CN101842159B - 关联的多参数单细胞测定及残余生物材料回收的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了对高通量样本逐个细胞分析和关联表型和基因型信息的方法和装置。分离细胞，并逐个分析了其表型信息和基因型信息，然后将所述表型信息和基因型信息相关联。在微流通道网络内在连续流动样品上或在预装进纳孔阵列芯片的样品上使用对样品群的表型-基因型信息进行相关性分析的方法。进行表型-基因型分析及其相关性分析的方法可规模化的用于从数百个细胞到数千个细胞到数万个和数十万个细胞的样品量。

Description

关联的多参数单细胞测定及残余生物材料回收的方法和装置
技术领域
本发明涉及对将基因组材料进行分选、收集而获得的高通量样品中的蛋白和核酸逐个细胞进行自动的、关联的定量测定的方法和装置。
相关申请
本国际申请要求2007年8月9日提交的名称为“关联的多参数单细胞测定及残余生物材料回收的方法”的临时申请No.60/954,946的权利，将所述临时申请通过引用整体并入本文。
背景技术
荧光激活细胞分选(FACS)在研究和临床应用中广泛使用。所述仪器具有非常快速地进行多参数分析和分选的能力，但其通常需要大样品量和进行操作和维护的训练有素的操作员，且难以消毒。FACS仪器可分析少至10000个和多达几千万个细胞。而在分选应用中，进行分选的能力降低，因为样品大小小于100,000个细胞。在所有情况下，所述细胞必须事先标记。大多数情况下，使用缀合了荧光分子(如异硫氰酸荧光素，又名FITC)的抗体标记抗原或相似的膜结合蛋白，但核染色剂、胞内染料或细胞指导的荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白，又名GFP)合成也可通过流式细胞术检测。流式细胞术也适用于分子检测。例如，可将具有多种颜色和/或强度的荧光珠用作固体支持物以用于蛋白或多肽分析物的抗体捕获测定。同样，可将核酸与珠和荧光标记杂交，以使用流式细胞术来进行快速读取。在这两种情况下，在使用流式细胞术测定前进行生物化学测定，并可将所述仪器作为珠快速读取仪使用。在某些情况下，扫描式细胞术在读取中同样有效。FACS仪器支持至所述仪器支持的独立荧光通道数的多个信息，但所述多个信息为单一类型(例如，仅表型)。
实时聚合酶链反应(又名qPCR)是用于定量测定从目的细胞中提取的DNA和RNA的技术。使用相当于10,000～100,000个细胞的合并基因组量来进行大多数qPCR反应。研究人员对测定个细胞的遗传内容越来越感兴趣，但此努力被当前可用的高成本试剂和劳动密集性操作法所阻碍。因此，大多数单细胞PCR研究仅在少于100个上细胞进行。即使现有的机器人技术和用量为1～10μL/的1536微孔板仍比几百孔的花费昂贵。当出现目的细胞占细胞数量的比例少于1％的罕见情况时需要将达50000个的细胞逐一进行检查。没有大量时间和金钱的花费，目前的技术无法达到这种通量水平。
在信号转导的研究和系统生物学的工作中，通常需要使差异信息相关联。将细胞表面受体或报告子与胞内信号转导链接的数据对这些活动越来越有价值。迄今为止，所述信息基于大量细胞相关联。通常情况下，测定数千至数百万计的细胞的表面蛋白或RNA表达，并将所述信息在统计学上相关联。在测定过程中，样品的任何异质性被平均。siRNA基因沉默之类的强大技术本身可将异质性导入样品中，从而受到此信息平均的限制。
许多研究者已得到了逐个细胞定量关联基因型的蛋白(或其他的表型特征)和核酸的值。微流术(microfluidics)已被确定为一项能使仪器进行所述测定的技术，但还未产生作为例子的方法和仪器。
微加工式细胞仪具有分析和分选少达1000个细胞的潜力，而在易于使用的封闭体系中随之消耗的试剂更少。当用复制酶之类的高成本试剂工作时前者是重要的。而后者是重要的，因为与常规的FACS仪器不同，其不产生气溶胶，减少污染分选细胞和与生物有害材料工作的风险。已描述了几种微加工细胞分析仪和分选仪，但大多数为“概念证明”。
通过对微加工式细胞仪、单细胞包裹技术和适当信号处理的这些元件进行结合，可生产出具有逐个细胞检测蛋白表达和基因表达的相关性的仪器。
发明内容
如下所述，在微流网络中这些元件组合实现相关测定。事先标记细胞，以进行表型测定。在一实施方式中，连续流动的微流网络集成了所有功能。在微流网络的第一部分中，测定细胞的表型标记产生的荧光信号。微流网络的第二部分在微反应器中将细胞与适合基因表达测定的预定混合试剂进行独立包裹。在微流网络的下一部分中，用可包含在微反应器内容物中或从其中分离的参照信号来编码包裹的细胞流。在微流网络的第四部分中，裂解细胞，并用适宜技术(例如，实时聚合酶链反应(又名实时PCR)或qPCR)测定基因表达。然后在下一阶段解码微反应器流，且信号处理算法关联表型和基因型测定值。作为最后一个可选步骤，可分选微反应器，以富集特定基因组。在相关实施方式中，首先包裹细胞，从而表型分型和编码同时发生。随后裂解细胞，然后同时进行基因表达测定和解码。这减少微流网络上的询问点数。
在第二实施方式中，组合微流网络与微孔阵列，以分离个细胞，并关联用户预选的遗传信息与表型群。在第一部分中，用微流网络测定细胞的表型标记产生的荧光信号。在第二部分中，用多路径切换网络将细胞分选入个纳流(nanofluidic)微孔。所述孔排列成各细胞位于唯一确定的坐标中，或所述孔可排列成将细胞分入2个以上的阵列中。在后一种情况下，用户基于获得的表型信息选择一个以上的门来选择细胞的所欲目的地。密封所述孔，以用适合基因表达测定的预定混合试剂独立包裹所述细胞。裂解所述细胞，并用适宜技术通过读取阵列来测定基因表达。可分析微孔中的反应信息，以检测遗传信号的统计学分布，且可将所述信息反过来与选定表型离散性关联。作为最后的可选步骤，可收集个微孔内容物，用于进一步的基因分析。
在第三实施方式中，使用利用纳流(nanofluidic)微孔阵列的扫描式细胞术分离个细胞，并获取关联的表型和基因型信息。同样，事先标记细胞，以进行表型测定。将所述细胞置于所述微孔中，并密封所述孔，以用适合基因表达测定的预定混合试剂独立包裹所述细胞。对细胞的扫描式细胞术分析收集了指向所述孔坐标的表型信息，裂解所述细胞，然后用适宜技术通过读取阵列来测定基因表达。级联所述信号至单相关数据集。作为最后的可选步骤，可收集个微孔内容物，用于进一步的基因分析。
在所有的实施方式中，可进行一个以上的表型测定。通常情况下，可同时检测到至4个或5个独立荧光信号。各反应中基因表达测定值可为一种基因的测定值或优选为两种以上基因复合的测定值，以获得关于选定基因表达水平的标准化的定量信息。
附图简述
图1为示本发明的如何逐个获得和关联分析用表型(例如用荧光偶联抗体标记的细胞表面蛋白)信息和基因型(例如单细胞、多重定量PCR)信息的概念图。
图2为连续流形式的本发明元件的原理框图。
图3为改良的连续流形式或扫描式细胞术形式的本发明元件的原理框图。
图4为在图2的连续流实施方式中使用的微流元件的示意图。
