JP2023528238A - 微小液滴を操作する装置および方法の改善 - Google Patents

Abstract

接着細胞をマイクロビーズに接合することにより、微小液滴アッセイシステムにおいて接着細胞を処理する方法が提供される。方法５０は、第１の複数の微小液滴をマイクロ流体空間にロードする工程であって、第１の微小液滴の各々は、マイクロビーズと第１の流体とを含む工程（５２）と；第２の複数の微小液滴をマイクロ流体空間にロードする工程であって、第２の微小液滴の各々は、接着細胞と第２の流体とを含む工程（５４）と；第１の複数の微小液滴と第２の複数の微小液滴とを融合させ、複数の融合微小液滴を形成する工程であって、各融合微小液滴は、第１および第２の流体と、少なくとも１つのマイクロビーズと、少なくとも１つの接着細胞とを含む工程（５６）と；融合微小液滴の各々を撹拌し、少なくとも１つの接着細胞が少なくとも１つのマイクロビーズに接着するように、融合微小液滴の各々内の第１および第２の流体を動かす工程（５８）とを含む。【選択図】図１

Description

本発明は、微小液滴を操作する方法およびシステム、特に、微小液滴アッセイシステムにおいて細胞を処理する方法およびシステムに関する。本発明は、接着細胞をマイクロビーズに接合することにより、微小液滴アッセイシステムにおいて接着細胞を処理する方法にも関する。

ヒトおよび／または動物組織に由来する細胞は、薬剤のスクリーニングのために機能細胞または組織類似体を生成するために、研究開発ツールとして使用するため、特に、ウイルスベクターおよびワクチン、ならびにさまざまな治療用タンパク質の産生のため、培養下で操作されうる。

哺乳類細胞は、ウイルス感染によって薬剤を作り出し、遺伝子操作によって治療用タンパク質を作り出すために作成されうる。これらの薬剤の多くは、タンパク質の標準形が欠けているか、それを十分な量作り出すことができない患者にとって必要なものである。

このような細胞の成長には、糖、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、ならびにインスリンおよびさまざまなサイトカインなどの成長因子を含む栄養素の混合物を含む複雑な環境が必要である。さらに、血流またはリンパ系に元々備わっているいくつかの細胞型を除いて、組織に由来する細胞は、足場依存性であり、これは浮動性の個別細胞としては成長しないことを意味する。従って、組織環境から切り離された後、細胞は、接着する表面を必要とし、それがなければ生存して分裂することができなくなる。

例えば、臓器オンチップアプリケーションにおいて、従来のマイクロ流体技術内で接着細胞を培養する方法が知られている。具体的には、接着細胞の培養を試みる既存のプレートベースのワークフローがある。このようなマイクロ流体システムは、流体の流れが微細構造チャネルにより定められ、制御される、連続流マイクロ流体技術を含むことができる。このようなマイクロ流体システムは、別々の量の流体が個々に操作される、デジタルマイクロ流体技術も含むことができる。デジタルマイクロ流体技術の１つのクラスは、「誘電体上のエレクトロウェッティング（ＥｌｅｃｔｒｏＷｅｔｔｉｎｇ Ｏｎ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ）」（ＥＷＯＤ）デバイスと、参照により援用されるＷＯ２０１８／２３４４４５で開示されたものなど、光学ＥＷＯＤデバイスのサブクラスとを含む。このようなデバイスは、マイクロ流体チップの周囲の、任意に油性キャリア相により取り囲まれた、細胞培地の液滴の制御運動を可能にする。しかしながら、このようなプラットフォームにおいて接着細胞の成長を成し遂げるためには、液滴の内容物と、チップデバイス上の何らかの培養領域とを制御可能に接触させる必要があり、従来の液滴を処理するマイクロ流体プラットフォームで成し遂げるには手間がかかる。

デジタルマイクロ流体技術における接着細胞の培養についての開示は限られていた。例えば、先の開示では、電極の配列を有するラブオンチッププラットフォームにおいて従来のエレクトロウェッティングを使用し、哺乳類細胞の培養を実施することが説明されている。しかしながら、このようなプラットフォームは、作動に使用される固定電極のサイズが大きいため、同時に操作できる細胞の数が制限される。同じ理由から、このようなプラットフォームは、通常、サブナノリットル体積で包まれた個別細胞を操作するのには適していない。さらに、固定電極の位置およびサイズにより、このようなシステムの柔軟性および適応性が制限される。

他の開発においては、マイクロビーズキャリアから形成された固体支持体上への細胞の接着が広く知られており、マイクロビーズが細胞接着のための表面積を増加させる、スケールアップした生物学的生産のためにこれまで使用されている。しかしながら、従来の液滴プラットフォームを使用して、固体のマイクロビーズを接着細胞と結び付けることは、特に単一細胞レベルでの作業は、難易度が高い。各細胞が明確な数のビーズにさらされるように、制御と並行して多数の液滴の融合を実施することはできない。接着細胞の成長は接着した支持体上で利用可能な表面積に依存しているため、接着細胞株を培養するとき、各細胞がさらされる明確な数のビーズを制御できることが重要である。従って、各マイクロビーズに接着した細胞の数は、最適な接着細胞培養のため、正確に制御されなければならない。液滴がチャネル内でインキュベートまたは保存される機器は、ガスの供給が制限されるため、細胞生存能力のレベルが低い。

多くの重要なアッセイに関して、接着細胞は、表現型形質についてスクリーニングされた後、マイクロ流体システムから回収されなければならない。いくつかのアッセイにおいては、この目的は、ＤＮＡシークエンシング、ＲＮＡシークエンシング、またはＰＣＲ検出を含みうる、遺伝分析を実施することである。いくつかのアッセイにおいては、この回収の目的は、回収された物質から細胞のコロニーを拡大させることであり、クローンコロニーが、回収された単一の細胞から拡大される場合も含む。接着細胞がコロニーに成長する必要があるとき、接着細胞は、回収後、接着状態にならなければならない。接着細胞がオンチップで成長し、拡大のために回収される、任意の他のマイクロ流体システムにおいて、接着細胞は、チップから外への輸送のため、一時的に浮遊状態に引き戻され、続いて、マイクロウェルプレートまたはフラスコでの成長のため、接着状態に戻されなければならない。細胞が接着状態と浮遊状態との間を移るたびに、その過程が細胞にストレスをもたらし、細胞生存能力を低下させ、細胞の発現プロファイルを変化させる。そのため、回収の過程およびそれに関連した再浮遊は、マイクロ流体細胞培養システムの既知の欠陥となっており、細胞を接着状態でマイクロ流体システムから回収できるシステムを有することは、非常に有利となる。

従って、効率的で、迅速な、費用効果の高い方法で、マイクロビーズなどのビーズ上に接着細胞を付着させ、成長させ、および／または分注する方法および装置を提供することが要求されている。方法および装置は、多数の液滴が並行して融合されるときでも、各接着細胞が明確な数のビーズにさらされるように、液滴融合工程中に十分な制御を維持すべきである。接着細胞のマイクロビーズへの付着およびマイクロビーズからの分離を制御する効率的な方法を提供することにより、細胞の付着および増殖を推進し、高いスループット環境において標的細胞の制御成長を可能にすることができる。

このような背景から、本発明は生じた。

本発明の態様によれば、接着細胞をマイクロビーズに接合することにより、微小液滴アッセイシステムにおいて接着細胞を処理する方法であって、第１の複数の微小液滴をマイクロ流体空間にロードすることであって、第１の微小液滴の各々は、マイクロビーズと第１の流体とを含むことと；第２の複数の微小液滴をマイクロ流体空間にロードすることであって、第２の微小液滴の各々は、接着細胞と第２の流体とを含むことと；第１の複数の微小液滴と第２の複数の微小液滴とを融合させ、複数の融合微小液滴を形成することであって、各融合微小液滴は、第１および第２の流体と、少なくとも１つのマイクロビーズと、少なくとも１つの接着細胞とを含むことと；融合微小液滴の各々を撹拌し、少なくとも１つの接着細胞が少なくとも１つのマイクロビーズに接着するように、融合微小液滴の各々内の第１および第２の流体を動かすこととを含む方法が提供される。

実施形態によっては、接着細胞をマイクロビーズに接合することにより、微小液滴アッセイシステムにおいて接着細胞を処理する方法であって、マイクロビーズと第１の流体とを含む第１の複数の微小液滴と、接着細胞と第２の流体とを含む第２の複数の微小液滴とをマイクロ流体空間にロードすることと；第１の複数の微小液滴と第２の複数の微小液滴とを融合させ、複数の融合微小液滴を形成することであって、各融合微小液滴は、第１および第２の流体と、少なくとも１つのマイクロビーズと、少なくとも１つの接着細胞とを含むことと；融合微小液滴を撹拌し、少なくとも１つの接着細胞が少なくとも１つのマイクロビーズに接着するように、第１および第２の流体を動かすこととを含む方法が提供される。

