JP4570945B2

JP4570945B2 - 液滴操作装置及び操作方法

Info

Publication number: JP4570945B2
Application number: JP2004349583A
Authority: JP
Inventors: 和宣岡野; 賢二安田
Original assignee: On-chip Cellomics Consortium
Current assignee: On-chip Cellomics Consortium
Priority date: 2004-12-02
Filing date: 2004-12-02
Publication date: 2010-10-27
Anticipated expiration: 2024-12-02
Also published as: JP2006162264A

Description

本発明は、化学反応を極微量で行うマイクロデバイスや、細胞を１個ずつ取り扱い、細胞に対して種々反応を行ったり観測を行ったりするシステムを実現するための新しい技術に関する。

従来の生化学反応をはじめとする化学反応は、ある大きさを持つ容器の中で行うのが一般的である。たとえば、ＲＮＡライゲーション反応では、蓋のできるマイクロチューブに３’末端リン酸基を持つＲＮＡ断片、このＲＮＡに導入したい配列の合成オリゴＤＮＡ、ＲＮＡリガーゼなどの混合液を入れ、１５℃で一昼夜放置して反応を進行させる。

また、細胞を観察するには、一般的には、スライドガラス上に細胞を含む溶液をのせ、その上をカバーガラスで覆い、顕微鏡で観察する。あるいは、細胞培養シャーレやマイクロプレート上に所定量の培地を入れ、その中で細胞を培養し、容器の底面を通して細胞を観察するのが一般的である。細胞に対して薬効を見る場合などは、同様にマイクロプレートなどの容器に細胞を入れ、培養し、そこに、影響を見たい薬剤を添加して細胞の状態変化を観察する。

細胞を取り扱う技術には、空気中に液滴を形成しその中に確率的に細胞が一個入るような系を作成し、細胞を一細胞ずつ計測したり分離したりする技術がある。これはセルソーターと呼ばれる装置で行われる。セルソーターは蛍光染色処理後の細胞を電荷を持たせた液滴中に１細胞単位で単離して滴下し、この液滴中の細胞の蛍光の有無、光散乱量の大小を基に、液滴が落下する過程で、落下方向に対して法平面方向に高電界を任意の方向に印加することで、液滴の落下方向を制御して、下部に置かれた複数の容器に分画して回収する技術である。この技術について詳しくは非特許文献１に報告されている。

Kamarck, M. E., Methods Enzymol.第１５１巻第１５０頁から１６５頁（１９８７年）

一般的に、生化学反応などに用いる反応体積は目的に応じて設定されるが、近年は微量反応が要求されるようになっている。特に計測を目的とした反応では、計測装置の微量化が進んでいるが、それに見合うだけの前処理反応の微量化はなされていないのが現状である。たとえば、キャピラリーＤＮＡシーケンサーでは内径が５０μｍ程度のキャピラリーを用いて試料ＤＮＡが電気泳動により分離される。この場合、計測に必要とされる試料体積は数十ｎｌであるが、試料ＤＮＡを準備する処理では、実際には、少ない場合でも５μｌ程度の試料ＤＮＡが得られる反応を行っている。ナノＬＣでも同様である。すなわち、試料を準備する反応は数十μｌの容量で行わせ、得られる試料のごく一部を計測に利用しているに過ぎない。

従来は、使用されなかった試料の残りはストックしておき、何か問題があるときは、ストックしている試料をもう一度分析装置にかけることが行われていた。しかし、最近、解析装置の信頼性が向上し、残存試料をストックしておく必要性が低くなってきていることを考えると、無駄の多い処理といえる。

一方、種々の化学合成やスクリーニングに関しても反応液の微量化が進んでいるが、液体ハンドリングは微量になると精度を維持しながら処理を進めることが困難になる。そのため、ビーズを使った固相と液相の界面で反応をおこない、色々な反応の組み合わせを同時に行う技術が開発されている。

しかし、必ずしも固相を利用した反応が万能的に使われるとは限らず、液相での反応が必要な場合も多い。それは、固相表面では、反応物の片方が固体表面に固定されているため、反応速度が遅くなり、あるいは、立体障害で反応基質そのものが固相表面の反応基を攻撃できない、ゼータ電位の問題で不特定なものが固相表面に吸着する、あるいは、静電反発力で固相表面に近寄れない、など色々な問題があるからである。

他方、液体での微量反応を実現するためには、特に、特定の溶質を含む反応媒体を含む液を如何に区分し、区分された反応媒体を含む液を他の溶質を含む反応媒体と如何に接触させるかにある。

液滴を作成して液滴に細胞や溶質を溶かし込み種々反応を行う技術が特願２００３‐１３９７７３に記載されている。液滴を容器として利用するのは微量反応を行うには合理的である。このためには複数の液滴を試験管に見立て、これを所定のタイミングで混ぜ合わせ、反応を開始する必要がある。このためには液滴を所定の位置まで搬送する必要がある。

