KR20230012541A - 미세액적 조작을 위한 장치 및 방법 개선 - Google Patents

Abstract

부착성 세포를 마이크로비드에 접합시킴으로써 미세액적 분석 시스템에서 부착성 세포를 취급하는 방법이 제공된다. 상기 방법(50)은 복수의 제1 미세액적을 미세유체 공간에 로딩하는 단계, 여기에서 각각의 제1 미세액적은 마이크로비드(52)와 제1 유체를 함유함; 복수의 제2 미세액적을 미세유체 공간에 로딩하는 단계, 여기에서 각각의 제2 미세액적은 부착성 세포 및 제2 유체를 함유함(54); 상기 복수의 제1 미세액적 및 상기 복수의 제2 미세액적을 병합하여 복수의 병합된 미세액적을 형성하며(56), 각각의 병합된 미세액적은 상기 제1 및 제2 유체, 적어도 하나의 마이크로비드 및 적어도 하나의 부착성 세포를 함유하는 단계; 및 상기 각각의 병합된 미세액적에서 상기 제1 및 제2 유체를 이동시켜 적어도 하나의 부착성 세포가 적어도 하나의 마이크로비드에 부착되도록 상기 각각의 병합된 미세액적을 교반하는 단계(58);를 포함한다.

Description

미세액적 조작을 위한 장치 및 방법 개선

본 발명은 미세액적을 조작하는 방법과 시스템, 특히 미세액적 분석 시스템에서 세포를 취급하는 방법과 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 또한 부착성 세포를 마이크로비드에 접합시킴으로써 미세액적 분석 시스템에서 부착성 세포를 취급하는 방법에 관한 것이다.

인간 및/또는 동물 조직 유래의 세포는 특히 바이러스 벡터와 백신 및 다양한 치료 단백질의 생산을 위한 연구 개발 도구로 사용하기 위해 배양 조직에서 조작되어 의약품 스크리닝을 위한 기능성 세포 또는 조직 유사체를 생성할 수 있다.

포유동물 세포는 바이러스 감염을 통해 의약품을 생산하고 유전공학을 통해 치료 단백질을 생산하도록 만들 수 있다. 이러한 의약품의 다수는 정상적인 형태의 단백질이 결핍되거나 충분한 양으로 생산할 수 없는 환자에게 필요하다.

이러한 세포 성장은 당, 아미노산, 비타민, 미네랄 및 인슐린과 다양한 사이토카인과 같은 성장인자를 포함하는 영양소의 혼합물이 함유된 복잡한 환경을 필요로 한다. 또한, 혈류 또는 림프계 고유의 특정 세포 유형을 제외하고는, 조직으로부터 유래된 세포는 고정-의존적(anchorage-dependent)이며, 이는 자유롭게 부유하는 개별 세포로는 성장하지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, 상기 조직 환경에서 방출된 후, 세포는 부착할 수 있는 표면을 필요로 하며, 그렇지 않으면 생존 및 분열하지 못한다.

종래의 미세유체 내부에 부착성 세포를 배양하는 방법은 예를 들어, 장기-온-칩(organ-on-chip) 응용분야에서 알려져 있다. 특히, 부착성 세포를 배양하려는 기존의 플레이트-기반 워크플로우가 존재한다. 이러한 미세유체 시스템은 유체의 흐름이 미세구조화된 채널에 의해 라우팅되고 제어되는 연속-흐름 미세유체장치를 포함할 수 있다. 또한 별도의 체적의 유체가 개별적으로 조작되는 디지털 미세유체장치를 포함할 수도 있다. 디지털 미세유체장치의 한 종류는 '유전체 상 전기습윤'(EWOD, ElectroWetting On Dielectric) 장치 및 참조로 통합되는 WO2018/234445에 개시된 것과 같은 광학 EWOD 장치의 하위-분류를 포함한다. 상기 장치는 미세유체 칩 주위에서 선택적으로 오일-기반 캐리어 상에 의해 둘러싸인 세포 배지 액적의 이동을 제어할 수 있도록 한다. 그러나, 해당 플랫폼 상에서 부착성 세포 성장을 달성하기 위해서는, 칩 장치 상의 일종의 배양 영역과 액적 내용물 사이의 접촉을 제어 가능하도록 도입하는 것이 필요하며, 이는 종래의 어떠한 액적 취급 미세유체 플랫폼에서도 달성하기에 복잡하다.

디지털 미세유체 장치 상에 부착성 세포를 배양하는 것에 대해서는 제한적으로 개시되어 있다. 예를 들어, 종래의 개시는 포유동물 세포 배양을 구현하기 위해 전극 어레이를 갖는 랩온어칩(lab-on-a-chip) 플랫폼에서 통상의 전기습윤을 사용하는 것을 기술하였다. 그러나 상기 플랫폼은 작동에 사용되는 고정 전극의 크기가 크기 때문에 동시에 조작할 수 있는 세포의 수가 제한된다. 동일한 이유로, 상기 플랫폼은 나노리터 이하의 체적에 캡슐화된 개별 세포를 조작하기에 일반적으로 적합하지 않다. 나아가, 고정된 전극 위치와 크기로 인해 상기 시스템의 유연성과 적응성은 제한적이다.

다른 개발에서, 마이크로비드 담체로 형성된 고체 지지체에 세포를 부착하는 것은 잘 알려져 있으며, 마이크로비드가 세포 부착을 위한 증가된 표면적을 제공하는 스케일-업 바이오-생산에 통상적으로 사용된다. 그러나 종래의 액적 플랫폼을 사용하여 부착성 세포와 고체 마이크로비드를 결합하는 것은, 특히 단일 세포 수준에서 작업하는 데 어려움이 있다. 각 세포가 정확한 수의 비드에 노출되도록 많은 수의 액적을 동시에 제어하면서 병합하는 것은 불가능하다. 부착성 세포의 성장은 부착된 지지체 상의 가용 표면적에 의존하기 때문에, 부착성 세포주를 배양할 때 각 세포가 노출되는 비드의 수를 정확하게 제어할 수 있는 것이 중요하다. 따라서 최적의 부착성 세포 배양을 위해서는 각각의 마이크로비드에 부착된 세포의 수를 정밀하게 제어하여야 한다. 액적이 채널에서 배양되거나 저장되는 기기는 제한된 가스 공급으로 인해 세포 생존능 수준이 낮다.

많은 중요한 분석의 경우, 부착성 세포가 표현형 형질에 대해 스크리닝된 후, 미세유체시스템으로부터 회수되어야 한다. 일부 분석에서 이는 DNA 시퀀싱, RNA 시퀀싱 또는 PCR 검출과 같은 유전자 분석을 수행하기 위한 것이다. 일부 분석에서 상기 회수는 회수된 물질로부터 세포의 콜로니(colony)를 증식하기 위한 것이며, 회수된 단일 세포로부터 클론의 콜로니가 증식되는 경우를 포함한다. 부착성 세포가 콜로니로 성장하여야 하는 경우, 회수 후 부착 상태가 되어야만 한다. 부착성 세포가 온-칩으로 성장되고 증식을 위해 회수되는 다른 미세유체 시스템에서는, 칩 밖으로 이송하기 위해 일시적으로 현탁액 상태로 취한 후 마이크로웰 플레이트나 플라스크에서 성장을 위한 부착 상태로 되돌려야 한다. 세포가 부착 상태와 현탁액 상태 사이에 있을 때마다, 상기 공정은 세포에 스트레스를 유발하고, 세포 생존능을 감소시키며, 세포의 발현 프로파일을 변화시킨다. 이와 같은 회수 및 관련 재-현탁 공정은 미세유체 세포 배양 시스템의 공지의 결함으로, 세포가 부착성 상태에서 미세유체 시스템으로부터 회수될 수 있는 시스템을 갖는 것은 매우 유리하다.

따라서, 효율적이고, 신속하며 비용 효율적인 방식으로 부착성 세포를 마이크로비드와 같은 비드 상에 부착, 성장 및/또는 배출하기 위한 방법과 장치를 제공하는 것이 요구된다. 상기 방법 및 장치는 많은 수의 액적이 병렬로 병합되는 경우에도 각각의 부착성 세포가 정확한 수의 비드에 노출되도록 액적 병합 단계 동안 충분한 제어를 유지해야 한다. 부착성 세포의 마이크로비드에 대한 부착 및 마이크로비드로부터의 탈착을 제어하는 효율적인 방법을 제공함으로써, 세포 부착 및 증식을 촉진시켜 높은 처리량 환경에서 표적 세포의 제어된 성장을 가능하게 할 수 있다.

