente reductor. La plata metálica forma un depósito negro fácilmente distinguible alrededor de cada partícula de oro. El tamaño de partícula preferido para anticuerpos marcados con oro que se utilizan en la invención es de 35 a 65 nm, aunque se puede tolerar variación apreciable dependiendo de factores bien entendidos tales como la concentración del analito y la afinidad de los reactivos., Si se utiliza una marca de enzima, tal como peroxidasa de rábano picante, la reacción se puede detectar mediante la adición de peróxido de hidrógeno y un colorante tal como orto fenilenediamina de acuerdo con procedimientos estándar. Puede haber una zona de pre incubación en la zona de detección aunque no es una característica necesaria de la invención. La zona de pre incubación se utiliza para remover productos presentes en la sangre que pueden interferir con las reacciones deseadas o hacerlas difíciles de detectar. Por ejemplo, si el dispositivo se va a utilizar para detectar analitos cardiacos, un ?nterferente típico es la isoforma de creatina cinasa, CK-MM. Los anticuerpos a la isoforma CK-MB pueden reaccionar de manera cruzada con CK-MM y dar lecturas falsas. Esto se puede evitar proveyendo suficiente anticuerpo inmovilizado para CK-MM en una zona de pre incubación corriente arriba del anticuerpo movible para CK-MB de manera que todo el CK-MM se remueve antes de que la muestra en movimiento alcance el anticuerpo de detección. El dispositivo de la figura 26 puede utilizar uno o una pluralidad de anticuerpos detectores marcados y anticuerpos de captura en líneas de anticuerpos de captura inmovilizadas. Cuando se utilizan varios detectores marcados, se debe tener cuidado para evitar reacciones cruzadas que interfieren. Con frecuencia es mejor que los anticuerpos estén dispuestos en más de una zona de detección para reaccionar con sus analitos específicos como se explica enseguida en conexión con las otras figuras. El dispositivo de las figuras 26 y 27 también se puede preparar para utilizar la reacción de biotina/avidina utilizando variaciones tales como las que se describen anteriormente. En la variación actualmente preferida como se aplica al dispositivo de la figura 29, un anticuerpo marcado con biotina y un anticuerpo marcado con oro se colocan de manera movible en la zona de detección 3, en donde cada uno de ellos reacciona con un epítope diferente sobre el analito para formar un complejo terciario compuesto de anticuerpo marcado con biotina/analito/anticuerpo marcado con oro el cual se mueve mediante acción capilar hacia y a través del canal 6 de zona de captura en donde reacciona con avidina o streptavidina para concentrarse y formar un producto de reacción detectable. Por supuesto, los anticuerpos utilizados en esta invención pueden ser monoclonales o policlonales. Se pueden utilizar equivalentes similares de la reacción de biotina/avidina. Todos ios reactivos mencionados en la presente se pueden reemplazar con equivalentes y son ilustrativos y no limitaciones de la invención. El experto en la técnica reconocerá que cualquier substrato poroso que separa cromatográficamente los glóbulos rojos y el plasma de la sangre entera se puede utilizar en esta invención. Sin embargo, se prefiere nitrocelulosa porque está fácilmente disponible a un costo razonable. La nitrocelulosa se ha utilizado en cromatografía y campos relacionados durante tantos años que los científicos y los técnicos están familiarizados con sus propiedades. Las láminas de nitrocelulosa disponibles comercialmente se pueden formar fácilmente en cualquier formación seleccionada con cualquier configuración de canales seleccionada. Las membranas de nitrocelulosa de la invención se pueden caracterizar como tipo esponja con una pluralidad de micro poros de varios tamaños y dimensiones interconectados dando surgimiento a fuerzas capilares dentro de la membrana. Esto permite que el fluido biológico bajo investigación se mueva a lo largo de la trayectoria seleccionada. Para la separación de plasma de glóbulos rojos en la práctica de esta invención, el área, geometría y dimensiones de los varios dispositivos se seleccionan de tal manera que las reacciones deseadas tienen lugar en áreas pre seleccionadas conforme la muestra líquida se mueve a lo largo de trayectorias pre diseñadas. Para diagnóstico cardiaco de sangre entera, esas áreas se seleccionan en base a las velocidades relativas de los frentes de la corriente de glóbulos rojoc y la corriente de plasma, las cinéticas de las reacciones deseadae, ia afinidad de los anticuerpos para sus epítopes respectivos y otros factores que son bien conocidos para el experto en la técnica o que se determinan fácilmente mediante procedimientos de prueba convencionales. La figura 27 muestra la configuración de una membrana porosa alterna con tres trayectorias de fluido, para utilizarse con tres analitos. La configuración y operación de la membrana será evidente a partir de la explicación de la operación de los otros dispositivos. Aunque, como se mencionó anteriormente, se prefiere diseñar los dispositivos de diagnóstico de esta invención para detectar más de un analito, es posible diseñarlos con un solo canal de captura y múltiples líneas de captura, una para cada analito, o con una pluralidad de canales de captura cada uno con una sola línea de captura. Sin embargo, este último diseño, no se prefiere debido a la necesidad de incrementar el volumen de muestra para asegurar que las reacciones tendrán lugar en todos los canales. Esto es contrario a un aspecto principal de la invención, es decir el uso de la muestra más pequeña posible con la cual es posible obtener resultados útiles. Un compromiso el cual hasta cierto grado, pero no completamente, soluciona el problema, es hacer los canales tan pequeños como sea posible y diseñarlos para que estén tan cerca uno de otro como sea posible. Sin embargo, la proximidad de los canales incrementa la dificultad de leer los resultados de manera confiable debido a que es difícil distinguir una línea de captura en un canal de una línea de captura en otro. Los dispositivos de la invención se pueden configurar con múltiples canales para tener más de un canal incluyendo el canal de prueba y/o un canal de control positivo y negativo. Los canales múltiples pueden tener cada uno más de una línea de captura. Los diseños serán fácilmente evidentes para el experto en la técnica. Un canal, normalmente el canal intermedio, contendrá solamente anticuerpos fijos al analito(s) que se sospecha. El canal de control positivo contendrá anticuerpos marcados móviles en la entrada al canal y anticuerpos fijos de manera más profunda en el canal. El canal de control negativo contendrá anticuerpos fijos, pero estará bloqueado en su entrada para evitar que entre la muestra que está bajo prueba. El canal de control negativo estará diseñado con un agujero de entrada a través del miembro de soporte para permitir la adición de un material libre de analitos tal como un regulador de pH el cual emigrará a los anticuerpos de captura. Los productos y procedimientos de la invención, además de su valor para probar analitos cardiacos como se describe en detalle anteriormente, también se pueden utilizar de manera útil en otros procedimientos médicos tales como pruebas de embarazo y de ovulación. Son especialmente útiles para probar infecciones causadas por virus particulares. Para esta utilidad se pueden diseñar para análisis competitivos y de emparedado. Se pueden utilizar para probar antígenos, anticuerpos, antígenos de superficie, y partículas de virus tales como gp 120 del virus de SIDA. Adicionalmente, los productos se pueden utilizar para prober fármacos incluyendo fármacos de abuso. Las reacciones conducidas en los varios procedimientos de diagnóstico que se utilizan en la práctica de esta invención son en general bien conocidas para el experto en la técnica. La mayoría de ellas son pruebas ELISA que se conducen en un formato nuevo y útil. La ventaja de esta invención es que provee formatos nuevos y útiles sobre los cuales se pueden conducir las reacciones sobre instrumentos pequeños, sostenidos a mano, con velocidad y eficiencia utilizando bajos volúmenes de líquidos de prueba mientras que permiten de manera concurrente que el operador tenga gran confianza en los resultados. Aunque las descripciones mencionadas anteriormente muestran el uno o más anticuerpos depositados de manera movible en la zona de detección 3, las ubicaciones alternas para los anticuerpos detectores así como para los otros reactivos están abarcadas dentro de la presente invención. El anticuerpo detector se puede proveer en forma de, por ejemplo, esferas liofilizadas, tales como una sola esfera grande o múltiples esferas pequeñas, colocadas dentro de la trayectoria de fluido corriente arriba de la membrana, de manera que la esfera se disuelva en el fluido. Ejemplos no limitantes de dichas esferas se describen en la solicitud co-pendiente y de propiedad común Serie No. (Expediente de abogado de E.U.A. No. 1112-1-999, presentada el 4 de julio de 1999)! Esta solicitud co-pendiente describe un método para formar una pluralidad de esferas de reactivo libres de detergente, uniformes, liofilizadas, rígidas, comprendiendo cada esfera una matriz de carbohidrato y que tiene distribuido a través de la misma al menos un anticuerpo útil para determinar la presencia de uno o más antígepos en un fluido corporal que comprende los pasos de formar una solución acuosa libre de detergente del carbohidrato y el reactivo anticuerpo, formar gotas uniformes de la solución y añadirlas a nitrógeno líquido en un contenedor a una velocidad tal que cada gota forma una esfera congelada separada en el nitrógeno, manteniendo las esferas congeladas en el contenedor cubiertas con nitrógeno líquido, y liofilizando las gotas congeladas para remover el nitrógeno y formar esferas secas. La esfera se puede proveer en un cana, de suministro de muestra, el canal de circulación de muestra, o en su unión, se puede proveer una pequeña cavidad en el canal de suministro de muestra o en la unión entre el canal de suministro de muestra 18 y el canal de circulación de muestra 19, para contener el material. En otra modalidad, el anticuerpo se deposita en forma liofilizada dentro del canal. También se pueden proveer otros reactivos de esta manera, tales como reactivos para eliminar substancias que interfieren, como se describe anteriormente. Adicionalmente, en un dispositivo con más de una trayectoria de fluido en la membrana para realizar más de un análisis, se pueden proveer los reactivos comunes a los análisis se pueden proveer en la trayectoria de fluido antes de la membrana, y los reactivos específicos para cada análisis se proveen en la zona de detección particular de la membrana como se describe anteriormente. Esas varias configuraciones están abarcadas dentro de la presente invención. Como se muestra en la figura 28A y 28B, el canal de suministro de muestra 18 en la superficies inferior de la capa superior 16 del dispositivo se puede diseñar con una capacidad volumétrica pre seleccionada con el fin de proveer una muestra adecuada para llenar la trayectoria de fluido del dispositivo y permitir la práctica del análisis como se describe anteriormente. La muestra se aplica al agujero que atraviesa 17 y la muestra llena el canal de suministro de muestra partiendo desde el extremo más cercano al agujero que atraviesa 17, y llenado hacia el extremo opuesto. Una vez que el canal de suministro de muestra está lleno, se ha aplicado el volumen pre seleccionado de muestra. Se puede proveer una ventana 91 , como se describe anteriormente, para indicar que el canal de suministro de muestra se ha llenado a su capacidad, la capa superior o la porción de la misma localizada arriba del canal de suministro de muestra se puede hacer de un material transparente de manera que el llenado se pueda observar fácilmente. Además, y como se muestra en un ejemplo de dicho dispositivo en la figura 28A, el canal de suministro de muestra 18 en la capa superior 16 se puede diseñar de manera que una vez que el canal de suministro de muestra 18 se ha llenado con la muestra a su volumen preseleccionado, el contacto del frente de la muestra que se mueve con una constricción angosta 92 en el extremo opuesto del canal que conduce a un canal capilar más angosto y al canal de circulación de muestra 19 provocará que la muestra en el canal de suministro de muestra sea conducida mediante acción capilar fuera del canal de suministro de muestra 18 y hacia el canal de circulación de muestra 19, después hacia la membrana 1 , como se describe anteriormente. La figura 28B muestra una sección transversal del dispositivo de la figura 28A a lo largo de la sección marcada E-E, que muestra el agujero que atraviesa 17 de aplicación de muestra, el canal de suministro de muestra 18, y la ventana 91 en la unión entre el extremo del canal de suministro de muestra 18 y el canal de circulación de muestra 19 para indicar que el canal de suministro de muestra 18 se ha llenado con muestra adecuada para conducir la prueba. La ventana opcional 91 se puede diseñar como un canal capilar con una sección ensanchada en la superficie superior de la capa superior para indicar fácilmente la presencia de sangre entera en la ubicación. Otras disposiciones de la ventana están abarcadas en la presente. Como se mencionó anteriormente, una disposición alterna provee una transparencia de tal manera que se puede observar el llenado del canal de suministro de muestra. En cualquier instancia, la aplicación de la muestra al agujero que atraviesa se puede descontinuar cuando la ventana indica que el canal de suministro de muestra está lleno, o mediante observación directa de un canal de suministro de muestra lleno. La figura 29 es una vista superior transparente del dispositivo de diagnóstico ensamblado, y las figuras 30a-C de la capa superior, la membrana 1 , y la capa de fondo 28, respectivamente. El dispositivo ¡lustrado está adaptado para diagnosticar tres analitos. El portador poroso está configurado con tres zonas de detección 50, 51 y 52 en comunicación operativa con tres canales de zona de captura 27 a, 27b y 27c, respectivamente. Para sencillez, esta figura no incluye los anticuerpos, el frente de glóbulos rojos, el frente de plasma y otros aspectos del nuevo dispositivo. Esos componentes se muestran en figuras previas. > La capa superior 16 tiene un agujero que atraviesa 17 el cual puede estar biselado, corriendo desde su superficie superior a la superficie interior comunicando con el canal de suministro de muestra 18, poco profundo, angosto, que comunica con el canal de circulación de muestra 19, poco profundo, angosto, formado en la superficie inferior de la capa superior 16 con geometría arqueada para conformarse con los bordes arqueados 11 de las zonas de detección 50, 51 y 52. El canal de circulación 19 está cerrado en ambos extremos 20. Opcionalmente, se puede proveer una xtensión 53 de un extremo del canal de circulación de muestra con una ventana de observación por arriba para servir como un indicador de que se ha aplicado muestra adecuada al dispositivo. Con referencia a las figuras 30A y 30C, la capa superior 16 está adherida a la capa de fondo 28 mediante pasadores 34 que se pueden ajustar mediante fuerza en los agujeros 35 correspondientes. Se puede utilizar cualquier otro medio de adhesión equivalente y las dos capas 16 y 28 se pueden fijar de manera permanente o removible. El portador poroso 1 se muestra en la figura 30B con un respaldo 29 tal como una película de poliéster. Se mantiene entre las capas 16 y 28 en un área opcionalmente hundida de manera que la membrana contacta la orilla 99 de la cavidad 102. Cualquiera de dicha configuración de la membrana 1 entre la capa superior 16 y la capa de fondo 28 stá abarcada dentro de la presente invención en tanto exista una trayectoria operativa a través de la cual el fluido añadido a través del agujero que atraviesa 17 pueda pasar a través del canal de suministro, el canal de circulactón 19, las zonas de detección y los canales de la zona de captura a los extremos cerrados de los canales 27a, 27b y 27c de la zona de captura. La membrana porosa 1 que se muestra en la figura 30B está configurada de manera similar al portador poroso de la figura 25 para la detección de tres analitos. De acuerdo con esto contiene tres zonas de detección 50, 51 y 52, que comunican con tres canales 27a, 27b y 27c, de zona de captura, respectivamente. El borde arqueado 11 de las zonas de detección se extiende sobre las paredes interiores 21 del canal de circulación 19 de manera que cuando se detiene el flujo de fluido en los extremos 20, fluirá mediante acción capilar hacia las zonas de detección 50, 51 y 52.