接着細胞は、培養前に、一時的に浮遊状態に保持されてよい。

任意に、融合微小液滴をマイクロ流体空間から取り出し、それらを処理済みのマイクロウェルプレートに分注し、細胞をプレートに付着させ、増殖させる。

本発明において開示されたような方法は、接着細胞のマイクロビーズへの付着およびマイクロビーズからの分離を制御し、推進する、効率的で拡張可能な方法を提供するため有利となる。よって、本発明の方法によれば、ユーザは、哺乳類細胞などの標的細胞の成長を確実に制御および／または操作できる。

「接着細胞」という用語は、本発明の文脈内で使用するとき、培養中、細胞生存能力のために支持構造を必要とする任意の細胞株を含むと理解されるべきである。他の種類の細胞は、浮遊状態で自由に成長でき、成長および増殖のために固体支持体を必要としない。接着細胞は、足場依存性であり、成長するためには固体支持体への接着を必要とする。接着細胞は、浮遊状態での成長に適応されてもよい。しかしながら、これには、接着細胞の浮遊状態への移行が必要であり、これにより細胞生存能力が低下する。従って、「接着細胞」という用語は、細胞生存能力のために固体支持体への接着を必要としないが、アッセイレポーターとして使用するためなど、他の理由で支持体に付着できる細胞株とは異なると理解されるべきである。接着細胞の例としては、限定はしないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類の組織細胞、生産細胞株、上皮細胞、および特定の種類のがん細胞が挙げられる。

加えて、マイクロビーズが、特に接着細胞のスケールアップした生物学的生産に有用である、接着細胞の接着のために、表面積を増加させることができるため、接着細胞を少なくとも１つのマイクロビーズに接着させることは、非常に望ましい。

さらに、マイクロビーズは、接着細胞が、生存し、増殖し、従来の表現型を発現させるために結合しうるのに好適な基板を提供する。加えて、マイクロビーズキャリアの使用は、それらが容易に操作および／または輸送できるため、有利となる。対照的に、従来の液滴操作デバイスにおいて細胞を成長させるためには、デバイス上に親水性パッチを設け、細胞が完全に濡れた液滴内で表面に接着できる、デバイスの複雑なパターニングを必要とする。これは、一旦細胞がパッチ上で接着状態になると、細胞が表面に結合し、液滴がパッチまで濡らすため、細胞を容易にかつ直ちに輸送または操作することができないことを意味する。

接着細胞とマイクロビーズとが数分間で一体となるのに十分な流量を生じさせるために、融合微小液滴を撹拌することが必要である。細胞およびキャリアビーズは、共に、ゆっくりと拡散する大粒子であり、ランダム拡散中に互いに遭遇する可能性は低く、静止液滴内では、内部流は最小限である。細胞を含む微小液滴を、マイクロビーズを通り越して一方向に流すことに頼るシステムもあるが、これでは、細胞とマイクロビーズとを確実に結合させるには不十分かもしれない。融合微小液滴の撹拌は、微小液滴をかき回す形で、または振盪により、または接着細胞とマイクロビーズとが接触するのに十分な内部流量を生じさせることができる任意の他の手段により、もたらされてよい。撹拌は、一方向の動きに限定されず、結果として、ビーズが、撹拌工程中、複数回、微小液滴の中心を通って前後に動くことができ、これにより少なくとも１つの接着細胞が少なくとも１つのマイクロビーズに確実に接着する。細胞および液滴は、共に、狭くて速い内部流の流れの中にある間、液滴内の最も早い流れに入って接触することができる。ほとんどの撹拌パターンに関して、この最大流の領域は液滴の外周となる。

第１および第２の流体は、それぞれ、第１および第２の複数の微小液滴に含まれる同一の流体であってよい。代替的に、第１および第２の流体は、異なってもよい。第１および／または第２の流体は、接着を促進するのに適したバッファーを含む流体であってよい。追加的に、または代替的に、第１および／または第２の流体は、細胞成長培地を含んでもよい。追加的に、または代替的に、第１および／または第２の流体は、薬、アッセイ試薬、浮遊ウイルスベクター、バイオポリマー、およびゲルを含んでもよい。

アッセイシステムは、微小液滴を操作するのに有用となりうるデバイスを備える。デバイスは、チップの表面上の経路に沿って流れるキャリア流体中に分散した微小液滴を受け取り、操作するように適合されたマイクロ流体チップを備えてよく、微小液滴は、光学的に媒介されたエレクトロウェッティング（ｏＥＷＯＤ）の力を使用して操作される。

ｏＥＷＯＤ力による微小液滴の操作は、チップ上の非効率で不要な空間となりうる物理的構造により微小液滴を補足するなど、微小液滴制御の他の方法に比べて有利となる。融合工程に対してマイクロビーズを安定に保つために、磁気マイクロビーズと磁場との使用を必要とする、当技術分野で周知の方法もある。しかしながら、本発明は、幅広いマイクロビーズ材料との使用に適している。従って、高い表面積／体積比および高い負荷能力など、接着細胞培養に最適な特性を有するマイクロビーズが選択されうる。代替的に、または加えて、方法は、非常に高いアスペクト比を有する長方形または円盤状のビーズを含む、さまざまな形状およびアスペクト比のマイクロビーズとの使用にも適している。実施形態によっては、液滴内のビーズは、各マイクロビーズに適用される外部磁力によって、流体内で動かされる。平らで、高アスペクト比のマイクロビーズは、それらの凝集効果に対する感受性が低いため、このような操作に特に適しているかもしれない。

代替的に、または加えて、本発明の方法は、層状構造から形成され、かつ磁化材料と非磁化材料とを含む層を有する、マイクロビーズとの使用に適している。追加的に、本発明の方法は、バーコードまたはマーキングパターンを表示し、特定のビーズの識別を補助するマイクロビーズとの使用に適している。実施形態によっては、マイクロビーズは、ゲルまたはハイドロゲルから成ってよい。ゲルは、成長因子または栄養素を供給し、細胞生存能力を強化するために使用できるため、有利になりうる。

さらに、ｏＥＷＯＤ力を使用し、試薬、細胞その他の物質を、表面に配置されるマイクロビーズに送達してもよい。マイクロビーズは、独立して保持されてもよいし、外部磁力により操作されてもよい。

本発明の方法は、少なくとも１つのマイクロビーズに接着した少なくとも１つの接着細胞に対して、選択、アッセイ、培養、または回収過程を実施する工程を更に含んでよい。

実施形態によっては、選択過程には、限定はしないが、蛍光内因性レポーターを発現させる細胞のみを選択すること、または表面マーカー染料が存在するシグナルを示す細胞のみを選択すること、またはビーズの周囲に特定の形態または立体構造を取る細胞のみを選択することが含まれてよい。

実施形態によっては、選択過程には、限定はしないが、追加的な融合作業によって、１つまたは複数のレポータービーズ要素を液滴に追加すること、および蛍光レポーター分子と併せて、ビーズ上で接着細胞により分泌されたタンパク質の癒着により誘起されたレポータービーズの周囲での蛍光シグナルの形成をモニタリングし、続いて、特定のクラスのビーズによりピックアップされた物質を分泌する細胞のみを選択することが含まれてよい。

実施形態によっては、アッセイ過程を実施することには、限定はしないが、薬を追加し、アポトーシスもしくは細胞死などの、細胞における反応をモニタリングもしくは特定すること、またはビーズに結合された標的細胞に作用する細胞の第２集団もしくは単一の細胞を追加すること、またはウイルスベクターを追加すること、またはサイトカインもしくは他の化合物などの刺激に融合させることが含まれてよい。

実施形態によっては、培養過程を実施することには、限定はしないが、細胞を培養し、ビーズにわたって増殖および成長させること、または培養中に各液滴に追加されるさまざまな栄養素、サイトカイン、および薬など、さまざまな異なる条件で細胞を培養することが含まれてよい。

実施形態によっては、回収過程を実施することは、対象の微小液滴、例えば、マイクロビーズおよび／または接着細胞を含む微小液滴を回収することであるのが望ましいかもしれない。回収された微小液滴は、更なる実験のため、組織培養処理済みのウェルプレートなど、プレート上に分注されてよい。

マイクロ流体チップは、マイクロ流体チップが、微小液滴を操作し、光学的に媒介されたエレクトロウェッティング（ｏＥＷＯＤ）の力の適用により微小液滴内に含まれる接着細胞の付着および分離の制御を可能にするように構成されうる、被覆構造を備えてよい。

実施形態によっては、マイクロ流体空間は、光学的に媒介されたエレクトロウェッティング（ｏＥＷＯＤ）によって微小液滴を操作するように構成されたマイクロ流体チップの一部である。

実施形態によっては、マイクロ流体空間は、光学的に媒介されたエレクトロウェッティング（ｏＥＷＯＤ）によって第１および第２の複数の微小液滴を操作するように構成されたマイクロ流体チップの一部である。

