MXPA98007544A - Dispositivo de inmunoensayo - Google Patents

Abstract

Esta invención provee dispositivos diagnósticos en los cuales todas las reacciones, necesarias para determinar la presencia de un analito en sangre entera sin interferencia de células sanguíneas rojas, tienen lugar en una o a lo mucho dos membranas, sobre las cuales se separa cromatográficamente una corriente de sangre entera que fluye longitudinalmente, para proveer un frente de células sanguíneas rojas y un frente de plasma principal.

Description

DISPOSITIVO DE INMUNOENSAYO CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a dispositivos y métodos útiles para ensayos diagnósticos a fin de determinar la presencia de analitos característicos de una condición mórbida, tal como alfuncionamiento cardíaco o infección microbiana. Más particularmente, es útil para identificar analitos en sangre entera, aunque no está limitada de esta manera.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se ha desarrollado recientemente una cantidad de procedimientos de inmunoensayo los cuales utilizan reacciones que tienen lugar sobre una membrana porosa o celular, siendo detectables las reacciones ya sea visualmente o con un instrumento tal como un reflectóme ro. Aunque no están limitados de esta manera, estos procedimientos implican generalmente reacciones an ígeno/an icuerpo en los cuales un miembro del par reactivo se etiqueta con una etiqueta detectable. Típicamente, la etiqueta es una etiqueta de enzima o una etiqueta de solución coloidal tal como oro. Los técnicos están bien enterados de muchas etiquetas útiles y de su método de operación. Por consiguiente, no hay necesidad de mayores discusiones acerca de las etiquetas en la presente.

Los dispositivos inmunocromatográficos típicos de esta naturaleza se describen en varias patentes de Estados Unidos y extranjeras. Por ejemplo, la patente de Estados Unidos 4,861,711 describe un dispositivo en el cual se detecta un analito mediante de reacciones antígeno/anticuerpo que tienen lugar en una serie de membranas coplamares en contacto de borde a borde. Las patentes de Estados Unidos 4,477,575 y 4,816,224 describen dispositivos laminares que incluyen una capa de fibra de vidrio para conducir reacciones similares. Otros dispositivos laminados se describen en las patentes de Estados Unidos: 4,774,192 5,079,142 4,753,776 5,096,809 4,933,092 5,110,724 4,987,065 5,144,890 4,075,078 5,290,678 5,135,716 5„591,645 La patente de E.U.A. No. 5,135,716 utiliza un agente aglutinante para oxidar en la separación de células sanguíneas rojas. Todas las patentes describen dispositivos laminados. Según están enterados los solicitantes, no se ha conocido o descrito previamente ningún dispositivo inrmunocromatográfico no laminado operable con sangre entera.

Los dispositivos tales como los descritos en las patentes anteriormente identificadas son a menudo difíciles de fabricar porque son de capas múltiples y requieren varias capas de tiras porosas y de filtración para garantizar resultados exactos. Para la detección de analitos es la sangre entera, es necesario separar las células sanguíneas rojas, para que no interfieran con la visualización del producto teñido, que es usualmente una consecuencia de la reacciones de inmunoensayo. Se han usado vellones de fibra de vidrio para filtración, pero esto añade simplemente otra capa al dispositivo. Las dificultades surgen a causa de los problemas de colocar exactamente varias capas de tiras flexibles delgadas en correspondencia apropiada una sobre la otra mientras que se retiene a la vez las zonas de colocación de muestras, la zonas de reacción y otras áreas de las tiras en relación apropiada de una con otra. Los problemas se complican además por las dificultades de colocar el dispositivo colocado en la platafopna apropiada o sobre ella que es a menudo un receptáculo o hueco con el miembro superior e inferior separables, incluyendo postes y ranuras fijos para evitar que el dispositivo se mueva y mantener las áreas definidas del dispositivo en posición apropiada en relación con las ventanas de observación y otras aberturas en el receptáculo. Los instrumentos de inmunoensayo tales como los precedentes, cuando se emplean para detectar analitos en sangre entera utilizan etiquetas sobre los anticuerpos para los analitos que dan a lugar a un producto detectable. En el caso usual, un anticuerpo detector etiquetado reacciona con un epítope sobre el analito y otro anticuerpo de captura reacciona con otro epítope sobre el analito. Típicamente, el producto es visiblemente detectable porque está teñido. En algunas construcciones, el color es evidente a simple vista. En dispositivos más sofisticados, la concentración del analito se puede determinar midiendo la intensidad del color producido con un instrumento adecuado. En ambos casos, la presencia de células sanguíneas rojas en el área de desarrollo de color interfiere con la visualización apropiada del color debido al intenso matiz de la células. Se ha hecho mucho esfuerzo para evitar esta interferencia. Como resultado, todos los dispositivos propuestos para análisis de sangre entera incluyen cierto tipo de filtro para separar las células sanguíneas rojas a fin de producir un suero o plasma que no menos cave la visibilidad del color que se produce. Un billón de fibra de vidrio dio por resultado el disposito de la patente de Estados Unidos 4,477,575 para filtrar las células sanguíneas rojas. Otras patentes describen el uso de filtros de papel o de plástico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención provee un dispositivo en cual todas las reacciones necesarias para determinar la presencia de un analito en sangre entera, sin interferencia de células sanguíneas rojas, tienen lugar sobre uno o a lo mucho dos dispositivos con membrana ensamblado mediante técnicas de fabricación sencillas. El dispositivo puede estar contenido en un receptáculo muy simple. Aun que la invención no está limitada de esta manera, por conveniencia, se describirá según se utiliza para la detección de analitos cardíaco en sangre entera. Se puede emplear adicionalmente para detectar y/o medir una extensa variedad de analitos en la sangre, tales como: fármacos, incluyendo fármacos terapéuticos y fármacos en abuso; hormonas, vitaminas, proteínas, incluyendo anticuerpos de todas las clases, péptidos; esteroides, bacterias, hongos, virus, parásitos, componentes y productos de bacterias, hongos, virus o parásitos; alérgenos de todos los tipos, productos o componentes de células normales o malignas; etc. Como ejemplos particulares, se pueden mencionar digoxina, hCG; insulina; teofilina; hormona luteinizante; hormona estimuladora de tiroides; organismos que causan o que están asociados con varios estados mórbidos, tales como pirógenos de estreptococos (grupo A), Herpes Simples I y II, ci omegalovirus, Chlamidia, anticuerpo de la rubéola, etc.