본 발명이 발생한 것은 이러한 배경에 대항하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 부착성 세포를 마이크로비드에 접합함으로써 미세액적 분석 시스템에서 부착성 세포를 취급하는 방법이 제공되며, 상기 방법은: 복수의 제1 미세액적을 미세유체 공간에 로딩하는 단계, 여기에서 각각의 제1 미세액적은 마이크로비드와 제1 유체를 함유함; 복수의 제2 미세액적을 미세유체 공간에 로딩하는 단계, 여기에서 각각의 제2 미세액적은 부착성 세포 및 제2 유체를 함유함; 상기 복수의 제1 미세액적 및 상기 복수의 제2 미세액적을 병합하여 복수의 병합된 미세액적을 형성하며, 각각의 병합된 미세액적은 상기 제1 및 제2 유체, 적어도 하나의 마이크로비드 및 적어도 하나의 부착성 세포를 함유하는 단계; 및 상기 각각의 병합된 미세액적에서 상기 제1 및 제2 유체를 이동시켜 적어도 하나의 부착성 세포가 적어도 하나의 마이크로비드에 부착되도록 상기 각각의 병합된 미세액적을 교반하는 단계;를 포함한다.

일부 실시예에서, 부착성 세포를 마이크로비드에 접합함으로써 미세액적 분석 시스템에서 부착성 세포를 취급하는 방법이 제공되며, 상기 방법은: 마이크로비드와 제1 유체를 함유하는 복수의 제1 미세액적 및 부착성 세포 및 제2 유체를 함유하는 복수의 제2 미세액적을 미세유체 공간에 로딩하는 단계; 상기 복수의 제1 미세액적 및 상기 복수의 제2 미세액적을 병합하여 복수의 병합된 미세액적을 형성하며, 각각의 병합된 미세액적은 상기 제1 및 제2 유체, 적어도 하나의 마이크로비드 및 적어도 하나의 부착성 세포를 함유하는 단계; 및 제1 및 제2 유체를 이동시켜 적어도 하나의 부착성 세포가 적어도 하나의 마이크로비드에 부착되도록 상기 병합된 미세액적을 교반하는 단계;를 포함한다.

상기 부착성 세포는 배양 전 현탁된 상태로 일시적으로 유지될 수 있다.

선택적으로, 상기 병합된 미세액적을 미세유체 공간으로부터 배출하고, 세포가 플레이트에 부착되어 증식되도록 처리된 마이크로웰 플레이트에 분배한다.

본 발명에 개시된 방법은 부착성 세포의 마이크로비드에 대한 부착 및 마이크로비드로부터의 탈착을 제어 및 촉진하기 위한 효율적이고 확장 가능한 방법을 제공하기 때문에 유리하다. 따라서, 본 발명의 방법은 사용자가 포유동물 세포와 같은 표적 세포의 성장을 신뢰성 있게 제어 및/또는 조작할 수 있도록 한다.

본 발명의 문맥 내에서 사용된 용어 '부착성 세포'는 배양 동안 세포 생존을 위한 지지 구조를 필요로 하는 임의의 세포주를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 다른 유형의 세포들은 현탁액에서 자유롭게 성장할 수 있으며, 성장 및 증식을 위한 고형 지지체를 필요로 하지 않는다. 부착성 세포는 고정 의존적이고 성장을 위해 고형 지지체에 부착이 필요하다. 부착성 세포는 현탁액에서 성장하도록 적응될 수 있다. 그러나 이는 부착성 세포를 현탁 상태로 전이시키는 것을 필요로 하며, 이는 세포 생존능을 감소시킨다. 따라서 '부착형 세포'라는 용어는 세포 생존을 위해 고형 지지체에 부착될 필요는 없으나, 분석 리포터로서 사용하기 위한 것과 같은 다른 이유로 지지체에 부착될 수 있는 세포주와는 구별되는 것으로 이해되어야 한다. 부착성 세포의 예는 중국 햄스터 난소 (CHO)세포, 생산 세포주, 상피 세포 및 특정 유형의 암세포와 같은 포유동물 조직 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

또한, 적어도 하나의 마이크로비드에 부착성 세포를 부착하는 것은 마이크로비드가 부착성 세포의 대규모 바이오 생산에 특히 유용한 부착성 세포 부착을 위해 증가된 표면적을 제공할 수 있기 때문에 매우 바람직하다.

더욱이, 마이크로비드는 부착성 세포가 생존, 증식하고 그들의 통상적인 표현형을 발현하기 위해 결합할 수 있는 적합한 기재를 제공한다. 게다가, 마이크로비드 담체는 용이하게 조작 및/또는 운반될 수 있기 때문에 사용하기에 유리하다. 대조적으로, 종래의 액적 조작 장치에서 세포를 성장시키는 것은 세포가 완전히 습윤된 액적 내에서 표면에 부착할 수 있는 장치 상의 친수성 패치를 제공하기 위하여 장치의 복잡한 패턴화를 필요로 한다. 이는 상기 세포가 상기 표면에 결합되고 액적이 상기 패치에 습윤됨에 따라, 일단 세포가 상기 패치에 부착된 상태에 들어가면 용이하게 운반되거나 조작될 수 없음을 의미한다.

병합된 미세액적을 교반하는 것은 부착형 세포와 마이크로비드가 수 분 내에 함께 모이기에 충분한 유체 흐름을 유발하는데 필요하다; 세포 및 담체 비드 모두는 느리게 확산하는 큰 입자이고, 랜덤 확산을 통해서는 서로 만날 가능성이 낮으며 정지된 액적에서는 내부 흐름이 최소화된다. 일부 시스템은 단일 방향으로 마이크로비드를 지나 유동하는 세포를 포함하는 미세액적에 의존하지만, 이는 세포와 마이크로비드의 결합을 보장하기에 충분하지 않을 수 있다. 상기 병합된 미세액적을 교반하는 것은 미세액적을 교반하는 형태 또는 진탕하거나 혹은 부착성 세포와 마이크로비드가 접촉하기에 충분한 내부 유체 흐름을 유발할 수 있는 임의의 다른 수단에 의해 이루어질 수 있다. 교반은 단일 방향으로 이동하는 것에 한정되지 않으며, 결과적으로 상기 비드가 교반 단계 동안 미세액적의 중심을 통해 전후로 여러 번 이동할 수 있으며, 이는 적어도 하나의 부착성 세포가 적어도 하나의 마이크로비드에 부착되도록 한다. 세포와 액적 모두는 액적 내부에서 가장 빠른 유동 스트림으로 들어갈 수 있으며, 좁고 빠르게 흐르는 내부 유동 스트림에 있는 동안 접촉하게 된다. 대부분의 교반 패턴에서 이 최대 유동 영역은 액적의 외부 둘레 주변이다.

상기 제1 및 제2 유체는 복수의 제1 및 제2 미세액적에 각각 포함된 동일한 유체일 수 있다. 또는 제1 및 제2 유체는 상이할 수 있다. 제1 및/또는 제2 유체 (들)은 부착을 촉진하기에 적합한 완충액을 포함하는 유체일 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 상기 제1 및/또는 제2 유체(들)은 세포 성장 배지를 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로 상기 제1 및/또는 제2 유체(들)은 약물, 분석 시약, 현탁된 바이러스 벡터, 생체고분자 및 겔을 포함할 수 있다.

상기 분석 시스템은 미세액적을 조작하는데 유용할 수 있는 장치를 포함한다. 상기 장치는 상기 칩의 표면 상의 경로를 따라 흐르는 캐리어 유체 내에 분산된 미세액적을 수용하고 조작하도록 구성된 미세유체 칩을 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 미세액적은 광학 매개 전기습윤(oEWOD) 힘을 사용하여 조작된다.

oEWOD 힘으로 미세액적을 조작하는 것은 비효율적이고 칩 공간을 낭비할 수 있는 물리적 구조로 미세액적을 트랩핑(trapping)하는 것과 같은 미세액적 제어의 다른 방법보다 유리하다. 당업계에 공지된 일부 방법은 상기 병합 단계에 대해 상기 마이크로비드를 정지 상태로 유지하기 위해 자성 마이크로비드와 자기장을 필요로 한다; 그러나 본 발명은 광범위한 마이크로비드 소재와 함께 사용하기에 적합하다. 따라서 높은 표면적 대 부피비 및 높은 로딩 능력과 같은 부착성 세포 배양을 위한 최적의 특성을 갖는 마이크로비드를 선택할 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 상기 방법은 매우 높은 종횡비를 갖은 직사각형 또는 디스크 형상의 비드를 포함하는 다양한 형상 및 종횡비의 마이크로비드와 함께 사용하기에 적합하다. 일부 실시예에서, 액적 내의 비드는 각각의 마이크로비드에 인가되는 외부 자력을 통해 유체 내에서 이동하게 된다. 평평한, 높은 종횡비의 마이크로비드는 응집 효과에 대한 감수성이 감소하기 때문에 이러한 방식의 조작에 특히 적합할 수 있다.