Ahora es evidente el propósito del separador capilar 23. Si, en ausencia del separador capilar 23, el portador poroso 1 estuviera en contacto con una superficie de fondo plano de la capa superior 16, el fluido en el canal de circulación 19 fluiría entre esa superficie y el portador poroso 1 en vez de solamente a través de la membrana en su trayectoria preseleccionada desde el agujero que atraviesa 17 a los extremos de los canales de la zona de captura. El flujo se detiene en los extremos del canal de circulación para que sea posible controlar el tamaño de la muestra. Como se mencionó anteriormente, se puede proveer una ventana opcional 39 sobre una extensión opcional 53 del canal de circulación de muestra, para indicar que la muestra adecuada se ha aplicado para llenar el canal. Como se anotó. en la figura 28A, también se puede proveer una ventana 91 que indica la aplicación adecuada de volumen de muestra. Si la capa superior 1o es transparente, será evidente fácilmente la formación de un producto de reacción visible. Si la capa superior 16 es opaca se construirá con una o más ventanas de observación, una que se muestra en la presente como 38, con una ventana de prueba 37 opcional. Esas ventanas como se muestra en la figura 30A estarán en registro con los canales de la zona de captura de manera que el operador puede ver la formación de productos coloreados o ajustar un instrumento tal como un reflectómetro para determinar si se ha formado un producto de reacción detectable. El dispositivo puede tener ventanas separadas para observar la zona de captura para cada analito. En dispositivos preferidos, habrá una ventana que se extiende transversalmente de la superficie superior 30 de manera que los resultados de todas las reacciones se pueden ver al mismo tiempo.

Adicionalmente, hay una ventana opcional 39 que corresponde a una extensión del canal de circulación de muestra debajo (figura 30B), para ser utilizada como un indicador de que se ha añadido muestra adecuada para llenar el dispositivo. La aparición de la muestra, en particular, sangre, bajo esta ventana opcional es una indicación de que se ha aplicado muestra adecuada. Una de las ventajas de esta invención es que aunque los dispositivos estén diseñados para medir uno, dos o tres antígenos, pueden tener las mismas dimensiones. Por supuesto, la capa de portador poroso 1 estará diseñada de diferente manera en cada caso. Sin embargo, la capa superior 16 y la capa de fondo 28 no requieren ningún cambio para ajustar con capas de portador 1 diseñadas de diferente manera. Se observará que lo que ha sido descrito es un dispositivo y método que permite la detección de componentes en una muestra líquida, por ejemplo analitos cardiacos en sangre entera, suero o plasma, mediante reacciones de antígeno/anticuerpo utilizando enzimas o marcas directas en análisis competitivos o de emparedado. En los dispositivos de la invención, los reactivos se mueven a lo largo de una trayectoria formada por canales conectados sucesivamente en planos diferentes de los miembros de soporte y la membrana. Aunque está disponible una amplia variedad de materiales de nitrocelulosa en varios tamaños de celda, los portadores porosos actualmente preferidos son aquellos que, si se utilizan como un filtro, es decir para filtrar partículas de una corriente de líquido que fluye verticalmente a la superficie horizontal de la membrana, evitarán el paso de partículas más grandes de 3 a 12 (m. En la práctica de la invención, se prefieren membranas con un tamaño de poro de 5 a 12 (m, preferiblemente de 3 a 8 (m. Es posible alguna variación. Sin embargo, conforme disminuye el tamaño de poro, disminuye la capacidad de moverse de un fluido dentro de la membrana, incrementando por lo tanto el tiempo que se requiere para el diagnóstico. Si los poros son demasiado grandes, el tiempo del paso se reduce con el resultado de que los reactivos no están en contacto uno con otro por un período de tiempo suficiente para que ocurran las reacciones de diagnóstico, o que ocurran a un grado tan limitado que no provean la información deseada. Las membranas de nitrocelulosa están disponibles comercialmente con soporte de poliester u otras películas. Se prefieren estas para utilizarse en esta invención debido a que las membranas sin soporte tienden a ser bastante frágiles, susceptibles a fracturas y difíciles de manejar en un entorne de producción en masa. Además, las películas son impermeables a los fluidos que fluyen de manera que no interfieren con el flujo de muestras líquidas a través de las trayectorias seleccionadas de los dispositivos de esta invención. Una de dichas membranas está disponible en una variedad de tamaños de poro de Gerbermembrane de Gerbershausen, Alemania. Los anticuerpos que se utilizan en esta invención se preparan mediante técnicas estándar. Consultar, por ejemplo, Falfre, Howe, Milstein et al, Nature vol. 266, 7, 550-552, Abril de 1977. La descripción pertinente de este artículo respecto a la preparación de anticuerpos monoclonales está incorporada a la presente por referencia. Los procedimientos para fijar anticuerpos a substratos tales como nitrocelulosa son conocidos y utilizables en la producción de los dispositivos de esta invención. La nitroceiulosa es un aglutinante ávido por proteínas. De aquí que, el anticuerpo de captura inmóvil solo necesita aplicarse en la zona de captura en un área predeterminada. El anticuerpo detector marcado se puede fijar a la membrana de manera movible saturando primero la zona de detector con otra proteína tal como albúmina de suero bovino. Como se anotó anteriormente, los anticuerpos y otros reactivos se pueden depositar en o proveerse < mo esferas en el baño de fluido antes de la membrana. Cuando la muestra que se utiliza en el análisis en sangre entera, y se desea la separación de los glóbulos rojos del plasma, los reactivos provistos en el dispositivo no deben provocar lisis de los glóbulos rojos en la muestra, para permitir la separación. El dispositivo de esta invención se puede fabricar fácilmente mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Como se mencionó anteriormente, se pueden realizar otros procedimientos de análisis utilizando el dispositivo de la presente invención y sus modificaciones descritas. Esto incluye análisis cuantitativos y cualitativos, ambos formatos de inmunoanálisis y no inmunoanálisis. Los análisis basados en enzima, tales como la cuantificación de glucosa en sangre entera utilizando la combinación de glucosa oxidasa y peroxidasa, con los reactivos y substrato cromogénico adecuados para generar un color en proporción al nivel de glucosa en la muestra, se pueden configurar para funcionar utilizando un dispositivo de esta invención. El experto en la técnica reconocerá la capacidad de adaptación de otros formatos de análisis al presente dispositivo. Lo siguiente describe un tercer aspecto de la invención. Como se mencionó anteriormente, los dispositivos de esta invención se pueden utilizar para analizar una variedad de muestras líquidas, especialmente muestras biológicas que se pueden analizar mediante reacciones convencionales de antígeno/anticuerpo de la variedad competitiva o de emparedado utilizando reactivos marcados que emiten una señal detectable. El experto en la técnica recorocerá que existen varias aplicaciones del dispositivo de la invención. Está contemplado actualmente que la invención encontrará su principal utilidad para el diagnóstico de sangre entera para la presencia de analitos cardiacos tales como troponina I, troponina T, mioglobina, CK-MB, cadena ligera de miocina, proteína de unión a ácido graso, glicogen fosforilasa BB, actina y cualquiera de un hospedero de otros analitos conocidos que se encuentran en la sangre conforme el tejido cardiaco se deteriora después de un evento isquémico tal como angina o infarto al miocardio. De acuerdo con esto, la invención se describirá principalmente como se utiliza en el diagnóstico de eventos cardiacos. Sin embargo, el dispositivo se puede adaptar para utilizarse para detectar una amplia variedad de analitos mediante análisis ¡nmunológico y otros formatos de análisis que aprovechan la separación de plasma de glóbulos rojos en un flujo de fluido cromatográfico del dispositivo de la presente invención.