图5为在图2的连续流实施方式中如何通过周期事件或非周期事件的编码和解码来获得表型和基因型测定关联的例子的示意图。
图6为用于进行表型和基因型关联的、包含独立式一次性盒和仪器的集成系统的实施方式的原理框图。
图7示图6所示与微流网络一起使用的样品装载盒的实施方式。
图8示用于逐个细胞进行表型和基因型分析和关联的样品装载器、微流装载芯片和毛细管的实施方式。
图9A示与图8所示的毛细管一起使用的热控组件的实施方式。
图9B示在图9A所示的热控组件中的毛细管夹持器的实施方式。
图9C示在图9A所示的热控组件中的毛细管夹持器的另一实施方式。
图10示与图7所示用于逐个细胞进行表型和基因型分析和关联的样品装载器一起使用的微流芯片的实施方式。
图11示与图7所示用于逐个细胞进行表型和基因型分析和关联的样品装载器一起使用的微流芯片的另一实施方式。
图12为单细胞表型和基因型分析和关联的离散关联实施方式的原理框图。
图13A为用于进行图12所示的离散关联实施方式的微流元件和纳孔(nanowell)阵列的示意图。
图13B为用于分选和索引图13A所示的实施方式中的单个细胞的步骤的示意图。
图14A示与多分支微流回路中的纳孔离散关联的方法的另一实施方式。
图14B示使用图14A所示的实施方式对分选成9种表型群的样品的表型-基因型关联。
图15A为在纳孔(nanowell)中用扫描式细胞术对单细胞进行表型和基因型分析及关联的另一实施方式的元件的示意图。
图15B示在图15A所示的实施方式中的扫描和索引个细胞的步骤。
图16为在单细胞基因组分析仪和分选仪的连续流实施方式中使用的微流元件的示意图。
图17为在包含基因型分选的离散实施方式中使用的微流元件和纳孔(nanowell)阵列的示意图。
图18A～D示显示流动形式的实际装置的实际显微图。
图19为跟踪示波器，其显示作为细胞前向散射和液滴前向散射的时间函数的振幅。
图20为包含不同长度的编码滴的六个平行的毛细管的显微图。
图21为具有不同长度和顺序的编码滴的三个毛细管的显微图。
图22A和B分别示PCR前和后在微容器中的检测结果。
图23A和B示在PCR扩增前和后在三相体系中的微容器。
发明详述
本发明提供了适于对例如对从数百个细胞～数千个细胞到数万个细胞～数十万个细胞数规模的样品逐个细胞分析表型(如用缀合了荧光的抗体或组成型表达的荧光报告分子(例如绿色荧光蛋白)标记的细胞表面蛋白或胞内蛋白)信息和基因型(如用于检测单核苷酸多态性(SNP)、DNA拷贝数或RNA基因表达的单细胞、多重定量PCR或RT-PCR)信息的方法和装置。较大的样品量有利于利用多维散点图来揭示基因和蛋白之间的生物模式和关系。如图1所示，本发明的主要目的为通过逐个询问单个细胞来获得已选定的表型特征和已选定的基因表达，然后逐个细胞关联所述信息。用于关联高通量样品的表型-基因型信息的方法可在微流网络中的连续流动样品上进行，或在预装载于纳孔(nanowell)阵列芯片中的静态样品上进行。例如，可使用在连续流实施方式中的流式细胞术或使用扫描式细胞术来对预装载在纳孔(nanowell)芯片中的静态样品进行表型测定，以检测指示所述样品中细胞的物理特性(如细胞形态、细胞大小或荧光标记的定位(在细胞核、细胞表面或细胞质))的荧光信号。在某些实施方式中，使用例如两种、三种或四种颜色的荧光检测进行多表型测定。其他表型分析方法包括测定光散射，即细胞的正向和侧向散射。然后编码所述细胞，以创建用于在后的关联的表型测定索引。在纳孔(nanowell)芯片中，所述阵列上细胞位置提供编码信号。在一连续流实施方式中，将细胞包裹在纳升微容器中，并可将染料、编码珠或任何光学可检测的物理参数与所述微容器伪随机结合以创建索引。然后裂解所述细胞，并扩增靶DNA序列(如通过等温扩增或聚合酶链反应(PCR)(包括：终点PCR、实时PCR(RT-PCR)或定量PCR(qPCR))，或其他任何扩增核酸的方法)，以测定细胞中的基因表达、基因型或核酸的其他目的特征。用光学图像传感器检测和测定各微容器中的扩增产物(即扩增的DNA序列)，并将此数据发送到处理器，以与先前测定的各微容器中的表型信息相关联。使用由参照信号或纳孔(nanowell)阵列位置创建的索引解码各微容器中的表型数据，并将所述信息与靶DNA或RNA扩增获得的基因型信息(如单核苷酸多态性(SNP)、DNA的拷贝数或RNA基因表达的检测)相关联。
图2示在连续流实施方式中分析个细胞及关联表型和基因型数据的步骤。在步骤100中，分析了含在水溶液中的多个细胞的样品输入部10的整群的选定的表型特征，如蛋白表达、细胞形态、细胞大小或荧光标记(在细胞核中对在细胞表面或细胞质中)位置。首先，如使用经荧光分子(荧光染料)、绿色荧光蛋白或染料标记的抗体标记所述细胞。然后将所述样品导入到微流流动细胞中，且将所述细胞汇集为单束细胞流。通过表型标记逐个测定了细胞流产生的荧光信号。在一些实施方式中，使用四种颜色的流式细胞术测定多个表型特征。下一步，在步骤102中，将细胞独立包裹在含适合扩增细胞中的靶DNA序列的预定试剂混合物的纳升微容器或滴中。例如，如在下面进一步的讨论中，可将所述细胞和PCR试剂混合物导入到微流网络中的流道中，所述微流网络设计为分离和包裹油包水滴流中的个细胞。所述滴或微容器优选具有大于样品细胞且小于流道横截面直径的横截面直径。例如，微容器优选在30μm～500μm之间，取决于流道尺寸。多数微容器基于细胞浓度和滴体积依据泊松分布优选含有一个细胞或0个细胞。此外，可使用包裹的主动控制(如以控制的方式使用压缩、阀门或闸门来计量细胞)装载非泊松分布的0个或一个细胞。例如，在一些实施方式中，至少90％的微容器含有1或0个细胞，或至少80％的微容器含有1或0个细胞，或者至少70％的微容器含有1或0个细胞，或者至少60％的微容器含有1或0个细胞。测定在各微反应器中的细胞数，以标准化结果数据。例如，在一方法中，照明流道，且用光学检测器检测信号(如前向散射)，其指示滴中细胞的有无。更精密的检测使用前向散射阵列的检测，以提供更好的空间分辨率以计算和定位滴中的细胞/粒子。在另一方法中，可将暗场照明和成像添加到单个检测器散射测定。当前向散射信号检测滴前沿时，CCD照相机可同步拍摄所述滴的暗场图像。细胞/粒子会在图像中为亮点，其可经处理和鉴定而用于计数。
在一些实施方式中，可基于用户选定的参数(如测定的表型特征)分选所述细胞。例如，可通过荧光、前向散射或任何适宜成像或检测形式在流体流中检测具有所欲特征的靶细胞的存在。然后可使用双向电泳、气动开关或双向流体或光学开关(如序列号为11/781,848，名称为“细胞分选系统和方法”的共同在审专利申请中所述，其通过引用整体并入本文)将靶细胞引至靶流道，以用于包裹和/或编码。可将非靶细胞引至与废物槽连接的废物流道。在一些实施方式中，可在表型测定前分选所述细胞。另外，可基于测定的表型特征分选所述细胞。在另一实施方式中，可使用两种油形成三相体系，其中一种油充当装载流体而第二种油充当滴间间隔。这抑制了相邻水滴的聚结。图23A和B示PCR扩增前和后在三相体系中的微容器的例子。