上記特許出願には、液滴を搬送する方法として帯電した液滴を２枚の対向する電極の間を通し、２枚の電極に直流電界をかけることで細胞を任意の方向に打ち出す技術が開示されている。しかし、液滴の移動は初期に電極により与えられるエネルギーで移動するのみであり、より安定な液滴搬送を行うには、液滴の移動速度を制御したり液滴を停止させたりする技術を開発する必要がある。特に液滴が複数である場合、たとえば、異なる溶質を含む数十個の液滴が液滴のサイズの倍程度の間隔で並んでいるアレーから、任意の液滴のみを隣接する液滴に影響を受けず、あるいは、与えずに移動させるのに最適な液滴搬送技術はいまだ実現していない。

本発明は、基板上に密に並んだ液滴群から任意の液滴のみを所定の位置に移動させるに信頼のできるシステムと方法を提供することを目的とする。

本発明の液滴操作は、以下のように実現される。まず、絶縁体表面の全域が撥水性とされている基板上に、マトリックス状に配列された親水性の液滴移動ラインを形成し、これらのラインの両端部に親水性の液滴保持領域を形成する。液滴保持領域に液滴を形成し、移動させたい液滴のみを荷電する。荷電された液滴に、液滴の荷電と同じ極性の静電気を持つ電極を近接させて、液滴と電極との間の反発力で、親水性の液滴移動ライン上を移動させる。移動させた液滴は親水性の液滴保持領域で停止させ、この位置で除電し安定に保持する。移動させた液滴は、この液滴保持領域で他の液滴に接触させて、反応させる。

本発明では、基板上の液滴を自由に移動することを可能にしたことにより、基板上で液滴を接触させ、液滴中の基質や反応性生物の濃度をコントロールすることができ、したがって、一連の化学反応を液滴を容器として利用する微量反応を実現できる。すなわち、種々化学物質や細胞を保持する液滴を自在の組み合わせで反応させるハイスループットスクリーニングチップやマルチプルマイクロリアクターを実現できる。

（実施例１）
図１（ａ）は、本発明の液滴操作に適用できる基板の斜視図、（ｂ）は、基板表面に、反応させる個々の液滴を保持した状態を示す基板の斜視図、（ｃ）は液滴操作の状態を模式的に示す基板の斜視図である。

図１（ａ）において、１００は基板であり、絶縁体でできている。基板１００の表面の全域は撥水性とされている。また、基板１００の表面には、親水性の液滴移動ライン２３，２４のマトリックスが作成されている。液滴移動ライン２３，２４のマトリックスの両端には親水性の液滴保持領域ａ，ｂ，−−−，ｐおよび親水性の液滴保持領域１，２，−−−，１６が作成されている。ここでは、親水性の液滴保持領域ａ，ｂ，−−−，ｐおよび親水性の液滴保持領域１，２，−−−，８は、反応させる個々の液滴を保持する液滴保持領域として利用し、親水性の液滴保持領域９，１０，−−−，１６は、液滴を衝突させて反応を起こさせた合体後の液滴を保持する液滴保持領域とする。ここで、想定される液滴量は０．１〜１μｌとし、液滴保持領域は、たとえば、３０μｍφのドット状の親水性領域とする。また、液滴の移動のパスとなる親水性ライン２３，２４は２μｍ幅とする。液滴は、液滴保持領域から、静電気による力を受けてこの親水性ライン２３，２４の上に押し出され、この上を転がることができる。１０１は、位置合わせマークである。

液滴保持領域に形成された液滴が静電気による力を受けるためには、液滴が帯電している（荷電されている）ことが必要である。この荷電は、たとえば、Micro Total Analysis Systems 2004, vol. 1, pp. 144-146 （Proceedings of μTAS 2004, 8^th International Conference on Minitualized Systems for Chemistry and Life Sciences, ISBN 0-85404-643-7）記載の方法を改良して用いる。図２（ａ）、（ｂ）は液滴保持領域で液滴を荷電させる手順を示した図であり、図２（a）は液滴を帯電させる初期の段階の状態を、図２（ｂ）は液滴が帯電させられて液滴保持領域に移った状態を示す図である。