De hecho, y como se verá enseguida, se puede configurar un solo dispositivo para realizar una pluralidad de análisis de más de un formato, por ejemplo un inmunoanálisis y un análisis basado en enzima, al proveer los componentes de análisis particulares en cada una de las trayectorias de fluido separadas en el dispositivo. Las estructuras de la invención son especialmente útiles para analizar sangre, suero y plasma para CK-MB, mioglobina, cadena ligera de miocína, troponina I, troponina C, troponina T, y complejos de troponina I, troponina C y troponina T que contengan al menos dos sub unidades de troponina como se describe en las patentes de E.U.A. 5,747 274, 5,290,678, y • 5,710,008, el contenido pertinente de las cuales está incorporado a la presente por referencia. La figura 31 ilustra una capa de portador poroso seco 1 (también referida en sinónimo como membrana 1 ) de la invención configurada para el análisis de sangre entera para un analito o una pluralid-id de analitos mediante reacciones entre el analito(s) y pares de anticuerpos que reaccionan con diferentes epítopes sobre el analito en la clásica reacción de antígeno/anticuerpo utilizando pares de anticuerpos policlonales o monoclonales, estando marcado un miembro del par seleccionado. La figura muestra la capa de portador 1 en la cual la porosidad de una porción seleccionada de la capa ha sido destruida para dejar solamente un área porosa que define a la zona de detección 3 semicircular con un borde 1 1 y el canal 6 de zona de captura el cual está cerrado en el extremo terminal 12. De manera alternativa, y preferiblemente, la porosidad se puede destruir a lo largo del borde de la zona a la que se hace referencia anteriormente, confinando la muestra al interior del borde. Esta membrana 1 la cual para análisis de sangre entera es preferiblemente de nitrocelulosa o material equivalente separa cromatograficamente los glóbulos rojos para formar un frente 13 de glóbulos rojos y un frente 14 de plasma corriente abajo de la misma. Para el análisis de otras muestras líquidas, pueden ser preferibles otros materiales. La zona de detección 3 contiene anticuerpo de detección 4 con marca detectable 5 que reacciona con el analito, si está presente, para formar un complejo de anticuerpo marcado/antígeno. Aunque, por conveniencia, solamente so muestra un anticuerpo, la zona de detección 3 puede contener varios anticuerpos marcados. El anticuerpo marcado 4 es movible, es decir, está depositado de manera movible en la zona de detección 3 mediante cualquiera de varios medios conocidos de manera que el complejo de anticuerpo marcado/analito una vez formado es libre de moverse corriente abajo hacia el canal 6 de zona de captura para reacción con el anticuerpo de captura 7 fijo de manera transversal al canal 6 de la zona de captura para formar un producto de reacción detectable. Se notará a partir de la siguiente descripción adicional que el anticuerpo de detección se puede proveer en la trayectoria de fluido antes de la membrana, por ejemplo, en forma de esferas o material depositado en el canal de suministro de muestra, el canal de circulación de muestra, o en una cámara entre los mismos. Nuevamente, por conveniencia, solamente se muestra una línea de anticuerpo de captura 7, pero puede existir una pluralidad de tales líneas, una para cada analito que será detectado. El canal 6 de la zona de captura puede contener opcionalmente un producto 15 que reacciona con cualquier substancia que esté normalmente presente en el fluido que será analizado para producir un producto de control visible que indica que el fluido ha pasado la zona de captura. El uso de una reacción de control es opcional, pero se prefiere. La presente aplicación ofrece mejoras adicionales sobre los dispositivos mencionados anteriormente. El dispositivo de la presente invención, como se muestra en el ejemplo de las figuras 32-34, tiene un canal de suministro de muestra 18 que se extiende sobre la superficie superior del dispositivo, cubierto por una pieza de cubierta 75 que se muestra en la figura 34 A. Ejemplos no limitantes de los componentes del presente dispositivo se describirán en detalle adicional enseguida. Las ventajas del canal de suministro de muestra sobre la superficie superior del dispositivo son múltiples. Primera, el llenado del canal de suministro de muestra se puede observar por el operador del dispositivo, y, si la capacidad del canal de suministro de muestra es igual a la cantidad de muestra necesaria para realizar la prueba, la aplicación de la muestra se puede detener cuando el operador note que el canal está completamente lleno. Segunda, el canal de suministro de muestra se puede colocar en cualquier ubicación adecuada sobre la superficie superior del dispositivo, incluyendo la colocación sobre la porción del dispositivo que aloja a la membrana, en tanto que el canal de suministro de muestra sobre la superficie superior de la pieza superior no interfiera con la membrana u otros componentes del dispositivo entre las piezas superior e inferior, o la observación o lectura de los resultados. Esto permite proveer un dispositivo más pequeño, su tamaño [imitado solamente al tamaño de la membrana. El tamaño de membrana reducido y la reducción o eliminación de cualquier extensión del dispositivo que comprende el canal de suministro de muestra provee un dispositivo más pequeño con menos membrana, reduce el costo de fabricación, empaque y transporte, y provee un dispositivo más agradable para el usuario, y no perjudicial al medio ambiente. Una posición conveniente para el canal de suministro de muestra es tal que el agujero de aplicación de muestra del dispositivo está en una ubicación sobre el dispositivo que se ahusa en un punto, tal como se muestra en la figura 32. Esto provee un medio conveniente para llenar el dispositivo con sangre entera obtenida mediante perforación en el dedo, sosteniendo la abertura 60 de aplicación de muestra a la gota de sangre, en la cual la muestra, normalmente de 30 a 50 (I, se atrae mediante acción capilar hacia y llena el canal de suministro de muestra, después de lo cual la muestra se conduce al canal de circulación de muestra y después hacia la membrana. Adicionalmente, el canal de suministro de muestra puede estar pre cargado con un reactivo de prueba seco, tal como anticuerpos conjugados en oro para el analito, y/o anticuerpos biotinilados al analito, para operar el inmunoanálisis como se describe en la presente. La precarga puede comprender la aplicación de una solución que comprende el reactivo(s) el cual después se seca en el canal de suministro de muestra, o colocación de partículas, por ejemplo, esferas liofilizadas que comprenden reactivos de prueba, en un hueco o cavidad definido en el canal. Al contacto con la muestra, el reactivo seco se disuelve en la muestra y es llevado a lo largo de la trayectoria del fluido. ' Otra característica del dispositivo de esta invención es que la sección del canal de suministro de muestra 18 en la ubicación 92 cerca de la unión del canal de circulación 19 se puede reducir en sección transversal de manera que habrá movimiento capilar de la muestra hacia esa sección del canal de suministro de muestra 18 que tiene el volumen más pequeño. La ventaja particular de esta configuración es que el canal de suministro de muestra 18 se puede diseñar para contener el volumen exacto de muestra necesario para conducir el análisis. Conforme el canal de suministro de muestra se llena con muestra y la muestra contacta la porción del canal reducida en sección transversal, la acción capilar hará que la muestra se mueva a la porción en sección transversal reducida adicionalmente y de esta manera transfiera la muestra desde el canal de suministro de muestra al canal de circulación de muestra e inicie la separación cromatográfica de plasma de la sangre y el procedimiento de inmunoanálisis. Las figuras 32-34 muestran en detalle los componentes de un ejemplo de un dispositivo de la presente invención. Son posibles numerosas configuraciones alternas y están abarcadas por la presente invención. El experto en la técnica entenderá fácilmente que son posibles otras configuraciones, en particular, la reducción adicional en tamaño del dispositivo colocando el canal de suministro de muestra sobre la porción de membrana, como se muestra en la figura 35 A y se describe en mayor detalle enseguida. La figura 32 A muestra una vista superior de la pieza superior 16 del dispositivo, diseñada para sostener el portador poroso 1 (membrana 1 ) entre la misma y la pieza inferior 28 que se muestra en la figura 33. La pieza superior 16 incluye la ventana 41 que se provee para permitir al operador observe la zona de captura 7 así como una zona 15 opcional de indicador de fin de prueba sobre la membrana 1. En otra modalidad se provee la ventana 43 para ver el fin de la trayectoria de fluido para indicar la completación de la prueba. La pieza superior 16 también incluye parte del canal de suministro de muestra 18, el canal de circulación de muestra 19, como se observa desde abajo en la figura 32D, el último teniendo las mismas características como las que se describen por ejemplo en la figura 5 anteriormente. La figura 32B muestra una vista delantera, y la figura 32C una vista lateral, de la pieza superior. '' La figura 32E muestra una vista compuesta, en sección transversal de un ejemplo de un dispositivo ensamblado de la presente invención que muestra la pieza superior 16, la pieza de fondo 28, la pieza de cubierta 75 del canal de suministro de muestra. La figura también muestra la trayectoria de fluido: el puerto de aplicación de muestra 60, el canal de suministro de muestra 18, la unión angosta 92, que provee comunicación entre el canal de suministro de muestra 18 y el canal de circulación de muestra, la membrana 1 , la ventana para observar la zona(s) de captura 41 , y la ventana 43 de indicador de fin de prueba. Las ventanas del dispositivo para observar la zona de captura y la zona opcional de indicador de fin de prueba pueden ser aberturas en la capa superior del dispositivo, o la capa superior puede estar fabricada de un material u transparente el cual se hace opaco mediante impresión o tratamiento de superficie para hacer opacas las porciones que no se van a observar. En una modalidad, la zona de indicador de fin de prueba 15 contiene un producto que reacciona con cualquier substancia normalmente presente en el fluido que será analizado para producir un producto de control visible que se puede observar a través de la ventana 43. En otra modalidad se deposita un producto tal como un colorante sobre la membrana 1 en la ubicación 15 que no se puede observar a través de la ventana 43. El colorante se disuelve en el fluido y se abre paso al final de la trayectoria de fluido, 12, en donde es visible a través de la ventana 43. La capa superior 16 tiene una abertura dC para aplicación de !a muestra. En la operación del dispositivo, el canal de suministro de muestra 18 se llena con la muestra. Cuando la muestra alcanza la porción del canal de suministro de muestra de tamaño más estrecho 92, la acción capilar impulsa la muestra hacia el canal de circulación de muestra 19 y hacia la membrana 1. La cubierta 75 del canal de suministro de muestra, si es transparente, permite que el operador observe el llenado del canal de suministro de muestra e indica cuando está completamente lleno. La muestra se conduce desde el canal de suministro de muestra al canal de circulación y hacia la membrana. Como se mencionó anteriormente, el canal de circulación de muestra está configurado para hacer pasar la muestra hacia la membrana. La configuración de las paredes 21 y 22 del canal de circulación de muestra, y la trayectoria de fluido definida sobre la membrana mediante, por ejemplo, impresión con una tinta especial, mantiene la muestra en la trayectoria de fluido. Como se anotó anteriormente, el dispositivo del momento es adecuado para medición de uno o más analitos utilizando procedimientos de inmunoanálisis así como otros procedimientos, incluyendo análisis basados en enzimas. La discusión en la presente se refiere a un procedimiento de inmunoanálisis a manera de ejemplo no limitante. Como en la discusión anterior, la muestra recoge el anticuerpo detector marcado conforme se mueve hacia el canal de captura, durante cuyo tiempo el analito en la muestra forma compißjos de anticuerpo-antígeno con el anticuerpo detector. La muestra, con el frente de plasma delante de y separado del frente de glóbulos rojos, alcanza ¡a zcna de captura en la cual el analito, con anticuerpo marcado unido, interactúa con y forma un emparedado con el anticuerpo de captura. La acumulación de anticuerpo marcado en la zona de captura indica la presencia de analito en la muestra. Al concluir la prueba, por ejemplo, cuando la ventana de indicador de fin de prueba indica que la prueba está completa, el operador observa la ventana para color en la zona(s) de captura. Como se anotó anteriormente, el anticuerpo detector marcado, así como otros reactivos, se puede colocar en el canal de suministro de muestra.