在步骤104中，用参照信号编码微容器来索引在微容器中的细胞的表型信息，用于随后与微容器中的细胞的基因表达相关联。参照信号可包含在微容器中或从微容器中分离。可使用具有独特标记且可光学测定的任何物理参数以伪随机模式产生参照信号。然后记录和储存一个以上编码的微容器图像，用于随后在用包含在微反应器中或从微反应器中分离的～进行基因型测定后与微容器图像进行比较和关联。例如，在一些实施方式中，可以伪随机模式将荧光微珠或染料注入微容器，然后其成像。另外，微容器的尺寸、微容器的长度和/或微容器之间的间隔可以变化，以创建一个可重建的伪随机模式。在编码模式中的参照信号时间间隔可依据需要的跟踪精度而变化。例如，在一些实施方式中，参照信号可与每个微容器连接，或参照信号可与每10个微容器连接，或与每100个微容器连接，或与每200个微容器连接，或与每500个微容器连接，或与每1000个微容器连接。
在步骤106中，测定了细胞的基因型。裂解细胞并经受扩增(如等温扩增、终点PCR、反转录PCR或定量PCR)靶DNA序列所需的热条件。在经PCR进行扩增的实施方式中，使温度循环以产生用于PCR所需循环数的适合温度。这可通过使用热块或Peltier装置的标准热循环仪完成，或可通过替代技术(如烤箱、冷热空气、流动具有良好热传导性的加热液体、在不同温度下的仪器组件之间传输装置或现有技术已知的其他任何适宜加热元件(认为所述相同列表可适用于本文所述的其他实施方式))完成。在一些实施方式中，微容器可连续流经重复通过固定温度区的蛇形流道，以完成聚合酶链反应。另外，可将微容器装载进流道中并保留或多或少的静电，同时流道的温度通过所需的温度分布反复循环，以完成聚合酶链反应。微容器经受所需的PCR循环数以扩增靶DNA，并测定扩增产物。在微反应器中包裹细胞的混合试剂包括非特异性荧光检测分子(如嵌入染料)，或序列特异性荧光探针(如分子信标，探针)或现有技术已知的其他任何适宜探针或标记，当激发所述探针或标记时，其发出与扩增产物量成比例的荧光。所述探针可与以与DNA产物成比例的量存在的通过DNA扩增过程产生的双链DNA产物、单链DNA产物或非产物寡核苷酸结合。成像系统使用所需波长的光来激发荧光探针，以直接或间接测定扩增的产物。
在步骤108中，解码基因型测定。光学检测器(如光电倍增管、CCD照相机、光电二极管或光电二极管阵列或其他光学检测器)测定在各微容器中的从探针或标记发出的荧光信号强度，并在各PCR循环期间测定扩增产物量至少一次。将光学检测器的图像发送到计算机进行图像处理和比较，以记录微容器的编码模式。在步骤110中，可用现有技术已知的图像处理算法来比较从基因型测定获得的图像和索引图像，然后可逐个细胞关联基因型测定和表型测定。
在一些实施方式中，在步骤112中，可基于测定的基因表达来分选微容器，以捕获靶核酸用于进一步分析。可基于基因型测定使用上文所述的光学开关指引微容器进入靶流道或废物流道。
在另一实施方式中，如图3所示，可同时进行多步骤以使在微流网络上的询问点数最少。在这里，将样品输入部12中已标记的用于表型分析的细胞导入仪器中，且在步骤102中，将其独立包裹在含适合扩增细胞中的靶DNA的预定混合试剂的微容器或滴中。可在透明的微容器中同时包裹用于编码的参照信号，或另外可控制流动条件以伪随机的改变微容器的物理特征，以建立参照信号。在步骤103中，可在一步骤中测定和记录表型及参照信号，以编码表型信息，并创建用于与基因型测定关联的索引。接下来在步骤105中，也可在一步骤中测定基因型和解码信号。例如，在上述第一实施方式中，所述基因型分型光源和检测器不同于解码用光源和检测器。在这里，可共享所述光源和/或检测器。
裂解个细胞，然后使所述微容器经受扩增(如实时PCR或定量PCR)靶DNA序列所需的热条件。使所述微容器经受所需PCR循环数，以扩增靶DNA。通过激发包含在PCR试剂混合物中的荧光探针，并用光学检测器检测荧光强度来测定PCR循环中的扩增产物。所述光学检测器可为使用连续流体系的扫描检测器，或为固定式检测器。将图形发送到计算机，以用于图像的处理和比较，从而记录微容器的编码模式。然后可逐个细胞关联基因型测定值和表型测定值。
图4～5进一步详细显示了上述步骤，并使用微流组分进行所述步骤。在步骤100中，通过将细胞200经微流入口202导入到流道209中来进行表型分析。通过两个侧面的鞘缓冲通道203、204建立的鞘缓冲流201夹住所述细胞200。在鞘流中使用的缓冲液可为与正在分析的细胞生物学相容，且与在荧光检测(即所述缓冲液在荧光激发/检测波长处具有足够低的吸光度)和光学开关波长中使用的光学照明相容的任何缓冲液。鞘缓冲液的优选实施方式使用PBS/BSA，在含有1％牛血清白蛋白(BSA)级分5的pH 7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)。
鞘缓冲液201将细胞200聚集成细胞200的单束线，然后在分析区205对其进行询问，以测定一个以上的所需细胞表型特征。照明光源(如固定或扫描激光器、UV灯、发光二极管或其他平行光源)可导致连接到细胞200的标记(如荧光染料、抗体、GFP或其他荧光色素)发荧光，并散射细胞及容器，以提供各细胞和容器的物理性质的信息(如尺寸、形态或缘界)。一个以上的光学检测器(如CCD成像、PMT或光电二极管阵列)测定产生的信号。也可在分析区205进行其他类型的光学测定(如光散射)，以测定细胞200的表型特征。在一些实施方式中，可使用例如四种颜色的流式细胞术或通过测定荧光和/或散射来进行多表型测定。例如，可通过多荧光团标记细胞，或使用对不同波长发出的荧光敏感的其他荧光探测通道(通常使用单激发波长(例如但不仅限于488nm))进行多表型测定。在这里，各检测通道合并了PMT与适宜分色镜和用于附加附加荧光团的荧光发射波长的发射滤光片。以这种方式，由2～4次荧光检测，即完成通道调适。
在所示实施方式中，将含有基因表达测定所需的试剂和荧光DNA检测分子或探针的PCR混合物经置于鞘流道203、204和包裹流道207a、b之间的侧向试剂流道206a、b注射进流动流(flow stream)。在另一实施方式中，可通过鞘缓冲流道203、204将PCR混合物导入到细胞流中。
在下一步骤102中，通过将疏水性包裹介质经侧向包裹流道207a、b导入到流道209中来进行包裹。可使用硅油、矿物油、氟碳油或其他疏水性液体以促进分散水滴的产生。所述包裹介质夹住PCR混合物流和细胞进入个水基纳升微容器或微反应器208。所述纳升微容器208优选具有大于细胞200但不显著大于微流通道209的直径。优选将包裹流道207a、b中的流动条件选择为确保优选包裹0个或一个细胞/微容器。例如与流式细胞术匹配的微流通道通常具有50μm～100μm×150μm～300μm的横截面，且可获得的聚四氟乙烯毛细管的直径可小至400μm，因此微容器208的直径在30μm～400μm的范围内。