基板１００は絶縁体であり、２０１は図１で説明した液滴保持領域であり、この領域に液滴２０４が形成されているものとする。液滴保持領域２０１に対応する基板１００の背面に電極１１２が設けられている。液滴保持領域２０１の上には、液滴２０４に自由に接触できるキャピラリー２１０があり、キャピラリー２１０内部には導電性の溶液２１１が充填されており、キャピラリー２１０の反対側において電極２１２と接している。電極１１２と電極２１２に所定の電圧をかけ、キャピラリー２１０先端の溶液２１１と液滴２０４とを接触させる。その結果、電極１１２が正極、電極２１２が負極になるように電圧が印加された場合には、液滴２０４とキャピラリー内部溶液２１１は全体として分極し、液滴２０４にはマイナス荷電２２１が過剰になる。この状態でキャピラリー２１０を速やかに引き上げ、液滴２０４から離すと、図２（ｂ）のように液滴２０４はマイナスに帯電する。逆に、電極１１２が負極、電極２１２が正極になるように電圧が印加された場合には、液滴２０４をプラスに帯電させることができる。この電極１１２、電極２１２間に印加する電圧は、後述するように、スイッチボード７４のスイッチ１１５を介して印加するかしないかを決めることができる。

図３（ａ）は基板１００の液滴保持領域の荷電用電極部分とスイッチボード７４との関連を示す断面図であり、（ｂ）は基板１００の液滴保持領域の除電用電極部分とスイッチボード７４との関連を示す断面図である。すなわち、図３（ａ）は反応させる個々の液滴を保持する液滴保持領域である親水性の液滴保持領域ａ，ｂ，−−−，ｐおよび親水性の液滴保持領域１，２，−−−，８の電極部分を示す断面図、（ｂ）は液滴を衝突させて反応を起こさせる液滴、および反応して合体した後の液滴を保持する液滴保持領域である親水性の液滴保持領域９，１０，−−−，１６の電極部分を示す断面図である。

図３（ａ）に示すように、反応させる個々の液滴を保持する液滴保持領域２０１_１には、この領域の基板１００の背面に、電極１１２_１が設けられる。したがって、液滴保持領域２０１_１に液滴が形成されたとき、液滴と対応する位置の基板１００の背面にある電極１１２_１が対峙することになる。一方、基板１００の背面にはスイッチボード７４が設けられる。スイッチボード７４の、基板１００の背面の電極１１２_１に対応する位置には接続電極１１４_１が設けられ、基板１００をスイッチボード７４に載置したとき、対応する位置の電極１１２_１と接続電極１１４_１が接続される。接続電極１１４_１は、それぞれ、選択的に開閉できるスイッチ１１５を介して電源１１６と接続される。スイッチ１１５を閉じて、図２（ａ）、（ｂ）で説明したように、液滴保持領域２０１_１の液滴と電極１１２_１との間に電圧を印加すると、この液滴は荷電される。図では、スイッチ１１５が独立したものとして表示されているが、これは、スイッチボード７４をシリコン基板として、半導体回路により構成して、オン、オフ制御を後述するパソコン７６により制御するものとしても良い。

図３（ｂ）に示すように、同様に、液滴を衝突させて反応を起こさせた合体後の液滴を保持する液滴保持領域２０１_２では、液滴と接触するように、電極１１０が設けられる。これらの電極１１０は、基板１００の背面の対応する位置に設けられた電極１１２_２と接続線１１１で接続される。スイッチボード７４の電極１１２_２に対応する位置には接続電極１１４_２が設けられ、基板１００をスイッチボード７４に載置したとき、対応する位置の電極１１２_２と接続電極１１４_２が接続される。接続電極１１４_２は接地されている。したがって、これらの液滴保持領域２０１に液滴が入ると液滴は電荷を失い、安定に保持される。実施例のスイッチボード７４や回路の静電容量を極力小さくしなければならないことは言うまでもない。

図１（ｂ）には、基板１００の液滴保持領域ａ，ｂ，−−−，ｐおよび親水性の液滴保持領域１，２，−−−，８に液滴が形成された状態を示す。この液滴形成は、例えば、以下のようにして行う。

図４は、細胞６２を含む液滴をピペット６１の先端に形成し、これを光学的にモニターしながら基板１００の液滴保持領域に分配する構成を模式的示す図である。６９はＸＹ方向に駆動されるステージであり、７７はステージ６９の駆動装置である。ステージ６９の上面には上述したスイッチボード７４が設けられ、この上面に基板１００が載置される。基板１００の上部には、細胞６２を含む懸濁液６３があらかじめ吸い上げられて保持されているピペット６１が配置される。ピペット６１は、液滴に含むべき細胞が変更されるときは、新しいものと交換され、汚染を防止する。ピペット６１の根元部には、チューブ８０を介してシリンジポンプ８１が設けられ、シリンジポンプ８１には駆動装置８２が取り付けられている。シリンジポンプ８１が駆動装置８２により駆動されると、ピペット６１内の懸濁液６３が細胞６２とともに押し出される。なお、ピペット６１の根元部とチューブ８０との接続部が離れたように図示されているのは、ピペット６１を拡大して表示するためであり、分離されているわけではない。