実施形態によっては、本発明のマイクロ流体チップは、第１および第２の複合壁を含むｏＥＷＯＤ構造を備える。第１の複合壁は、第１の基板を含んでよく、第１の基板は、基板上に第１の透明導体層を含み、第１の透明導体層は、７０～２５０ｎｍの範囲の厚さを有し、光活性層は、導体層上で４００～１０００ｎｍの波長範囲の電磁放射により活性化され、光活性層は、３００～１５００ｎｍの範囲の厚さを有し、光活性層上に第１の誘電体層を有し、第１の誘電体層は、３０～１６０ｎｍの範囲の厚さを有する。第２の複合壁は、第２の基板と、基板上に第２の導体層とを備えてよく、第２の導体層は、７０～２５０ｎｍの範囲の厚さを有し、任意に第２の導体層上に第２の誘電体層を有し、第２の誘電体層は、１２０～１６０ｎｍの範囲の厚さを有する。第１および第２の誘電体層の露出面は、１８０μｍ未満離れて配置され、微小液滴を含むように適合されたマイクロ流体空間を画定してよい。Ａ／Ｃソースを備えて、第１および第２の導体層を接続している第１および第２の複合壁にわたって電圧を提供してよい。電磁放射の少なくとも１つのソースは、光活性層に衝突するように適合された光活性層のバンドギャップよりも高いエネルギーを有して提供され、第１の誘電体層の表面に対応する仮想エレクトロウェッティング箇所を誘起してもよい。さらに、光活性層上の電磁放射の衝突点を操作するための手段が提供され、仮想エレクトロウェッティング箇所の配置を変化させるように構成され、それにより少なくとも１つのエレクトロウェッティング経路が作り出され、それに沿って、微小液滴が移動させられてよい。

実施形態によっては、マイクロ流体空間は、光学的に媒介されたエレクトロウェッティング（ｏＥＷＯＤ）によって微小液滴を操作するように構成されたマイクロ流体チップの一部である。

実施形態によっては、本発明のマイクロ流体チップは、第１および第２の複合壁を含むｏＥＷＯＤ構造を備える。第１の複合壁は、第１の基板と、基板上に第１の透明導体層とを備えてよく、第１の透明導体層は、７０～２５０ｎｍの範囲の厚さを有し、光活性層は、導体層上で４００～８５０ｎｍの波長範囲の電磁放射により活性化され、光活性層は、３００～１５００ｎｍの範囲の厚さを有し、光活性層上に第１の誘電体層を有し、第１の誘電体層は、３０～１６０ｎｍの範囲の厚さを有する。第２の複合壁は、第２の基板と、基板上に第２の導体層とを備えてよく、第２の導体層は、７０～２５０ｎｍの範囲の厚さを有し、任意に第２の導体層上に第２の誘電体層を有し、第２の誘電体層は、３０～１６０ｎｍの範囲の厚さを有する。第１および第２の誘電体層の露出面は、２０～１８０μｍ離れて配置され、微小液滴を含むように適合されたマイクロ流体空間を画定してよい。Ａ／Ｃソースを更に備えて、第１および第２の導体層を接続している第１および第２の複合壁にわたって電圧を提供してよい。チップは、光活性層に衝突するように適合された光活性層のバンドギャップよりも高いエネルギーを有する電磁放射の第１および第２のソースを更に備え、第１の誘電体層の表面に対応する仮想エレクトロウェッティング箇所を誘起してよい。チップは、光活性層上の電磁放射の衝突点を操作するための手段を含み、仮想エレクトロウェッティング箇所の配置を変化させ、それにより少なくとも１つのエレクトロウェッティング経路を作り出し、それに沿って微小液滴が移動させられてもよい。

これらの構造の第１および第２の壁は、透明であり、その間にマイクロ流体空間が挟まれている。

第１および第２の基板は、請求項にかかる幾何学的形状を維持するに十分なほど機械的に強い任意の材料から製造される。例えば、ガラス、金属、またはエンジニアリングプラスチックである。実施形態によっては、基板は、ある程度の柔軟性を有してよい。更に別の実施形態においては、第１および第２の基板は、１００～１０００μｍの範囲の厚さを有する。実施形態によっては、第１の基板は、シリコン、石英ガラス、およびガラスの１つから成る。実施形態によっては、第２の基板は、石英ガラスおよびガラスの１つから成る。

第１および第２の導体層は、第１および第２の基板の一方の表面に位置し、典型的に、７０～２５０ｎｍ、好ましくは７０～１５０ｎｍの範囲の厚さを有する。これらの層の少なくとも１つは、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）などの透明導電材、銀などの導電性金属の非常に薄い膜、またはＰＥＤＯＴなどの導電性ポリマーから作成される。これらの層は、連続シートまたはワイヤなどの一連の別個の構造として形成されてよい。代替的に、導体層は、電磁放射がメッシュの隙間に向けられている導電材のメッシュであってもよい。

光活性層は、第２の電磁放射のソースによる刺激に応答して、局所的な電荷領域を生成できる半導体材料を含んでよい。例としては、３００～１５００ｎｍの範囲の厚さを有する水素化アモルファスシリコン層が挙げられる。実施形態によっては、光活性層は、可視光の使用により活性化される。第１の壁の場合には光活性層は、任意に第２の壁の場合には導電層は、典型的に３０～１６０ｎｍの範囲の厚さの誘電体層で被覆されている。この層の誘電特性には、好ましくは＞１０＾７Ｖ／ｍの高誘電強度および＞３の誘電率が含まれる。好ましくは、この層は、可能な限り薄いが、一貫して絶縁破壊を回避する。実施形態によっては、誘電体層は、アルミナ、シリカ、ハフニア、または薄い非導電性ポリマー膜から選択される。

これらの構造の別の実施形態においては、少なくとも第１の誘電体層は、好ましくは両誘電体層は、防汚層で被覆され、さまざまな仮想エレクトロウェッティング電極箇所において所望の微小液滴／キャリア流体／表面接触角を確立するのを支援し、追加的に、微小液滴がチップ内を移動するにつれて、微小液滴の内容物が表面に接着し、減少することを防止する。第２の壁が第２の誘電体層を備えない場合、第２の防汚層は、第２の導体層上に直接的に適用されてよい。

最適な性能のためには、防汚層は、２５０°Ｃで大気－液体－表面３点インタフェースとして測定されたとき、５０°～１８０°の範囲にあるべき微小液滴／キャリア流体／表面接触角を確立するのを支援すべきである。実施形態によっては、これらの層は、１０ｎｍ未満の厚さを有し、典型的には単分子層である。別の実施形態では、これらの層は、アルコキシシリルなどの親水基で置換された、メタクリル酸メチルまたはその誘導体などのアクリレートエステルのポリマーから成る。防汚層の一方または両方は疎水性であり、最適な性能を保証する。実施形態によっては、２０ｎｍ未満の厚さのシリカの間質層が、化学的に互換性のあるブリッジを提供するために、防汚コーティングと誘電体層との間に介在してよい。

第１および第２の誘電体層、従って第１および第２の壁は、幅が少なくとも１０μｍ、好ましくは２０～１８０μｍの範囲であり、中に微小液滴が含まれるマイクロ流体空間を画定する。好ましくは、微小液滴が含まれる前に、微小液滴自体は、微小液滴空間の幅よりも１０％を超えて大きい、好適には２０％を超えて大きい固有の直径を有する。よって、チップに入る際、微小液滴は、例えば、より高い微小液滴融合能力によって、エレクトロウェッティング性能の向上につながる圧縮を受ける。実施形態によっては、第１および第２の誘電体層は、フルオロシランなどの疎水性コーティングで被覆される。

別の実施形態においては、マイクロ流体空間は、所定の量だけ離して第１および第２の壁を保持するための１つまたは複数のスペーサーを備える。スペーサーに対する選択肢には、光パターニングにより生成された中間レジスト層から作り出されたビーズまたはピラー、隆起部が含まれる。代替的に、酸化ケイ素または窒化ケイ素などの堆積物質を使用して、スペーサーを作り出してもよい。代替的に、接着コーティングを有する、または有さない軟質プラスチック膜を含む膜の層を使用して、スペーサー層を形成することもできる。さまざまなスペーサー幾何学的形状を使用し、ピラーの線により画定される、狭チャネル、先細チャネル、または部分的に囲まれたチャネルを形成することができる。慎重な設計によって、これらのスペーサーを使用して、微小液滴の変形を補助し、続いて微小液滴の分割を実施し、変形された微小液滴に対する操作をもたらすことが可能である。同様に、これらのスペーサーを使用して、物理的にチップのゾーンを区切り、液滴集団間の相互汚染を防止し、水圧下でチップをロードするとき、液滴の流れを正しい方向に推進できる。