대안적으로, 또는 부가적으로, 본 발명의 방법은 층 구조로 형성되고 자화된 및 비자화된 소재를 포함하는 층들을 갖는 마이크로비드와 함께 사용하기에 적합하다. 또한 본 발명의 방법은 특정 비드의 식별을 돕기 위해 바코드 또는 마킹 패턴을 표시하는 마이크로비드에 사용하기에 적합하다. 일부 실시예에서, 마이크로비드는 겔 또는 하이드로겔로 구성될 수 있다. 겔은 세포 생존력을 증진시키기 위해 성장 인자 또는 영양소를 공급하는데 사용할 수 있으므로 유리할 수 있다.

더욱이, oEWOD 힘은 시약, 세포 및 기타 물질을 표면 상에 배치된 마이크로비드에 전달하기 위해 사용될 수 있다. 상기 마이크로비드는 외부 자력에 의해 독립적으로 유지되거나 또는 조작될 수 있다.

본 발명의 방법은 적어도 하나의 마이크로비드에 부착된 적어도 하나의 부착성 세포에 대한 선택, 분석, 배양 또는 회수 공정을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시예에서, 상기 선택 공정은 형광 내인성 리포터를 발현하는 해당 세포만을 선택하거나, 표면 마커 염색의 존재 시 신호를 나타내는 해당 세포만을 선택하거나, 상기 비드 주위에 특정 형태 또는 구조를 취하는 해당 세포만을 선택하는 것을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

일부 실시예에서, 상기 선택 공정은 추가의 병합 조작을 통해 하나 이상의 리포터 비드 요소를 상기 액적에 추가하고, 형광 리포터 분자와 비드 상에서 부착성 세포에 의해 분비된 단백질의 융합에 의해 유도된 리포터 비드 주위의 형광 신호의 형성을 모니터링하고, 이어서 특정 부류의 비드에 의해 포착된 물질을 분비하는 해당 세포만을 선택하는 것을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

일부 실시예에서, 분석 공정을 실시하는 것은 약물을 첨가하고 아포토시스(apotosis)나 세포 사멸과 같은 세포에서의 반응을 모니터링 또는 확인하거나, 상기 비드에 결합된 표적 세포에 작용하는 제2 세포 집단 또는 단일 세포를 첨가하거나, 바이러스 벡터를 첨가하거나 혹은 사이토카인이나 다른 화합물과 같은 자극제에 병합하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

일부 실시예에서, 배양 공정을 실시하는 것은 비드를 가로질러 증식하고 성장하도록 세포를 배양하거나, 배양 동안 각각의 액적에 첨가되는 상이한 영양소, 사이토카인 및 약물과 같은 다양한 조건에서 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일부 실시예에서, 관심있는 미세액적, 예를 들어 마이크로비드 및/또는 부착성 세포를 포함하는 미세액적을 회수하기 위하여 회수 공정을 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 회수된 미세액적은 추가의 실험을 위하여 조직 배양 처리된 웰 플레이트와 같은 플레이트 상에 분배될 수 있다.

상기 미세유체 칩은 코팅 구조를 포함할 수 있으며, 여기서 미세유체 칩은 미세액적을 조작하고 광학 매개 전기습윤 (oEWOD) 힘의 인가에 의해 상기 미세액적 내에 함유된 부착성 세포의 부착 및 탈착을 제어할 수 있도록 구성될 수 있다.

일부 실시예에서, 상기 미세유체 공간은 광학 매개 전기습윤 (oEWOD)을 통해 미세액적을 조작하도록 구성된 미세유체 칩의 일부이다.

일부 실시예에서, 상기 미세유체 공간은 광학 매개 전기습윤 (oEWOD)을 통해 복수의 제1 및 제2 미세액적을 조작하도록 구성된 미세유체 칩의 일부이다.

일부 실시예에서, 본 발명의 미세유체 칩은 제1 및 제2 복합벽(composite wall)을 포함하는 oEWOD 구조를 포함한다. 상기 제1 복합벽은 제1 기재; 상기 기재 상의 제1 투명 전도층을 포함하는 제1 기재, 상기 제1 투명전도층은 70 내지 250nm 범위의 두께를 가짐; 상기 전도층 상의 400-1000nm 파장 범위의 전자기 방사선에 의해 활성화되는 광활성층, 상기 광활성층은 300-1500nm 범위의 두께를 가짐, 및 상기 광활성층 상의 제1 유전층, 상기 제1 유전층은 30 내지 160nm 범위의 두께를 가짐,을 포함할 수 있다. 상기 제2 복합 벽은 제2 기재; 상기 기재 상의 제2 전도층, 상기 제2 전도층은 70 내지 250nm 범위의 두께를 가짐, 및 선택적으로 상기 제2 전도층 상의 제2 유전층, 상기 제2 유전층은 120 내지 160nm 범위의 두께를 가짐,을 포함할 수 있다. 상기 제1 및 제2 유전층의 노출된 표면은 미세액적을 함유하도록 구성된 미세유체 공간을 규정하기 위하여 180 μm 미만으로 이격하여 배치될 수 있다. 상기 제1 및 제2 전도층을 연결하는 상기 제1 및 제2 복합벽의 양단에 전압을 인가하기 위한 A/C 소스가 포함될 수 있다. 상기 제1 유전층의 표면 상에 대응하는 가상 전기습윤 위치를 유도하기 위하여 광활성층에 충돌하도록 구성된 상기 광활성층의 밴드갭보다 높은 에너지를 갖는 적어도 하나의 전자기 방사선 소스 또한 제공될 수 있다. 또한, 상기 광활성층 상의 전자기 방사선의 충돌점을 조작하기 위한 수단이 제공되며, 상기 가상 전기습윤 위치의 배치를 변화시켜 미세액적을 이동시킬 수 있는 적어도 하나의 전기습윤 경로를 생성하도록 구성된다.

일부 실시예에서, 상기 미세유체 공간은 광학 매개 전기습윤(oEWOD)을 통해 미세액적을 조작하도록 구성된 미세유체 칩의 일부이다.

일부 실시예에서, 본 발명의 미세유체 칩은 제1 및 제2 복합벽(composite wall)을 포함하는 oEWOD 구조를 포함한다. 상기 제1 복합벽은 제1 기재; 상기 기재 상의 제1 투명 전도층, 상기 제1 투명전도층은 70 내지 250nm 범위의 두께를 가짐; 상기 전도층 상의 400-850nm 파장 범위의 전자기 방사선에 의해 활성화되는 광활성층, 상기 광활성층은 300-1500nm 범위의 두께를 가짐, 및 상기 광활성층 상의 제1 유전층, 상기 제1 유전층은 30 내지 160nm 범위의 두께를 가짐,을 포함할 수 있다. 상기 제2 복합벽은 제2 기재; 상기 기재 상의 제2 전도층, 상기 제2 전도층은 70 내지 250nm 범위의 두께를 가짐, 및 선택적으로 상기 제2 전도층 상의 제2 유전층, 상기 제2 유전층은 30 내지 160nm 범위의 두께를 가짐,을 포함할 수 있다. 상기 제1 및 제2 유전층의 노출된 표면은 미세액적을 함유하도록 구성된 미세유체 공간을 규정하기 위하여 20~180 μm 이격하여 배치될 수 있다. 상기 제1 및 제2 전도층을 연결하는 상기 제1 및 제2 복합벽의 양단에 전압을 인가하기 위한 A/C 소스가 추가로 포함될 수 있다. 상기 칩은 제1 유전층의 표면 상에 대응하는 가상 전기습윤 위치를 유도하기 위하여 광활성층에 충돌하도록 구성된 상기 광활성층의 밴드갭보다 높은 에너지를 갖는 제1 및 제2 전자기 방사선 소스를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 칩은 상기 가상 전기습윤 위치의 배치를 변화시켜 미세액적을 이동시킬 수 있는 적어도 하나의 전기습윤 경로를 생성하도록, 광활성층 상의 전자기 방사선의 충돌점을 조작하기 위한 수단을 포함할 수 있다.

이러한 구조의 제1 및 제2 벽은 그 사이에 끼워진 미세유체 공간을 가지며 투명하다.

상기 제1 및 제2 기재는 상기 청구된 기하학적 구조를 유지하기에 기계적으로 충분히 강한 임의의 소재로 제조된다. 예를 들어: 유리, 금속 또는 엔지니어링 플라스틱. 일부 실시예에서, 상기 기재는 어느 정도의 유연성을 가질 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 제1 및 제2 기재는 100-1000μm 범위의 두께를 갖는다. 일부 실시예에서, 제1 기재는 실리콘, 용융 실리카 및 유리 중 하나로 구성된다. 일부 실시예에서, 제2 기재는 용융 실리카 및 유리 중 하나로 구성된다.