一方、ピペット６１の先端部には、ピペット６１の先端部に培養液を供給するための他のピペット７０の先端が配置される。ピペット７０の根元部にはチューブ８４を介してシリンジポンプ８５が設けられ、シリンジポンプ８５には駆動装置８６が取り付けられている。シリンジポンプ８５が駆動装置８６により駆動されると、シリンジポンプ８５内の培養液がピペット７０から押し出される。

また、ピペット６１の先端部に形成された液滴を基板１００の液滴保持領域に移すためのピペットの上下動駆動装置８７が設けられる。ここでは、上下動駆動装置８７はピペット６１に連係するものとする。上下動駆動装置８７に、使用者により、ピペット６１を下げる信号が与えられると、ピペット６１は下に動き、ピペット６１の先端部に形成された液滴を基板１００の液滴保持領域に移す。上下動駆動装置８７に、使用者により、ピペット６１を復旧させる信号が与えられると、ピペット６１は図に示す位置に戻る。ピペット６１の図に示す位置への復旧は、下げ操作から、パソコン７６により、タイムシーケンシャルに行われるものとしても良い。一点差線８９は上下動駆動装置８７とピペット６１との連係を意味する。

さらに、ピペット６１の先端部の近傍の内部および先端部に形成される液滴の大きさをモニターするための光学系を構成する光源６６、集光レンズ６７が設けられ、これに対向する位置で基板１００の下部にコリメートレンズ６８およびモニター７５が設けられる。したがって、基板１００、スイッチボード７４およびステージ６９は、光学的に透明である必要がある。７６は、いわゆる、パソコンであり、モニター７５からの入力信号に応じて、あらかじめ格納してある所定のプログラムから得られる制御信号、および、使用者がモニター７５の表示画面を見ながら与える操作入力信号７８に応じて駆動装置７７，８２，８６および８７に必要な信号を与える。なお、ここでは、図示しなかったが、モニター７５の検出している画面と同一の表示をパソコン７６のモニターに表示するのが便利である。そうすれば、モニター７５は、小型のＣＣＤカメラとすることができる。また、操作入力信号７８は、パソコン７６の入力装置を介して与えられるものである。

ここで、ピペット６１のサイズについて考えると以下のようである。ピペット６１は、その先端に、必要な細胞数を持つ適当な大きさの液滴を構成できるようにすることが必要である。一方、ピペット６１内には、細胞を含む懸濁液６３をピペット６１で吸い上げてから使用するが、液滴を構成するときに、ピペット６１の先端を通過する細胞がモニター７５で誤り無く検出できることが必要である。したがって、ピペット６１の先端部の直径は細胞１個あるいは所定の細胞数の塊が通過するのを許すが、計数できないほどの細胞が、一度に通過できないものとする。すなわち、現在、汎用的に使用されている培養用ピペットのように径が太いものではなく、透明で、先端部の直径が、一般的な動物細胞用として２０〜１００μｍ、バクテリアなどの微生物用では５μｍ程度とするのが良い。

基板１００の液滴保持領域に細胞６２を分配する操作について以下説明する。まず、システムが起動されると、使用者は、図１に示したマーカー１０１に着目して基板１００が所定の起動位置にあるように位置決めする。次に、細胞６２の最初の分配位置をピペット６１および７０の先端部に対応する位置に移動させる操作入力信号７８に応じて、駆動装置７７によりステージ６９を操作する。基板１００が所定の位置まで来ると、ピペット６１内部の細胞懸濁液６３を細胞６２とともに排出する操作を行う。この際、ピペット６１の先端部の外側と先端部近傍の内部を光源６６とモニター７５からなる光学系で監視する。モニター７５の出力をパソコン７６に取り込み、パソコン７６の画像演算結果をもとに駆動装置８２を動作させて、シリンジポンプ８１の送液を制御することができる。

モニター７５でピペット６１の先端を監視しながら、駆動装置８２を動作させて、シリンジポンプ８１を動かし、細胞６２を含む懸濁液６３をピペット６１の先端から排出して、ピペット先端に液滴を形成する。このとき、液滴中に所定の細胞数が挿入されたことをモニター７５を通してパソコン７６が認識し、駆動装置８２に停止指令を出して、シリンジポンプ８１を停止させる。

以下、説明をシンプルにするため、液滴に挿入される細胞６２の数は１個として説明するが、細胞数は目的に応じて任意に使用者が決めればよい。たとえば、１０個でもよい。細胞６２の認識は、ピペット６１の先端部の液滴７１中に存在する細胞６２を直接検出するだけでも良いが、より効率的には、ピペット６１の内部を移動する細胞６２をモニター７５で監視し、パソコン７６で細胞のピペット内での位置と移動速度を計算し、ピペット６１の先端から液滴２１内に排出される時を予測してシリンジポンプ８１を制御してもよい。後者の認識方法を用いれば、たとえば短い間隔で複数の細胞がピペット内を移動している場合などに細胞を１個だけ液滴の中に入れる場合に有利となる。