第１および第２の壁には、導体層に取り付けられたＡ／Ｃ電源のソースを使用してバイアスがかけられ、これらの間に、好適には１０Ｖ～５０Ｖの範囲の電位差がもたらされる。これらのｏＥＷＯＤ構造は、典型的に、４００～８５０ｎｍの範囲、好ましくは６６０ｎｍの波長を有する第２の電磁放射のソース、および光活性層のバンドギャップを上回るエネルギーと関連して採用されている。好適には、光活性層は、採用される放射の入射強度が０．０１～０．２Ｗｃｍ^－２の範囲である仮想エレクトロウェッティング電極箇所において活性化されることになる。

電磁放射のソースが画素化される場合、それらは、好適には、ＬＥＤまたは他のランプからの光により照らされるデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）などの反射スクリーンを使用して、直接的または間接的に供給される。これにより、仮想エレクトロウェッティング電極箇所の非常に複雑なパターンが迅速に作り出され、第１の誘電体層上で破壊されることが可能になり、それにより、微小液滴を、厳密に制御されたエレクトロウェッティング力を使用して、基本的に任意の仮想経路に沿って正確に誘導できるようになる。このようなエレクトロウェッティング経路は、第１の誘電体層上の仮想エレクトロウェッティング電極箇所の連続体から構成されていると考えることができる。

光活性層上の電磁放射のソースの衝突点は、従来の円形または環状を含む任意の都合のよい形状でありうる。実施形態によっては、これらの点の形態は、対応する画素化の形態により判定され、別の実施形態においては、一旦微小液滴がマイクロ流体空間に入ると、微小液滴の形態に全体的にまたは部分的に対応する。一実施形態において、衝突点、従ってエレクトロウェッティング電極箇所は、三日月形であってよく、微小液滴の意図された進行方向に配向されてよい。好適には、エレクトロウェッティング電極箇所自体は、第１の壁に接着している微小液滴の表面より小さく、液滴と表面誘電体との間に形成される接触線を横切る最大の電界強度勾配をもたらす。

ｏＥＷＯＤ構造のいくつかの実施形態では、第２の壁は、電磁放射の同一のソースまたは異なるソースを用いて、第２の誘電体層上に仮想エレクトロウェッティング電極箇所を誘起させることもできる光活性層も含む。第２の誘電体層の追加により、構造の上面から下面への微小液滴のウェッティングエッジの移行、および各微小液滴へのより強いエレクトロウェッティング力の適用が可能になる。

第１および第２の誘電体層は、単一の誘電材料で構成されてもよいし、２つ以上の誘電材料の複合体であってもよい。誘電体層は、限定はしないが、Ａｌ_２Ｏ_３およびＳｉＯ_２から作成されてよい。

第１の誘電体層と第２の誘電体層との間に、ある構造が提供されてよい。第１の誘電体層と第２の誘電体層との間の構造は、限定はしないが、エポキシ、ポリマー、シリコンもしくはガラス、またはその混合物もしくは複合体で作成でき、真っすぐな、角のある、曲がった、または微細構造の壁／面を有する。第１の誘電体層と第２の誘電体層との間の構造は、頂部および底部の複合壁に接続され、密封されたマイクロ流体デバイスを作り出し、デバイス内にチャネルおよび領域を画定してよい。構造は、２つの複合壁間のギャップを占有してよい。代替的に、または追加的に、伝導体および誘電体は、既に壁を有する形状の基盤上に配置されてもよい。

本発明の方法および装置のいくつかの態様は、誘電泳動または光ピンセットによって微小粒子を操作するように構成されたデバイスなど、エレクトロウェッティングデバイス以外の光学的に活性化されたデバイスにも好適に適用される。そのようなデバイスにおいて、細胞または粒子は、機能的に同一の光学機器を使用して操作および検査され、仮想光学誘電泳動勾配を生成する。本明細書において定義されたような微小粒子は、生体細胞などの粒子、ポリスチレンおよびラテックス、ハイドロゲル、磁気マイクロビーズ、またはコロイドを含む材料から作成されるマイクロビーズを指してよい。誘電泳動および光ピンセットメカニズムは、当技術分野で広く知られており、当業者により直ちに実施されうる。

光学エレクトロウェッティングについて上述した方法と同様に、第１の高解像度光アセンブリを使用して、光学的に媒介された誘電泳動の組み合わせにより、粒子および／または細胞の微細操作および詳細検査を実施する。第２の粗い光アセンブリを使用して、多くの誘電泳動トラップを形成する。これらの２つのアセンブリの組み合わせにより、粗い光アセンブリを使用して非常に多くの粒子および／または細胞を保持および輸送する一方、微細な光アセンブリを使用して微細操作および検査作業を実施する方法に対する能力がもたらされる。

よって、本発明の開示されたマイクロ流体チップは、幅広いサイズにわたる微小液滴の操作を可能にし、デジタル処理で制御され、動的に再プログラム可能な操作工程を提供する点で有利である。装置のマイクロ流体基板は、パターニングされた電極を有さず、いくつかの複雑な低収率の製造工程を取り除き、従来の手法と比較して電気相互接続を簡略化する。これにより、隣接する電極間の絶縁破壊によりデバイスが故障することもなくなる。

結果として得られるデバイス構造は、よって、キャリア相および液滴の独立制御など、従来の手法と比較して、より複雑で、総合的なワークフローを可能にし、より高密度の液滴をマイクロ流体チップ表面の複数の領域にわたって制御することも可能にする。液滴は、１００万個まで、同時に操作されうる。

光学操作システムは、総合的な光学的測定および検査システムと結合されうる。この補助システムにより、ユーザは、細胞の数、マイクロビーズの数、任意の蛍光シグナルの明るさ、および細胞の形態を含む、微小液滴の内容物を判定できるようになってよい。液滴の内容物の自動ソフトウェア認識により、ｏＥＷＯＤ操作パターンを使用して特定の所望のパラメーターに対するチップ上の液滴を濃縮し、不要な液滴は拒否してチップの出口へ出すことが可能かもしれない。従って、正しい数のキャリアビーズおよび細胞を正確に含む、チップ上の液滴の集団を形成し、所望のアッセイおよび成長工程を実行することが可能かもしれない。

マイクロビーズの表面は、部分的にまたは完全に被覆されてよい。マイクロビーズは、タンパク質で被覆されうる。実施形態によっては、複数のマイクロビーズは、細胞接着を促進するように構成されたポリペプチドの表面機能化を有する。実施形態によっては、マイクロビーズは、細胞接着を促進するように構成されたポリペプチドの表面機能化を有する。

実施形態によっては、ペプチドの表面機能化は、以下の配列：Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ（ＧＲＧＤＳ）、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）、またはＧｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ（ＧＲＧＤＳＰ）の１つまたは複数を含む。これらの配列は、マイクロビーズの表面上での不要な干渉を最小限に抑えるため、好ましい短ポリペプチド配列である。

実施形態によっては、マイクロビーズの表面は、以下の、ポリペプチド、コラーゲン、ラミニン、マトリゲル（ＲＴＭ）、合成ハイドロゲル、またはポリスチレンの１つまたは複数で被覆されてよい。

実施形態によっては、マイクロビーズの表面は、汚染試薬で被覆され、汚染層を形成し、標的細胞の培養成長および接着を推進してもよい。汚染剤は、ウシ胎仔血清を含んでよい。他の実施形態においては、汚染剤は、Ｆ１２成長培地、ＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ、およびＯｐｔｉ－ＭＥＭ（ＲＴＭ）などの標準成長培地を含む。他の実施形態においては、汚染剤は、緑色蛍光タンパク質、ウシ血清アルブミン、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、キチン、マトリゲル（ＲＴＭ）、ハイドロゲル、およびエラスチンの１つを含む。

他の実施形態においては、マイクロビーズの被覆構造は、ポリリジン、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）、コラーゲン、ラミニン、および二酸化ケイ素の少なくとも１つを含んでよい。

実施形態によっては、マイクロビーズの被覆構造は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリリジン、コラーゲン、およびラミニンの１つを含んでよく、被覆構造を形成することには、前記化合物が自発的に、非共有的に基礎の表面に接着するように、化合物を含む水溶液でマイクロビーズを濡らすことが含まれてよい。

実施形態によっては、マイクロビーズの被覆構造は、化学リンカーによって表面に結合されたＢＳＡの層を含んでよい。基礎の表面が酸化アルミニウムの層を露出させている実施形態においては、化学リンカーは、１６－ホスホノヘキサデカン酸もしくは３－アミノプロピルホスホン酸、または３～１６（またはそれ以上）のメチレン基から成るアルカン鎖リンカーに結合された任意の好適なω－ホスホノカルボン酸を含む。基礎の表面が二酸化ケイ素の層を露出させている実施形態においては、化学リンカーは、（３－アミノプロピル）トリメトキシシランまたは２～６のメチレン基から成るアルカン鎖に結合された好適なω－アミノホスホン酸を含む。実施形態によっては、タンパク質の上述した化学リンカーへの結合は、タンパク質群と表面との間に共有結合が生じるように、ＢＳＡおよび表面の両方をＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ′－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）にさらすことと同時に行われる。