Una característica importante de esta invención es la configuración geométrica de dispositivo en el cual cuando se utiliza para análisis de sangre entera está diseñada para proveer un torrente a partir del cual se han separado substancialmente todas la células sanguíneas rojas. Como el resultado del diseño geométrico del dispositivo, un volumen fijo de plasma está en contacto con un área preseleccionada de dispositivo durante un período más prolongado, proveyendo así suficiente tiempo de contacto para que tenga lugar las reacciones de enlace. Dicho volumen fijo está determinado por la capacidad volumétrica de la membrana.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Se entenderá mejor esta invención cuando se considere conexión con la siguiente descripción la cual, junto con los dibujos, forma parte de esta especificación en la cual: La figura 1 es una vista en planta de un dispositivo de capa única de la invención. La figura 2 es una vista en planta de un dispositivo de la invención en donde una membrana larga superior se desdobla y se gira a 180° con respecto a otra membrana más corta sobre la cual está sobrepuesta en contacto con fluidos. La figura 3 es una vista en planta de un producto de la invención que muestra cuatro dispositivos de la invención en la misma estructura uritaria.

La figura 4 es una vista en explosión de un producto alterno de la invención que muestra un dispositivo de capa doble de la invención sobre una plataforma con el miembro superior o inferior. La figura 5a muestra una sección a través de un alojamiento de dispositivo correspondiente a la actual figura 4. La figura 5b muestra una vista en planta de la membrana superior para su uso en la figura 5a La figura 5c muestra una vista en planta de la membrana inferior para su uso en la figura 5a. La figura 6a muestra una sección a través del alojamiento de dispositivo evitando el uso de un orificio en la membrana superior mostrada en la figura 4. La figura 6b muestra una vista en planta de la membrana superior para su uso en la figura 6. La figura 6c muestra una vista en planta de la membrana inferior para su uso en la figura 6a. La figura 7 muestra un dispositivo de membrana única usada en el ejemplo 2. Las partes están identificadas por nombre para su fácil comprensión. La figura 8 muestra un dispositivo usado en el ejemplo 3. Las partes están identificadas similarmente. La figura 9 muestra el dispositivo usado en el ejemplo 4 etiquetado similarmente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En esta descripción de la invención, el dispositivo es la estructura de membrana empleada para retardar cro atrográficamente el flujo de células sanguíneas rojas en sangre aplicada a un zona de aplicación de la misma para transformar así la sangre entera en un torrente con frente de plasma seguido por un frente de la células sanguíneas rojas en movimiento más lento. El dispositivo está adaptado particularmente y bien adecuado para la recepción y el procedimiento diagnóstico de cantidades pequeñas de muestra de fluido, tales como gotículas de sangre entera recibidas a partir de un procedimiento de porción en el dedo. La estructura de membrana sirve también de substrato para las reacciones diagnósticas. El receptáculo es el portador, sostén o plataforma para el dispositivo. Un producto de la invención es la combinación de un dispositivo y un receptáculo. Un factor con ribuyente fundamental para la invención descrita y reclamada en la presente es el descubrimiento de que las membranas celulares, construidas preferiblemente de nitrocelulosa, retardarán o eliminarán preferencialmente el flujo de las células sanguíneas rojas que se mueven a lo largo de la membrana, formando así un torrente que presenta un frente de células sanguíneas rojas y corriente abajo del mismo un frente de plasma. Más específicamente, las células sanguíneas rojas no se filtran de la sangre entera, sino que se separan cromatográficamente del plasma el cual, en el substrato de membrana seleccionado, fluye más rápido que las células sanguíneas rojas. Otra característica de la invención es que el segmento o la sección de plasma del torrente, el cual está substancialmente libre de células sanguíneas rojas, se manipula de modo que fluya lentamente a través del área en la cual tiene lugar algunas de las reacciones diagnósticamente útiles. Se explicará esta características con más detalle a continuación en la presente. Los dispositivos de esta invención están diseñados con un zona de aplicación de muestras a la cual se aplica la muestra de sangre y, corriente abajo de la zona de aplicación de muestra, un zona de flujo, tal como ejemplo una zona de reacción alargada que incluye una zona detectara corriente arriba de un zona de captura. En este respecto, un dispositivo de la invención no es diferente a los dispositivos previamente conocidos, tales como los que se describen en la patentes identificadas anteriormente. La características crítica sobre tocios los tales dispositivos es que un analito, un cadena ligera de mioglobina o miosina en la sangre, reacciona con un anticuerpo etiquetado móvil teñido para el analito en la zona de reacción para formar un complejo antígeno/anticuerpo. Este complejo es soluble o suspendido en un líquido o portador y se mueve hacia abajo de la membrana para reaccionar con un anticuerpo de captura para formar un producto de reacción de anticuerpo/antígeno/anticuerpo, en donde el antígeno es el analito. Todos aquellos dispositivos, cuando se emplean con sangre entera para lograr la diagnosis mediante la producción del producto de color, emplea cierto tipo de filtro para detener el flujo de células sanguíneas rojas y separarlas de las áreas en donde tienen lugar las reacciones diagnósticas útiles para evitar la interferencia con la formación e interpretación de los colores. Típicamente, el filtro es un filtro de fibra de vidrio, de plástico o de celulosa, que separa las células sanguíneas rojas conforme a la sangre se mueve longitudinalmente a partir del punto de aplicación hacia el área de reacción. En contraste con tales construcciones diagnósticas previamente conocidas, el dispositivo de esta invención logra una separación cromatográfica en donde las células sanguíneas rojas continúan fluyendo, pero a velocidad más lenta que la de el plasma o el suero. Por consiguiente, las células sanguíneas rojas se separan del plasma cromatográficamente antes que por filtración. Se ha descubierto sorprendentemente que la sangre entera, conforme se mueve a lo largo de la membrana tal como una membrana de nitrocelulosa, se separa cromatográficamente a un torrente de plasma que se mueve de manera relativamente rápida y a un torrente de células sanguíneas rojas que se mueven de manera relativamente lenta. Como resultado, las células sanguíneas rojas logran separarse del plasma. En un dispositivo de la invención, las reacciones inmunológicas iniciales pueden tener lugar incluso antes de que el frente de plasma del torrente substancialmente libre de células sanguíneas rojas se haya formado. La reacción continúa en el plasma separado para proveer información diagnósticamente útil. Durante un evento isquémico, tal como una anguina estable o inestable o un infarto del miocardio, una variedad de diferentes proteínas características del evento son liberadas con el tejido cardiaco. Esas proteínas a las cuales se hace referencia como analitos pueden usarse diagnósticamente como se describe en las patentes de E.U.A. No. 5,290,678 y No.-5,604,105, las citas de las cuales se incorporan en la presente por referencia. Algunos ejemplos típicos de analitos son la mioglobina, creatina cinasa-MB (CK-MB), cadena ligera de miocina, troponina I y troponina T. Como se describe en estas patentes, la presencia de estos analitos en la sangre entera se determina mediante reacciones de antígeno/anticuerpo que tienen lugar en la estructura laminada en la cual el analito hace contacto primero con el anticuerpo detector etiquetado que reacciona con un primer epítope sobre el analito para formar un complejo anticuerpo etiquetado/analito. El complejo se pone en contacto después con un anticuerpo de captura que reacciona con otro epítope sobre el analito para formar un producto de reacción anticuerpo etiquetado/analito/anticuerpo detector visible. Como se describe en las patentes, la detección de la presencia por lo menos de tres analitos en más de las cantidades normales permite al médico caracterizar exactamente en evento cardiaco como anguina estable o inestable o un infarto del miocardio. Hay muchos otros analitos cardiacos que se pueden emplear similarmente. Son obtenibles también los dispositivos con solamente uno o dos analitos, pero generalmente no pueden dar tanta información como los dispositivos adaptados a tres o más analitos. Un claro entendimiento de esta invención será facilitado por una descripción de algunas modalidades específicas. La descripción estará seguida por una discusión de algunas de las consideraciones generales implicadas en el diseño de los productos de la invención. La figura 1 muestra un dispositivo típico de la invención constituido de una membrana 10 configurada como se muestra. La membrana incluye una zona de aplicación de muestras 12 a la cual se puede aplicar una o más cotas de sangre entera. Como se indica con anterioridad, es una ventaja particular de la invención que se puede analizar directamente la sangre entera y que se requieran solamente cantidades pequeñas de sangre, por ejemplo de aproximadamente 8 a aproximadamente 20 µl o aún menos. Se puede obtener esta cantidad de sangre y aplicarla directamente de una porción de dedo o de un gotero o pipeta después de su extracción de un paciente.