ここで、細胞懸濁液６３の細胞濃度が低いときは、細胞がピペット６１の先端から出る直前に液滴７１を形成し始め、所定時間後に液滴形成を停止すれば、液滴７１の大きさを一定にすることができる。液滴を形成したくないときは、たとえばブロアーでピペット６１の先端から出てくる液を吹き飛ばせばよい。あるいは、基板１の外にドレインを設け、そこに排出してもよい。

一方、細胞懸濁液６３の細胞濃度が高いと、ピペット６１から排出される液量がまちまちとなる。すなわち、ピペット６１から排出される細胞６２の排出の頻度が上がるから、液を排出させる時間を所定の時間に固定していると、その時間内に次の細胞が液滴７１の中に入ってしまう可能性がある。このようなケースでは、ピペット７０を用いる。ピペット７０とこれに連結されたシリンジポンプ８５には、培養液あるいは細胞希釈液のみが入れられている。すなわち、モニター７５を通して細胞６２が液滴２１に入るのをパソコン７６が確認したとき、駆動装置８２に停止指令を出して、シリンジポンプ８１を停止させるとともに、このときまでに液滴７１を形成するのに駆動されたシリンジポンプ８１の繰り出し量から、その時点の液滴７１の体積を割り出す。この体積と液滴７１の所望の体積との差をパソコン７６で計算する。この計算結果に応じて、その時点に出来ている液滴７１にピペット７０で培養液あるいは細胞希釈液を加えるように、パソコン７６から駆動装置８６に動作信号を送り、シリンジポンプ８５を駆動して、ピペット７０を用いて液滴２１の体積が所定の値になるまで液を加える。

このとき、ピペット７０に液滴中の細胞が逆流しないように、ピペット７０の先端は細胞が通らない大きさ、たとえば０．２μｍφとするのが良い。あるいは、先端が０．２μｍのフィルター構造を有するものとするのが良い。

このようにして作成した細胞が１個含まれる液滴７１は、ピペット６１の上下動駆動装置８７により、ステージ６９の上に置かれた基板１００の上の細胞保持領域に接触させられ、液滴７１は基板１００の細胞保持領域に移動する。細胞６２を含む液滴７１が基板１００の細胞保持領域、すなわち、基板１００の液滴保持領域に移動したことが確認されると、使用者は操作信号２８を与えて、ステージ駆動装置７７を動かし、次の液滴を置く位置にピペット先端が位置するように、基板１００を移動させる。この移動は、親水性領域４の配置の情報をパソコン７６に与えておけば、パソコン７６によって自動的に行うことができる。そして、この新しい位置で、上述のようにしてピペット６１の先端に新たな液滴を形成し、基板１００の液滴保持領域に移動させる。これを繰り返して、基板１００の液滴保持領域の必要な部位に液滴を置く。形成する液滴が細胞等を含まないものであれば、液滴のサイズを調整するためのピペット７０とこれの関連のものは必要ない。

図１（ｃ）には、基板１００の液滴保持領域ａ，ｂ，−−−，ｐおよび親水性の液滴保持領域１，２，−−−，８に液滴が形成された状態から任意の液滴を合体させ、反応を起こさせる手順の概念を示す。図１（ｃ）では、液滴保持領域３に有った液滴１０２が液滴保持領域１１に移されて電荷を放出した状態にあり、液滴保持領域ｃにあった負に帯電した液滴１０３が、液滴保持領域ｅから伸びている液滴移動ラインと液滴保持領域３から伸びている液滴移動ラインの交点の位置まで移動している状態を、液滴保持領域ｌにあった負に帯電した液滴１０５が、液滴保持領域ｌから伸びている液滴移動ライン上を移動している状態を示している。これらの、帯電している液滴を移動させるのは、負に帯電させられている操作棒１０７による。操作棒１０７は、移動させるべき液滴と同じ極性の電荷で帯電しているから、液滴を移動させたい方向の液滴の背後から液滴に接近させるだけで、非接触により、移動させることができる。他の液滴は、たとえ、隣接していてもチャージアップされていないので動くことは無い。なお、図では、液滴１０３，１０５が、ともに、移動途中のように示したが、液滴の移動は、一つずつ行う。操作棒１０７による液滴の移動をより詳細に述べると以下のようである。