代替的に、実施形態によっては、共有結合は、まず、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム（スルホ－ＮＨＳ）が存在するＥＤＣを使用して表面を活性化させ、続いて、後続の工程でＢＳＡを導入することにより形成される。代替的に、このような共有結合は、ＥＤＣを使用せず、例えば、サクシニミジルエステルまたは無水コハク酸終端リンカーを使用することにより形成されうる。実施形態によっては、ＢＳＡは、コラーゲン、ラミニン、またはフィブロネクチンなどの別の適切なタンパク質に置換される。他の実施形態においては、ＢＳＡは、上述したような適切なタンパク質の混合物と置換される。

他の実施形態においては、マイクロビーズの被覆構造は、二酸化ケイ素を含んでよく、被覆構造を形成することは、スパッタリング、原子層堆積、またはその熱蒸発の１つを含んでよい。

実施形態によっては、マイクロビーズの被覆構造は、抗体の層を含み、標的細胞の表面上での抗原の接着を促進よい。マイクロビーズの被覆構造は、生物活性物質による機能化に限定されない。

好ましくは、接着細胞は、自然な接着状態でありうる。実施形態によっては、接着細胞は、自然な接着状態にある。特別の定めのない限り、「自然な状態」という用語は、本明細書において定義されたとき、増殖し、安定した表現型発現状態を選ぶ接着状態における接着細胞の物理的性質および／または化学的性質を指す。自然な接着状態において、接着細胞は、足場依存性であり、細胞生存能力および細胞成長のために固体支持体への付着を必要とする。実施形態によっては、固体支持体は、マイクロビーズでありうる。接着細胞が浮遊状態での成長に適応することも可能であるが、これには、細胞が接着状態から浮遊状態に移行する必要があり、この過程は、細胞にストレスをもたらし、細胞生存能力を低下させ、細胞の発現プロファイルを変化させる。アプリケーションによっては、接着細胞は、回収後に、接着状態で、コロニーで成長することが求められる。従って、細胞が成長し、自然な接着状態でマイクロ流体システムから回収されうるシステムを有しているのは、非常に有利となる。接着細胞を自然な接着状態で培養するシステムは、チップから外への輸送のため、細胞を一時的に浮遊状態に移行させ、続いて、マイクロウェルプレートまたはフラスコでの成長のため、細胞を接着状態に戻さなければならない状態を回避し、従って、細胞へのストレスを避ける。

実施形態によっては、方法は、第１の複数および第２の複数の微小液滴の内容物を検査し、液滴あたりのビーズおよび細胞の数を判定する工程を更に含んでよい。

実施形態によっては、方法は、融合に先立って、第１の複数および第２の複数の微小液滴の少なくともサブセットを検査し、微小液滴の内容物と微小液滴あたりのビーズまたは細胞の数とを判定する工程を更に含んでよい。

実施形態によっては、方法は、所望の細胞数を有するものを除いて微小液滴を処分するように構成された選別作業の工程を更に含んでよい。実施形態によっては、方法は、所望の細胞数を有するものを除いて１つまたは複数の微小液滴を処分する選別作業の工程を更に含んでよい。クローン性を維持するのに必要とされる所望の細胞の数は、１つの単細胞である。

実施形態によっては、方法は、所望のビーズ数を有するものを除いて微小液滴を処分する選別作業の工程を更に含んでよい。実施形態によっては、方法は、所望のビーズ数を有するものを除いて１つまたは複数の微小液滴を処分する選別作業の工程を更に含んでよい。所望のビーズ数は、１～１０の範囲であってよい、または、２、４、６、または８より多くてよい。実施形態によっては、所望のビーズ数は、１０、８、６、４、または２未満であってよい。

実施形態によっては、方法は、所定の閾値未満のビーズ数を有する微小液滴の選択を特定し、選択された液滴の２つ以上を融合させ、ビーズ数を増加させる工程を更に含んでよい。実施形態によっては、方法は、所定の閾値未満のビーズ数を有する微小液滴の選択を特定し、選択された微小液滴の２つ以上を融合させ、ビーズ数を増加させる工程を更に含んでよい。

所定の閾値は、アッセイごとに変化しうる。一例として、１～１０のマイクロビーズを含む微小液滴が選択され、融合されてもよいし、３～１０のマイクロビーズが選択され、融合されてもよい。別の例においては、１０～３０のマイクロビーズ、１０～４０、１０～５０、１０～６０、１０～８０のマイクロビーズを含む微小液滴が選択され、融合されてもよい。任意に、１～１００のマイクロビーズを含む微小液滴が選択され、融合されてもよい。更なる例においては、１００～２００のマイクロビーズを含む微小液滴が選択され、融合されてもよい。更なる例においては、１００～３００、１００～４００、１００～５００、１００～６００、１００～７００、１００～８００、または１００～９００のマイクロビーズを含む微小液滴が選択され、融合されてもよい。任意に、１０００を超えるマイクロビーズを含む微小液滴が、融合作業のため選択されてよい。融合作業は、ｏＥＷＯＤまたはＥＷＯＤを使用して実施されてよい。

実施形態によっては、方法は、所定の閾値レベルでビーズ数を有する微小液滴の選択を特定し、選択された微小液滴の２つ以上を分割し、ビーズ数を減少させる工程を更に含んでよい。所定の閾値は、アッセイごとに変化しうる。この場合、ほんの一例として、１～１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００を超えるマイクロビーズを含む微小液滴が、分割のため選択されてよい。分割作業は、ｏＥＷＯＤまたはＥＷＯＤを使用して実施されてよい。

実施形態によっては、微小液滴の選別および／または選択は、ｏＥＷＯＤ制御下で実施されてよい。ｏＥＷＯＤを使用して液滴を選別することは、選別および選択作業で使用されるチャネルおよび／またはバルブに対する要求を回避することができるため、有利となる。ｏＥＷＯＤ制御下で液滴を選別することは、従って、チップ上で使用される空間の効率性を増加させ、微小液滴の選別作業の速度を速めることができる。

実施形態によっては、第１および／または第２の複数の微小液滴の各々は、結合プロモーターを更に含んでよい。

１つまたは複数の微小液滴は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などの結合プロモーターを更に含んでよい。結合プロモーターは、ビーズまたはタンパク質コーティング上のカルボキシル基を活性化し、それらと細胞または別のタンパク質上のアミド基との共有結合を形成させることができる架橋剤である。活性化されたカルボキシル基の密度が高いほど、結合が強くなる。

実施形態によっては、方法は、細胞成長培地と平衡が保たれている交換キャリア相をマイクロ流体空間に導入する工程を更に含んでよい。細胞成長培地の例としては、限定されないが、ＲＰＭＩ１６４０、ＥＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＨａｍのＦ１２、ＨａｍのＦ１０、Ｆ１２－Ｋ、ＨＡＴ培地が挙げられる。

実施形態によっては、第１の流体および／または第２の流体は、細胞成長培地を含んでよく、方法は、細胞成長培地と平衡が保たれているキャリア相をマイクロ流体空間に導入する工程であって、キャリア相は、融合微小液滴で枯渇した任意の細胞成長培地を交換する工程を更に含んでよい。

交換キャリア相は、周囲の油と連続的に交換されている流体を含んでよい。細胞が液滴内で成長するにつれ、細胞は、キャリア相を介して酸素および／または二酸化炭素の局所環境を枯渇させる。主要な栄養素、および酸素および二酸化炭素ガスなどの細胞成長を推進するガス供給は、キャリア相に溶解されうる。実施形態によっては、細胞成長にとって重要な酸素、二酸化炭素その他のガスは、キャリア相において継続的に取り換えられ、培地が補給される。

キャリア相と細胞成長培地および／または酸素および二酸化炭素との平衡を保つことは、ユーザがｐＨを制御できるようになるため、有利となりうる。追加的に、キャリア相は、水および細胞培地を溶解させる、わずかだが十分な能力を有してよい。油を細胞培地で前処理することにより、液滴は、より安定化しうる。

実施形態によっては、使用されうる細胞成長培地としては、限定されないが、ＲＰＭＩ１６４０、ＥＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＨａｍのＦ１２、ＨａｍのＦ１０、Ｆ１２－Ｋ、および／またはＨＡＴ培地が挙げられる。

実施形態によっては、キャリア相は、追加的に剥離剤を含んでよい。

実施形態によっては、キャリア相は、少なくとも１つのマイクロビーズから少なくとも１つの接着細胞を切り離すための剥離剤を含んでよい。

「剥離剤」という用語は、本願の文脈内で使用するとき、前もって接着されていた固体支持体からの接着細胞の分離を推進する任意の物質を含む。剥離剤は、細胞への被害を最小限に抑えつつ、細胞－支持体相互作用を断ち切ることにより、接着細胞のそれらの支持体からの切り離しを推進する。