상기 제1 및 제2 전도층은 상기 제1 및 제2 기재의 일면에 위치하며, 전형적으로 70 내지 250nm, 바람직하게는 70 내지 150nm 범위의 두께를 갖는다. 이들 층 중 적어도 하나는 ITO(Indium Tin Oxide)와 같은 투명 전도성 재료, 은과 같은 전도성 금속의 초박막 또는 PEDOT와 같은 전도성 고분자 등으로 이루어진다. 상기 층들은 연속적인 시트 또는 와이어와 같은 일련의 개별 구조물로 형성될 수 있다. 대안적으로, 전도층은 전자기 방사선이 메쉬의 간극 사이로 향하는 전도성 소재의 메쉬일 수 있다.

상기 광활성층은 상기 제2 전자기 방사선 소스에 의한 자극에 반응하여 국부 전하 영역을 생성할 수 있는 반도체 소재를 포함할 수 있다. 예로서 300 내지 1500nm 범위의 두께를 갖는 수소화된 비정질 실리콘층을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 광활성층은 가시광선의 사용에 의해 활성화된다. 제1 벽의 경우 광활성층 및 선택적으로 제2 벽의 경우 전도층은 전형적으로 30 내지 160nm 두께 범위의 유전층으로 코팅된다. 상기 층의 유전특성은 바람직하게는 >10^7 V/m의 높은 유전강도와 >3의 유전상수를 포함한다. 바람직하게는, 절연파괴(dielectric breakdown)를 회피하는 것에 지장이 없을 만큼 가능한 한 얇다. 일부 실시예에서, 상기 유전층은 알루미나, 실리카, 하프니아 또는 비전도성 고분자 박막으로부터 선택된다.

이러한 구조의 다른 실시예에서, 적어도 상기 제1 유전층, 바람직하게는 둘 모두는 방오층으로 코팅되어, 다양한 가상 전기습윤 전극 위치에서 원하는 미세액적/캐리어 유체/표면 접촉각을 설정하는 것을 지원하고, 추가적으로 미세액적이 칩을 통해 이동함에 따라 미세액적의 내용물이 표면에 부착하거나 감소하는 것을 방지하는 것이 바람직하다. 상기 제2 벽이 제2 유전층을 포함하지 않는 경우, 제2 방오층은 상기 제2 전도층 상에 직접 도포될 수 있다.

최적의 성능을 위해, 상기 방오층은 250℃에서 공기-액체-표면 3점 계면으로 측정할 때, 50-180° 범위 내에 있어야 하는 미세액적/캐리어 유체/표면 접촉각을 설정하는데 도움이 되어야 한다. 일부 실시예에서, 상기 층(들)은 10nm 미만의 두께를 가지며 전형적으로 단분자층이다. 또 다른 실시예에서, 상기 층들은 메틸 메타크릴레이트나 친수성 기(예를 들어, 알콕시 실릴)로 치환된 그 유도체와 같은 아크릴레이트 에스테르의 고분자로 구성된다. 상기 방오층 중 하나 또는 둘 모두는 최적의 성능을 보장하기 위해 소수성이다. 일부 실시예에서, 20nm 미만의 두께의 실리카 간극층(interstitial layer)이 화학적으로 호환가능한 브리지를 제공하기 위해 방오코팅과 유전층 사이에 개재될 수 있다.

상기 제1 및 제2 유전층, 따라서 제1 및 제2 벽은 폭이 10 μm 이상, 바람직하게는 20-180μm 범위이고, 그 내부에 미세액적을 함유하는 미세유체 공간을 정의한다. 바람직하게는, 미세액적이 함유되기 전에, 미세액적 자체는 미세액적 공간의 폭보다 10%이상, 적절하게는 20%이상 큰 고유의 직경을 갖는다. 따라서, 칩에 들어가면서 상기 미세액적은 압축되어, 예를 들어 더 나은 미세액적 병합 능력을 통해 전기습윤 성능이 향상된다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 유전층은 플루오로실란과 같은 소수성 코팅으로 코팅된다.

다른 실시예에서, 미세유체 공간은 제1 및 제2 벽을 소정 거리만큼 이격시켜 유지하기 위한 하나 이상의 스페이서를 포함한다. 스페이서에 대한 옵션은 비드나 기둥, 광-패터닝에 의해 생성된 중간 레지스트층으로부터 생성된 융기(ridges)를 포함한다. 대안적으로, 실리콘 산화물 또는 실리콘 질화물과 같은 증착된 물질이 스페이서를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 접착제 코팅이 있거나 없는 유연성 플라스틱 필름을 포함하는 필름층을 사용하여 스페이서층을 형성할 수 있다. 다양한 스페이서 구조를 사용하여 좁은 채널, 테이퍼 채널 또는 기둥의 라인에 의해 정의되는 부분적으로 둘러싸인 채널을 형성할 수 있다. 신중한 설계에 의해, 상기 스페이서를 사용하여 미세액적의 변형을 돕고, 이어서 미세액적 분할을 수행하고 변형된 미세액적에 영향을 미치는 조작을 실시할 수 있다. 유사하게 이러한 스페 이서는 칩의 영역들을 물리적으로 분리하여 액적 집단들 사이의 교차 오염을 방지하고, 수압 하에서 칩에 로딩할 때 올바른 방향으로 액적의 흐름을 촉진하는데 사용될 수 있다.

상기 제1 및 제2 벽은 상기 전도체층에 부착된 A/C 전원을 사용하여 바이어스 되어 그들 사이에 전위차를 제공하며; 적절하게는 10V 내지 50V의 범위이다. 이러한 oEWOD 구조는 파장이 통상적으로 400-850nm 범위, 바람직하게는 660nm이며 광활성층의 밴드갭을 초과하는 에너지를 갖는 제2 전자기 방사선의 소스와 함께 사용된다. 적절하게는, 상기 광활성층은 사용되는 방사선의 입사 강도가 0.01 내지 0.2 Wcm^-2 범위인 가상 전기습윤 전극 위치에서 활성화될 것이다.

전자기 방사선의 소스가 픽셀화되는 경우 LED 또는 다른 램프 유래의 빛에 의해 조사되는 디지털 마이크로미러 장치(DMD)와 같은 반사 스크린을 사용하여 직접 또는 간접적으로 적절하게 공급된다. 이는 가상 전기습윤 전극 위치의 고도로 복잡한 패턴이 상기 제1 유전층 상에서 신속하게 생성되고 파괴될 수 있게 함으로써 미세액적이 밀접하게 제어된 전기습윤 힘을 사용하여 본질적으로 임의의 가상 경로를 따라 정밀하게 조종될 수 있게 한다. 이러한 전기습윤 경로는 상기 제1 유전층 상의 가상 전기습윤 전극 위치의 연속체로부터 구성되는 것으로 볼 수 있다.

광활성층 상의 전자기 방사선 소스의 충돌점은 통상의 원형 또는 환형을 포함하는 임의의 편리한 형상일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 점의 형태는 상응하는 픽셀화의 형태에 의해 결정되고, 다른 실시예에서는 미세액적이 일단 미세유체 공간에 들어가면 미세액적의 형태에 전적으로 또는 부분적으로 대응된다. 일 실시예에서, 충돌점 및 그에 따른 전기습윤 전극 위치는 초승달 형상일 수 있으며, 미세액적의 의도된 이동 방향으로 배향될 수 있다. 적절하게는 상기 전기습윤 전극 위치 그 자체는 상기 제1 벽에 부착된 미세액적 표면보다 더 작고, 상기 액적과 표면 유전체 사이에 형성된 접촉라인을 가로질러 최대 전계강도 구배를 제공한다.

oEWOD 구조의 일부 실시예에서, 상기 제2 벽은 가상 전기습윤 전극 위치가 동일하거나 상이한 전자기 방사선 소스에 의해 상기 제2 유전층 상에도 유도될 수 있게 하는 광활성층 또한 포함한다. 제2 유전층의 추가는 구조의 상부 표면으로부터 하부 표면까지 미세액적의 습윤 가장자리의 전이를 가능하게 하고, 각 미세액적에 더 많은 전기습윤 힘을 인가할 수 있게 한다.

상기 제1 및 제2 유전층은 단일 유전물질로 구성될 수도 있고, 둘 이상의 유전물질의 복합체일 수도 있다. 상기 유전층은 Al₂O₃ 및 SiO₂로부터 제조될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

제1 및 제2 유전체층들 사이에 구조물이 제공될 수 있다. 제1 및 제2 유전체층 사이의 상기 구조물은, 에폭시, 고분자, 실리콘 또는 유리 또는 이들의 혼합물이나 복합체로, 직선형, 각진형, 곡선형 또는 미세구조화된 벽/면 형상으로 제조될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 제1 및 제2 유전체 사이의 구조물은 상부 및 하부 복합벽에 연결되어 밀폐된 미세유체 장치를 생성하고, 상기 장치 내의 채널 및 영역을 정의할 수 있다. 상기 구조물은 두 복합벽 사이의 간격을 점유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 전도체와 유전체는 이미 벽을 갖는 성형된 기재 상에 증착될 수 있다.