図５は、図１に示される液滴移動ラインの一つの上で、操作棒１０７により液滴１０５を移動させている状態を模式的示す図である。この場合、ピペット６１を帯電している絶縁性の操作棒１０７に置換し、図４で説明した液滴の形成と同様に、モニター７５により操作棒１０７の先端部と液滴１０５とを監視しながら、操作信号７８により、上下動駆動装置８７により、操作棒１０７の上下動を制御し、操作棒１０７と液滴１０５が接触しないように注意しながら、ステージ６９の移動方向を制御する。ここでは、上下動駆動装置８７は、上下動の単純動作のみとして説明したが、例えば、図１(ｃ)を参照して明らかなように、移動させられる液滴は、方向転換も必要であるから、駆動装置８７は、これらの機能にも対応しやすいものとするのが良い。すなわち、液滴に対する力が常に背後から作用するのに好適な位置と形を取れるようにするのである。

操作棒１０７と液滴１０５との反発力に押されて移動した液滴１０５は親水性の液滴保持領域間で移動されると、接地された電極に接触することになるから、電荷を失い、エネルギーの低い位置に自動的に停止する。駆動装置８７は、この段階で、操作棒１０７を上に持ち上げ、液滴１０５と接触するのを避ける。

図５では棒状の操作棒１０７で液滴操作を行うが、液滴の移動の方向制御や停止などには、図６に示すリング状の操作棒１０７’の構造がより実用的である。たとえば親水性ライン２３、２４にそってマイナスに荷電した液滴１０５を移動させる場合、マイナスにチャージしたリング状の操作棒１０７’のリング内に液滴が来るように液滴上部からリングを下ろす。液滴１０５と操作棒リング１０７’はともにマイナスに荷電しているため、液滴はリング内の中央近傍に安定してとどまる。このためリングを移動させると液滴もリングの中央近傍に保持されたまま移動する。図５に示した棒の場合は液滴を後ろから押す形となるために移動方向に対して左右のぶれを防ぐことができない。このため、棒の移動速度が速いと液滴が親水性ラインから外れてしまう可能性が否定できない。また、停止位置も基板側との相互作用で安定な位置に止まるが、速度が速いと慣性で液滴が泊まりきれないことも起こりうる。これに対してリングを用いると平面方向の全周囲から液滴を保持して移動することになるので、親水性ラインから脱線したり、慣性で停止位置で止まりきれなかったりする事故を低減できより確実な液滴搬送が可能となる。

なお、実施例１では、基板上の液滴位置の確認には基板を観察する光学系を構成する光源６６、集光レンズ６７、これに対向する位置で基板１００の下部にコリメートレンズ６８およびモニター７５を用いることとした。このため基板１００には透明の材質を用いることが求められる。あるいは、薄層のシリコン基板を用い、観察に用いる光としては水に吸収のある赤外領域の波長を用いることで容易に液滴の位置を確認できるようになる。もちろん、基板上面から実体顕微鏡のような光学系を用いることとすることもでき、より自由な基板組成を用いることができる。光学系については、後述する実施例２，３でも同様である。

このように移動させ、停止した液滴に、別の液滴を同様に移動させて、衝突させて種々反応を起こさせることができる。あるいは、細胞を一個ずつ液滴に封入したものをアレー状に並べた細胞ストアーと種々化学物質などを含む液滴のアレーを準備し、細胞と液滴の任意の組み合わせの細胞と反応液を反応部に移動させ細胞に対する化学物質の影響を調べるなどの使い方ができる。

(実施例２)
実施例２では液滴の帯電方法の他の例について説明する。実施例２では、液滴に帯電粒子を打ち込む方法を取るので、実施例１の電荷を付与するための電極１００およびこれに関連する接続線、電極、スイッチボードおよび電源は不要である。

図７は、図１に示される基板１００の液滴保持領域に、図４で説明したのと同様に形成された液滴に電荷を付与するための構成と操作法を説明する図である。液滴３３_１，３３_２，−−−，３３_８が親水性の液滴保持領域３２の上に静止している。この状態では液滴は電荷を持っていない。任意の液滴３３_４を帯電させるには、帯電粒子打ち込み装置２００を用いる。帯電粒子打ち込み装置２００は溶液４５を送り込むガス加圧装置４０、溶液保持容器４１、電極４２_１と４２_２、電源部４３、ソレノイドバルブ４４からなる。溶液保持容器４１は先端部の出口４６が導電性で電源部４３と電極４２_１を介して接続されているが、溶液保持容器４１や回路全体は電気的に浮いた状態で接地から絶縁されている。溶液保持容器４１は一部中の様子がわかるように図示してある。電源は電源４３_１とコンデンサー４３_２、閉塞器４３_３とその他の回路で構成されている。ここで、帯電粒子打ち込み装置２００は、図４で説明した液滴の形成手段の上段に設けられることができるので、液滴の形成後に、液滴の形成手段を待避させた後、図５の状況にすることができる。また、ここでは、液滴の形成手段の光学系の基板より下側の部分のみを利用している形としているが、上側の部分が帯電粒子打ち込み装置２００の邪魔にならない構造にすることにより、光学系は同じものとすることができる。