実施形態によっては、剥離剤は、以下の、トリプシン、ＥＤＴＡ、プロテアーゼ、クエン酸、またはアキュターゼ（ＲＴＭ）の１つまたは複数であってよい。

実施形態によっては、剥離剤は、以下の、トリプシン、ＥＤＴＡ、プロテアーゼ、またはクエン酸の１つまたは複数であってよい。

アッセイ中の剥離剤の導入により、細胞は、任意に、接着状態から浮遊状態に戻ることができる。浮遊状態の細胞は、続いて、更なる継代培養のため、液滴分割作業により形成された２つの娘液滴間の細胞集団の分割を含む更なる操作を受けることができる点で有利である。さらに、浮遊状態の細胞は、更なる分析のため、細胞のサブ選択として娘液滴においてサンプリングされ、オフチップで回収されうる。

実施形態によっては、方法は、融合液滴をインキュベートし、ビーズに接着している細胞をモニタリングする工程を更に含んでよい。実施形態によっては、方法は、複数の融合微小液滴をインキュベートし、融合微小液滴の各々においてマイクロビーズに接着している細胞をモニタリングする工程を更に含んでよい。インキュベーションは、３７°Ｃで、５％のＣＯ_２、２１％のＯ_２の組成、および９５％より多い相対湿度の大気圧で、実施されてよい。

このようなモニタリングには、細胞形態を判定し、細胞の数をカウントするために、明視野顕微鏡検査が含まれる。同様に、細胞の表現型特性を、それらの化学組成または蛍光レポーターの測定によって判定するために、蛍光画像または暗視野像が取得されうる。蛍光レポーターは、内因性レポーターシステムを備え、その中で、細胞は、顕微鏡検査により測定されうる蛍光タンパク質を発現させる。蛍光レポーターは、細胞表面上の物質または細胞体内の物質に特有な外因性蛍光レポーターも含み、細胞の近傍での外因性レポーターの蓄積を示す蛍光像は、同様に、特定の表現型状態を示すことができる。細胞の表現型状態は、細胞が接着状態にあるかどうかに大きく依存しうる。そのため、細胞が接着立体構造にある間、細胞の表現型状態をモニタリングすることが可能であれば、哺乳類細胞の生物学的生産など、多くの重要な過程をプロファイルするのに有利となる。

実施形態によっては、方法は、融合微小液滴に対してオンチップレポーターアッセイを実施する工程を更に含んでよい。例えば、レポートアッセイは、検出のため、融合微小液滴上に蛍光レポーターを付着させる用途を含んでよい。これは、細胞が接着状態のときのみアッセイ可能であるように、すなわち、いくつかの細胞が、マイクロビーズに接着した後にのみ、サイトカインを分泌し始めるように、細胞が修正されている融合液滴において、接着細胞を検出する際に重要となりうる。

実施形態によっては、方法は、融合微小液滴をレセプタクルに分注する工程を更に含んでよい。実施形態によっては、レセプタクルは、組織培養処理済みのウェルプレートなど、ウェルプレートであってよい。実施形態によっては、方法は、融合微小液滴を１つまたは複数の組織培養処理済みのウェルプレートに分注する工程を更に含んでよい。この工程は、ユーザが、液滴から外に出た細胞を、任意の余分な処理工程を伴わずに、ビーズ上で、続いて組織培養処理済みのウェルプレート上で取得できるため、有利となりうる。

実施形態によっては、方法は、融合微小液滴に含まれるビーズおよび細胞を、細胞が表面に接着し、増殖するように、処理済みのウェルプレートの表面に堆積させる工程を更に含んでよい。本実施形態において、細胞は、接着状態のままでいることなく、処理済みのウェルプレートに回収され、ビーズからプレート表面に広げられうる点で有利である。本実施形態において、ビーズ上の接着細胞のクラスター（または単一の接着細胞）は、細胞接着に適した表面にごく接近して堆積される。ビーズが微小液滴内にある場合、この堆積は、印刷、スポッティング過程の間、または表面の開口部を通って液滴を分注する間に行われうる。ビーズおよび細胞が表面に接触した後、細胞は、自発的に表面に接着してよい。さらに、細胞は、増殖してよく、この増殖が進むにつれて、表面に接着してよい。本実施形態は、細胞を再浮遊させる要求を取り除き、細胞を培養表面に堆積させる前にビーズから切り離す点で有利である。

実施形態によっては、方法は、複数の融合微小液滴を処理済みのウェルプレートの表面に堆積させる工程であって、各融合微小液滴は、少なくとも１つのマイクロビーズに接着された少なくとも１つの細胞を含む工程を更に含んでよい。

以下、ほんの一例として、添付の図面を参照し、本発明をさらに、より具体的に説明する。

本発明の方法を示すフローチャートである。 マイクロビーズを含む微小液滴と接着細胞を含む微小液滴との模式図である。 マイクロ流体チップ上で本発明の方法を実施するための例示の構成を示す図である。 単一のマイクロビーズに接着した単一の細胞を示す図である。 微小液滴内の多数のマイクロビーズと多数の細胞とを示す図である。 微小液滴内の単一のマイクロビーズと多数の細胞とを示す図である。 図７Ａは、マイクロビーズと結合した後、４時間後の細胞生存能力を示す図である。図７Ｂは、マイクロビーズと結合した後、２２時間後の細胞生存能力を示す図である。 図８Ａは、４時間後のマイクロビーズ上の細胞増殖を示す図である。図８Ｂは、２２時間後のマイクロビーズ上の細胞増殖を示す図である。

図１および図２を参照すると、微小液滴アッセイシステムにおいて接着細胞などの細胞を処理する方法５０が示され、説明されている。方法は、接着細胞をマイクロビーズに接合することを含む。図１を参照すると、マイクロビーズと第１の流体とを含む第１の複数の微小液滴は、マイクロ流体空間にロードされる（５２）。マイクロ流体空間は、光学的に媒介されたエレクトロウェッティング（ｏＥＷＯＤ）によって微小液滴を操作するように構成されたマイクロ流体チップの一部である。接着細胞と第２の流体とを含む第２の複数の微小液滴も、マイクロ流体空間にロードされる（５４）。第２の微小液滴は、第１の微小液滴と同一のマイクロ流体チップ上にロードされ、接着された細胞を含む第１の微小液滴に隣接した位置に置かれうる。第１および第２の複数の微小液滴は、毛管作用によってマイクロ流体空間にロードされうるか、圧力駆動流によってマイクロ流体空間にロードされうる。場合によっては、ポンプまたはシリンジを使用して、第１および／または第２の複数の微小液滴をマイクロ流体空間にロードしてよい。

次の工程において、第１の複数の微小液滴は、第２の複数の微小液滴と融合する（５６）。第２の微小液滴は、例えば、２対の微小液滴列で第１の微小液滴と対にされてよい。第２の微小液滴は、続いて、第１の微小液滴と融合され、複数の融合微小液滴を形成する。その結果、各融合微小液滴は、第１および第２の流体と、少なくとも１つのマイクロビーズと、少なくとも１つの接着細胞とを含む。

図１に示すように、方法は、少なくとも１つの接着細胞が少なくとも１つのマイクロビーズに向かって動き、マイクロビーズに接着するように、かき回すことにより、または振盪により、または第１および第２の流体を動かすのに好適な任意の他の力により、融合微小液滴を撹拌する工程５８を伴う。好ましくは、融合微小液滴は、細胞とビーズとが接触し、接着が始まるまで、かき回される。対象の微小液滴は、続いて、インキュベートされ、マイクロビーズに接着している細胞の経過がモニタリングされる。

マイクロビーズは、２μｍ～２００μｍの直径を有してよいが、直径は、１０、２０、４０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、または１８０μｍより大きくてよい。実施形態によっては、マイクロビーズの直径は、２００、１８０、１６０、１４０、１２０、１００、８０、４０、２０、または１０μｍ未満であってよい。場合によっては、２つ以上のマイクロビーズが一体となり、ビーズクラスターを形成してよい。ビーズクラスターの形成は、培地のｐＨおよび／または塩分含有量を変化させるなど、培地条件を変化させることにより生じてよい。ビーズがクラスター化することで、より広い表面積が形成され、より多くの接着細胞が接着するためのより大きな面積を提供できるようになる。

追加的に、マイクロビーズの表面は、短ポリペプチドなどのタンパク質で被覆および／または機能化されうる。ポリペプチド配列の例としては、限定はしないが、ＧＲＧＤ、ＲＧＤ、ＧＲＧＤＳ、またはＧＲＧＤＳＰが挙げられてよい。マイクロビーズは、部分的にまたは完全にポリペプチドで被覆されうる。マイクロビーズの表面に付着したポリペプチドは、細胞接着を促進できる。追加的に、または代替的に、マイクロビーズの表面は、以下の物質、すなわち、コラーゲン、ラミニン、および／またはポリスチレンの１つまたは複数で被覆されうる。

マイクロビーズの材料は、以下の物質：シリカ、ポリスチレン、ラテックス、ポリエステル、ＰＭＭＡ、マグネタイト、および／またはフェライトの１つまたは複数から作成されてよい。