본 발명의 방법과 장치의 일부 양태는 전기영동 또는 광학 핀셋(optical tweezer)을 통해 미세입자를 조작하도록 구성된 장치와 같은 전기습윤 장치 이외의 광학적으로-활성화된 장치에 응용하기에 적합하다. 이러한 장치에서 세포 또는 입자는 기능적으로 동일한 광학 기구를 사용하여 조작되고 검사되어 가상 광학 전기영동 구배를 생성한다. 본 명세서에서 정의된 마이크로입자는 생물학적 세포, 폴리스티렌 및 라텍스를 포함하는 물질로 제조된 마이크로비드, 하이드로겔, 자성 마이크로비드 또는 콜로이드와 같은 입자를 지칭할 수 있다. 전기영동 및 광학 핀셋 메커니즘은 당업계에 잘 알려져 있으며 당업자에 의해 용이하게 구현될 수 있다.

광학 전기습윤에 대해 전술한 방법과 유사하게, 광학 매개 전기영동의 조합을 통해 입자 및/또는 세포의 정밀 조작 및 상세 검사를 실시하기 위해 제1 고해상도 광학 어셈블리가 사용된다. 제2 조대(coarse) 광학 어셈블리는 유전영동 트랩의 어레이를 형성하기 위해 사용된다. 이러한 두 개의 어셈블리의 조합은 미세 광학 어셈블리를 사용하여 미세 조작 및 검사 작업을 수행하는 동안 조대 광학 어셈블리를 사용하여 매우 많은 수의 입자 및/또는 세포를 유지 및 운반하는 방법을 가능하게 한다.

따라서, 본 발명의 개시된 미세유체 칩은 유리하게는 넓은 범위의 크기에 걸친 미세액적의 조작과, 디지털 방식으로 제어되는 것을 가능하게 하며, 동적으로 재프로그램 가능한 작동 단계를 제공한다. 상기 장치의 미세유체 기재는 패턴화된 전극이 없으므로, 종래 접근 방식에 비해 여러 복잡한 저수율 제조 단계가 제거되고 전기적 상호 연결이 단순화된다. 이웃한 전극들 사이의 절연파괴에 의한 장치 고장 또한 제거된다.

따라서, 결과적인 장치 구조는 종래의 접근 방식에 비해 캐리어 상 및 액적의 독립적인 제어와 같은 보다 정교하고 통합된 워크플로우를 허용할 뿐만 아니라 미세유체 칩 표면의 영역에 걸쳐 더 큰 액적 밀도를 제어할 수 있도록 한다. 최대 100만 개의 액적이 동시에 조작될 수 있다.

상기 광학 조작 시스템은 통합된 광학 측정 및 검사 시스템과 결합될 수 있다. 이 보조 시스템은 사용자가 세포의 수, 마이크로비드의 수, 임의의 형광 신호의 밝기 및 세포의 형태를 포함하는 미세액적의 내용물을 결정할 수 있도록 한다. 액적 내용물의 자동화된 소프트웨어 인식에 의해, 원하지 않는 액적을 칩의 배출구로 내보내도록 상기 oEWOD 조작 패턴을 사용하여, 특정 바람직한 파라미터에 대해 칩 상의 액적을 풍부하게 할 수 있다. 이와 같이 원하는 분석 및 성장 단계를 실행하기 위해 칩 상에 확실하게 정확한 수의 담체 비드 및 세포를 포함하는 액적 집단을 형성하는 것이 가능할 수 있다.

상기 마이크로비드의 표면은 부분적으로 또는 완전히 코팅될 수 있다. 상기 마이크로비드는 단백질로 코팅될 수 있다. 일부 실시예에서, 마이크로비드들은 세포 부착을 용이하게 하도록 구성된 폴리펩티드의 표면 기능화를 갖는다. 일부 실시예에서, 마이크로비드는 세포 부착을 용이하게 하도록 구성된 폴리펩티드의 표면 기능화를 갖는다.

일부 실시예에서, 펩티드 표면 기능화는 하기 서열 중 하나 이상을 포함한다; Gly-Arg-Gly-Asp-Ser (GRGDS), Arg-Gly-Asp (RGD) 또는 Gly-Arg-Gly-Sap-Pro (GRGDSP). 상기 서열은 마이크로비드의 표면에서의 원치 않는 간섭을 최소화하기 때문에 바람직한 짧은 폴리펩티드 서열이다.

일부 실시예에서, 마이크로비드의 표면은 다음 중 하나 이상으로 코팅될 수 있다; 폴리펩티드, 콜라겐, 라미닌 (laminin), 마트리겔 (RTM, matrigel), 합성 하이드로겔 또는 폴리스티렌.

일부 실시예에서, 마이크로비드의 표면은 부착제(fouling reagent)로 코팅되어 부착층을 형성하고 표적 세포의 배양 성장 및 부착을 촉진할 수 있다. 상기 부착제는 태아 소 혈청(Fetal Bovine Serum)을 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 부착제는 다음과 같은 표준 성장 배지를 포함한다: F12 성장 배지, RPMI 배지, DMEM, 및 Opti-MEM (RTM). 다른 실시예에서, 부착제는 다음 중 하나를 포함한다: 녹색 형광 단백질, 소 혈청 알부민, 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 키틴, 마트리겔 (RTM), 하이드로겔, 및 엘라스틴.

다른 실시예에서, 상기 마이크로비드의 코팅 구조는 폴리리신(Polylysine), (3-아미노프로필)트리에톡시실란 (APTMS), 콜라겐, 라미닌 및 이산화규소 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.

일부 실시예에서, 상기 마이크로비드의 코팅 구조는 소 혈청 알부민 (BSA), 폴리리신, 콜라겐, 및 라미닌 중 하나를 포함할 수 있으며, 상기 코팅 구조를 형성하는 것은 상기 화합물이 자발적으로, 비-공유적으로(non-covalently) 기저의 표면에 부착되도록 상기 화합물을 포함하는 수용액으로 마이크로비드를 습윤시키는 것을 포함할 수 있다.

일부 실시예에서, 상기 마이크로비드의 코팅 구조는 화학적 링커를 통해 표면에 커플링된 BSA 층을 포함할 수 있다. 기저의 표면에 산화 알루미늄 층이 노출되는 실시예에서, 상기 화학적 링커는 16-포스포노헥사데칸산(16-phosphonohexadecanoic acid) 또는 3-아미노프로필포스폰산(3-Aminopropylphosphonic acid) 또는 3 내지 16(또는 그 이상)의 메틸렌기를 포함하는 알칸 사슬 링커에 커플링된 임의의 적절한 ω-포스포노카르복실산(ω-phosphonocarboxylic acid)을 포함한다. 기저의 표면에 이산화규소층이 노출되는 실시예에서, 상기 화학적 링커는 (3-아미노프로필)트리메톡시실란((3-Aminopropyl) trimethoxysilane) 또는 2-6개의 메틸렌기를 포함하는 알칸 사슬에 커플링된 적절한 ω-아미노포스폰산(ω-aminophosphonic acid)을 포함한다. 일부 실시예에서, 단백질을 전술한 화학적 링커에 커플링시키는 것은 단백질 그룹과 표면 사이에 공유결합이 형성되도록 BSA와 표면 모두를 N-(3-디메틸아미노프 로필)-N'-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC)에 동시에 노출시키는 것에 의해 수행된다.

또는, 일부 실시예에서, 공유 결합은 먼저 N-하이드록시 술포숙신이미드 나트륨염 (sulfo-NHS)의 존재 하에서 EDC를 사용하여 표면을 활성화시키고, 후속 단계에서 BSA를 도입하는 것에 의해 형된된다. 또는, 상기 공유 결합은 EDC를 사용하지 않고, 예를 들어 숙신이미딜 에스테르 또는 숙신산 무수물 말단을 갖는 링커를 사용하여 형성될 수 있다. 일부 실시예에서, BSA는 콜라겐, 라미닌 또는 피브로넥틴과 같은 다른 적절한 단백질로 대체된다. 다른 실시예에서, BSA는 상기 열거된 적절한 단백질의 혼합물로 대체된다.

다른 실시예에서, 상기 마이크로비드의 코팅 구조는 이산화규소를 포함할 수 있으며, 상기 코팅 구조를 형성하는 것은 스퍼터링, 원자층 증착 또는 그의 열 증발 중 하나를 포함할 수 있다.

일부 실시예에서, 상기 마이크로비드의 코팅 구조는 표적 세포의 표면에 항원의 부착을 용이하게 하는 항체층을 포함할 수 있다. 마이크로비드의 코팅 구조는 생물학적 활성 물질을 이용한 기능화에 한정되지 않는다.