La sangre se mueve corriente abajo de la zona de aplicación 12 a una zona de reacción que incluye una zona de detector 14 que contiene un reactivo de anticuerpo detector etiquetado con un epítope sobre el analito para producir urv complejo anticuerpo etiquetado/analito. Esta reacción es bien conocida y no es necesario describirla con detalle. Se puede utilizar cualquiera de una variedad de etiquetas utilizables para el experto en la técnica. Se prefieren las etiquetas de metal y enzima. Se prefieren especialmente las etiquetas de metal debido a su notable sensitividad. Entre los metales, el oro es el más preferido principalmente porque se emplea tan extensamente para este tipo de reacción y sus características son muy bien entendidas. Adicionalmente, se puede realzar una señal de oro para que se haga fácilmente visible mediante el uso de una sal de plata soluble y un agente reductor de acuerdo con los procedimientos conocidos. La etiqueta de oro actúa como catalizador para reducir la sal de plata a plata metálica, que se deposita como un producto amiscible. Un par reactivo típico es el lactato de plata, que sirve como la fuente de iones de plata reducibles y la hidroquilina como agente reducto. La plata metálica forma un depósito negro fácilmente perceptible alrededor de cada partícula de oro. Puede haber una zona de preincubación que comienza en la zona de aplicación y continua la zona detectora aunque no es una característica necesaria de la invención. Se emplea la zona de preincubación para separar los productos presentes en la sangre que interfieran con las reacciones deseadas y hagan difícil detectarlos.. Un interferón típico es la isoforma de creatina sinasa, CK-MM. Los anticuerpos para la isoforma CK-MB pueden reaccionar cruzadamente con CK-MM y dar lecturas falsas. Se puede evitar esto proveyendo suficiente cuerpo inmovilizado para CK-MM en una zona de preincubación de modo que se separe todo el CK-MM antes de que la muestra en la movimiento alcance la zona de detección. El dispositivo de la figura 1 puede utilizar uno o a una multitud de anticuerpos vectores etiquetados. Cuando se emplean varios detectores etiquetados se debe ejercer cuidado para evitar las reacciones de interferencia. A menudo es mejor que los anticuerpos estén dispuestos en una. o más zonas de detección para reaccionar con sus analitos específicos. El anticuerpo detector etiquetado es móvil, es decir, esta unido moviblemente a la membrana 10 en la zona detectora 14 de modo que el complejo anticuerpo etiquetado/analito, una vez formado, está libre para moverse corriente abajo. Desde luego, los anticuerpos empleados en esta reacción o en reacciones que se describirán subsiguientemente pueden ser monoclonales o policlonales. Una gran cantidad de tales anticuerpos son bien conocidos y fácilmente obtenibles y pueden prepararse mediante procedimientos regulares. Conforme la sangre se mueve corriente abajo alejándose de la zona de aplicación 12, las células sanguíneas rojas se mueven más lentamente que el plasma y forman un frente 16. Una proporción del componente de plasma de la muestra sanguínea original continúa corriente abajo como un segmento de plasma como fuente se indica en la figura 1 con el 18. Finalmente y como se indica anteriormente, substancialmente todas las células sanguíneas rojas están confinadas a un área que abarca la zona de aplicación 12 el fuente 16 de células sanguíneas rojas. Si se ha formado un complejo anticuerpo etiquetado/analito, este se disolverá en el plasma y se llevará hacia la zona de captura 20. En la zona de captura, el complejo hará contacto con el anticuerpo de captura, el cual reaccionará con el complejo para formar un producto de reacción anticuerpo etiquetado detectable/analito/anticuerpo. Se notará que la primera reacción del anticuerpo etiquetado y el analito puede tener lugar en el torrente sanguíneo entero en presencia de las células sanguíneas rojas. Por el análisis apropiado de los analitos en la muestra de sangre, no es necesario saber en este punto que el anticuerpo detector ha reaccionado con un analito. Las células sanguíneas rojas no son interferentes. Si se desea, sin embargo, se puede formar el complejo corriente abajo del fuente 16 de células sanguíneas rojas mediante la colocación apropiada del anticuerpo etiquetado, pero esto puede incrementar innecesariamente la longitud del dispositivo. Si la etiqueta es una solución coloidal tal como oro, se formará una línea visible, la cual como se sugiere anteriormente puede ser el producto de oro o puede ser plata reducida. Si la etiqueta es una enzima tal como peroxidasa de rábano picante, se puede detectar la reacción mediante la adición de peróxido de hidrógeno y una tintura tal como ortofenilendiamina de acuerdo con procedimientos regulares. El dispositivo de la figura 1 incluye una zona de control 22, la cual puede contener un producto que reaccione con cualquier substancia presente normalmente en la sangre y en el plasma para producir un producto miscible. El uso de una reacción de control es opcional, pero es preferido de modo que el operador sepa que se ha aplicado suficiente sangre en la zona de aplicación 12 y que las reacciones diagnósticas han tenido la oportunidad de tener lugar. Los expertos en la técnica reconocerán que las reacciones descritas tendrán una cinética de reacción característica y que cada una requerirá un período para que se complete la reacción. Para garantizar que habrá suficiente tiempo para la terminación de la reacción con el anticuerpo de captura y la producción de suficiente producto fácilmente miscible, el dispositivo de la invención está configurado de modo que se retarde la velocidad de flujo de la corriente de plasma y hay más tiempo para la reacción del complejo anticuerpo etiquetado/analito con el anticuerpo de captura. En general, se puederv lograr referentemente medios la modulación al control del flujo de la muestra del fluido y sus componentes. Por ejemplo, la membrana puede estar configurada de modo que se pueda alargar el flujo de fluido (es decir, flujo del plasma) para que se extienda al extremo de la membrana. Otra manera de la cual se puede controlar el flujo es restringiendo los canales, ya sea en tamaño o en número, mediante lo cual puede tener lugar tal flujo. Una tercer manera para controlar el flujo es aplicar un volumen predeterminado de muestra a la membrana, de modo que la cantidad de tal membrana corresponda al volumen que llene solamente los canales disponibles en la membrana para tal flujo de fluido. Según lo anterior, el dispositivo puede incluir una modulación de flujo o medios de control asociados con la membrana o las tiras, que pueden comprender, por ejemplo, una o más restricciones en el ancho de la membrana, la colocación de uno o más reguladores o barreras de flujo similares, para inhibir el flujo de plasma. Se pueden formar tales reguladores mediante compresiones de la membrana las cuales eliminarían la porosidad y, por consiguiente, inhibirían o imitarían el flujo a través de la misma. Se pueden efectuar también la modulación o recepción de flujo alargando la corriente de plasm de modo que aumente la distancia que de al fluido un volumen fijo de plasma antes de que alcance un anticuerpo de captura. El resultado final es que el volumen total de plasma permanezca en las zonas de captura 20 durante un período más prolongado. La capacidad volumétrica de la tira entre la zona de captura de 20 y el extremo de la tira 10a determina el volumen de plasma que fluye a través de la región de captura 20. Es decir, se detiene el flujo cuando la tira está totalmente saturada. Además, esto evita también el flujo posterior de las células rojas y evita que obscurezcan la región de captura. Naturalmente, se contemplan variaciones de diseño, construcción, con ig ración y tamaño del dispositivo, dentro del alcance de la presente invención. Otra función del alargamiento es proveer una separación mayor entre el frente de células sanguíneas rojas y el frente 18 plasma para un volumen de plasma mínimo. Esto es importante para reducir al mínimo la posibilidad de que las células sanguíneas rojas mig revi a la zona de captura 20 y confunden los resultados. Hay varios medios para efectuar el alargamiento de la ruta que debe seguir el segmento de plasma. Se muestra uno de tales medios en la figura 1 la cual muestra una depresión de lados de la membrana para formar un cuello 24. Se puede formar el cuello cortando los bordes de la membrana. Sin embargo, tal corte debe ser efectuado, por ejemplo, por un dispositivo de láser, ya que los medio convencionales pueden comprimir el espacio capilar, es decir, los poros, a lo largo de los bordes de los canales de la membrana y pueden interferir así con el flujo del fluido. Se puede formar también comprimiendo la membrana para forma una sección comprimida de la configuración deseada a través de la cual el plasma no puede fluir. Se puede lograr también el mismo resultado impregnando la membrana con cera u otra sustancia inerte para formar también la configuración deseada a través de la cual no fluya en plasma. Otras alternativas más incluyen comprimir una serie de diseños redondos, cuadrados u alargados a través de la membrana en el área mostrada con un cuello 24 en la figura 1. Si se elige esta alternativa, no hay depresión de la membrana, sino que los segmentos comprimidos evitan el flujo del plasma de manera análoga aquella en la cual la roca se impide en el flujo de agua en un río. La figura 2 ilustra una modalidad de la invención en la cual la zona de aplicación 12 y la zona de detección 14 está en una capa de membrana inferior 26 debajo del extremo corriente arriba de la capa de membrana superior 29. La ventaja de este diseño es que disminuye en tanto la longitud del dispositivo como el flujo de tiempo a través del dispositivo. Se logra esto mientras se retiene el flujo esencial de la muestra a través del dispositivo sin la pérdida del efecto cromatográfico. Por consiguiente, se puede analizar un volumen más grande de sangre en un período más corto. Una estructura alterna sería un ancho localmente creciente de la membrana. Sin embargo, esto no es preferido ya que altera la características del flujo formando regiones de estancamiento en las cuales puede acumularse el plasma, para no fluir. En el dispositivo de la figura 2, la zona de aplicación 12 es la sección de la capa inferior 26 debajo del orificio completo 27 a través del cual se aplica la sangre antes de fluir corriente abajo de la capa inferior 26 a través de la zona de detección 14 y la capa superior 29. El área que está alrededor del orificio completo 27 en la zona de aplicación 12 de la capa superior 29 es una área bloqueado 28 formada por ejemplo por compresión o con cera. El propósito del bloqueo es evitar que la sangre fluya corriente abajo en la capa superior 29 y forme un canal para fluya la sangre a la zona de detección 14 de capa inferior 26. La sangre entera fluye a través de la zona de detección 14 en donde el analito, si está presente, hace contacto y reacciona con un anticuerpo de detección etiquetado y después el miembro superior 29. La operación del dispositivo de la figura 2 es después de ello igual a la del dispositivo de la figura 1. Hay un frente 16 de células sanguíneas rojas, una corriente de plasma con el frente 18, una zona de control 22 y un cuello 24. Se notará que en el dispositivo de la figura 2, el extremo corriente abajo 30 del miembro inferior 26 traslapa el área bloqueada 28 del miembro superior 29 de modo que forma una trayectoria de flujo para la sangre. El área bloqueada 28 puede consistir de un revestimiento impermeable de cera u otro líquido acuoso para controlar