Como se anotó anteriormente, el canal de suministro de muestra 18 está en comunicación operativa con el canal de circulación de muestra 19. El canal de circulación de muestra 19 se muestra en una configuración arqueada con el fin de conformarse con el borde 11 de la zona de detección 3 semicircular de la figura 31. El canal de circulación de muestra 19 puede estar abierto o cerrado en ambos extremos 20. Está formado con la pared interior 21 y la pared exterior 22 y está rodeado por un separador capilar 23 que funciona para asegurar que el flujo de la muestra es hacia la zona de detección 3 de la figura 31 en todos los puntos del borde 1 1 , y después hacia el canal de captura 6 en su extremo de entrada 6a. La figura 33 muestra el detalle de un ejemplo de una piez? de fondo 28 de la presente invención. La pieza de fondo sostiene la membrana 1 en su lugar, y puede tener lengüetas 66 y 68 como se muestra que corresponden con muescas en la pieza superior 16 para facilitar el ajuste de las piezas juntas para sostener la membrana en la posición correcta. La figura B muestra una vista frontal de la pieza de fondo 28 como se ve desde el extremo con lengüetas 68, y la figura 33C una vista lateral. Las figuras 34A y 34B muestran la pieza de cubierta del canal de suministro de muestra, desde vistas superior y delantera, respectivamente. Ei extremo con muesca 62 representa el área de aplicación de muestra, ya que este extremo se alinea con el extremo de la pieza superior 16 para formar una abertura 60. El extremo apuntado de la cubierta representa el aspecto que cubr la porción del canal de suministro de muestra 18 que se angosta para formar un canal capilar 92 n comunicación con el canal de circulación de muestra. La pieza de cubierta 75 está adherida a la pieza superior 16 deslizando la pieza de cubierta hacia la pieza superior a lo largo del canal de suministro de muestra, las extensiones en ángulo 64 en los lados de la pieza de cubierta 75 se deslizan hacia surcos longitudinales correspondientes 69 que corren a lo largo de las paredes interiores del canal de suministro de muestra en la pieza superior. Se pueden utilizar otros medios para adherir la pieza de cubierta a la pieza superior, incluyendo adhesivos, soldadura, etc. Las figuras 35-36 muestran ejemplos de otras modalidades de la presente invención, en particular, otras posiciones para el canal de suministro de » muestra 18. Se proveen vistas superiores, vistas de fondo, y secciones longitudinales para dos ejemplos; las vistas A muestran la superficie superior de la pieza superior 16, las vistas C la superficie de fondo de la pieza superior 16, las vistas B una sección longitudinal de las piezas superiores 16, y las vistas D las piezas posteriores 28. En la figura 35, el canal de suministro de muestra está situado sobre la sección del dispositivo que contiene la membrana, permitiendo que el dispositivo tenga un tamaño reducido. El puerto de aplicación de muestra 60 está sobre el lado del dispositivo. La figura 36 muestra un dispositivo con una extensión desde la porción que sostiene la membrana del dispositivo, que provee un dispositivo más grande con el puerto de aplicación de muestra 60 en el extremo del dispositivo. La figura 38 (que corresponde a la figura 1 1 anterior) muestra la configuración de una membrana 1 de la invención en la cual se utiliza la reacción de bíotina/streptavidina para diagnosticar una muestra de sangre entera para la presencia de tres analitos. El diseño se puede utilizar para determinar la presencia de varios analitos tales como mioglobina, troponina I o T y CK-MB en una muestra pequeña. La membrana 1 está formada con tres trayectorias distintas, una para cada analito que conduce desde los bordes 1 1 a, 1 1 b y 1 1 c de tres zonas de detección separadas 3a, 3b y 3c. Las zonas de detección están separadas mediante segmentos de bloqueo 24. Toda el área operativa está configurada como para proveer tres zonas de detección 3a, b y c en comunicaciones operativas en sus bordes 1 1 a, 1 1 b y 1 1 c con el canal de circulación de muestra 19 sobre la superficie inferior de la capa superior 16 del dispositivo. Las zonas de detección 3a, 3b y 3c están er comunicación operativa con los extremos de entrada 6a, 6b y 6c correspondientes de los canales de zona de captura respectivos. La zona de detección 3a contiene dos anticuerpos marcados, por ejemplo un anticuerpo marcado de biotina para CK-MB y un anticuerpo marcado con oro para CK-MB. , En general, en la figura 37 los círculos negros representan anticuerpos marcados con oro mientras que los círculos abiertos representan anticuerpos marcados con biotina. No se dan números de referencia para esos anticuerpos detectores con el fin de no aglomerar esta figura. Como un ejemplo de la separación del plasma de los glóbulos rojos durante la operación del dispositivo de la figura 37, el frente de glóbulos rojos en cada una de las tres zonas de detección 3a, 3b y 3c se muestra como 13a, 13b y 13c, respectivamente, y la ubicación de los frentes de plasma respectivos se muestra como 14a, 14b y 14c, respectivamente. Si CK-MB está presente en la muestra, el complejo que se forma entrará al canal de captura en la entrada 6a para finalmente reaccionar con streptavidina en la línea de 7a de streptavidina para producir un producto visible. Reacciones análogas tienen lugar con otros analitos tales como troponina I o troponina T y con mioglobina en las trayectorias separadas que se muestran en fa figura. Los mismos u otros analitos se pueden detectar similarmente con reacciones convencionales de antígeno anticuerpo. Además del inmunoanálisis del tipo emparedado descrito en el ejemplo anterior, se pueden proveer otros formatos de inmunoanálisis, incluyendo análisis competitivo. Se puede proveer cuantificación o semi-cuantificación utilizando varias cantidades de los diferentes componentes del análisis. Adicionalmente, el dispositivo puede llevar a cabo análisis diferentes al inmuno análisis. Por ejemplo, la interacción del analito con una enzima o una serie de enzimas, en presencia de los co-factores y substratos cromogénícos adecuados, puede resultar en la generación de un color en la muestra que indica la presencia de un analito en la muestra. El color se puede observar en la ventana 41. Aunque, como se mencionó anteriormente, se prefiere diseñar los dispositivos de diagnóstico de esta invención para detectar más de un analito, es posible diseñarlos con un solo canal de captura y múltiples líneas de captura, una para cada analito, o con una pluralidad de canales de captura cada uno con una sola línea de captura. Sin embargo, este último diseño, no se prefiere debido a la necesidad de incrementar el volumen de muestra para asegurar que las reacciones tendrán lugar en todos los canales. Esto es contrario a un aspecto principal de la invención, es decir el uso de la muestra más pequeña posible con la cual es posible obtener resultados útiles. Un compromiso el cual hasta cierto grado, pero no completamente, soluciona el problema, es hacer los canales tan pequeños como sea posible y diseñarlos para que estén tan cerca uno de otro como sea posible. Sin embargo, la proximidad de los canales incrementa la dificultad de leer los resultados de manera confiable debido a que es difícil distinguir una línea de captura en un canal de una línea de captura en otro. Los dispositivos de la invención se pueden configurar para tener más de un canal incluyendo el canal de prueba y/o un canal de control positivo y negativo. Los canales múltiples pueden tener cada uno más de una línea de captura. Los diseños serán fácilmente evidentes para e¡ experto en la técnica. Un canal, normalmente el canal intermedio, contendrá solamente anticuerpos fijos al analito(s) que se sospecha. Ei canal de control positivo contendrá anticuerpos marcados móviles en la entrada al canal y anticuerpos fijos de manera más profunda en el canal. El canal de control negativo contendrá anticuerpos fijos, pero estará bloqueado en su entrada para evitar que entre la muestra que está bajo prueba. El canal de control negativo estará diseñado con un agujero de entrada a través del miembro de soporte para permitir la adición de un material libre de analitos tal como un regulador de pH el cual emigrará a los anticuerpos de captura. Los productos y procedimientos de la invención, además de su valor para probar analitos cardiacos como se describe en detalle anteriormente, también se pueden utilizar de manera útil en otros procedimientos médicos tales como pruebas de embarazo y de ovulación. Son especialmente útiles para ,i probar infecciones causadas por virus particulares. Para esta utilidad se pueden diseñar para análisis competitivos y de emparedado. Se pueden utilizar para probar antígenos, anticuerpos, antígenos de superficie, y partículas de virus tales como gp 120 del virus de SIDA. Adicionalmente, los productos se pueden utilizar para probar fármacos incluyendo fármacos de abuso. Las reacciones conducidas en los varios procedimientos de diagnóstico que se utilizan en la práctica de esta invención son en general bien conocidas para el experto en la técnica. La mayoría de ellas son pruebas ELISA que se conducen en un formato nuevo y útil. Las ventajas de esta invención sen que provee formatos nuevos y útiles sobre los cuales se pueden conducir las reacciones sobre instrumentos pequeños, sostenidos a mano, con velocidad y eficiencia utilizando bajos volúmenes de líquidos de prueba mientras que permiten de manera concurrente que el operador tenga gran confianza en los resultados. Se puede utilizar cualquiera de una variedad de marcas disponibles para el experto en la técnica en los dispositivos de esta invención. Se prefieren las marcas de metal y enzima. Los marcadores de metal se prefieren especialmente debido a su notable sensibilidad. Entre los metales, el oro es el más preferido debido a que se utiliza ampliamente para este tipo de reacción y sus características están muy bien entendidas. Además, una señal de oro se puede mejorar para volverse fácilmente visible mediante el uso de una sal de plata soluble y un agente reductor de acuerdo con procedimientos conocidos. La marca de oro actúa como un catalizador para reducir la sal de plata a plata metálica, la cual se deposita como un producto visible. Un par reactivo típico es lactato de plata, que sirve como la fuente de ¡ones de plata reducibles, e hidroquinona como un agente reductor. La plata metálica forma un depósito negro fácilmente distinguible alrededor de cada partícula de oro. El tamaño d^ partícula preferido para anticuerpos marcados con oro que se utilizan en la invención es de 35 a 65 nm, aunque se puede tolerar variación apreciable dependiendo de factores bien entendidos tales como la concentración del analito y la afinidad de los reactivos. Si se utiliza una marca de enzima, tal como peroxidasa de rábano picante, la reacción se puede detectar mediante la adición de peróxido de hidrógeno y un colorante tal como orto fenilenediamina de acuerdo con procedimientos estándar. Puede haber una zona de pre incubación en la zona de detección aunque no es una característica necesaria de la invención. La zona de pre incubación se utiliza para remover productos presentes en la sangre que pueden interferir con las reacciones deseadas o hacerlas difíciles de detectar. Por ejemplo, si el dispositivo se va a utilizar para detectar analitos cardiacos, un interferente típico es la isoforma de creatina cinasa, CK-MM. Los anticuerpos a la ¡soforma CK-MB pueden reaccionar de manera cruzada con CK-MM y dar lecturas falsas. Esto se puede evitar proveyendo suficiente anticuerpo inmovilizado para CK-MM en una zona de pre incubación corriente arriba del anticuerpo movible para CK-MB de manera que todo el CK-MM se remueve antes de que la muestra en movimiento alcance el anticuerpo de detección. El dispositivo que utiliza la membrana de la figura 37 puede utilizar uno o una pluralidad de anticuerpos detectores marcados y anticuerpos de captura en líneas de anticuerpos de captura inmovilizadas. Cuando se utilizan varios detectores marcados, se debe tener cuidado para evitar reacciones cruzadas que interfieren. Con frecuencia es mejor que los anticuerpos estén dispuestos en más de una zona de detección para reaccionar con sus analitos específicos como se explica enseguida en conexión con las otras figuras. El dispositivo de la presente invención también se puede preparar para utilizar la reacción de biotina/avidina utilizando variaciones tales como !as que se describen anteriormente. En la variación actualmente preferida como se aplica al dispositivo, un anticuerpo marcado con biotina y un anticuerpo marcado con oro se colocan de manera movible en la zona de detección 3, en donde cada uno de ellos reacciona con un epítope diferente sobre el analito para formar un complejo terciario compuesto de anticuerpo marcado con biotina/analito/anticuerpo marcado con oro, el cual se mueve mediante acción capilar hacia y a través del canal 6 de zona de captura en donde reacciona con avidina o streptavidina para concentrarse y formar un producto de reacción detectable. Por supuesto, los anticuerpos utilizados en esta invención pueden ser monoclonales o policlonales. Se pueden utilizar equivalentes similares de la reacción de biotina/avidina. Todos los reactivos mencionados en la presente se pueden reemplazar con equivalentes y son ilustrativos y no limitaciones de la invención. El experto en la técnica reconocerá que cualquier substrato poroso que separa cromatográficamente los glóbulos rojos y plasma de la sangre entera se puede utilizar en esta invención. Sin embargo, se prefiere nitrocelulosa porque está fácilmente disponible a un costo razonable. La nitrocelulosa se ha utilizado en cromatografía y campos relacionados durante tantos años que los científicos y los técnicos están familiarizados con sus propiedades. Las láminas de nitrocelulosa disponibles comercialmente se pueden formar fácilmente en cualquier formación seleccionada con cualquier configuración de canales seleccionada. Las membranas de nitrocelulosa de la invención se pueden caracterizar como tipo esponja con una pluralidad de micro poros de varios tamaños y dimensiones interconectados dando surgimiento a fuerzas capilares dentro de la membrana. Esto permite que el fluido biológico bajo investigación se mueva a lo largo de la trayectoria seleccionada. Para la separación de plasma de glóbulos rojos en la práctica de esta invención, el área, geometría y dimensiones de los varios dispositivos se seleccionan de tal manera que las reacciones deseadas tienen lugar en áreas pre seleccionadas conforme la muestra líquida se mueve a lo largo de trayectorias pre diseñadas. Para diagnóstico cardiaco de sangre entera, esas áreas se seleccionan en base a las velocidades relativas de los frentes de la corriente de glóbulos rojos y la corriente de plasma, las cinéticas de las reacciones deseadas, la afinidad de los anticuerpos para sus epítopes respectivos y otros factores que son bien conocidos para el experto en la técnica o que se determinan fácilmente mediante procedimientos de prueba convencionales. Aunque la figura 37 muestra la configuración de una membrana porosa con tres trayectorias de fluido, para utilizarse con tres analitos, también se p'J?de proveer una sola trayectoria de fluido con tres zonas de captura, y como se anotó anteriormente, se prefiere. Una de las ventajas de esta invención es que aunque los dispositivos estén diseñados para medir uno, dos o tres antígenos, pueden tener !es mismas dimensiones. Por supuesto, la capa de portador poroso 1 estará diseñada de diferente manera en cada caso. Sin embargo, la capa superior 16 no requiere ningún cambio para ajustar con capas de portador 1 diseñadas de diferente manera. Se observará que lo que ha sido descrito es un dispositivo y método que permite la detección de componentes en una muestra líquida, por ejemplo analitos cardiacos en sangre entera, suero o plasma, mediante reacciones de antígeno/anticuerpo utilizando enzimas o marcas directas en análisis competitivos o de emparedado. En los dispositivos de la invención, los reactivos se mueven a lo largo de una trayectoria formada por canales conectados, sucesivamente en planos diferentes de los miembros de soporte y la membrana.