ソレノイドバルブ４４および閉塞器４３_３は、図４で説明したパソコン７６により、同期して作動させるシーケンスとなっている。パソコン７６により、まず、コンデンサー４３_２に電源４３_１により、静電蓄電される。閉塞器４３_３は開いているので、電極４２_１と４２_２間には電界がかからない。溶液保持容器４１は常にガス加圧装置４０で加圧されているが、この状態ではソレノイドバルブ４４により出口４６が閉じているので液滴４８が打ち出されない。パソコン７６の指令によりソレノイドバルブ４４を瞬時開くと、溶液保持容器４１は加圧されているので、溶液が出口４６から打ち出される。液滴４５が出口４６から離れる直前にパソコン７６指令により閉塞器４３_３を閉じる。すると、出口４６はマイナスに帯電し、電極４２_２はプラスに帯電する。これにより出口４６から離れる液滴４８も帯電する。プラス電極４２_２にはスリット４７が開いており、帯電した液滴４８はスリット４７を通過して基板１００上の液滴３３_４に衝突する。このため、液滴３３_４自体もマイナスに荷電される。一つの液滴の荷電が終わった後、モニター７５で監視しながら、ステージを移動させて、他の必要な液滴を荷電することができる。

液滴３３のシリーズの体積は０．１〜１μｌであるので、液滴３３に打ち込むための帯電液滴４８の大きさも、それに比べて十分小さい必要がある。このような微小液滴を作成する技術は既存のものを使用すればよい。ソレノイドバルブ４４を用いる方法はナノリットルレベルの液滴を作成することができる技術で、すでにＤＮＡマイクロアレーの作成装置として実用化されている。この技術をそのまま使用してもよい。あるいは、既存のセルソーターで用いられているようなソレノイドバルブの代わりにピエゾなどの振動子を用いて液滴を作成する技術を用いてもよい。

(実施例３)
実施例２では、帯電液滴４８が帯電粒子打ち込み装置２００の直下の液滴に打ち込まれるから、帯電粒子の打ち込みの標的となる液滴３３の選択には、ステージを移動させる（または、帯電粒子打ち込み装置２００を移動させる）ことが必要である。実施例３では、液滴に打ち込む粒子が荷電されていることに着目して、荷電液滴の飛翔をコントロールするものとした。

図８は、図１に示される基板１００の液滴保持領域に、図４で説明したのと同様に形成された液滴に電荷を付与するために荷電液滴５８の飛翔をコントロールする構成と操作法を説明する図である。荷電液滴５８を打ち込むべき液滴３３_１，３３_２，−−−，３３_８が親水性の液滴保持領域３２の上に静止している。電極４２_１と４２_２間に電界を掛けた状態で荷電液滴５８を打ち出し、偏向電極５１_１と５１_２の板の間に電界を掛ける。たとえば、液滴５８がマイナスに荷電しているとすると、偏向電極５１_１側がプラスになるように電界を掛ける。荷電液滴５８の打ち込まれる液滴位置に応じて、偏向電極５１_１と５１_２の板の間の電界の大きさを制御することで、荷電液滴５８を打ち込むべき液滴を任意に選択することができる。一方、たとえば、電界は３０００Ｖで常に掛けておき、偏向電極５１_１を偏向電極５１_１’のように角度を変えるように制御するものとすることもできる。偏向電極５１_１のときは荷電液滴５８にかかる電界強度が大きくなるので液滴５８は外側の液滴３３_１の方に打ち込まれる。角度が５１_１’のようなときには電界が小さくなるので液滴３３_２に荷電液滴５８が打ち込まれる。同様に電極５１_２の位置を変えることで液滴３３_４や３３_５に自在に荷電液滴５８を打ち込むことができる。電極５１に加える電圧の大きさ、あるいは、電極５１の角度、荷電粒子の放出等の制御は、パソコン７６で行う。

（（ａ）は、本発明の液滴操作に適用できる基板の斜視図、（ｂ）は、基板表面に、反応させる個々の液滴を保持した状態を示す基板の斜視図、（ｃ）は液滴操作の状態を模式的に示す基板の斜視図である。（ａ）、（ｂ）は液滴保持領域で液滴を荷電させる手順を示した図であり、（a）は液滴を帯電させる初期の段階の状態を、（ｂ）は液滴が帯電させられて液滴保持領域に移った状態を示す図である。（ａ）は基板１００の液滴保持領域の荷電用電極部分とスイッチボード７４との関連を示す断面図であり、（ｂ）は基板１００の液滴保持領域の除電用電極部分とスイッチボード７４との関連を示す断面図である。細胞６２を含む液滴をピペット６１の先端に形成し、これを光学的にモニターしながら基板１００の液滴保持領域に分配する構成を模式的示す図である。図１に示される液滴移動ラインの一つの上で、操作棒１０７により液滴１０５を移動させている状態を模式的示す図である。図１に示される液滴移動ラインの一つの上で、操作棒１０７により液滴１０５を移動させている状態を模式的示す他の図である。図１に示される基板１００の液滴保持領域に、図４で説明したのと同様に形成された液滴に電荷を付与するための構成と操作法を説明する図である。図１に示される基板１００の液滴保持領域に、図４で説明したのと同様に形成された液滴に電荷を付与するために荷電液滴５８の飛翔をコントロールする構成と操作法を説明する図である。