el flujo del líquido. El efecto final de la disposición mostrado en la figura 2 es formar un canal de flujo que fuerce la sangre a fluir a partir de la zona de aplicación 12 a través de la zona de detección 14 y hasta la zona de captura 20. El flujo es todavía esencialmente a lo largo de las membranas, manteniendo así el efecto cromatográfico. Se puede invertir la posición de las capas mostradas en la figura 2, en cuyo caso no se requeriría a través del orificio 27. La dirección de flujo es todavía sustancialmente a lo largo de las membranas. El efecto de la construcción de membranas traslapadas es aumentar al máximo la cantidad de sangre que el dispositivo puede utilizar sin hacer excesiva la duración de la prueba a la vez que se retiene todavía el flujo esencialmente longitudinal. La figura 3 ilustra una modalidad de la invención en la cual 4 dispositivos están sobre el mismo substrato 60. Todos los dispositivos comparten la zona de aplicación 12. La sangre añadida en la zona de aplicación 12 fluye a través de cada dispositivo y reacciona de la misma manera que describe previamente. Se puede imprimir la modalidad de dispositivo múltiple sobre un hoja de material de membrana formando las líneas que definen cada dispositivo por compresión o calor o imprimiendo las líneas sobre la hoja de membrana con cera u otro material que formen los canales de flujo apropiados en cada dispositivo. Alternativamente, se puede formar el dispositivo múltiple por separado cortándolo de una hoja de membrana y adhiriéndolo a substrato inerte tal como una hoja de plástico con ninguna atracción capilar para la sangre o el plasma que fluye. En efecto, las membranas de nitrocelulosa con refuerzos de poliéster son obtenibles comercialmente y se prefieren actualmente para producir los varios dispositivos de esta invención. Otras configuraciones de las modalidades de dispositivo múltiple serán evidentes para los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden poner los dispositivos en una configuración de lado a lado como se muestra en la figura 4. La figura 4 ilustra una modalidad de la invención en la cual 2 dispositivos adyacentes están apoyados sobre un receptáculo 30 que tiene un miembro de cubierta 36 y un miembro de soporte 34. Como se muestra, el producto de la invención soporta 2 dispositivos, cada uno con una sola detección 14. En la figura 4, los números son idénticos a los números de las otras figuras y tienen el mismo significado. La figura es una vista en explosión que muestra 2 dispositivos unidos cada uno designado como 10 reforzado con una hoja de poliser 32 en el receptáculo que comprende un miembro de soporte 34 y un miembro de cubierta 36 para conectarse con el miembro de soporte 34 y un miembro de cubierta 36 para conectarse con el miembro de soporte 34 a fin de envolver los dispositivos 10. Cambiando de cubierta 36 incluye un orificio completo 38 en correspondencia exacta con la zona de aplicación 12 para aplicar sangre entera. Incluye también las ventanas de observación 40 en correspondencia exacta con las zonas de captura 20 presentes en cada uno de los dispositivos 10 y, si están presentes, la zonas de control 22, para permitir al operario observar los resultados. El miembro de cubierta 36 puede contener opcionalmente un orificio indicador 42 de muestra suficiente que permita al operario si se ha añadido suficiente sangre para completar la prueba. Puede contener también un orificio de observación 44 de la señal final de prueba que avise al operario que ha transcurrido tiempo suficiente de modo que puedan leerse los resultados sin peligro de negativas falsas debido a lectura prematura. Se puede cumplir con el mismo requisito de seguridad con un cronómetro u otro dispositivo para medir el tiempo. Si se desea una señal de prueba, se puede colocar una mancha de tintura en el extremo de un dispositivo si usa solamente uno o el extremo de uno de los dispositivos, si emplean dispositivos múltiples. En cualquier caso, la tintura estará corriente arriba del orificio de observación 40. Se disolverá en el plasma que fluye y se llevará al orificio de observación 44 para indicar al operario que es tiempo de leer la prueba. Más específicamente, la región 46 del dispositivo 10 (figura 4) muestra la configuración de un dispositivo que mide el bie po que se tiene debajo de la ventana de observación 44. Se colocará una tintura dentro de la zona de control 22 y la sección de la extensión 46 que está debajo de la ventana 44. La apariencia de la tintura debajo de la ventana 44 indicará al ope ra rio que es tiempo de leer los resultados. Los miembros 48 soportan el dispositivo en el receptáculo 30. La figura 5a muestra un miembro de cubierta 51 simplificado y un miemb ro de soporte inferior 52 simplificado. La abertura 53 provee acceso para que se aplique sangre a través del orificio 27 en la memb rana supe rior 29 y por consiguiente sobre la memb rana inferior 26. La región obscura de las dos membranas corresponde al refuerzo de poliéster y la región punteada a la nitrocelulosa. La región sombreada 28 de la membrana superior es una barrera de ce ra para evitar que la sangre se abso rba di rectamente a la membrana superior. La regiones sombreadas 54A y 54B en la membrana inferior 12 evitan simplemente la proida por estancamiento de sangre en las esquinas . La línea de cera 55 sirve para restringi r la velocidad de flujo de la sang re a las membranas infe rior y superior. La zona de despejo 56 , que rodea la abe rtura 53, evita que se absorba la sangre a lo largo de los canales capilares que pueden formarse de otra manera entre el alojamiento superio r y la superficie de poliéster de la memb rana superior. El ancho de la región de captura 57 está ala rgado en relación con la región de ga rganta para proveer visibilidad mejo rada de resultado analítico . La figu ra 6A es similar a la ante rior, pero evita la necesidad de p roveer un o rificio en la membrana superior. La membrana superior 10 está hecha más corta de modo que la abertura 63 conecta la aplicación de sangre directamente a la zona aplicación 12 de la membrana inferior 26. Las demás características se describen anteriormente y los números tienen el mismo significado. La operabilidad de los dispositivos de prueba de la invención depende finalmente de separar las células sanguíneas rojas de la sangre entera de modo que se permita que el plasma substancialmente transparente que contiene el complejo anticuerpo etiquetado/analito alcanza la zona de captura 20 de modo que el cable de color sea detectable sin interferencia con el color fuerte de las células sanguíneas rojas. No se apreciaba, hasta ahora, que tal resultado se podía realizar si el uso de membranas verticales y separadas para separar las células sanguíneas rojas por filtración, en la cual el flujo es a través del espesor de la membrana. Pocas observaciones sencillas serán suficientes si aparecerá el frente de células sanguíneas rojas el plasma transparente sobre una membrana celular de dimensiones y tamaño de poro definidos. Una vez que se sabe eso, el experto en la técnica que conoce el analito que se está sometiendo a prueba, la finalidad del analito de los anticuerpos empleados y la cinética de la reacciones, sabrá donde colocar el anticuerpo y el anticuerpo de captura así como la longitud apropiada del disposito. Incluso si no se conocen esos factores, se pueden determinar fácilmente de manera impírica las posiciones óptimas de los anticuerpos y la longitud de la corriente de plasma para evitar la señal óptima. Todo esto completamente dentro de la habilidad de la técnica. El artesano hábil reconocerá que se puede ampliar en esba invención cualquier membrana que separe cromatográficarnente las células sanguíneas rojas y el plasma de la sangre entera. Sin embargo, se prefiere la icrocelulosa porque es fácilmente obtenible a costo razonbles. Se ha empliado nitrocelulosa én cromatogra ía y campos relacionados durante tantos años que los científicos y los técnicos están familiarizados con sus propiedades. Se puede convertir fácilmente nitrocelulosa obtenible comercialmente enteras de cualquier longitud y ancho seleccionados. La membranas de nitrocelulosa de la invención pueden caracterizarse como esponjosas con una multitud de microporos interconectados de varios tamaños y dimensiones dando lugar a fuerzas capilares dentro de la membrana. Esto permite que el filo biológico en la investigación se mueva a lo largo de la tira alejándose de zona de aplicación de la muestra. Para la separación del plasma de lae células sanguíneas rojas en la práctiva de esta invención, se selecciona el material de la membrana, la configuración geométrica y las dimensiones de modo que las reacciones deseadas tenga lugar en áreas superseleccionadas. Se seleccionan estas áreas con base a la velocidades relativas de los frentes de la corriente de células sanguíneas rojas y de la corriente de plasma. La cinética de las reacciones deseadas, la afinidad de los anticuerpos para sus epítopes respectivos, el tamaño de las partículas en reacción y otros factores son conocidos y fácilmente determinados por procedimientos de pruebas convencionales. Aunque está disponible una variedad de membranas de nitrocelulosa en varios tamaños de célula, las membranas actualmente preferidas son aquellas que, si se usan como filtro, es decir las partículas de filtración de una corriente líquido que fluye verticalmente a la superficie perpendicular de la membrana, evitarán el paso de partículas mayores que 3-12 µm. En la práctica de la invención, se prefieren las membranas con un tamaño de poro de aproximadamente 5 a 12 µm, preferiblemente a 3 a 8 µm. Es posible cierta variación1. Sin embargo, conforme disminuye el tamaño de poro, disminuye la movilidad de un fluido dentro de la membrana, aumentando así el tiempo requerido para la diagnosis. Si los poros son demasiados grandes, el tiempo de paso se reduce con el resultado de que los reactivos no están en contacto uno con otro durante un tiempo suficiente para que ocurran las reacciones diagnósticas u ocurran a un grado tan limitado que no proveen la información deseada. La membranas de nitrocelulosa con poliéster de refuerzo y otras películas son obtenibles comercialmente. Se prefieren estas para su uso en esta invención puesto que las membranas no refuerzadas tienden a ser bastante frágiles y susceptibles de fractura. Además, las películas son impermeables a los ruidos que fluyen de modo que pueden formarse canales de flujo substancialmente longitudinales mediante la colocación apropiada de las membranas dentro de un alojamiento. Tal membrana es obtenible para una variedad de tamaños de poro a través de Gerb rmem rane de Gerbershausen, Germany. Las procedimientos para la preparación de anticuerpos etiquetados para su uso en esta invención son bien conocidos por los artesanos hábiles y no es necesario describirlos con detalle. Las etiquetas actualmente preferidas son etiquetas de metal, particularmente etiquetas de oro, cuya visibilidad y sensitividad puede realsa se usando plata de acuerdo con técnicas conocidas. El tamaño de partícula preferido para los anticuerpos etiquetados con oro usados en la invención es de aproximadamente 35 a 65 nm, aunque puede tolerarse una variación apreciable dependiendo de factores bien entendidos tales como la concentración del analito y la afinidad de los reactivos. Los anticuerpos empleados en esta invención se preparan mediante técnicas regulares. Véase por ejemplo, Falfre, Howe, Milstein y otros., Nature Vol. 266,7, 550-552-abril de 1977. La cita de este artículo de gran influencia sobre la preparación de anticuerpos monoclonales se incorpora en la presente por referencia.