Aunque las descripciones mencionadas anteriormente muestran el uno o más anticuerpos depositados de manera movible en la zona de detección 3, las ubicaciones alternas para los anticuerpos detectores así como para los otros reactivos están abarcadas dentro de la presente invención. El anticuerpo detector se puede proveer en forma de, por ejemplo, esferas liofilizadas, tales como una sola esfera grande o múltiples esferas pequeñas, colocadas dentro de la trayectoria de fluido corriente arriba de la membrana, de manera que la esfera se disuelva en el fluido.

La esfera se puede proveer en un canal de suministro de muestra, el canal de circulación de muestra, o en su unión; se puede proveer una pequeña cavidad en el canal de suministro de muestra o en la unión entre el canal de suministro de muestra 18 y el canal de circulación de muestra 19, para contener el material. En otra modalidad, el anticuerpo se deposita en forma liofilizada dentro del canal. También se pueden proveer otros reactivos de esta manera, tales como reactivos para eliminar substancias que interfieren, como se describe anteriormente. Adicionalmente, en un dispositivo con más de una I trayectoria de fluido en la membrana para realizar más de un análisis, se pueden proveer los reactivos comunes a los análisis se pueden proveer en la trayectoria de fluido antes de la membrana, y los reactivos específicos para cada análisis se proveen en la zona de detección particular de la membrana como se describe anteriormente. Esas varias configuraciones están abarcadas dentro de la presente invención. Aunque está disponible una amplia variedad de materiales de nitrocelulosa en varios tamaños de celda, los portadores porosos actualmente preferidos son aquellos que, si se utilizan como un filtro, es decir para filtrar partículas de una corriente de líquido que fluye verticalmente a la superficie horizontal de la membrana, evitará el paso de partículas más grandes de 3 a 12µm. En la práctica de la invención, se prefieren membranas con un tamaño de poro de 5 a 12 µm, preferiblemente de 3 a 8 µm. Es posible alguna variación. Sin embargo, conforme disminuye el tamaño de poro, disminuye la capacidad de moverse de un fluido dentro de la membrana, incrementando por lo tanto el tiempo que se requiere para el diagnóstico. Si los poros son demasiado grandes, el tiempo del paso se reduce con el resultado de que los reactivos no están en contacto uno con otro por un período de tiempo suficiente para que ocurran las Xí reacciones de diagnóstico, o que ocurran a un grade tan limitado que no provean la información deseada. Las membranas de nitrocelulosa están disponibles comercialmente con soporte de poliéster u otras películas. Se prefieren estas para utilizarse en esta invención debido a que las membranas sin soporte tienden a ser bastante frágiles, susceptibles a fracturas y difíciles de manejar en un entorno de producción en masa. Además, las películas son impermeables a los fluidos que fluyen de manera que no interfieren con el flujo de muestras líquidas a través de las trayectorias seleccionadas de los dispositivos de esta invención. Una de dichas membranas está disponible en una variedad de tamaños de poro de Gerbermembrane de Gerbershausen, Alemania. Los anticuerpos que se utilizan en esta invención se preparan mediante técnicas estándar. Consultar, por ejemplo, Falfre, Howe, Milstein et al, Nature vol. 266, 7, 550-552, Abril de 1977. La descripción pertinente de este artículo respecto a la preparación de anticuerpos monoclonales está incorporada a la presente por referencia. Los procedimientos para fijar anticuerpos a substratos tales como nitrocelulosa son conocidos y utilizables en la producción de los dispositivos de esta invención. La nitrocelulosa es un aglutinante ávido por proteínas. De aquí que, el anticuerpo de captura inmóvil solo necesita aplicarse en la zona de captura en un área predeterminada. El anticuerpo detector marcado se puede fijar a la membrana de manera movible saturando primero la zona de detector con otra proteína tal como albúmina de suero bovino. Las ubicaciones alternas para los anticuerpos detectores están anotadas anteriormente. Como se ilustra en las figuras 38A-38B, se provee una cavidad 100 en la unión entre el canal de suministro de muestra y el canal de circulación de muestra para contener una esfera u otra forma de reactivos tal como anticuerpo detector marcado liofilizado, el cual se disolverá en el fluido que será analizado conforme pasa a través de esta región del dispositivo. La figura 38A también muestra una ventana 43 de indicador de fin de prueba y una tira de reactivo correspondiente sobre ia membrana justo corriente arriba de esta ventana. El fluido disuelve y lleva este reactivo a la vista en la ventana 43 para indicar que la prueba ha terminado.