在下一步骤104中，编码和解码微反应器208的序列，以辅助将表型和基因型相关联。如图5所示，在表型分析和油滴包裹之间通过将一个以上的编码珠220伪随机地连接到细胞流中一些细胞200来进行编码。在图示实施方式中，所述编码珠220具有可读取和记录的荧光信号，以创建在微容器208的流中的个微容器208的位置的索引。另外，可以伪随机模式将染料的可光学检测的脉冲与个细胞相连接。一旦编码珠220连接到细胞200，所述细胞200被包裹到个微容器208中，然后所述微容器208流经可导致编码珠220发荧光的解码激光器225，且一个以上的检测器225测定产生的信号，以编码微容器208，及创建微容器208的索引。记录的编码珠(或染料)和细胞的模式成为可在细胞裂解后使用的唯一标志，以使从各反应器的信号反过来与测定的细胞表型相关联。在进行扩增后，将第二解码激光器226置于邻近所述蛇形流道210处，以使微容器成像。所述第二解码激光器226使用光源(如固定或扫描激光器、UV灯或发光二极管)，以导致编码珠206发荧光或散射，且光学检测器(如CCD成像、光电倍增管、光电二极管或光电二极管阵列)测定信号，以创建微容器208的图像，其可与储存的编码图像进行比较，以鉴定个微容器208。通常使用用于鉴定在磁性数据存储器中丢失的数据位的纠错算法来确定事件的顺序。
在图示实施方式中，通过改变在流道209中的流动条件以改变微容器208之间的间距来提供第二冗余编码信号。如图5所示，这可创建另一可光学检测的参照信号(即液缘界信号(droplet boundarysignal))，其可被成像、储存和重建，以追踪个微容器208。在另一实施方式中，可独立使用用于创建独特、可重建模式的参照信号的任何方法，以编码微容器。此外，在两种实施方式中，通过提高或降低将编码信息连接到个微容器的频率来制作的编码信号或多或少的强烈依赖于在细胞追踪中的可接受误差水平。例如在一些实施方式中，可将编码珠连接到每个微容器。另外，可将随机模式的编码珠应用于每10个容器、或每50个容器、或每100个容器、或每500个容器、或每1,000个容器的多微容器。类似地，如果通过改变微容器之间的距离来创建编码信号，可将所述距离调至在10个容器的块、或50个容器的块、或100个容器的块、或500个容器的块或1000个容器的块中编码。
接下来在步骤106中，裂解包裹的细胞200，并用实时PCR或定量PCR分析其基因表达。可利用现有技术已知的多种方法裂解细胞，所述方法包括用激光光解、基于超声波的裂解或化学裂解。然后所述微容器208流经蛇形微流通道210以使微容器208流经扩增和实时检测扩增的基因产物所需的一个以上的热区。在图示实施方式中，蛇形通道210重复流经三个温区211、212和213。温区维持在适宜温度，以进行PCP循环。例如如本文所示，第一温区211约为60°，第二温区212约为72°，第三温区213约为96°。温控系统调整流动条件，以确保微容器可在各温区保留适宜PCR循环时间。使微容器208多次流经温区211、212、213，且在各次通过后进行测定，以测定扩增产物量。如以上所讨论，PCR混合物包括发出与扩增产物量成比例水平的荧光的探针。所述荧光团可由光源214(如固定和扫描激光器、UV灯、发光二极管)在各PCR循环期间在特定的时间或温度激发，并通过检测器215(如光电倍增管、CCD照相机、光电二极管或光电二极管阵列或其他光学检测器)检测。检测器215测定荧光强度，以确定在微反应器208中的扩增产物量。
接下来在步骤108中，解码先前所记录的表型测定值。如图5所示，在个微容器208在蛇形通道210中扩增时，第二解码激光器225读取来自所述个微容器208的编码信号。然后将编码信号和基因表达测定结果发送到处理器，以用于编码信号的解码，及将与编码信号连接的细胞的表型信息与新近测定的基因表达相关联。
在一些实施方式中，需要从所测定细胞的选定部分回收遗传物质，或基于遗传标志(无需关联表型)分选细胞。例如如图12所示，在一些实施方式中，在基因表达测定的最后，可将微容器208分选进入两个槽，如废物槽231和靶槽230。使用侧向力开关225分选微容器，以基于关联的表型-基因型测定将层流之间的微容器208切换流入到靶流道220和废物流道21中。使用光力、双向电泳、射流脉冲或相似手段控制侧向力开关。在一些实施方式中，不进行表型测定，且PCR扩增后的分选只基于基因型测定。
图6示在微流网络中逐个细胞进行表型和基因型关联的集成系统的实施方式。仪器300含有可重复使用的平台，其固定了热组件302，激发源303、308和所需的检测器312、304和306，以询问和分析含在盒320中的样品。包含微流网络芯片的一次性样品装载盒320与仪器300芯片连接，以进行样品的分析。盒320具有配置为含有编码、分离和扩增样品细胞所需的细胞样品和所有试剂、缓冲液、编码染料或编码珠和包裹介质的多个槽321～324。在所示的实施方式中，在槽323中含有细胞样品，在槽324中含有油包裹介质，在槽322中含有编码珠，且在槽321中含有用于产生单细胞流的鞘缓冲液。在这里，在鞘槽321中也包括含有扩增所需试剂和荧光标记的PCR混合物。
用UV粘着剂将芯片与盒320的光学窗口区连接，且芯片输入口与其一次性盒320上相应的槽容积(reservoir volumes)连接。将芯片上的样品流道309中的输入口与一次性盒上的细胞样品槽323流通连接，以将所述细胞导入到样品流道309中。细胞样品槽323的形状通常为圆锥形，往输入口的方向渐细。在优选的实施方式中，入口槽含有聚丙烯插入物，以使细胞粘附最少，从而使细胞产量最大。芯片上的微流通道305、307流通连接槽321、324的出口到样品流道309。侧向流道305a、b配置为添加PCR混合物到样品流道309中，然后侧向流道307引导油进入样品流道309，以在油中包裹样品细胞。在仪器300内安置盒320，以在样品流道309邻近安置光源(如488nm的激光器303和荧光检测器312)。盒优选由光学透明的丙烯酸塑料制成。光学视窗还使可对在微流网络中的选定位点进行可见的询问，并使激发光源和光学检测器经盒投影到微流芯片。如果适合的话，也可用其他光学透明的塑料或适宜材料替代丙烯酸。微流通道通常用光学透明的物质制成，以使细胞检测光投影到样品流道309。基板通常为但不限于玻璃、石英、塑料(如聚甲基甲丙烯酸酯(PMMT)等)及其他可塑的或可行的聚合物(如聚二甲基硅氧烷、PDMS或SU8)。
从488nm的激光器303发出的光经盒320投影到在包裹区上游的样品流道309，以询问细胞。488nm的激光器303，样品细胞的选定表型特征。荧光检测器312测定荧光，以测定细胞的表型信息。然后在适宜条件下将包裹介质(如油)导入到样品流道309，以将单个细胞包裹入个纳升微容器。然后基于一个以上的测定的包裹的细胞的表型特征经样品流道309分选微容器，以用于进一步的基因型分型，或进入废物流道330以运输到废物槽334。当微容器流经样品流道309时，索引解码激光器308以伪随机顺序激发先前与细胞所连接的索引珠。解码传感器306检测、成像和储存连接到细胞的索引珠的顺序，从而它们流经样品流道309，以创建微容器的索引，以用于与后续的基因型测定图像相关联。一旦微容器已被编码，将其装载到用于PCR扩增的微流芯片上的蛇形微流通道中。将仪器上的热组件302置于邻近预装载微流通道处，使微流芯片中的微容器循环通过完成PCR扩增所需的温区。热组件302包括热控元件和使用热块或Peltier装置的标准热循环仪，其也可使用其他技术来完成，如一个以上的集成加热丝、烤箱、冷热空气、流动具有良好导热性的加热液体、在不同温度下的仪器组件之间传输装置、或现有技术已知的其他任何适宜加热元件。在一些实施方式中，可使用多个加热元件以建立空间上的热区，所述芯片用动力元件物理通过所述热区。另外，可使用单个加热元件(如冷/热空气加热器)交替加热和冷却微流通道，以使其循环经历PCR扩增用温度分布。热控元件控制温度，并使蛇形通道多次循环经历完成所需PCR循环数的PCR温度分布。