Los procedimientos para fijar anticuerpos a los substratros tales como nitrocelulosa son conocidos y utilizables en la producción de dispositivos de esta invención. La nitrocelulosa es un aglutinante de afinidad por las proteínas. Por consiguiente, el anticuerpo de captura inmóvil necesita aplicarse solamente a la zona de captura en un área predeterminada. El anticuerpo detector etiquetado puede fijarse móvilmente a la membrana saturando primero la zona detectora 14 con otra proteína tal como albúmina de suero bovino. El procedimiento óptimo para practicar esta invención, que es aplicable cuando están disponibles anticuerpos con afinidad apropiada por el analito; se pueden etiquetar efectivamente estos anticuerpos, por ejemplo con una etiqueta de metal en enzima; cuando la cinética de reacción es favorable, y cuando los varios productos de reacción se mueven a través de la membrana a velocidades prácticas, se logra en 4 pasos simples. Estos son: 1) Añadir una cantidad pequeña de sangre a la zona de aplicación, 2) Permitir que la sangre se mueva a la zona de detección en donde el analito, si está presente, se une en complejo con anticuerpo etiquetado o móvil a un analito para formar un complejo anticuerpo etiquetado/analito que fluirá con la sangre, 3) Permitir que la sangre que contiene el complejo se mueva a través de la membrana hasta que se forme un frente 16 distindo de células sanguíneas rojas un frente 18 separado de plasma. El plasma contiene complejo anticuerpo etiquetado/analito disuelto, que lleva a través de la membrana hacia la zona de captura 20. 4) Permitir que la corriente de plasma substancialmente libre de células sanguíneas rojas haga contacto con el anticuerpo de captura en la zona de captura 20 durante un período suficiente para producir un producto de reacción detectable de anticuerpo etiquetado/analito/anticuerpo de captura. Sin embargo, hay variaciones de este procedimiento óptimo disponibles una o más de las condiciones anteriormente descritas no están presentes. Por ejemplo, sucede algunas veces que el complejo anticuerpo etiquetado/analito se forma bastante fácilmente, pero no se combina con suficiente anticuerpo de captura para producir una señal fácilmente detectable. Esto puediera pasar si un número suficiente de los complejos no entrara en contacto con los anticuerpos de captura o entrara en contacto con ellos en una configuración que no sea óptima para forma un producto de reacción. Otros posibles problemas son el insuficiente tiempo de incubación o la baja afinidad de los anticuerpos. Se pueden evitar estas dificultades aprovechando la reacción avidina/extraptabidina o reacciones análogas bien conocidas por el artesano hábil. El uso de la técnica biotina/avidina, de cual reacción biotina/estraptavidina es un ejemplo, ilustra la versatilidad de la invención. Aprovecha la alta afinidad de la estraptavidina por biotina. Más particularmente, el uso de biotina como el material capturado estraptavidina con el material capturados confiere el beneficio de la interacción más rápida y más positiva de estos reactivos entre sí. En una aplicación de este procedimiento, se fijan dos anticuerpos separablemente en la zona de detección y estraptavidina en la zona de captura. El anticuerpo detector se etiqueta, preferiblemente con un metal tal como oro y se etiqueta otro anticuerpo en la misma zona con biotina. Si el analito para los anticuerpos está presente en el plasma, un complejo que contiene anticuerpo detector etiquetado/analito/anticuerpo detector etiquitado con biotina se formará en la zona de detección. El complejo se moverá a través de la membrana en el plasma en la zona de captura. Estreptavidina se inmobiliza en la zona de captura. Cuando el complejo alcanza la estreptavidina, esta se une a la biotina y concentra el complejo en un área pequeña. Como resultado, la señal se hace detectable. En esta variación preferida de la reacción con biotina, el complejo anticuerpo etiquetado con biotina/analito/anticuerpo detector etiquetado se hace detectable por reacción de la bistina con estreptavidina o reactivo análogo en la zona de captura. Se puede emplear este esquema de reacción, por ejemplo, para detectar cadena ligera de miosina (CLM). En esta modalidad, el dispositivo está dispuesto con dos anticuerpos para MLC en zona detectora. Se etiqueta un anticuerpo con oro, el otro con biotina. Si está presente CLM en la sangre que se está sometiendo a prueba, el complejo que se forma contendrá un anticuerpo etiquetado con oro, MLC de anticuerpo etiquetado con biotina. Este complejo se moverá a través del dispositivo a la zona de captura y reaccionará con la estreptavidina inmovilizada para producir una señal visible. Se ha descrito esta invención principalmente con referencia a la detección de analitos cardiacos. Estos incluyen, por ejemplo, CKMB, MLC, mioglobina, glicógeno, fosforilasa, troponina T y troponina I. Se pueden utilizar también los dispositivos y los productos de la invención como será evidente para el artesano hábil a fin de detectar un número de otras substancias en la sangre entera. Estas incluyen, por ejemplo, H. pilori. anticuerpos, HCG y hLH'. La prueba descrita y reclamada en la presente es sus varios aspectos es simple y flexible. Los productos de la invención se producen fácilmente y no requieren características adicionales de la técnica anterior, tales como sumideros de desperdicios de medios porosos y capas de filtro. Una características fundamental de la invención es que se requieren solamente dos volúmenes de sangre. Además, no se emplea líquido y lavado. Se dan los siguientes ejemplos no limitantes a manera de ilustración solamente.