一例において、マイクロビーズは、Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ（ＧＲＧＤＳ）などの短ペプチドの表面機能化により作成されてよい。短ペプチド、すなわち、Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ（ＧＲＧＤＳ）は、結合バッファー（結合バッファー：０．１ＭのＭＥＳ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５）において１００ｕｇ／ｍＬで等分されうる。ＥＤＣは、ビーズスラリーに速やかに注がれうる。ビーズは、続いて、ローテータにおいて、およそ２時間、室温で、ボルテックスおよびインキュベートされる。混合物は、インキュベーション中にボルテックスされることもある。ビーズは、続いて、洗浄され、１ｘのＰＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０、および０．０２％のＮａＮ３、ｐＨ７．４で再懸濁される。上で概説されたような手順により、ＧＲＧＤＳのタンパク質配列で被覆されたマイクロビーズが提供される。マイクロビーズは、ＧＲＤなどの他のタンパク質配列で被覆されてもよい。

図２を参照すると、本発明にかかる方法が示されている。図２に示すように、液滴６０内のビーズ６２は、流体光学デバイスにおいて液滴６０内の細胞６４と融合される。融合後、結合した液滴６６は、矢印６７で示されるように撹拌され、ビーズ６２と細胞６４とを物理的に相互作用させる。ビーズ６２と細胞６４とのクラスターは、液滴内でインキュベートされ、細胞は接着状態になる。クラスターを検査することで、細胞形態が接着状態に特徴的なものに変化したかを確認できる。

マイクロビーズのエマルションの調製には、ビーズが乳化装置を通って加圧下で送り出される前に、まずビーズを細胞培地の溶液に懸濁させることが必要となる。初期溶液の体積ビーズ密度は、結果として得られるエマルションで必要とされるビーズ密度と一致しなければならず、ビーズを撹拌し、乳化過程を通じて均質な分散を維持しなければならない。乳化装置は、一方の端に出口開口部を有し、他方の端に連続流体の入口を有するマイクロチャネルプレートチップを備える。出口端は、キャリア相の容器に浸かっており、典型的には、これは油性キャリア相であり、ビーズ培地と混合しない。プレートを通って送り出されたビーズは、培地が砕けて液滴に入る出口開口部において、培地に取り囲まれて現れる。キャリア相により取り囲まれたビーズを含む培地液滴から結果として得られるエマルションは、続いて、細胞ベースのアッセイでの使用のため、流体光学チップに送り出されうる。

細胞のエマルションの調製には、典型的に、平底の細胞培養フラスコ内で維持されているオフチップ培養ストックから細胞を回収することが必要となる。接着状態で培養している細胞は、トリプシンまたは別の好適な剥離剤を使用して再浮遊されなければならない。剥離剤は、その後、接着状態に戻ることを阻害しないように、続いて不活性化または除去されなければならない。除去は、細胞を遠心分離機において容器の底部に沈降させ、上澄みを培地で置き換える洗浄工程を繰り返すことにより成し遂げられうる。非活性化は、プロテアーゼベースの剥離試薬を含む溶液への過剰なタンパク質基質の追加により成し遂げられうる。各液滴内で特定の占有率の細胞が必要とされる場合、インプットは、インプットの細胞の密度が必要とされる液滴占有率と一致するように、希釈または濃縮されなければならない。一旦細胞が浮遊し、必要とされた密度になり、剥離試薬が不活性化または除去されると、細胞は、マイクロビーズについて上述したように、乳化装置を通って送り出されなければならない。

結果として得られるエマルションは、続いて、液滴操作および細胞とビーズとの接着クラスターの形成のため、流体光学チップ上に送り出される。

少なくとも１つのマイクロビーズに接着した少なくとも１つの接着細胞を含む少なくとも１つの融合微小液滴が、更なるアッセイのために選択されてよい。例えば、培養された接着細胞への蛍光レポーター染料の導入など、いくつかのアッセイ例が、このような培養された接着細胞に対して実施された。培養された接着細胞に対して実施されうる他のアッセイ例としては、レポータービーズの導入、ＦＲＥＴレポーターの導入、内因性発現したレポーターの画像化、顕微鏡細胞形態測定、培養細胞の溶解、ＰＣＲなどの遺伝子検出アッセイ、等温増幅または蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリッド形成法、およびＤＮＡシークエンシング調製が挙げられてよい。代替的に、分離した細胞は、更なる分析のため、単純にオフチップに流されうる。

図３を参照すると、開示されたような本発明にかかる方法を実行するのに適したｏＥＷＯＤスタックを備えるマイクロ流体チップの例示の構成が示されている。

典型的に、液滴を操作するためのマイクロ流体デバイスは、例えば、混合しないキャリア流体の存在下で、液滴を、カートリッジまたはマイクロ流体チューブの２つの対向壁により画定されたマイクロ流体空間を通って移動させてよい。誘電体層で覆われた微小電極が、１つまたは両方の壁内に埋め込まれ、微小電極の各々は、周期的にスイッチが迅速にオンオフされることで層の電界特性を修正できるＡ／Ｃバイアス回路に接続される。これにより、１つまたは複数の所定の経路に沿って液滴を操作するのに使用できる微小電極の近くに、局所的な方向性のある毛管力が生じる。このようなデバイスは、誘電体上のエレクトロウェッティング（頭字語ＥＷＯＤ）デバイスにより知られている。エレクトロウェッティング力が光学的に媒介されたこの手法の変形例は、オプトエレクトロウェッティング（以下、対応する頭字語ｏＥＷＯＤ）として当技術分野で周知である。

ｏＥＷＯＤを採用するマイクロ流体デバイスは、第１および第２の壁により画定されたマイクロ流体キャビティを備えてよく、第１の壁は、複合体設計であり、基板と、光導電層と、絶縁（誘電体）層とから成る。光導電層と絶縁層との間には、互いに電気的に絶縁され、光活性層に結合されている導電性セルの配列が配置されてよく、その機能は、絶縁層上に対応するエレクトロウェッティング電極箇所を生成することである。これらの箇所において、液滴の表面張力特性は、エレクトロウェッティング分野の手段によって変更されうる。これらの導電性セルは、続いて、光導電層に衝突する光により、一時的にスイッチがオンにされてよい。この手法は、その実用性が電極の配置によりある程度なお制限されてはいるが、切り替えがずっと容易かつ迅速になる点で有利となる。さらに、液滴を移動させることができる速度、および実際の液滴経路を変化させることができる程度に関しては制限がある。

図３に示すような例示のデバイスは、２５°Ｃで１センチストーク以下の粘度を有し、非閉じ込め状態において１００μｍ未満、例えば、２０～８０μｍの範囲の直径を有する、フルオロカーボンオイルに乳化された水性微小液滴１の操作に適している。実施形態によっては、直径は、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、または１８０μｍより大きくてよい。実施形態によっては、直径は、２００、１８０、１６０、１４０、１２０、１００、８０、６０、５０、３０、３０、または２０μｍ未満であってよい。

デバイスのｏＥＷＯＤスタックは、１３０ｎｍの厚さを有する導電性酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）の透明層３で被覆された、各々の厚さが５００μｍの頂部ガラスプレート２ａと底部ガラスプレート２ｂとを備える。導電性酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）の層３の各々は、Ａ／Ｃソース４に接続され、底部ガラスプレート２ｂ上のＩＴＯ層は、接地されている。底部ガラスプレート２ｂは、厚さが８００ｎｍのアモルファスシリコンの層５で被覆されている。頂部ガラスプレート２ａおよびアモルファスシリコンの層５は、各々、厚さが１６０ｎｍの高純度アルミナまたはハフニアの層６で被覆され、次にポリ（３－（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレート）の単分子層７で被覆され、高純度アルミナまたはハフニアの層６の表面は疎水性となる。

頂部ガラスプレート２ａおよびアモルファスシリコンの層５は、スペーサー（不図示）を使用して８μｍ離れて配置され、デバイスキャビティに導入されたとき、微小液滴がある程度の圧縮を受けるようにする。ＬＥＤ光源８により照らされた、反射性の画素化されたスクリーンの画像は、通常、底部ガラスプレート２ｂの真下に配置され、０．０１Ｗｃｍ^２のレベルの可視光（波長６６０または８３０ｎｍ）が、各ダイオード９から放出され、底部ガラスプレート２ｂおよび導電性酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）の層３を通って多数の上向きの矢印の方向の伝播により、アモルファスシリコンの層５に衝突させられる。

さまざまな衝突点において、電荷の光励起領域１０がアモルファスシリコンの層５内に作り出され、これは、対応するエレクトロウェッティング箇所１１において、高純度アルミナまたはハフニアの層６上に変更された液体－個体接触角を誘起する。これらの変更された特性により、微小液滴１を１つのエレクトロウェッティング箇所１１から別のエレクトロウェッティング箇所１１に推進させるのに必要な毛管力が提供される。ＬＥＤ光源８は、配列のどのダイオード９が、予めプログラムされたアルゴリズムにより任意の所定の時間に照らされるかを判定するマイクロプロセッサ１２により制御される。