En otra modalidad que se muestra en la figura 39, el anticuerpo detector en la posición 100 está presente en el canal de suministro de muestra. Las figuras 40 A-40B y 41 A-41 B muestran otras variaciones en el diseño del dispositivo para comprender una cavidad para contener reactivos en forma seca o de esferas, en particular, una concavidad. Como se anotó anteriormente, los reactivos que se proveen en la trayectoria de fluido pueden incluir anticuerpo(s) detector marcado así como otros reactivos necesarios para realizar la prueba, incluyendo aquellos necesarios para remover substancias que interfieren que pueden estar presentes en la muestra. Los reactivos se pueden proveer sobre la membrana y en la trayectoria de fluido, como sea necesario. Varias combinaciones se entenderán por el experto en la técnica para proveer análisis operables para los analitos selecconados. Cuando la muestra que se utiliza en el análisis es sangre entera, y se desea la separación de glóbulos rojos de plasma, los reactivos que se proveen en el dispositivo no deben provocar lisis de los glóbuloc rojos en la muestra, para- ermitir la separación. El dispositivo de esta invención se puede fabricar fácilmente mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Como se mencionó anteriormente, se pueden realizar otros procedimientos de análisis utilizando el dispositivo de la presente invención y sus modificaciones descritas. Esto incluye análisis cuantitativos y cualitativos, ambos formatos de inmunoanálisis y no inmunoanálisis. Los análisis basados en enzima, tales como la cuantificación de glucosa en sangre entera utilizando la combinación de glucosa oxidasa y peroxidasa, con los reactivos y substrato cromogénico adecuados para generar un color en proporción al nivel de glucosa en la muestra, se pueden configurar para funcionar utilizando un dispositivo de esta invención. El experto en la técnica reconocerá la capacidad de adaptación de otros formatos de análisis al presente dispositivo. Los siguientes ejemplos no limitantes se dan solamente a manera de ilustración.

EJEMPLO 1 Prueba CK-MB de sangre entera 1 A) Sobre una membrana de nitrato de celulosa con soporte de poliéster (tamaño de poro nominal de 3 µm de Gerbermembrane GmbH, Gerbershausen, Alemania), se dibuja un contorno como en la figura 4 con un marcador Paint Marker 751 amarillo (de Edding AG, Ahrensburg, Alemania). Se prepara una línea de captura con una solución de 13 mg/ml de streptavidina acuosa (Streptavidina, poly, de Microcoat GmbH, Benried, Alemania). Se prepara una línea de control con una solución que contiene 80 µl de una solución al 4% (p/v) de sucrosa (de Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania), 10 µl de agua y 10 µl de una solución de 1 mg/ml de CK-MB recombinante (de Spectral Diagnostics, Toronto, Canadá). Después de secado, la membrana se impregna con una solución bloqueadora que contiene en concentraciones finales: 0.06% (p/p) de Octil-beta-D-Gluco-piranosida (de Fluka Chemie AG, Buchs, Suiza), una dilución de 1:30 de Kasein-Bindemittel (de H. Schminike & Co., Erkrath, Alemania) y 30 mM de ácido 1 ,4-piperazinadietanesulfónico (de Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania) con un pH final de 6.2. Después de secado, se aplicaron 2.7 µl de una solución de conjugado de oro y 2 µl de solución de anticuerpo biotinilado, y la membrana se seca nuevamente. La solución de conjugado de oro se prepara con 40 nm de sol de oro cargada con 22 µg/ml del anticuerpo 5CKMB-6 de Spectral Diagnostics, Toronto, a un OD (520 nm) de 10 preparado por British Biocell International, Cardiff, GB. A 45 µl de este conjugado de oro (OD 10), se añaden 45 µl de agua y 10 µl de una solución acuosa al 2.5% (p/v) de Croteina C (de Croda Chemicals Ltd., GB) y se mezclan. La solución de anticuerpo biotinilado se prepara con el anticuerpo lrCKMB-28 de Spectral Diagnostics, Toronto, como se describe a 57 µl de agua 20 µl de una solución acuosa al 6% (p/v) c"e Croteina C y 3 µl de una solución de abastecimiento de 2 mg/ml de la solución de anticuerpo biotinilado se añaden y se mezclan. (B) para comparación, se prepararon pruebas como en 1 A) pero sin !a- solución de- anticuerpo biotinilado, y en lugar de la línea de captura de streptavidina se prepara una línea de captura de anticuerpo con el anticuerpo lrCKMB-28 (de Spectral Diagnostics, Toronto) a una concentración de 13 mg/ml. A sangre entera heparinizada se agrega rCKMB a concentraciones indicadas y se aplican 28 µl a la prueba. Los resultados (dentro de 6-7 minutos) son como sigue: = línea de señal no visible ++++ = línea de señal fuerte n.d. = no determinado. Todas las líneas de control son positivas.

EJEMPLO 2 Prueba de Comparación de CK-MB Semicircular a Rectangular Para demostrar la versatilidad del concepto, la entrada de muestra en un área semicircular (segmento de círculo) (figuras 4 y 5) se comparó con una entrada de muestra en una configuración rectangular, es decir, desde 3 lados (figuras 9 y 10). Las áreas de prueba son en ambos casos las mismas. Aparte del contorno de la orilla y las direcciones de entrada de sangre todos los otros procedimientos son como en el ejemplo 1 A.

EJEMPLO 3 Área semicircular-Tres analitos-Una zona de detección Se prepara una prueba como en el ejemplo 1 B), pero además de la línea de captura de anticuerpo CKMB hay una línea de captura de anticuerpo TNI y una línea de captura de anticuerpo Myoglobina. TNI d- captura: 13 mg/ml de TNI policlonal de cabra. Captura de CKMB: 13 mg/ml lrCKMB-28. Captura de Myoglobina: 13 mg/ml de mioglobina policlonal de conejo. Todos- les anticuerpos son de Spectral Diagnostics, Torontc. Los conjugados de oro para los 3 analitos son de British Biocell Intern. Cardiff, GB. TNI-oro-a: 40 nm de sol de oro cargado con 8 µg/ml de anticuerpo 81-7 (OD 10).

TNI-oro-b: 40 nm de sol de oro cargado con 16 µg/ml de anticuerpo 21 -14 (OD 10). Mioglobina-oro: 15 nm cargado con 90 µg/ml de anticuerpo 2Mb-295 (OD 10).

CKMB-oro: 40 nm de sol de oro cargado con 22 µg/ml 5CKMB-6 (OD 10). Todos los anticuerpos son de Spectral Diagnostics, Toronto.

La solución de TNI conjugado de oro contiene: 15 µl de TNI-oro-a a un OD de 33, 30 µl de TNI-oro-b a un OD de 33, 45 µl de agua y 10 µl de una solución acuosa al 2.5% (p/v) de Croteina C. 2.7 µl de esta solución se aplican al área de prueba. La solución de conjugado de oro de CKMB/Mioglobina contiene: 48 µl de CKMB-oro a un OD de 33, 25 µl de Mioglobina-oro a un OD de 6, 17 µl de agua y 10 µl de una solución acuosa al 2.5% de Croteina C. 2 µl de esta solución se aplican al área de prueba. A sangre entera heparinizada se agrega rCKMB, TNI y Mioglobina a concentraciones indicadas, y se aplican 28 µl a la prueba. Los resultados son como sigue: Restos: incluso sangre sin agregar de un sujeto saludable puede contener cantidades mínimas de mioglobina.

EJEMPLO 4 Área semicircular-Tres analitos-Tres zonas de detección Para más de un analito con alta sensibilidad se utilizó un contorno como en la figura 1 1. Las líneas de captura se preparan con streptavidina (13 mg/ml) como en el ejemplo 1 A (de manera similar el procedimiento de bloqueo).

En este ejemplo el contorno está dibujado con un marcador Paint Marker 780 blanco ( de Edding AG, Ahrensburg, Alemania). Todos los conjugados de sol de oro son preparados por British Biocell Intern. Cardiff, GB. Todos los anticuerpos son de Spectral Diagnostics, Toronto. TNl-conjugado de oro: Se mezclan las siguientes soluciones: 18 o µl de conjugado de oro A con un OD de 55 (50 nm de sol de oro cargado con 18 µg/ml del anticuerpo 81 -7 a OD 10), 36 µl do conjugado de oro B con un OD de 55 (60 nm de sol de oro cargado con 10 µg/ml de anticuerpo 21 -14 a OD 10), 36 µl de agua y 10 µl de una solución acuosa al 2.5% (p/v) de Croteina C. 1.8 µl de esta solución se aplican al área de prueba. Anticuerpos TNI biotinilados: Se mezclan las siguientes soluciones: 67 µl de agua, 25 µl de una solución acuosa al 6% de Croteina C. 3.5 µi de una solución de abastecimiento de anticuerpos TNI de cabra biotinilados y 5 µl de una solución de 27.6 mg/ml de Cromosoma IgG Puro de Cabra (Chrom Puré Goat IgG) (de Jackson Immuno Research laboratories Inc.). 2.1 µl de esta solución se aplican al área de prueba. Conjugado de oro-CKMB: Como en el ejemplo 1 A), excepto que el OD de la solución de abastecimiento es 33, y se aplican 1.1 µl de la mezcla. Anticuerpos CKMB Biotinilados: Como en el ejemplo 1 A), excepto que se aplican 1.4 µl.