EJEMPLO 1 SEPARACIÓN DE CELULAS SANGUÍNEAS ROJAS Se sometieron a prueba membranas de nitrato de celulosa (profulsadas con poliéster), de 3 µm y 8 µm de tamaño de poro nominal de Gerbermembrane GmbH, Gerbershansen, Alemania) y fueron sometidas a prueba en cuanto a la capacidad de retardar el flujo de células sanguíneas rojas de sangre entera sometida a cromatografía horizontal. Se cortaron las membranas a una longitud de 45 mm y un ancho de 6 mm. A una área de aplicación (7 mm x 6 mm) en un extremo, se aplicaron 15 µl de sangre entera. Después de la terminación de la separación cromatográfica, se midió la distancia del frente del plasma en el frente de células sanguíneas rojas desde el origen, como sigue: EJEMPLO 1 (CONTINUACIÓN) EJEMPLO 2 DETECCIÓN DE MIOGLOBINA EN SANGRE ENTERA Sobre una hoja de membrana de 20 mm x 10 mm (nitrato de celulosa 8 µm de tamaño de poso nominal, Gerbermembrane) se prepara un contorno mostrado en la figura 7 mediante una técnica de impresión en cera (como se publica en Laboratory News, en enero de 1996). Productos conjugados de solución coloidal de oro antimioglobina fueron preparados por British Biocell, Inc. L(BBI), Cardiff, Reino Unido (40 nm de solución coloidal de oro, cargados con el anticuerpo 2 Mb-295 de Spectral Diagnostics, Toronto a una concentración de 1.5 µg/ml y a una densidad óptica (520 nm) de 1). A 10 ml de esta solución, se añadieron 400 mg de IgG bovina (de Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen, Alemania) y 5 mg de octil-D-glucopiranósido (de Fluka chemie AG, Buchs, Suiza) y se aplicaron 0.8 µl de esta mezcla a la zona detectora. Se preparó la línea de captura por impregnación con una solución por anticuerpos antimioglobina policlonales de conejo de Spectral Diagnostics (número de lote 95 APM075C) a una concentración de 3 mg/ml en una solución salina regulada en su pH con fosfato pH 7.3, para crear una zona de captura. A la zona de aplicación sanguínea, se añadieron 4µl de sangre entera a las concentraciones de mioglobina que se muestran a continuación y los resultados (en el transcurso de 3 a 3.5 minutos) fueron como sigue: Concentración de Mioglobina Señal en la línea de captura 50 ng/ml señal débil 200 ng/ml señal clara 500 ng/ml señal fuerte EJEMPLO 3 DETECCIÓN SIMULTANEA DE CK-MB Y MIOGLOBINA EN SANGRE ENTERA Se obtuvo la configuración sobre hojas de membrana apropiadas como se ilustra en la figura 8, trazando sobre una hoja de 26 mm x 20 mm (membrana superior) y una hoja de 10 mm x 20 mm (membrana inferior) las líneas indicadas con una pluma "edding 780" (de Edding AG, Ahrensburg, Alemania). La tinta seca forma una barrera para soluciones acuosas, similar al procedimiento de impresión de cera del ejemplo 2. La zona de captura de la capa de membrana superior (membrana de nitrato de celulosa reforzada con poliéster, 8 µm del tamaño de poro nominal de Gerbe membrane GmbH) contiene una primera línea impregnada con una solución de Streptavidin (de Sigma-Aldrich GmbH, Deisenhofen, Alemania) en agua a una concentración de 30 mg/ml. La solución de impregnación de la segunda línea es una solución de 3 mg/ml de anticuerpos antimioglobina de conejo (Spectral Diagnostics, número de lote 95 APM075C) en solución salina regulada en su pH con fosfato. Para aumentar la reproductividad de la humedad de la membrana, se impregnaron las áreas indicadas con una solución detergente suave del 0.05% (p/p) de octil-Dglucopiranósido (de Fluka AG, Suiza) en agua. La zona de detección de la capa de membrana inferior (membrana de nitrato de celulosa reforzada con poliéster 3 µm de tamaño de poro nominal, de Gerbermembrane GmbH) se impregna con las siguientes soluciones: a) Tres µl de una solución conjugada de solución coloidal de oro. Se prepara esta solución como sigue (productos conjugados de solución coloidal de oro anti CK-MB y antimioglobina fueron tratados por BBI, Cardiff, Reino Unido). A 900 µl de producto conjugado de solución coloidal de oro anti-CKMB (40 nm de solución coloidal de oro cargados con 22 µg/ml (a un OD de 10) del anticuerpo (5CKMB-6 de Spectral Diagnostics), se añadieron 100 µl de producto conjugado de solución coloidal de oro antimioglobina (40 nm de solución coloidal de oro con 15 µg/ml ( a un OD de 10 de anticuerpo 2MB-295 de Spectral Diagnostics). Además, se añadieron y mezclaron 10 mg de octil-D-glucopiranosido (de Fluka AG, Buchs, Suiza) . b) Dos µl de una solución de anticuerpo de biotinilada. Se añadieron dos µl de una solución de 9.5 mg/ml de biotinamidocaproato- N-hidroxisuccinimida-éster (de Sigma-Aldrich GmbH) en 1 ml de acetonitrilo-agua (1:1, v/v) a 1 ml de una solución que contenía 2 mg/ml del anticuerpo rCKMB-28 (de Spectral Diagnostics) en 75 mM de fosfato de potasio, pH 8.5, se mezcló e incubó durante 2 horas seguido por la adición de 20 µ de una solución de 500 mM de monoclorhidrato de lisina DL ( de Fluka AG) y 100 mM de fosfato de potasio, pH final 8.5., y se incubaron durante 0.5 horas. Se realizó la solución durante la noche contra 5 nM de fosfato de potasio, 10 nMde cloruro de sodio, pH7. Se diluyó la solución anticuerpo con agua a una concentración de 35 µg/ml y se añadieron 1 ml de esta solución diluida, 10 mg de Croteína C y 3 mg de octil-D-glucopiranosido para dar la solución biotinilada de anticuerpo. c) 3.5 µ de una solución de 75 nM de HEPES, pH 6.8, y 0.05% de octil-D-glucopiranosido. Se aplicaron 25 µl de sangre heparinizada que contenía mioglobina (Spectral Diagnostics, número de lote 3-10238) o rCK-MB (Spectral diagnostics, número de lote 3-24363G) que contenía a las concentraciones indicadas a la zona de aplicación y los resultados fueron como sigue (en el transcurso de 9 a 12 minutos): EJEMPLO 4 DETECCIÓN DE TROPONINA I EN SANGRE ENTERA En la figura 9 se ilustra un diseño trazado con una pluma Staedtler Lumocolor 313 (de Staedtler, Nuernerg, Alemania) sobre una hoja de membrana de 30 mm x 35 mm (nitrato de celulosa, 3 µm de tamaño de poro nominal, Gerbermembrane). En la zona de captura se impregna una línea con una solución de 13 mg/ml de estreptavidina (poli) de Microcoat GmbH, Penzberg, Alemania. Después de secar, se impregna la membrana con una solución acuosa al 0.5% de Croteína C (de Croda GmbH) en la zona detector y aplicación para evitar la unión no específica. La zona detectora se impregnó después con: a) 5 µ de una solución conjugada de solución coloidal de oro: A 90 µl de un producto conjugado de solución coloidal de oro anti-TN-I (60 nm de solución coloidal de oro con 10 µg/ml (a uno OD de 10) de anticuerpo 21-14 de Spectral Diagnostics) de uno OD de 30, se añaden 10 µl de un regulador de pH de succinato de sodio a 250 M, pH 5.5, y se mezcla para dar la solución conjugada de solución coloidal de oro. b) 2 µl de solución biotinilada de anticuerpo: Se hace la biotinilación como en el ejemplo 3, para con el anti cuerpo 81-7 anti-TN-I de Spectral diagnostics. A 50 µl de esta solución biotinilada de anticuerpo a una concentración de 600 µg/ml, se añadieron 50 µl de una solución de octil-D-glucopiranosido al 0.6% y MES a 200 mM pH 5.5 y se mezclaron para dar una solución de anticuerpo biotinilada. Se aplicaron 35 µl de sangre entera heparinizada que contenía TN-I a las concentraciones indicadas, a la zona de aplicación y los resultados fueron como sigue (en el transcurso de 9 a 12 minutos): TNI ng/ml Señal* en la línea de captura _ 0.5 + 1 ++ 2 ++ *) " ninguna líneai de señal visible línea de señal visible fuerte Deben tenerse que la invención no está limitada a las ilustraciones descritas y mostradas en la presente, las cuales se estiman que son meramente ilustrativas de las mejores modalidades para llevar a cabo la invención y las cuales son susceptibles de modificación de forma, tamaño, disposición de las piezas y detalles de operación. Se pretende antes bien que la invención abarque todas las tales modificaciones que están dentro del espíritu y alcance como definen las reivindicaciones