在各PCR循环后分析微容器，以确定扩增产物量。如上所述，所述PCR混合物含有探针，其发出与扩增产物量成比例水平的荧光。在各PCR循环期间可通过光源(如固定和扫描激光器、UV灯、发光二极管)在特定时间或特定温度下激发探针。通过在微流芯片邻近安置的PCR图像传感器304(如光电倍增管、CCD照相机、光电二极管或光电二极管阵列、或其他光学检测器)测定荧光信号。所述图像传感器304测定荧光强度，以测定微反应器208中的扩增产物量和各微容器中细胞的基因型。所述索引解码激光器308也激发与各微容器连接的索引珠，并通过解码传感器306使编码信号成像。然后将各微容器的编码信号和基因型数据发送到处理器，以索引和关联表型测定与来自个微容器208的基因型数据。在一些实施方式中，逐个循环对微容器进行成像和跟踪，例如使用滴尺寸和各图像中的位置。在另一实施方式中，在完成所需PCR循环数后对微容器进行成像，并读取编码信号。
图7示与微流毛细管或微流芯片一起使用的一次性样品装载盒的实施方式，其用于进行单细胞分析及关联表型信息和基因型信息。盒有6个内置的槽321～326，各具有单独配置为提供与连接芯片上的微流通道接口连接的输出口。用咬对盖340密封槽容积(reservoirvolumes)321～326，所述咬对盖具有钻进去的端口以用于连接气动控制器和个槽321～326。所述端口可对槽应用气压，其可通过对槽321～326单独施压来驱动流体和细胞经过连接的微流芯片的微流网络。在另一实施方式中，可通过注射泵、蠕动泵或其他方式的运动驱动流体。在所示的实施方式中，槽323配置为容纳约5～50μL体积的样品；槽324配置为容纳约50～1500μL体积的包裹介质(如油)，且槽321配置为容纳PCR混合物。在一些实施方式中，槽322可配置为容纳编码介质(如荧光珠或染料)。槽321、322、323和324各包含配置为与连接的芯片的微流网络上的入口流通连接的端口，以用于装载样品、PCR混合物和可选的编码介质，及将细胞包裹在包裹介质中。可使用槽325和326作为废物槽形式的实施方式，其中在包裹前分选所述细胞。另外，可将一个以上的槽325和326与连接的PCR芯片上的多个通气道流通连接，以允许芯片上的微流通道内的样品流的热膨胀和收缩，同时可防止外部环境污染样品流。盖340包含硅胶垫片，以辅助其密封盒体341。它还包括0.1μm的聚丙烯过滤器，以在盒体和外部环境间创造透气、液密的接口。在序列号为11/781848，名称为“细胞分选系统和方法”的共同在审专利申请(其通过引用整体并入本文)中进一步详述了一次性盒的其他实施方式。
如上所述，进行表型-基因型关联的方法和装置可适于数百个细胞～数千个细胞至数万个～数十万个细胞数规模的样品。可将仪器平台300和一次性样品装载盒320可与配置为处理达一百个细胞的样品、或达一千个细胞的样品、或达一万个细胞的样品、或达十万个细胞的样品的多种不同的毛细管或微流网络芯片一起使用。
图8示与一次性盒320一起使用的微流装载芯片400和毛细管420的实施方式。微流芯片410配置为例如通过UV粘着剂连接将其与盒320的光学窗口区连接。当芯片连接到盒320时，在微流芯片上安置输入部口411、412和413，以与PCR混合物槽321、包裹介质槽324和样品输入槽323相联接。样品输入部口413与样品流道409流通连接，由此，在使用中，包含在样品槽323中的样品细胞会被输送到样品流道409中。PCR混合物槽411与PCR流道405a、b流通连接，其在T形接头处与样品流道409相交，以将PCR混合物导入到流经样品流道409的样品细胞流中。在一些实施方式中，控制PCR混合物的流动条件，从而PCR混合物的导入还将样品流组织为单束细胞流。另外，当在样品细胞输入部413导入样品时，样品流道409的直径可配置为将样品组织成单束细胞流。包裹介质入口412与包裹流道407流通连接，其在PCR混合物交叉点下游的L形接头处与样品流道409相交。包裹介质(如油)在适宜流动条件下在样品流道409和包裹流道407之间的“L”形接头处流进细胞和PCR混合物流，以夹断细胞和PCR混合物滴进入纳升微容器流(优选含由油包裹介质包围的单个细胞)。控制在包裹流道407中的流动条件，以确保在每微容器中优选包裹0或一个细胞。例如，与流式细胞术匹配的微流通道的截面通常为50～100μm×150～300μm，且可用的Teflon毛细管直径可小至400μm，所以纳升微容器408将具有30～400μm的直径。可通过直接驱动泵、气动泵、电动力学、毛细管作用、重力或其他产生流体流动的方法完成微流通道网络中的流动条件的设置和控制。
然后将微容器408流装载进微流毛细管420中，以用于微容器中遗传物质的扩增及基因表达的测定。如上所述，可进一步控制样品流道409和包裹流道307的流动条件，以改变纳升微容器的尺寸和/或如上所述的纳升微容器间的间隔，其可提供用于编码和索引微容器的相对位置的微容器的特有顺序。在所示的实施方式中，毛细管中的微容器间的距离(d)为约500～1000μm，且微流毛细管420的总长度(L)为500～1000mm，以提供约1000个微容器的容量。在另一实施方式中，可调整液滴的间距和/或微流毛细管的总长度，以适应更大或更小的样品。在使用时，将毛细管塑成蛇形布置，其含有由两端接头连接的多个邻近平行区段。例如，在一些实施方式中，将毛细管划分成10～20个的平行区段。切断所述接头，留下多个邻近的平行区段，其各长40～50mm。在扩增处理前可将毛细管划分成多个区段，以使其在毛细管内的微容器位置上、在PCR扩增循环间热膨胀的连锁反应最小化，从而提高追踪个微容器位置的能力，由此可将扩增产物的测定与先前的各个微容器的表型测定相关联。