바람직하게는, 부착성 세포는 그 본래의 부착 상태에 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 부착성 세포는 그 본래의 부착 상태에 있다. 특별히 명시되지 않는 한, 본 명세서에 정의된 용어 "본래의 상태 (native state)"는 부착성 세포가 증식하고 안정적인 표현형 발현 상태를 나타내는 부착 상태에 있는 부착성 세포의 물리적 및/또는 화학적 특성을 지칭한다. 본래의 부착 상태에서, 부착성 세포는 고정 의존적이고 세포 생존 및 세포 성장을 위해 고형 지지체에 부착해야 한다. 일부 실시예에서, 고형 지지체는 마이크로비드일 수 있다. 부착성 세포가 현탁액에서 성장하도록 순응될 수 있지만, 이를 위해서는 세포가 부착 상태에서 현탁 상태로 전이되어야 하며, 이러한 과정은 세포에 스트레스를 유발하고 세포 생존능을 감소 시키며 세포들의 발현 프로파일을 변화시킨다. 일부 응용 분야에서, 부착성 세포는 회수 후 부착 상태의 콜로니에서 성장하는 것이 요구된다. 따라서, 세포가 그 본래의 부착 상태에서 미세유체 시스템으로부터 성장되고 회수될 수 있는 시스템을 갖는 것은 매우 유리하다. 그 본래의 부착 상태에서 부착성 세포를 배양하는 시스템은 세포를 칩 밖으로 운송하기 위해 일시적으로 현탁 상태로 전환한 다음 다시 마이크로웰 플레이트 또는 플라스크에서 성장을 위해 부착 상태로 되돌려야 하는 것을 방지하며, 따라서 세포에 스트레스를 주는 것을 방지한다.

일부 실시예에서, 상기 방법은 액적 당 비드 및 세포의 수를 결정하기 위하여 복수의 제1 및 복수의 제2 미세액적을 검사하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

일부 실시예에서, 상기 방법은 병합 전에, 미세액적의 내용물 및 미세액적 당 비드 또는 세포의 수를 결정하기 위해, 적어도 복수의 제1 및 복수의 제2 미세액적의 서브세트를 검사하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시예에서, 상기 방법은 원하는 세포 수를 갖는 것을 제외한 미세액적을 폐기하도록 구성된 분류 작업 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 원하는 세포 수를 갖는 것을 제외한 하나 이상의 미세액적을 폐기하기 위한 분류 작업 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 클론형성능 (clonality)을 유지하기 위해 필요한 원하는 세포 수는 하나의 단일 세포이다.

일부 실시예에서, 상기 방법은 원하는 비드 수를 갖는 것을 제외한 미세액적을 폐기하기 위한 분류 작업 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 원하는 비드 수를 갖는 것을 제외한 하나 이상의 미세액적을 폐기하기 위한 분류 작업 단계를 추가로 포함할 수 있다. 원하는 비드 수는 1 내지 10의 범위내 이거나, 또는 2, 4, 6 또는 8 초과일 수 있다. 일부 실시예에서, 원하는 비드 수는 10, 8, 6, 4 또는 2 미만일 수 있다.

일부 실시예에서, 상기 방법은 소정의 임계값 미만의 비드 수를 갖는 미세액적의 선택을 식별하고 상기 선택된 액적 중 둘 이상을 병합하여 비드 수를 증가시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 소정의 임계값 미만의 비드 수를 갖는 미세액적의 선택을 식별하고 상기 선택된 미세액적 중 둘 이상을 병합하여 비드 수를 증가시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 소정의 임계값은 분석마다 다를 수 있다. 예로서, 1 내지 10개의 마이크로비드를 함유하는 미세액적을 병합하기 위해 선택하거나, 3 내지 10개의 마이크로비드를 병합하기 위해 선택할 수 있다. 다른 예에서, 10 내지 30개의 마 이크로비드, 10 내지 40, 10 내지 50, 10 내지 60, 10 내지 80개의 마이크로비드를 함유하는 미세액적을 병합하기 위해 선택할 수 있다. 선택적으로, 1 내지 100개의 마이크로비드를 함유하는 미세액적을 병합하기 위해 선택할 수 있다. 추가적인 예에서, 100 내지 200개의 마이크로비드를 함유하는 미세액적을 병합하기 위해 선택할 수 있다. 추가적인 예에서, 100 내지 300, 100 내지 400, 100 내지 500, 100 내지 600, 100 내지 700, 100 내지 800 또는 100 내지 900개의 마이크로비드를 함유하는 미세액적을 병합을 위해 선택할 있다. 선택적으로, 1000개 이상의 마이크로비드를 포함하는 미세액적을 병합 조작을 위해 선택할 수 있다. 병합 조작은 oEWOD 또는 EWOD를 사용하여 이루어질 수 있다.

일부 실시예에서, 상기 방법은 소정의 임계값 수준의 비드 수를 갖는 미세액적의 선택을 식별하고 상기 선택된 미세액적을 둘 이상으로 분할하여 비드 수를 감소시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 소정의 임계값은 분석마다 다를 수 있다. 이 경우 및 단지 예로서, 1 내지 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 이상의 마이크로비드를 함유하는 미세액적이 분할을 위해 선택될 수 있다. 분할 조작은 oEWOD 또는 EWOD를 사용하여 이루어질 수 있다.

일부 실시예에서, 미세액적의 분류 및/또는 선택은 oEWOD 제어 하에서 수행될 수 있다. oEWOD를 사용하여 액적을 분류하는 것은 분류 및 선택 조작에서 사용되는 채널 및/또는 밸브에 대한 요구사항을 피할 수 있기 때문에 유리하다. 따라서 oEWOD 제어 하에서 액적을 분류하면 칩에 사용되는 공간의 효율이 증가할 수 있으며, 미세액적 분류 작업의 속도를 증가시킬 수 있다.

일부 실시예에서, 복수의 제1 및/또는 제2 미세액적들 각각은 커플링 촉진제를 추가로 포함할 수 있다.

하나 이상의 미세액적은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노) 프로필 카보디이미드, 하이로클로라이드 (EDC)와 같은 커플링 촉진제를 추가로 포함할 수 있다. 커플링 촉진제는 비드 또는 단백질 코팅에서 카르복실기를 활성화시켜 세포 또는 다른 단백질 상의 아미드기와 공유 결합을 형성하도록 하는 가교제이다. 활성화된 카르복실기의 밀도가 높을수록 더 강한 결합을 형성한다.

일부 실시예에서, 상기 방법은 상기 미세 유체 공간에 대체 캐리어 상을 도입하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있으며, 상기 캐리어 상은 세포 성장 배지와 평형을 이룬다. 세포 성장 배지의 예로 RPMI 1640, EMEM, DMEM이 있다. Ham's F12, Ham's F10, F12-K, Hat 배지를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

일부 실시예에서, 제1 유체 및/또는 제2 유체는 세포 성장 매체를 포함할 수 있으며, 상기 방법은 상기 미세 유체 공간에 캐리어 상을 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 캐리어 상은 세포 성장 배지와 평형을 이루고, 상기 캐리어 상은 상기 병합된 미세액적으로부터 고갈된 임의의 세포 성장 배지를 대체한다.

대체 캐리어 상은 주변의 오일과 연속적으로 교환하는 유체를 포함할 수 있다. 세포가 액적에서 성장함에 따라 세포는 캐리어 상을 통해 산소 및/또는 이산화탄소의 국부적 환경을 고갈시킨다. 주요 영양소 및 산소와 이산화탄소 가스와 같은 세포 성장을 촉진하는 가스의 공급이 캐리어 상에 용해될 수 있다. 일부 실시예에서, 산소, 이산화탄소 및 세포 성장에 중요한 다른 가스는 캐리어 상에서 지속적으로 대체되어 배지를 보충한다.

세포 성장 배지 및/또는 산소 및 이산화탄소로 캐리어 상을 평형화하는 것은 사용자가 pH를 제어할 수 있도록 하기 때문에 유리할 수 있다. 추가로 상기 캐리어 상은 작지만 물 및 세포 배지를 용해시키기에는 충분한 용량을 가질 수 있다. 오일을 세포 배지로 전처리함으로써, 액적이 더욱 안정해질 수 있다.

일부 실시예에서, 사용될 수 있는 세포 성장 배지는 RPMI 1640, EMEM, DMEM, Ham's F12, Ham's F10, F12-K 및/또는 HAT 배지를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

일부 실시예에서, 상기 캐리어 상은 방출제(release agent)를 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시예에서, 상기 캐리어 상은 적어도 하나의 마이크로비드로부터 적어도 하나의 부착성 세포를 방출하기 위한 방출제를 포함할 수 있다.