Claims (13)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un dispositivo diagnóstico que incorpora por lo menos una ventana celular y adecuado para determinar la presencia de un analito de una muestra de sangre entera que está fluyendo lateralmente a lo largo de la ventana teniendo en dicha membrana una zona de aplicación de la muestra a la cual se aplica la muestra de sangre entera y, corriente a bajo de la zona de aplicación de la muestra, una zona de flujo alargada, incluyendo una zona detectora y una zona de captura, conteniendo la zona detectora un anticuerpo detector etiquetado móvil que reaccionará para formar un complejo anticuerpo móvil/analito que se moverá corriente abajo, causando la membrana que las células sanguíneas rojas se separen cromatográficamente del plasma para causar la formación de un frente de plasma que se mueve hacia la zona de captura que tiene un frente de células sanguíneas rojas corriente arriba del mismo; estando la porción fundamental de cualquier complejo en la sección de la corriente entre las dos frentes, los cuales están sustancialmente libres de células sanguíneas rojas, conteniendo la zona de captura un reactivo que reaccionará con el complejo para formar un producto detectable, en donde el frente de células sanguíneas rojas no invade o fluye más allá de la zona de captura.

2.- El dispositivo de la reivindicación 1, caracterizado además porque el reactivo es un anticuerpo de captura para el analito.