图9A～C示基于上述PCR体系的与毛细管一起使用的热控组件。一旦将微容器装载入毛细管420，并将毛细管划分成多个区段421，将区段421安装进具有多个矩形槽423或毛细管夹持器的铝块422。矩形槽约为1mm深、或2mm深、或3mm深、或4mm深、或5mm深。在一实施方式中，如图9B所示，矩形槽423的宽度比毛细管的横切面直径稍窄，从而在槽的底部和侧壁与毛细管之间有热接触；而在一些实施方式中，当毛细管与铝块的底部和侧壁非常接近时，矩形槽的宽度比毛细管的直径稍大。在另一实施方式中，如图9C所示，底部毛细管夹持器424的形状相当于毛细管区段直径，以便在铝块422和毛细管区段421之间有更多的热接触。在上述两个实施方式中，矩形槽侧壁的宽度大于等于毛细管的直径。在一些实施方式中，可在铝块的顶部安装约1mm厚度的玻璃盖425，以防止向周围空气的传导和阻碍热辐射。另外，可在没有玻璃盖的情况上使用更深的槽。在另一实施方式中，可将矩形槽的侧壁制得比毛细管的直径薄，其有利于减少矩形槽之间的间隔，从而提高了加热块中毛细管的密度。在所述实施方式中，在高度与毛细管直径相等的矩形槽上使用玻璃盖，以在较薄的侧壁间保持良好的导热性；或制作的矩形槽的高度至少为毛细管直径的1.5倍。例如，在一实施方式中，如果槽的深度至少为毛细管直径的1.5倍，则其侧壁有约0.1mm～0.2mm的厚度。一旦用多个毛细管区段421装载铝块422，铝块的温度可以1℃/S从60℃升到95℃，以使毛细管区段421循环经过用于PCR扩增的温度分布。可使用任何适合的上述加热元件循环温度经历所需PCR的循环数。
图10示对更大的样品进行单细胞表型和基因型分析及关联的微流芯片500的实施方式。所示的微流芯片500约为75mm×75mm，且具有达10,000个微容器的容量。微流芯片优选为光透明基板，以使细胞检测光能投影到微通道。所述基板通常为但不限于：玻璃、石英、塑料(如聚甲基甲丙烯酸酯(PMMT)等)及其他可塑的或可行的聚合物(如聚二甲基硅氧烷、PDMS或SU8)。
如上所述，在使用时，将微流芯片500连接到含有样品、PCR混合物和包裹介质的一次性样品装载盒。当在一次性盒的光学窗口上安置芯片500时，在一次性盒上所述芯片500具有配置为连接到细胞槽、PCR混合物槽和油槽的细胞入口513、PCR混合物入口512和油入口511。细胞输入部口515与样品流道509流通连接，以便在使用时，将在一次性盒的样品槽中含有的细胞输送进入样品流道509。PCR混合物入口411与PCR流道505a、b流通连接，其与样品流道409相交，以将PCR混合物导入流经样品流道409的细胞流。在一些实施方式中，控制PCR混合物的流动条件，由此PCR混合物的导入将样品流汇集为单束细胞流。另外，当在细胞样品输入部513导入样品时，可将样品流动细胞509的直径配置为将样品汇集为单束细胞流。油入口512与包裹流道507流通连接，其在PCR混合物交叉点下游的L形接头处与样品流道409相交。在适宜流动条件下，在样品流道409和包裹流道407之间的“L”形接头处，将油流注入细胞和PCR混合物流中，以夹住细胞和PCR混合物滴进入纳升微容器流(优选含有由油包裹介质包围的单个细胞)。在一些实施方式中，为了限制包裹细胞的数量至预选的仍可反过来与表型测定相关联的亚群(subpopultion)，在包裹前提供分选区以分选样品。例如，可进行分选，以舍弃红细胞而只汇集有核细胞。纳升微容器的横截面直径优选比样品细胞大，且比流道的横截面直径小。例如，微容器的横截面直径优选为30～400μm，取决于流道尺寸。
如上所述，控制包裹流道507中的流动条件，以确保大部分微容器优选含有一个细胞或0个细胞，例如，在一些实施方式中，至少90％的微容器含有1或0个细胞，或至少80％的微容器含有1或0个细胞，或至少70％的微容器含有1或0个细胞，或至少60％的微容器含有1或0个细胞。另外，在一些实施方式中，可进一步控制包裹流道507和/或样品流道509的流动条件，以定期改变微容器尺寸和/或微容器间的间隔，以创建用于索引和跟踪个微容器的编码信号。可通过直接驱动泵、气动泵、电动力学、毛细作用、重力或其他产生流体流动的方法完成微流通道网络中的流动条件的设置和控制。
然后将微容器流装载进蛇形通道520中，所述蛇形通道520与样品流道509(用于扩增样品细胞中的靶序列)流通连接。通过多个弯段531a～i相连的邻近区段521a～j将蛇形分析通道509划分成多个平行区段521a～j。优选将蛇形通道划分成50～100个的平行区段，各50～100mm长，取决于样品尺寸和微容器间的所需间隔。通气道540a-j与蛇形通道520的各平行区段521a～j的各末端流通连接。通气道540a～j配置为适应在扩增过程中的温度循环之间各区段521a～j中的微容器流的热膨胀和收缩。将蛇形通道520划分成多个与通气道连接的平行区段以隔绝由各微小区段521a～j的热膨胀引起的微容器的运动，从而排除了沿整个蛇形通道520的热膨胀的连锁反应。因此，可大大减少在温度循环期间蛇形通道520内的微容器运动，并提高了在大体积样品(例如在蛇形通道520内含有)中追踪个微容器的能力。使在温度循环期间的微容器运动最小化也可使在相邻微容器占有的空间内来回移动的微容器的污染风险最小化，并降低了相邻微容器聚结的可能性。
在使用时，在装载蛇形通道520期间用高压封件密封通气道541a～j，以维持在蛇形通道520上的正压，并确保在蛇形通道中装载所述微容器。在一些实施方式中，第一，高压封件可包含机械膜和一个以上的橡胶垫片，以在样品装载期间密封各通气道540a～j。另外，可用在装载后可被蚀刻的光刻材料或可由热膨胀压制动(overcome)的疏水阀覆盖通气道。一旦装载入蛇形通道520，就可放开或移开第一高压封件。然后使用第二封件隔绝通气道540a～j与外部环境，以防止微容器污染。第二封件优选机械顺应，以适应在热循环期间的各区段521a～j中的微容器的热膨胀和收缩。例如，在一些实施方式中，所述第二封件可包括附着到通气道540a～j的薄膜或柔性膜。另外，通气道540a～j可与一次性盒上的一个以上的共用通气槽流通连接，其可用柔性膜或具有过滤器的盖与外部环境隔绝。
图11示用于对更大规模的样品(如含有达100,000个微容器的样品)进行单细胞表型和基因型分析和关联的微流芯片600的另一实施方式。芯片600被划分成4个独立的装载和分析区610a、b、c、d，各有蛇形通道620a～d，所述蛇形通道620a～配置为容纳达25,000个微容器，且微容器间的间隔为约100～200μm。可再想到将芯片依据所需芯片容量分成或多或少个装载区。在一次性盒上，各装载区610a～d配置为具有连接到细胞槽、PCR混合物槽和油槽的细胞入口613a～d、PCR混合物入口612a～d和油入口611a～d。芯片600上的各装载区610a～d优选具有与上述10,000个PCR容量芯片相同的尺寸，以便细胞输入部、PCR输入部和油输入部的相对位置相近。在使用时，可将PCR芯片600连接到动力台，其暂时连接各装载区610a～d到一次性盒，用于以如上所述用于具有一个装载和分析区的10,000个PCR微流芯片500时的相同方式，在芯片600中装载样品和PCR混合物，引导油将样品和PCR混合物包裹在纳升微容器中，及将微容器装载入蛇形分析区。另外，可将盒和芯片集成为一个一体装置。
例如，在一些实施方式中，一次性盒可具有包裹介质和PCR混合物共用的槽，其可例如使用上述动力台交替连接到各芯片，或多路传输到各芯片或装载区。另外，一次性盒具有多个独立的油槽和PCR混合物槽，其各与一个装载区连接。同样，在一些实施方式中，所述盒可具有一个样品槽，其使用一个以上的阀和流道多路传输到各细胞输入部。另外，在一些实施方式中，所述盒具有多个样品槽，其各独立连接到一个细胞输入部和分析区。所述盒还配置为允许光及用于进行表型分析的各装载区。