본 발명의 문맥 내에서 사용되는 용어 '방출제'는 이전에 부착된 고형 지지체로부터 부착성 세포의 탈착을 촉진하는 임의의 물질을 포함한다. 상기 방출제는 상기 세포에 대한 손상을 최소화하는 반면 세포-지지체 상호 작용을 파 괴함으로써 지지체로부터 부착성 세포의 방출을 촉진한다.

일부 실시예에서, 상기 방출제는 다음 중 하나 이상일 수 있다: 트립신, EDTA, 프로테아제, 시트르산 또는 아큐타아제 (RTM).

일부 실시예에서, 상기 방출제는 다음 중 하나 이상일 수 있다: 트립신, EDTA, 프로테아제 또는 시트르산.

분석 동안 방출제를 도입하면 세포가 선택적으로 부착 상태로부터 다시 현탁 상태로 되돌아갈 수 있다. 유리하게는, 현탁 상태의 세포는 추가의 계대배양을 위한 액적 분할 조작에 의해 형성된 두 개의 딸 액적 간 세포 집단의 분할을 포함하는 추가의 조작 대상이 될 수 있다. 더 나아가 현탁 상태의 세포는 세포의 계대 선택으로 딸 액적에서 샘플링될 수 있으며, 추가 분석을 위해 오프-칩으로 회수될 수 있다.

일부 실시예에서, 상기 방법은 병합된 액적을 배양하고, 비드에 부착된 세포를 모니터링하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 상기 복수의 병합된 미세액적을 배양하고 상기 각각의 병합된 미세액적에서 상기 마이크로비드에 부착된 세포를 모니터링하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 배양은 37℃, 5% CO₂, 21% O₂ 및 95% 초과의 상대습도의 조성인 대기압에서 수행될 수 있다.

이러한 모니터링은 세포 형태를 결정하고 세포의 수를 세기 위한 명시야 현미경 검사를 포함한다. 유사하게 형광 이미지 또는 암시야 이미지는 화학 조성이나 형광 리포터의 측정을 통해 세포의 표현형 특성을 결정하기 위해 촬영될 수 있다. 형광 리포터는 세포가 현미경 검사에 의해 측정될 수 있는 형광 단백질을 발현하는 내인성 리포터 시스템을 포함한다. 세포 표면 상 또는 세포체 내의 물질에 특이적일 수 있는 외인성 형광 리포터 또한 포함한다; 세포 근방의 외인성 리포터의 축적을 나타내는 형광 이미지는 마찬가지로 특정 표현형 상태를 나타낼 수 있다. 세포의 표현형 상태는 부착 상태에 있는 지 여부에 따라 크게 의존할 수 있다. 따라서 부착 구조에 있는 동안 세포의 표현형 상태를 모니터링할 수 있다면 포유동물 세포 바이오생산과 같은 많은 중요한 공정을 프로파일링 하는데 유리하다.

일부 실시예에서, 상기 방법은 상기 병합된 미세액적에서 온-칩 리포터 분석을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 리포트 분석은 검출을 위해 병합된 미세액적에 형광 리포터를 부착하는 사용을 포함할 수 있다. 이는 상기 부착 상태에서만 분석될 수 있도록 (즉, 일부 세포는 마이크로비드에 부착된 후 사이토카인을 분비하기 시작할 수 있다) 세포가 변형된 병합된 액적 내에서 부착성 세포를 검출하는 데 중요할 수 있다.

일부 실시예에서, 상기 방법은 상기 병합된 미세액적을 용기에 분배하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 용기는 조직 배양 처리된 웰 플레이트와 같은 웰 플레이트일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 상기 병합된 미세액적을 하나 이상의 조직 배양 처리된 웰 플레이트로 분배하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 단계는 수반된 어떠한 추가 공정 단계 없이 사용자가 세포를 액적 밖으로, 비드 위에, 그 후 조직 배양 처리된 웰 플레이트 상에 수득할 수 있도록 하기 때문에 유리할 수 있다.

일부 실시예에서, 상기 방법은 세포가 표면에 부착되고 증식되도록 처리된 웰 플레이트의 표면에 증착하기 위하여 병합된 미세액적에 함유된 비드와 세포를 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 유리하게, 상기 실시예에서, 세포는 부착 상태를 벗어나지 않은 채 처리된 웰 플레이트로 회수되어 비드로부터 플레이트 표면으로 확산될 수 있다. 상기 실시예에서, 비드 상의 부착성 세포의 클러스터 (또는 단일 부착성 세포)는 세포 부착에 적합한 표면에 근접하여 증착된다. 비드가 미세액적 내에 있는 경우, 이러한 증착은 인쇄, 점적(spotting) 공정 또는 유출구(orifice)를 통해 표면에 액적을 분배하는 것을 통해 이루어질 수 있다. 비드와 세포(들)이 표면과 만난 후, 세포는 자발적으로 표면에 부착될 수 있다. 더 나아가 세포는 증식할 수 있으며, 증식 과정을 통해 표면에 부착될 수 있다. 유리하게, 상기 실시예는 배양 표면에 증착시키기 전에 세포를 비드로부터 제거하여 재현탁시킬 필요가 없다.

일부 실시예에서, 상기 방법은 처리된 웰 플레이트의 표면 상에 상기 복수의 병합된 미세액적을 증착하는 단계를 추가로 포함하며, 여기에서 각각의 병합된 미세액적은 적어도 하나의 마이크로 비드에 부착된 적어도 하나의 세포를 함유한다.

본 발명은 이제 단지 예시로서 그리고 첨부된 도면을 참조하여 더욱 상세하게 설명될 것이다.

도 1은 본 발명의 방법을 보여주는 순서도를 제공한다;
도 2는 마이크로비드를 함유하는 미세액적과 부착성 세포를 함유하는 미세액적의 모식도를 보여준다;
도 3은 미세유체 칩에서 본 발명의 방법을 수행하기 위한 예시적인 구성을 보여준다;
도 4는 단일 마이크로비드에 부착된 단일 세포을 보여준다;
도 5는 미세액적 내 다수의 마이크로비드와 다수의 세포를 보여준다;
도 6은 미세액적 내 단일 마이크로비드 및 다수의 세포를 보여준다;
도 7의 A 및 도 7의 B는 각각 4 시간 및 22 시간에 마이크로비드와 결합 후 세포 생존능을 예시한다; 및
도 8의 A 및 도 8의 B는 각각 4 시간 및 22시간에 마이크로비드에서 세포 증식을 보여준다.

도1 및 도2를 참조하면, 미세액적 분석 시스템에서 부착성 세포와 같은 세포(50)를 취급하는 방법이 도시되고 예시되어 있다. 상기 방법은 부착성 세포를 마이크로비드에 접합시키는 것을 포함한다. 도 1을 참고하면, 마이크로비드와 제1 유체를 함유하는 복수의 제1 미세액적을 미세유체 공간(52)에 로딩한다. 미세유체 공간은 광학 매개 전기습윤 (oEWOD)을 통해 미세액적을 조작하도록 구성된 미세유체 칩의 일부이다. 부착성 세포와 제2 유체를 포함하는 복수의 제2 미세액적 또한 미세유체 공간(54)에 로딩된다. 상기 제2 미세액적은 상기 제1 미세액적과 동일한 미세유체 칩 상에 로딩될 수 있고, 상기 부착성 세포를 포함하는 제1 미세액적에 인접하여 위치할 수 있다. 상기 복수의 제1 및 제2 미세액적은 모세관 작용을 통해 미세 유체 공간에 로딩되거나 압력 구동 유동을 통해 미세 유체 공간에 로딩될 수 있다. 일부 경우에는, 복수의 제1 및/또는 미세액적을 미세유체 공간에 로딩하기 위해 펌프 또는 주사기가 사용될 수 있다.

다음 단계에서, 복수의 제1 미세액적은 복수의 제2 미세액적(56)과 병합된다. 제2 미세액적은, 예를 들어 2쌍의 미세액적 어레이에서 제1 미세액적과 쌍을 이루게 될 수 있다. 이후 제2 미세액적은 제1 미세액적과 병합되어 복수의 병합된 미세액적을 형성하게 된다. 이어서, 각각의 병합된 미세액적은 제1 및 제2 유체, 적어도 하나의 마이크로비드 및 적어도 하나의 부착성 세포를 함유한다.

도 1에 도시된 바와 같이, 상기 방법은 교반 또는 진탕 또는 적어도 하나의 부착성 세포가 적어도 하나의 마이크로비드를 향해 이동하여 그 자체가 마이크로비드에 부착하도록 제1 및 제2 유체의 흐름을 유발할 수 있는 임의의 다른 힘을 통해 상기 병합된 미세액적(58)을 교반하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 병합된 미세액적은 세포와 비드가 접촉하여 부착이 시작될 때까지 교반된다. 관심 미세액적은 이후 배양되고 세포가 마이크로비드에 부착되는 공정이 모니터링된다.