本発明の方法を実行するのに適したマイクロ流体チップの更なる具体的詳細は、本明細書において参照により援用される、公開特許ＷＯ２０１８／２３４４４５に見られる。

本発明のデバイスは、制御温度、異なる流れの領域、連続的に培養細胞を供給するためにキャリア流体を制御すること、栄養素の供給、および培養細胞を取り囲んでいるキャリア流体における局所的なガス濃度の制御など、接着細胞条件に適した環境制御の実行も提供する。

例えば、接着細胞培養は、低流量の領域に位置してよく、栄養素および化学物質を含み、成長を促すために培養にそれらを供給するより流れの速い領域に取り囲まれてよい。

図４を参照すると、融合微小液滴内の単一のマイクロビーズと単一の接着細胞とが示されている。各段階は、およそ０時間、１５分、３０分、４時間、２２時間後であり、接着細胞のマイクロビーズへの接着を示す。時間が経つにつれ、単一のマイクロビーズと単一の接着細胞とが、一体となり、接触する。単一の接着細胞は、図４に示すように、微小液滴内でマイクロビーズに接着する。図４に示す矢印は、接着細胞の増殖を示す。

図５を参照すると、多数のマイクロビーズと多数の接着細胞とを含む融合微小液滴が示されている。融合微小液滴は、０時間、１５分、３０分、４時間、および２２時間後の各段階においてモニタリングされる。図５では、多数の接着細胞がマイクロビーズを覆い、１つまたは複数のマイクロビーズと一体になる。場合によっては、構造、サイズ、および／または形状などの細胞形態は、マイクロビーズとのインキュベーション期間中に変化するかもしれない。形態の変化は、細胞の表現型状態および成長過程を示し、細胞の健康および生存率の指標として使用できる。

図６を参照すると、多数の接着細胞と共に単一のビーズを含む融合微小液滴が示されている。対象の融合微小液滴は、０時間、１５分、３０分、４時間、および２２時間後の各段階においてモニタリングされる。図６は、多数の接着細胞が単一のマイクロビーズに接着できることを示す。場合によっては、構造、サイズ、および／または形状などの細胞形態は、マイクロビーズとのインキュベーション期間中に変化するかもしれない。

図７Ａおよび図７Ｂは、それぞれ、４時間後および２２時間後における微小液滴の画像を提供し、細胞がマイクロビーズと接合した後の細胞生存能力テストを示している。提供された条件により、接着細胞はマイクロビーズと接合でき、細胞は、マイクロビーズ上で４時間培養される。接着細胞とマイクロビーズとを含む微小液滴は、続いて、抽出され、図７Ａに示すように組織培養処理済みのプレートに分注される。細胞は、続いて、２２時間後までマイクロビーズ上で培養される。２２時間後、接着細胞とマイクロビーズとを含む微小液滴は、続いて、抽出され、図７Ｂに示すように組織培養処理済みのプレートに分注される。

４時間後の融合微小液滴の画像を提供する図８Ａ、および２２時間後の融合微小液滴の画像を提供する図８Ｂに示す結果は、単一のビーズ上または多数のビーズ上の接着細胞は生存可能であり、インキュベーション期間中に増殖できることを示している。

複数の細胞と１つまたは複数のマイクロビーズとを含む各液滴は、さまざまな方法で特定のサンプリングアッセイのニーズに応じて操作されてよい。このような操作には、微小液滴が表面からデウェットする（ｄｅ－ｗｅｔ）、または部分的にデウェットするように、微小液滴に対するエレクトロウェッティング条件を変更することが含まれる。「デウェットする」という用語は、本明細書において使用されるとき、液滴が表面から引き離されるような、液滴とチップ表面との間の接触角の変化を指す。

培養細胞に対して実施されうる生物学的および／または化学的アッセイ例としては、レポータービーズの導入、ＦＲＥＴレポーターの導入、内因性発現したレポーターの画像化、顕微鏡細胞形態測定、培養細胞の溶解、ＰＣＲなどの遺伝子検出アッセイ、等温増幅または蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリッド形成法、およびＤＮＡシークエンシング調製が挙げられうる。代替的に、分離した細胞は、更なる分析のため、単純にオフチップに流されうる。

本発明のさまざまな更なる態様および実施形態も、本開示を考慮すれば当業者には明らかであろう。

「および／または」は、本明細書において使用される場合、２つの指定された特徴または構成要素の各々が他方を有する場合または有さない場合の特定の開示として捉えられるべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、各々が本明細書において個々に提示されている場合と同様に、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、および（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々の特定の開示として捉えられるべきでる。

文脈で他に指示がない限り、上記で提示された特徴の説明および定義は、本発明の任意の特定の態様または実施形態に限定されず、説明されている全ての態様および実施形態に等しく適用される。

本発明は、例としていくつかの実施形態を参照して説明されていることが、当業者であれば更に理解するであろう。本発明は、開示された実施形態に限定されず、その代替的な実施形態は、添付の特許請求の範囲に定義されたような本発明の範囲から逸脱せずに構成されうるであろう。

Claims (19)

1. 接着細胞をマイクロビーズに接合することにより、微小液滴アッセイシステムにおいて接着細胞を処理する方法であって、
   第１の複数の微小液滴をマイクロ流体空間にロードすることであって、前記第１の微小液滴の各々は、マイクロビーズと第１の流体とを含むことと、
   第２の複数の微小液滴を前記マイクロ流体空間にロードすることであって、前記第２の微小液滴の各々は、接着細胞と第２の流体とを含むことと、
   前記第１の複数の微小液滴と前記第２の複数の微小液滴とを融合させ、複数の融合微小液滴を形成することであって、各融合微小液滴は、前記第１および第２の流体と、少なくとも１つのマイクロビーズと、少なくとも１つの接着細胞とを含むことと、
   前記融合微小液滴の各々を撹拌し、少なくとも１つの接着細胞が少なくとも１つのマイクロビーズに接着するように、前記融合微小液滴の各々内の前記第１および第２の流体を動かすことと
   を含む方法。
2. 前記少なくとも１つのマイクロビーズに接着した前記少なくとも１つの接着細胞に対して、選択、アッセイ、培養、または回収過程を実施する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記マイクロ流体空間は、光学的に媒介されたエレクトロウェッティング（ｏＥＷＯＤ）によって前記第１および第２の複数の微小液滴を操作するように構成されたマイクロ流体チップの一部である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記マイクロビーズは、細胞接着を促進するように構成されたポリペプチドの表面機能化を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記ペプチドの表面機能化は、以下の配列：Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ（ＧＲＧＤＳ）、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）、またはＧｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ（ＧＲＧＤＳＰ）の１つまたは複数を含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記接着細胞は、自然な接着状態にある、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 融合に先立って、前記第１の複数および前記第２の複数の微小液滴の少なくともサブセットを検査し、前記微小液滴の内容物と微小液滴あたりのビーズまたは細胞の数とを判定する工程を更に含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 所望の細胞数を有するものを除いて１つまたは複数の微小液滴を処分するように構成された選別作業の工程を更に含む、請求項７に記載の方法。
9. 所望のビーズ数を有するものを除いて１つまたは複数の微小液滴を処分する選別作業の工程を更に含む、請求項７または８に記載の方法。
10. 所定の閾値未満のビーズ数を有する微小液滴の選択を特定し、前記選択された微小液滴の２つ以上を融合させ、前記ビーズ数を増加させる工程を更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 所定の閾値レベルでビーズ数を有する微小液滴の選択を特定し、前記選択された微小液滴の２つ以上を分割し、ビーズ数を減少させる工程を更に含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記第１および／または第２の複数の微小液滴の各々は、結合プロモーターを更に含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記第１の流体および／または第２の流体は、細胞成長培地を含み、前記方法は、細胞成長培地と平衡が保たれているキャリア相を前記マイクロ流体空間に導入する工程であって、前記キャリア相は、前記融合微小液滴で枯渇した細胞成長培地を交換するように構成されている工程を更に含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記キャリア相は、少なくとも１つのマイクロビーズから少なくとも１つの接着細胞を切り離すための剥離剤を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記剥離剤は、以下の、トリプシン、ＥＤＴＡ、プロテアーゼ、またはクエン酸の１つまたは複数である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記複数の融合微小液滴をインキュベートし、前記融合微小液滴の各々において前記マイクロビーズに接着している前記細胞をモニタリングする工程を更に含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記融合微小液滴に対してオンチップレポーターアッセイを実施する工程を更に含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記融合微小液滴をレセプタクルに分注する工程を更に含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記複数の融合微小液滴を処理済みのウェルプレートの表面に堆積させる工程であって、各融合微小液滴は、少なくとも１つのマイクロビーズに接着された少なくとも１つの細胞を含む工程を更に含む、請求項１８に記載の方法。

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