Mioglobina-conjugado de oro: Se mezclan las siguientes soluciones: 17 µl de un conjugado de oro con un OD de 6, (15 nm de sol de oro cargado con 90 µg/ml del anticuerpo 2Mb-295 a OD 10), 73 µl de agua y 10 µl de una solución acuosa al 2.5% (p/v) de Croteina C. 0.8 µl de esta mezcla se aplican al área de prueba. A sangre entera heparinizada se ag rega rCKMB, TNI y Mioglobina a concentraciones indicadas, y se aplican 70 µl a la prueba. Los resultados (dentro de 10 a 12 minutos) son como sigue: Se debe entender que la invención no está limitada a las ilustraciones que se describen y se muestran en la presente, las cuales se considera que son solamente ilustrativas de los mejores modos de llevar a cabo la invención y que son suceptibles a modificaciones de forma, tamaño, disposición de partes y detalles de operación sin apartarse del espíritu o alcance de la invención. La invención, más bien, está diseñada para abarcar todas esas modificaciones que están dentro del espíritu y alcance de las reivindicaciones.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un dispositivo de prueba analítica para determinar la presencia de al menos un analito en una muestra de fluido, dicho dispositivo comprende: un portador poroso seco; al menos una zona de detección que cubre al menos un segmento de un área de dicho portador, la muestra se permite entrar hacia la zona de detección desde una pluralidad de direcciones diferentes; al menos un canal de zona de captura que está en comunicación operativa con la zona de detección para permitir que la muestra fluya desde la zona de detección hacia el canal de zona de captura, las distancias entre todos los puntos en donde se permite entrar a la muestra a la zona oe detección y a dicho extremo de entrada son esencialmente las mismas. 2.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque contiene reactivos que se requieren para reacciones que determinan el analito. 3.- Un dispositivo de prueba analítica para determinar la presencia de al menos un analito en una muestra de fluido, dicho dispositivo comprende: un portador poroso seco a través del cual puede fluir una muestra mediante acción capilar; un medio de suministro de muestra a través del cual la muestra se puede aplicar al dispositivo y fluir en el mismo; un canal de circulación de muestra que está cerrado en sus extremos terminales y el cual circunscribe un área del portador; al menos una zona de detección que cubre al menos un segmento de dicha área del portador, en la cual al menos un segmento del canal de circulación de muestra se conforma con un borde de la zona de detección y está en comunicación operativa con dicha zona de detección, a través de cuyo borde la muestra se permite entrar hacia la zona de detección de manera simultánea desde una pluralidad de direcciones diferentes y formar una corriente que fluye lejos de dicho borde, la zona de detección contiene al menos un reactivo marcado de unión específica para el al menos un analito, cuyo al menos un reactivo de unión es capaz de reaccionar con el al menos un analito para formar al menos un complejo marcado que es capaz de moverse junto con dicha corriente; y al menos un canal de zona de captura que tiene un extremo de entrada y un extremo terminal cerrado, el extremo de entrada está en comunicación operativa con la zona de detección para permitir que la corriente fluya desde la zona de detección hacia el canal de zona de captura, las distancias entre todos los- puntos del borde y el extremo de entrada son esencialmente las mismas, el canal de zona de captura contiene al menos un reactivo de unión específica inmovilizado, cuyo al menos un reactivo de unión es capaz de reaccionar con y concentrar el al menos un complejo marcado para formar al menos un producto de reacción detectable. 4.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1 o 3, caracterizado además porque el analito se selecciona de troponina I, troponina T, mioglobina, CK-MB y mezclas de los mismos. 5.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1 o 3, caracterizado además porque el analito se selecciona de hCG, LH y mezclas de los mismos. 6.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1 o 3, caracterizado además porque la muestra de fluido se selecciona de sangre entera, plasma, suero y orina. 7.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1 o 3, caracterizado además porque el portador poroso seco es nitrocelulosa. 8.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1 o 3, caracterizado además porque comprende dos o más zonas de detección dispuestas sobre dicha área del portador, y hay un número igual de canales de zona de captura, cada uno de los cuales está en comunicación operativa con una zona de detección correspondiente. 9.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el canal de circulación de muestra está arqueado y dicha área es-semicircular. 10.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1 o 3, caracterizado además porque dicha área es poligonal o forma parte de un polígono. 1 1.- Un dispositivo de prueba analítica adecuado para determinar la presencia de al menos un antígeno contenido en un volumen pequeño de una muestra de fluido biológico mientras permite flujo rápido y eficiente de la muestra a través de al menos una trayectoria definida en la cual tienen lugar reacciones de determinación del antígeno, dicho dispositivo comprende: una capa superior que tiene una superficie superior formada con un agujero que atraviesa para la adición de la muestra, el agujero que atraviesa está en registro con un canal de suministro de muestra formado en la superficie inferior de la capa superior y en comunicación operativa con un canal de circulación de muestra cerrado en sus extremos terminales y formado con paredes interiores y exteriores para definir una trayectoria para la muestra en la superficie ¡nferior de la capa superior, las paredes interiores del canal de circulación definen una ¡ndentación en la superficie inferior de la capa superior, una capa de soporte adherida a la capa superior, una capa de portador poroso seco a través de la cual la muestra puede fluir mediante acción capilar emparedada entre las capas superior e inferior, la capa de portador poroso está configurada para contener al menos una zona de detección que tiene un borde en comunicación operativa con un segmento del canal de circulación de muestra y un segundo extremo opuesto en comunicación operativa con un canal de zona de captura que tiene un extremo de entrada y un extremo terminal cerrado para proveer por lo tanto un conducto a tra .'és de! cual la muestra líquida puede fluir mediante acción capilar desde el canal de circulación de muestra al extremo terminal del canal de zona de captura; el canal de suministro, el canal de circulación, ei canal de zona de detección y de zona de captura forman una trayectoria definida a través de la cual la muestra líquida fluye desde el agujero que atraviesa al extremo terminal del canal de captura; hay al menos un reactivo móvil, marcado, en el canal de zona de captura que reaccionará con y concentrará el complejo marcado para formar un producto de reacción detectable. 12.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el canal de circulación de muestra es arqueado. 13.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la muestra biológica líquida se selecciona de sangre entera, plasma, suero y orina. 14.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el antígeno se selecciona de troponina I, troponina T, mioglobina, CK-MB y mezclas de los mismos. 15.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el antígeno se selecciona de hCG, LH y mezclas de los mismos. 16.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la capa superior es transparente y el producto de reacción detectable es visible. 17.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la capa superior es opaca y tiene una ventana de observación a través de la cual el producto de reacción detectable es visible. 18.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque, en la zona de detección, hay una mezcla de un anticuerpo movible marcado el cual reaccionará con un epítope sobre el analito y un anticuerpo movible marcado con biotina el cual reaccionará con otro epítope sobre el analito, y el reactivo inmovilizado se selecciona del grupo consistente de streptavidina y avidina. 19.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la marca es una marca directa en partículas. 20.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque la marca es una marca de oro. 21.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque el portador poroso seco es nitrocelulosa. 22.- Ef dispositivo de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el al menos un antígeno es un analito cardíaco y dicha muestra biológica líquida es sangre entera, el portador poroso seco provoca que los glóbulos rojos se separen cromatográficamente del plasma para provocar la formación de un frente de plasma que se mueve en el canal de zona de captura y un frente de glóbulos rojos corriente arriba del mismo, la porción principal del complejo marcado estando entre el frente de glóbulos rojos y el frente de plasma de manera que el complejo marcado está sustancialmente libre de glóbulos rojos cuando encuentra al reactivo inmoviüzedc para formar el producto de reacción detectable. 23.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque, el reactivo móvil en la zona de detección, es un anticuerpo marcado el cual reaccionará con un epítope sobre el analito y el reactivo inmovilizado es un anticuerpo el cual reaccionará con otro epítope sobre el analito. 24.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque, en la zona de detección, hay una mezcla de un anticuerpo móvil marcado el cual reaccionará con un epítope sobre el analito y un anticuerpo móvil marcado con biotina el cual reaccionará con otro epítope sobre el analito, y el reactivo inmovilizado es una avidina. 25.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque contiene los reactivos para determinar la presencia de troponina I o troponina T. 26.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque contiene dos trayectorias, una que contiene los reactivos para determinar la presencia de mioglobina, el otro contiene los reactivos para determinar la presencia de CK-MB. 27.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque contiene tres trayectorias, la primera trayectoria contiene los reactivos para determinar la presencia de trop?nina I o troponina T, la segunda trayectoria contiene los reactivos para determinar la presencia de mioglobina, y la tercera trayectoria contiene los reactives- para determinar la presencia de CK-MB. 28.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la primera trayectoria contiene solamente los reactivos para determinar la presencia de troponina I. 29.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque hay solamente una trayectoria y contiene los reactivos para determinar la presencia de mioglobina y CK-MB. 30.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque hay solamente una trayectoria y contiene los reactivos para determinar la presencia de troponina I y troponina T junto con los reactivos para determinar la presencia de mioglobina y CK-MB. 31.- Un método para determinar la presencia de al menos un analito en una muestra de fluido, que comprende los pasos secuenciales de: i) proveer un portador poroso seco a través del cual puede fluir la muestra mediante acción capilar; ii) proveer al menos una zona de detección que cubre al menos un segmento de un área de dicho portador, de manera que la muestra se permite entrar hacia la zona de detección desde una pluralidad de direcciones diferentes, y dicha zona de detección contiene al menos un reactivo móvil de unión marcado para el al menos un analito, cuyo reactivo de unión es capaz de reaccionar con dicho analito para formar un complejo marcado; proveer al menos un canal de zona de captura que tiene un extremo de entrada que está en comunicación operativa con la zona de detección para permitir que la muestra fluya- desde la zona de detección - hacia el—cana! de zona de captura, las distancias entre todos los puntos en donde dicha muestra se permite entrar a la zona de detección y a dicho extremo de entrada son esencialmente las mismas, el canal de zona de captura contiene un reactivo de unión específica inmovilizado, cuyo reactivo de unión es capaz de reaccionar con y concentrar el complejo marcado para formar un producto de reacción detectable; iv) aplicar una cantidad de dicha muestra de fluido a la zona de detección; v) permitir que transcurra un período de tiempo suficiente para que la muestra de fluido fluya desde la zona de detección desde dicha pluralidad de diferentes direcciones al canal de zona de captura y cualquier analito en el mismo para formar un producto de reacción detectable en dicha zona de captura; vi) identificar la presencia del al menos un analito en la muestra de fluido mediante la detección de cualquier producto de reacción detectable en dicha zona de captura. 32.- El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque el al menos un analito es un analito cardiaco. 33.- El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque se proveen tres trayectorias para identificar la presencia de troponina I o troponina T junto con identificar la presencia de mioglobina y CK-MB. 34.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque se provee solamente una trayectoria para identificar la presencia de troponina I o troponina T junto con identificar la presencia de mioglobina y CK-MB. 35.