符号の説明

１００…基板、２３，２４…親水性の液滴移動ライン、１，２，−−−１６，ａ，ｂ，−−−，ｐ…親水性の液滴保持領域、８４，８０…チューブ、３２…液滴保持領域、３３_１，３３_２，−−−，３３_８…液滴、４０…ガス加圧装置、４１…溶液保持容器、４２_１，４２_２…電極、４３_１，４３_２…電源部とコンデンサー、４４…ソレノイドバルブ、４５…溶液、４６…出口、４３_３…閉塞器、６１，７０…ピペット、６２…細胞、６３…懸濁液、６６…光源、６７…集光レンズ、６８…コリメートレンズ、７４…スイッチボード、７５…モニター、７６…パソコン、７７…ステージ６９の駆動装置、８１，８５…シリンジポンプ、８２，８６，８７…駆動装置、１０１…位置合わせマーク、１０７，１０７’…操作棒、１１０，１１２，１１４…電極、１１１…接続線、１１６…電源、２００…帯電粒子打ち込み装置。

Claims

表面の一つが撥水性とされた絶縁性の基板と、
該基板の撥水性の表面に形成された複数の親水性の液滴保持領域と、
前記基板の前記親水性の液滴保持領域から延伸されて形成された親水性の液滴移動ラインと、
前記基板の前記親水性の液滴保持領域に液滴を形成する液滴形成装置と、
前記基板の前記親水性の液滴保持領域に保持された液滴を選択的に荷電する荷電装置と、
前記荷電された液滴の電荷と同じ極性の電荷を作用させ、前記荷電された液滴の電荷と反発力を生じさせる操作棒と、
を有する液滴操作装置であって、
前記基板の前記親水性の液滴保持領域の内の特定の液滴保持領域は液滴を荷電および除電できる構造であり、
前記基板の前記親水性の液滴保持領域に保持された液滴を選択的に荷電する荷電装置は、液滴の接する絶縁基板に前記液滴とは直接接しない静電的な第１の電極と、液滴に接することのできる溶液を保持するキャピラリーで該キャピラリー内液に直接接する構造の第２の電極からなり、液滴とキャピラリー内部の液を分極させることで前記液滴部分を荷電することを特徴とする液滴操作装置。
前記基板の前記親水性の液滴保持領域の内の特定の液滴保持領域は液滴の荷電を除電できる構造は、前記液滴保持領域に設けられた電極が接地されたものである請求項１記載の液滴操作装置。
前記基板の下部に配置され、前記基板が載置されたとき、前記基板の前記親水性の液滴保持領域に設けられた電極を接地するスイッチボードを備える請求項１又は２記載の液滴操作装置。
請求項１〜３のいずれかに記載の液滴操作装置を用いて、撥水性とされた絶縁性の基板上の親水性のパターン上に形成された複数の液滴を荷電し、該荷電された液滴に、該液滴と同じ極性の荷電された可動棒を近接させて、両者の反発力により、前記液滴を前記パターンに沿って移動させることを特徴とする液滴操作方法。
前記移動された液滴が、所定の位置で除電され、当該位置に移動された他の液滴と合体される請求項４記載の液滴操作方法。
表面の一つが撥水性とされた絶縁性の基板と、
該基板の撥水性の表面に形成された複数の親水性の液滴保持領域と、
前記基板の前記親水性の液滴保持領域から延伸されて形成された親水性の液滴移動ラインと、
前記基板の前記親水性の液滴保持領域に絶縁層を介して設けられた荷電用電極と、
前記基板の他の親水性の液滴保持領域内に設けられた電極に対応し、絶縁層を介して設けられた、該電極と電気的に接続された除電用電極と、
前記液滴を形成するためのキャピラリーであって、前記液滴に接することができる電極を備えたキャピラリーと
を備え、
前記荷電用電極と前記キャピラリーの前記電極とを用いて前記液滴を分極させることによって該液滴を荷電させることができる、液滴操作のためのシステム。
さらに前記荷電用電極および前記除電用電極のそれぞれと接触する電極を備えたスイッチボードを備え、前記荷電用電極と接触する電極は電源と接続可能であり、前記除電用電極と接触する電極は接地される、請求項６に記載のシステム。