如上文所述，参考微流芯片500，100,000PCR芯片600中的各装载和分析区610a～d含有蛇形通道620a～d，将其流通连接到所述蛇形通道620a～d与样品流道609a～d(用于各微容器中的样品细胞的靶序列扩增)的流通连接。将蛇形分析通道620划分成由多个弯段连接的多个平行区段。优选将各蛇形通道620a～d划分成50～100个的平行区段，各为约50～100mm长，取决于样品尺寸和所需微容器间的间隔。如上所述，将通气道640与蛇形通道620a～d的各平行区段的各末端流通连接，以密封在装载过程期间的蛇形通道620a～d，并且允许在扩增过程中隔绝蛇行通道与外部环境的同时允许蛇形通道热膨胀和收缩。
在另一实施方式中，可对预装进微孔阵列芯片的样品进行表型-基因型分析及关联。图12示为源于预装进微孔阵列的样品的基因型数据分析和关联表型-基因型数据的步骤。在步骤700中，独立分析了样品输入部70中细胞的选定表型特征。在一些实施方式中，在将细胞分离进纳孔前，在微流环境(例如通过上文所述的流式细胞术)中进行表型分析。另外，在个纳孔中分离细胞后，可使用扫描式细胞术进行表型测定。如上所述，在一些实施方式中，可使用例如多重荧光检测器或光散射测定仪和荧光的组合进行多表型测定。
在步骤702中，可基于用户选定的参数(如测定的表型特征)分选细胞。然后可将所述靶细胞指引至用于运送到纳孔阵列的靶流道。可将非靶细胞指引到连接废物槽的废物流道。
在步骤704中，在一个以上阵列的纳孔中顺序放置靶细胞。优选各纳孔可含有一个细胞。向纳孔中预装载基因表达测定所需试剂及在被激发时发出与扩增产物量成比例水平的荧光的荧光检测分子或探针。在一些实施方式中，可用孔数优选超过所测细胞数，以确保有限稀释。使用疏水性流体盖(如油)彼此隔绝个孔。可基于阵列中各细胞的精确位置索引和记录各纳孔中细胞的表型信息。
在步骤706中，测定个细胞的基因型。可利用加热、激光、超声波或化学裂解或任何本领域已知的其他适宜技术裂解细胞。热偶联阵列到块加热器，且使所述纳孔通过等温扩增或聚合酶链式反应(PCR)循环经历一个以上的扩增基因产物所需的温度。所述阵列经过所需的扩增循环数，并测定扩增的基因产物。
在步骤708中，解码基因型的测定。用光源(如固定或扫描激光器、UV灯、发光二极管)激发荧光检测分子或探针，且用光学检测器(如CCD成像、光电倍增管、光电二极管或光电二极管阵列)采集所述阵列的像，以测定各纳孔中的荧光信号强度，并检测扩增产物量。在一些实施方式中，用光学检测器(如CCD照相机)采集整个阵列的像。另外，通过扫描激发光源或扫描检测器(如连接到光电倍增管的光纤)顺序询问各纳孔。将图像发送到用于图像处理的处理器，并与先前记录的各纳孔的表型测定相关联，从而提供了各细胞的相关联的表型和基因型数据74。
如图13A～B示，在一些实施方式中，可在微流环境中顺序进行细胞的表型测定，然后在微孔阵列中装载所述细胞，以进行扩增和基因型分析。在这里，在步骤700中，通过将细胞808导入微流流道709中来进行表型分析。如上所述，可讲流道配置为例如通过减小流道709的横截面直径来将所述细胞会极为单细胞流，以用于表型分析。在分析区705顺序询问细胞808，以测定细胞的一个以上的表型特征。在一些实施方式中，基于测定的表型特征或用户选定的任何其他参数将细胞分选成靶细胞和非靶细胞。可通过荧光、前向散射或任何适宜成像或检测形式在流体流中检测具有所需特征的靶细胞的存在。然后使用通过引用整体并入本文的、序列号为11/781848、名称为“细胞分选系统和方法”的共同在审专利申请中描述的双向电泳、气动开关或双向流体或光学开关将靶细胞指引到靶流道711，以运输到纳孔阵列芯片800上的个纳孔801a～f。将非靶细胞指引到连接废物槽的废物流道710。
在步骤704中，将靶流道711与纳孔阵列芯片800上的微流通道803流通连接，以运输靶细胞流到个纳孔801a～f。将靶细胞808顺序放置在个纳孔801a～f中。将所需的PCR试剂和发出与扩增产物量成比例水平的荧光的荧光检测物或标记预装载到各纳孔位置801a～f。纳孔阵列中各细胞的位置创建索引，其可基于阵列中的位置随后用于将各细胞的表型测定与基因型测定相关联。各纳孔801a～f优选有几纳升的容积，以容纳单个细胞和扩增靶DNA序列所需的试剂。例如，在一实施方式中，孔为100μm×100μm的正方形，及具有70μm的深度。可使用各种材料微制造所述纳孔801a～f，所用材料包括但不限于：玻璃、石英、塑料(如聚甲基甲丙烯酸酯(PMMT)等)及其他可塑的或可行的聚合物(如聚二甲基硅氧烷、PDMS或SU8)。微流通道803连接纳孔801a～f的深度通常在但不仅限于10μm～100μm的范围。微流通道的宽度通常为但不仅限于深度的1～5倍。一旦细胞被装载到个纳孔801a～f中，使油或任何其他适宜包裹介质流经微流通道803，以分离与各孔中与PCR试剂在一起的个细胞。
接下来，在步骤706中，裂解分离的细胞，并循环经历完成聚合酶链反应所需的温度分布。例如，如文本所述，所述阵列800循环经历约96℃的第一温度、约60℃的第二温度、约72℃的第三个温度。在一些实施方式中，通过使用本领域已知的一个以上的元件(如加热块，集成加热丝、Peltier加热器)或通过循环热/冷流体或热/冷空气来将纳孔阵列温度调至产生用于PCR的适合温度。进行所需的PCR循环数，并测定扩增产物。通过光源(如固定和扫描激光器、UV灯、发光二极管)激发各纳孔中的荧光探针或标记，并用光学检测器815(如CCD成像、光电倍增管、光电二极管或光电二极管阵列)采集所述纳孔的像，以测定荧光信号强度。在另一实施方式中，可使用UV光测定核酸产物的吸光度。然后依据在阵列上的位置索引基因型的测定。因此，可基于在纳孔阵列上的位置将各个细胞的表型和基因型相关联。
在图14所示的另一实施方式中，将流道709中的细胞流808分选进入多个靶阵列901a～i。在多个靶阵列的情况下，依据多测定表型特征使用分选开关的网络来分选细胞流多次。例如，如下所示，使用4个分选开关725a～d，在各分选岔口通过三条线路分选细胞。在分选前基于测定的表型，所示分选网络能将细胞分成9个不同的阵列901a～i。如图14B所示，虽然不将个细胞反过来与它们的表型相关联，可确定各阵列的基因表达的逐个细胞的统计学分布，且可将统计值与用户选择的9个表型聚类相关联。