- Un dispositivo de prueba analítica adecuado para determinar la presencia de al menos un analito contenido en un volumen pequeño de una muestra biológica líquida mientras permite flujo rápido y eficiente de la muestra a través de al menos una trayectoria definida en la cual tienen lugar reacciones de determinación del analito, dicho dispositivo comprende: una capa superior que tiene una superficie superior formada con un agujero que atraviesa para la adición de la muestra, el agujero que atraviesa está en registro con un canal de suministro de muestra formado en la superficie inferior de la capa superior, dicho canal de suministro de muestra tiene paredes definidas por la superficie inferior de la capa superior y una superficie superior de una capa inferior, el canal de suministro de muestra en comunicación operativa con un canal de circulación de muestra cerrado en sus extremos terminales y formado con paredes interiores y exteriores para definir una trayectoria para la muestra en la superficie inferior de la capa superior, las paredes interiores del canal de circulación definen una indentación en la superficie inferior de la capa superior, la capa inferior adherida a la capa superior, el portador poroso seco entre las mismas en contacto con las paredes del canal de circulación de muestra y provee una trayectoria de fluido desde el mismo; la trayectoria de fluido de la capa de portador poroso seco está configurada para contener al menos una zona de detección que tiene un borde en comunicación operativa con el cana! de circulación de muestra, la muestra se permite entrar hacia la zona de detección desde el canal de circulación de muestra desde una pluralidad de direcciones diferentes; y un extremo opuesto en comunicación operativa con un canal de zona de captura que tiene un extremo de entrada y un extremo terminal cerrado para proveer un conducto a través del cual la muestra líquida puede fluir mediante acción capilar desde el canal de circulación de muestra al extremo terminal del canal de zona de captura, las distancias entre todos los puntos en donde se permite entrar a la muestra a la zona de detección y al extremo de entrada son esencialmente las mismas; el canal de suministro de muestra, el canal de circulación de muestra, el canal de zona de detección y de zona de captura forman una trayectoria definida a través de la cual la muestra líquida fluye desde el agujero que atraviesa al extremo terminal del canal de captura; hay un reactivo inmovilizado en el canal de zona de captura que reaccionará con dicho analito para formar un producto detectable. 36.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque el canal de circulación de muestra es arqueado. 37.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque la muestra biológica líquida se selecciona de sangre entera, plasma, suero y orina. 38.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque el analito se selecciona de mioglobina, CK-MB, cualquiera de troponina I o troponina T, y combinaciones de los mismos. 39.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque el analito se selecciona de hCG, LH y la combinación de los mismos. 40.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque la capa superior es transparente y el producto de reacción detectable es visible. 41.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque la capa superior es opaca y tiene una ventana de observación o transparencia a través de la cual el producto de reacción detectable es visible. 42.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque se provee un reactivo móvil marcado, dicho reactivo es un anticuerpo marcado el cual reaccionará con un epítope sobre el analito y el reactivo inmovilizado es un anticuerpo el cual reaccionará con otro epítope sobre el analito. 43.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque comprende una mezcla de un anticuerpo móvil marcado el cual reaccionará con un epítope sobre el analito y un anticuerpo movible marcado con biotina el cual reaccionará con otro epítope sobre el analito, y ei reactivo inmovilizado es una avidina. 44.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque el reactivo inmovilizado se selecciona del grupo consistente de streptavidina y avidina. 45.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque la marca es una marca directa en partículas. 46.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque la marca es una marca de oro. 47.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque el portador poroso seco es nitrocelulosa. 48.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque dicho reactivo móvil se provee en la zona de detección. 49.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque dicho reactivo móvil se provee en la trayectoria de fluido antes de la membrana. 50.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque contiene dos trayectorias, una que contiene los reactivos para determinar la presencia de mioglobina, el otro contiene los reactivos para determinar la presencia de CK-MB. 51.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque contiene tres trayectorias, una trayectoria contiene los reactivos para determinar la presencia de troponína I o troponina T, otra trayectoria contiene los reactivos para determinar la presencia de mioglobina, y otra trayectoria contiene los reactivos para determinar la presencia de CK-MB. 52.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque contiene los reactivos para determinar la presencia de troponina I. 53.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque hay solamente una trayectoria y contiene los reactivos para determinar la presencia de mioglobina y CK-MB. 54.- El dispositivo de conformidad con !a reivindicación • 35, caracterizado además porque hay solamente una trayectoria y contiene los reactivos para determinar la presencia de troponina I y troponina T junto con los reactivos para determinar la presencia de mioglobina y CK-MB. 55.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque se provee una ventana en la unión entre el canal de suministro de muestra y el canal de circulación de muestra para indicar que se ha añadido suficiente muestra al canal de suministro de muestra para conducir la determinación del al menos un analito. 56.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque el canal de suministro de muestra tiene una capacidad predeterminada que corresponde al volumen de muestra necesario para conducir la determinación del al menos un analito, el canal de suministro de muestra tiene medios para conducir dicho volumen predeterminado de muestra desde el canal de suministro de muestra al canal de circulación de muestra cuando el canal de suministro de muestra está lleno con el volumen predeterminado. 57.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado además porque la porción del canal de suministro de muestra en comunicación operativa con el canal de circulación de muestra comprende una porción capilar angosta que conduce al canal de circulación de mue stra, en el cual cuando el canal de suministro de muestra está lleno con la muestra al punto de contacto con dicha porción capilar angosta, la muestra se conduce al canal de circulación de muestra. 58.- Un dispositivo de prueba analítica adecuado para determinar la presencia de al menos un analito contenido en un volumen pequeño de una muestra biológica líquida mientras permite flujo rápido y eficiente de la muestra a través de al menos una trayectoria definida en la cual tienen lugar reacciones de determinación del analito, dicho dispositivo comprende: una capa superior que tiene una superficie superior formada con un agujero que atraviesa para la adición de la muestra, el agujero que atraviesa está en registro con un canal de suministro de muestra formado en la superficie superior de la capa superior, el canal de suministro de muestra en comunicación operativa con un canal de circulación de muestra cerrado en sus extremos terminales y formado con paredes interiores y exteriores para definir una trayectoria para la muestra en la superficie inferior de la capa superior, las paredes interiores del canal de circulación definen una indentación en la superficie inferior de la capa superior, una capa inferior adherida a la capa superior, la capa inferior y la capa superior sostienen un portador poroso seco entre las mismas, dicho portador poroso seco tiene una trayectoria de fluido; la trayectoria de fluido de la capa de portador poroso seco está configurada para contener ai menos una zona de detección que tiene un borde en comunicación operativa con un segmento del canal de circulación de muestra y un extremo opuesto en comunicación operativa con un canal de zona de captura que tiene un extremo de entrada y un extremo terminal cerrado para proveer un conducto a través del cual la muestra líquida puede fluir mediante acción capilar desde el canal de circulación de muestra desde una pluralidad de direcciones diferentes hacia el portador porcoo-y a la entrada del canal de zona de captura, hacia el canal de zona de captura, al extremo terminal del canal de zona de captura; las distancias entre todos los puntos en donde se permite entrar a la muestra a la zona de detección y al extremo de entrada son esencialmente las mismas; y el canal de suministro, el canal de circulación, el canal de zona de detección y de zona de captura forman una trayectoria definida a través de la cual la muestra líquida fluye desde el agujero que atraviesa al extremo terminal dei canal de captura; hay un reactivo inmovilizado en el canal de zona de captura que reaccionará con dicho analito para formar un producto detectable. 59.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque comprende al menos un reactivo marcado, móvil, el cual reaccionará específicamente con el analito para formar un complejo marcado el cual se moverá mediante acción capilar hacia el canal de zona de captura, y hay un reactivo inmovilizado en el canal de zona de captura que reaccionará con y concentrará el complejo marcado para formar un producto de reacción detectable. 60.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque el canal de circulación de muestra es arqueado. 61.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque la muestra biológica liquida se selecciona de sangre entera, plasma, suero y orina. 62.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque oí analito se selecciona- de mioglobina, CK-MB cualquiera de troponina I o troponina T, y combinaciones de los mismos. 63.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque el analito se selecciona de hCG, LH y mezclas de los mismos. 64.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque, el reactivo móvil en la zona de detección es un anticuerpo marcado el cual reaccionará con un epítope sobre el analito y el reactivo inmovilizado es un anticuerpo el cual reaccionará con otro epítope sobre el analito. 65.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque comprende una mezcla de un anticuerpo móvil marcado el cual reaccionará con un epítope sobre el analito y un anticuerpo móvil marcado con biotina el cual reaccionará con otro epítope sobre el analito, y el reactivo inmovilizado es una avidina. 66.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque el reactivo inmovilizado se selecciona del grupo consistente de streptavidina y avidina. 10 67.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque la marca es una marca directa en partículas. 68.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque la marca es una marca de oro. 69.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 58, ? ^ caracterizado además porque el portador perece seco es nitrocelulosa. 70.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque contiene los reactivos para determinar la presencia de troponina I o troponina T. 71.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 58, 0 caracterizado además porque contiene dos trayectorias, una que contiene los reactivos para determinar la presencia de mioglobina, el otro contiene los reactivos para determinar la presencia de CK-MB. 72.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque contiene tres trayectorias, una trayectoria contiene -í los reactivos para determinar la presencia de troponina I o troponina T, otra trayectoria contiene los reactivos para determinar la presencia de mioglobina, y otra trayectoria contiene los reactivos para determinar la presencia de CK-MB. 73.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque contiene solamente los reactivos para determinar la presencia de troponina I. • 74.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque hay solamente una trayectoria y contiene los reactivos para determinar la presencia de micglobina y CK-MB. 75.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque hay solamente una trayectoria y contiene los reactivos para determinar la presencia de troponina I y troponina T junto con los reactivos para determinar la presencia de mioglobina y CK-MB. 76.- El dispositivo- e -conformidad con la reivindicación 58. caracterizado además porque el canal de suministro de muestra tiene una capacidad predeterminada que corresponde al volumen de muestra necesario para conducir la determinación del al menos un analito, el canal de suministro de muestra tiene medios para conducir dicho volumen predeterminado^ de muestra desde el canal de suministro de muestra al canal de circulación de muestra cuando el canal de suministro de muestra está lleno con el volumen predeterminado. 77.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado además porque la porción del canal de suministro de muestra en comunicación operativa con el canal de circulación de muestra comprende una porción capilar angosta que conduce al canal de circulación de muestra, en el cual cuando el canal de suministro de muestra está lleno con la muestra al punto de contacto con dicha porción capilar angosta, la muestra se conduce al canal de circulación de muestra. 78.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque está presente un reactivo seco en el canal de suministro de muestra. 79.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado además porque dicho reactivo se selecciona del grupo consistente de un anticuerpo marcado a dicho analito, un anticuerpo biotinilado a dicho analito, y la combinación de los mismos.