3.- El dispositivo de reivindicación 1, caracterizado además porque la zona detectora contiene también un anticuerpo etiquetado con biotina, el reactivo es estreptavidina y el complejo es un complejo anticuerpo etiquetado-analito-anticuerpo etiquetado con biotina.

4.- El dispositivo de la reivindicación 1, caracterizado además porque el anticuerpo etiquetado reaccionará con un epítope del analito y el reactivo es un anticuerpo que reaccionará con otro epítope sobre el anticue o.

5.- El dispositivo de la reivindicación 1, caracterizado además porque la membrana celular es una sola membrana.

6.- El dispositivo de la reivindicación 1, caracterizado además porque dicha membrana celular se prepara a partir de nitrocelulosa.

7.- El dispositivo de la reivindicación 1, caracterizado además porque dicha membrana celular incluye un medio de control de flujo ubicado corriente abajo de dicha zona de aplicación de la muestra lo cual contribuye a la separación de las células sanguíneas rojas del plasma.

8.- El dispositivo de la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho medio de control de flujo comprende una reducción en el ancho de dicha membrana celular a lo largo de una porción en la longitud de la misma.

9.- El dispositivo de la reivindicación 8, caracterizado además porque dicha membrana celular está reducida en ancho por separación de una porción de la misma.

10.- El dispositivo de la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho medio de control de flujo comprende la disposición por lo menos de una región impermeable a los fluidos dentro de dicha membrana celular a lo largo de una porción de la longitud de la misma.

11.- El dispositivo de la reivindicación 8, caracterizado además porque dicha reducción el ancho de dicha membrana celular está definida por la disposición de una composición impermeable a los fluidos a lo largo de los bordes laterales de dicha porción de la longitud de la misma.

12.- El dispositivo de la reivindicación 11, caracterizado además porque hay regiones impermeables a los fluidos separables múltiples ubicadas a lo largo del ancho de dicha membrana celular.

13.- Un método para detectar la presencia de un analito en sangre entera, que comprende: a) depositar un volumen pequeño de dicha sangre entera sobre un dispositivo, comprendiendo dicho dispositivo una membrana celular, teniendo dicha membrana una zona de aplicación de la muestra en la cual se aplica la muestra de sangre y, corriente abajo de la zona de aplicación de la muestra, una zona de flujo alargada, incluida una zona detectora y una zona de captura, conteniendo la zona detectora un anticuerpo detector etiquetado móvil que reaccionará para formar un complejo anticuerpo móvil/analito que se moverá corriente abajo, causando la membrana que las células sanguíneas rojas se separen cromatográficamente del plasma para causar que la formación de un frente de plasma se mueva hacia la zona de captura y tenga un frente de células sanguíneas rojas corriente arriba de la misma; disolviéndose la porción fundamental de cualquier complejo de la sección de la corriente entre los dos frentes que están sustancialmente libres de células sanguíneas rojas, conteniendo la zona de captura un reactivo que reaccionará con el complejo para formar un producto detectable; y b) examinar la zona de captura de dicha membrana en presencia de una reacción, mediante la cual dicha reacción indica la presencia del analito que se trate de detectar.