如图15A～B所示，在一些实施方式中，在个纳孔801a～f中存放和分离细胞后，用扫描式细胞术测定各细胞的表型。在这里，标记细胞用于表型分析，例如使用缀合荧光分子(如异硫氰酸荧光素，又名FITC)的抗体、核染色剂、胞内染料或细胞指导合成的荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白，又名GFP)。然后将细胞放置于含扩增靶序列所需的PCR试剂和用于检测扩增的靶序列量的荧光探针或标记的纳孔801a～f中，并将其分离。纳孔801a～f可为正方形且平底，或优选渐细至小平底，以便使细胞自动在孔底集中，这减少了测定细胞的表型所需的光学扫描仪数。在各纳孔801a～f中放置单个细胞。使用光源840(如固定和扫描激光器、UV灯、发光二极管)激发在纳孔阵列800中细胞上的荧光标记，并用荧光检测器812顺序询问在阵列800中的各纳孔，以测定细胞的一种以上的表型特征。记录在阵列中的各细胞的位置和表型测定值，以使随后的单个细胞的基因型测定易于与表型测定相关联。如上所述，裂解分离的细胞，并经PCR温度分布多次循环所述细胞，以扩增遗传物质。使用激光器840激发在各纳孔中的荧光标记或探针，并用荧光检测器812测定荧光信号强度，以测定各PCR循环后的扩增遗传物质量。记录阵列中的各位置的基因型测定结果，并将其发送到处理器，以将其与先前所记录的各纳孔位置的表型测定相关联，从而将各个细胞的表型测定与基因型测定相关联。实际上，通过给孔阵列加上坐标系能进行编码和解码。
在一些实施方式中，如图15A和图18所示，需要基于细胞的表型和基因型测定，从在纳孔阵列中扩增和测定的细胞的选定部分回收遗传物质。在将细胞放置在纳孔阵列前或后，可如图13和图15所示对细胞的一个以上的表型测定进行询问，或如果仅基于基因型信息收集细胞，可直接将其放进纳孔阵列800中。如上所述，分离、裂解所述细胞，并经一个以上的温度热循环阵列800，以扩增基因表达标记。用光学检测器815测定扩增的遗传物质，并将其与各纳孔位置的表型信息相关联。然后使用自动微量移液器820基于相关联的表型-基因型信息从目的纳孔中收获遗传物质，以从个可寻址的目的孔中提取物质。
在图13和图15所示的纳孔的另一使用方法的实施方式仅用于基因型分析。可分离、裂解、热循环细胞，并如先前的图13和图15所述测定细胞的基因型信息，以获得在数万到数十万细胞上的平行的单细胞基因型数据。因为小体积(通常为纳升——，每细胞每反应的成本与相同数量散装细胞的每反应的成本相当。
图18A～18B示以各种流形式进行细胞分离的显微图。具体来说，显微图18A和18B示塑料形成的装置，而显微图18C和18D示PDMS形成的装置。在图18A中，在岔路口1000的样品混合溶液输入部1002、间隔材料输入部1004(如含有间隔油(如氟碳油))、溶液输入部1006，最终在输出部1008形成包含在由间隔物质分离的溶液内的样品混合物。图18B示用400μm的标尺度量的显微图。图18C示与图18具有相同常规元件的相似结构，且已用一致的方式编号。
图19示如标记所示的示波器跟踪的细胞前向散射和液滴前向散射。y轴表示强度，而x轴表示时间。从滴的前向散射(FSC)可看出，所述滴具有相当规律的周期性，且指明了一个滴和下一个滴间的缘界。相反，在细胞前向散射(FSC)中的峰的数量指明了在各滴中的细胞数。
图20示在图片中从上至下依次标记为1011至1016的6种毛细管的显微图。通过滴长度变化影响材料的编码。例如，将毛细管1013中的滴长度与邻近毛细管1012中的长度比较，显示滴长度的显著变化。
图21为又一通过改变滴长度影响编码模式的显微图。显微图中从上至下编码毛细管1021、1022和1023。长度和位置都可形成变化的顺序，其以“摩斯密码”的模式表示。
图22A和22B示基因表达的实际检测结果。图22A示平行的20个毛细管，其各用多个个反应体积充满。图22A示表型CD34的结果。图22B示qPCR后的结果。亮反应滴代表阳性基因的表达。用加到显微图上的箭头标记某些滴。通常，每滴中有一个或两个细胞。约5％的细胞为CD34阳性的KG1A，约95％的细胞为CD34阴性的Jurkat细胞。标记qPCR强度的图片示定量PCR强度作为循环数的函数。在x轴的左边为0个循环而在右边以约46个循环结束。CT直方图反映了逐个细胞的CD34表达量。
虽然上述发明描述了将核酸扩增与流式细胞术的表型数据相关联的方法和装置，仍可容易设想在微容器中进行其他分子检测(如DNA甲基化、蛋白质丰度、细胞因子检测、或其他酶或蛋白的检测)，以将其与各细胞的表型测定相关联。此外，虽然本发明的重点为在微容器内进行单个细胞的测定和关联，但应了解可使用上述装置和方法将在多个细胞上测定的表型-基因型数据相关联。
虽然已通过有明确目标的图示和例子详述了上述发明，但显然其对所属领域的技术人员来说容易理解。依据本发明的教导，也可在不背离本发明的精神和范围的情况下进行一定的改变和改进。

Claims (15)

1.逐个细胞关联表型和基因型信息的方法，包括：
(1)提供第一溶液和第二溶液，所述第一溶液含有多个细胞和至少一种用于扩增靶核酸序列的试剂，所述第二溶液不能与第一溶液混合；
形成包含多个样品室的阵列，每个所述样品室包含纳米流微孔，所述纳米流微孔的尺寸大小为含来自样品源的一个单个细胞和足以支持所述细胞的核酸扩增和定量分析的量的试剂混合物，并且所述纳米微孔配置用来提供到达样品室内容物的光学入口；
(2)逐个分析第一溶液中各细胞的表型；
(3)组合第一溶液和第二溶液，由此形成多个纳升微容器，其中大部分纳升微容器包裹单个细胞或不含细胞；
(4)用参照信号编码纳升微容器；
(5)使纳升微容器经受适合扩增靶核酸的热条件；
(6)测定各微反应器中扩增的核酸序列；及
(7)解码参照信号，以将各微反应器中扩增的核酸序列的测定值与微反应器中细胞的表型相关联。
2.权利要求1的方法，其中扩增所述靶核酸包括进行等温扩增。
3.权利要求1的方法，其中扩增所述靶核酸包括进行qPCR、实时PCR或终点PCR。
4.权利要求1的方法，还包括在用参照信号编码纳升微容器流后使纳升微容器流成像，以创建索引。
5.权利要求1的方法，其中分析表型包括测定荧光信号。
6.权利要求1的方法，其中分析表型包括进行多重表型测定。
7.权利要求1的方法，还包括基于表型测定将细胞分选为靶细胞和非靶细胞，其中所述非靶细胞被分流到废物槽。
8.权利要求1的方法，还包括裂解纳升微容器中的细胞。
9.权利要求1的方法，其中通过实时PCR或定量PCR测定扩增的核酸序列。
10.权利要求1的方法，其中测定扩增的核酸序列包括测定遗传物质的吸收。
11.权利要求1的方法，其中测定扩增的核酸序列包括测定结合到DNA产物或DNA扩增副产物的探针或染料的吸收。
12.权利要求1的方法，还包括基于扩增的核酸序列的测定分选纳升微容器流。
13.权利要求1的方法，还包括将所述第一溶液和第二溶液导入微流网络。
14.权利要求13的方法，其中所述微流网络包括：
(1)装载区，其至少包括合并所述第一和第二溶液用的第一和第二流道，由此形成包含多个纳升微容器的流；
(2)编码区；和
(3)分析区，其包括：
A蛇形流道，其具有多个平行分区，所述多个平行分区具有第一和第二末端，且彼此流通连接，
B多个通气道，其位于所述多个分区的第一和第二末端；及(4)解码区。
15.权利要求1的方法，其中将纳升微容器流分选到纳流微孔阵列中，由此各孔含单个微反应器，且其中使纳升微容器经受重复温度循环的步骤使微孔阵列经受重复温度循环。
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