상기 마이크로비드는 2 μm 내지 200 μm의 직경을 가질 수 있으나, 10, 20, 40, 80, 100, 120, 140, 160 또는 180 μm보다 클 수 있다. 일부 실시예에서, 마이크로비드의 직경은 200, 180, 160, 140, 120, 100, 80, 40, 20 또는 10 μm 미만일 수 있다. 경우에 따라, 두 개 이상의 마이크로비드가 함께 모여 비드 클러스터를 형성할 수 있다. 비드 클러스터의 형성은 배지의 pH 및/또는 염 함량과 같은 배지의 조건을 변경함으로써 발생할 수 있다. 비드는 더 많은 부착성 세포가 부착하기 위한 더 큰 면적을 제공하도록 함께 클러스터를 형성하여 더 큰 표면적을 제공할 수 있다.

추가로, 마이크로비드의 표면은 짧은 폴리펩티드와 같은 단백질로 코팅 및/또는 기능화될 수 있다. 폴리펩티드 서열의 예는 GRGD, RGD, GRGDS 또는 GRGDSP를 포함할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 마이크로비드는 폴리펩티드로 부분적으로 또는 완전히 코팅될 수 있다. 상기 마이크로비드의 표면에 부착된 폴리펩티드는 세포 부착을 용이하게 할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 마이크로비드의 표면은 하기 소재, 즉, 콜라겐, 라미닌 및/또는 폴리스티렌 중 하나 이상으로 코팅될 수 있다.

마이크로비드의 소재는 다음 물질 중 하나 이상으로부터 제조될 수 있다: 실리카, 폴리스티렌, 라텍스, 폴리에스테르, PMMA, 마그네타이트(magnetite) 및/또는 페라이트(ferrite).

일 예에서, 마이크로비드는 Gly-Arg-Gly-Asp-Ser(GRGDS)와 같은 짧은 펩타이드의 표면 기능화로 제조될 수 있다. 짧은 펩타이드 즉, Gly-Arg-Gly-Asp-Ser (GRGDS)는 커플링 완충액(커플링 완충액: 0.1M MES, 0.5M NaCI, pH 5.5)에 100 ug/mL로 분주될 수 있다. 비드 슬러리에 EDC를 즉시 부을 수 있다. 이후 상기 비드를 볼텍스(vortex)하고, 회전기에서 약 2시간 동안 상온 배양한다. 때때로, 혼합물을 배양 중에 볼텍스할 수 있다. 이후 비드를 세척하고, 1x PBS, 0.1% tween 20 및 0.02% NaN3, pH 7.4에서 재현탁한다. 상기 약술한 공정은 GRGDS의 단백질 서열로 코팅된 마이크로비드를 제공한다. 마이크로비드는 GRD와 같은 다른 단백질 서열로 코팅될 수 있다.

도 2를 참조하면, 본 발명에 따른 방법이 도시되어 있다. 도 2에 도시된 바와 같이, 액적(60) 내의 비드(62)는 광유체 장치 상에서 액적(60) 내의 세포(64)와 병합된다. 병합 후, 결합된 액적(66)은 화살표(67)로 표시된 바와 같이 교반되어, 비드(62)와 세포(64)가 물리적으로 상호작용하게 된다. 비드(62) 및 세포(64)의 클 러스터는 액적 내부에서 배양되고 세포들은 부착 상태로 들어간다. 상기 클러스터는 세포 형태가 부착 상태의 특성으로 변경되었는 지 확인하기 위해 검사될 수 있다.

마이크로비드 에멀젼의 제조는 유화 장치를 통해 압력 하에서 펌핑하기 전에 먼저 비드를 세포 배지 용액에 현탁하는 것을 필요로 한다. 초기 용액에서의 부피 비드 밀도는 생성된 에멀젼에서 요구되는 비드 밀도와 일치해야 하며, 유화 공정 전반에 걸쳐 균질한 분산을 유지하도록 비드를 교반하여야 한다. 상기 유화 장치는 일단에 배출구와 타단에 연속 유체의 주입구를 갖는 미세채널 플레이트 칩을 포함한다. 배출구의 단부는 캐리어 상의 용기에 침지된다; 일반적으로 이는 비드 배지와 비혼화성인 오일-기반 캐리어 상이다. 플레이트를 통해 펌핑된 비드는 배지가 액적으로 갈라지는 배출구에서 배지에 의해 둘러싸여 배출된다. 캐리어 상에 의해 둘러싸인 비드를 함유하는 배지 액적의 생성된 에멀젼은 이후 세포-기반 분석에 사용하기 위해 광유체 칩으로 펌핑될 수 있다.

세포 에멀젼의 제조는 일반적으로 바닥이 평평한 세포 배양 플라스크에서 유지되는 오프-칩 배양 스톡으로부터 세포를 회수하는 것을 필요로 한다. 부착 상태로 배양되고 있는 세포는 트립신 또는 다른 적절한 방출제를 사용하여 재현탁하여야 한다. 이후 방출제는 부착 상태로의 후속 복귀를 방해하지 않도록 비활성화되거나 또는 제거되어야 한다; 제거는 원심분리기에서 세포를 용기의 바닥으로 회전시키고, 상등액을 배지로 교체하는 반복 세척 단계에 의해 달성될 수 있다. 비활성화는 프로테아제-기반 방출제를 함유하는 용액에 과량의 단백질 기질을 첨가하는 것에 의해 달성될 수 있다. 각 액적의 내부에 세포의 특정 점유가 필요한 경우에는, 투입물에서 세포의 밀도가 요구되는 액적 점유와 일치하도록 투입물이 희석되거나 농축되어야 한다. 일단 세포가 현탁되고 요구되는 밀도에 도달하고 방출제가 비활성화되거나 제거되면, 세포는 마이크로비드에 대해 전술한 것과 같이 유화 장치를 통하여 펌핑되어야 한다.

생성된 에멀젼은 이후 액적 조작 및 세포와 비드의 부착 클러스터 형성을 위한 광유체 칩으로 펌핑된다.

추가의 분석을 위해, 적어도 하나의 마이크로비드에 부착된 적어도 하나의 부착성 세포를 함유하는 적어도 하나의 병합된 미세액적이 선택될 수 있다. 예를 들어, 배양된 부착성 세포에 형광 리포터 염료를 도입하는 것과 같은, 일부 예시적인 분석이 상기 배양된 부착성 세포에서 수행되었다. 배양된 부착성 세포에서 수행될 수 있는 다른 예시적인 분석은 다음을 포함할 수 있다: 리포터 비드의 도입, FRET 리포터의 도입, 내인적으로 발현된 리포터의 이미징, 미시적인 세포 형태 측정, 배양된 세포의 용해(lysis), PCR, 등온 증폭(isothermal amplication) 또는 형광 in-situ 혼성화와 같은 유전자 검출 분석 및 DNA 시퀀싱 준비. 또는, 탈착된 세포는 추가의 분석을 위해 칩 외부(off-chip)로 유출될 수 있다.

도 3을 참조하면, 개시된 바와 같은 본 발명에 따른 방법을 실시하기에 적합한 oEWOD 스택을 포함하는 미세유체 칩의 예시적인 구성이 도시되어 있다.

일반적으로, 액적 조작을 위한 미세유체 장치는, 예를 들어 비혼화성 캐리어 상의 존재 하에서, 카트리지 또는 미세유체 튜빙의 두 개의 대향 벽에 의해 정의된 미세 유체 공간을 통해 액적이 이동하도록 할 수 있다. 한쪽 또는 양쪽 벽 내에 내장된 미세전극은 각각이 층의 전계 특성을 수정하도록 간격을 두고 빠르게 스위치를 켜고 끌 수 있는 A/C 바이어싱 회로에 연결되어 있는 유전층으로 덮여있다. 이는 미세전극의 근방에서 하나 이상의 소정의 경로를 따라 액적을 조종하기 위해 사용될 수 있는 국부화된 방향성 모세관력을 발생시킨다. 상기 장치는 약어 EWOD(Electrowetting on Dielectric) 장치로 알려져 있다. 전기습윤 힘이 광학적으로 매개되는 이 접근법의 변형은 광전기습윤으로서, 그리고 이하에서의 해당 약어 oEWOD로 당업계에 공지되어 있다.

oEWOD를 사용하는 미세유체 장치는 제1 및 제2 벽에 의해 정의된 미세유체 공동을 포함할 수 있고, 여기에서 상기 제1 벽은 복합설계이고 기재, 광전도층 및 절연층(유전층)을 포함한다. 상기 광전도층과 절연층 사이에는, 서로 전기적으로 절연되며, 상기 광활성층에 결합되고, 상기 절연층 상에 상응하는 전기습윤 전극 위치를 생성하는 기능을 하는 전도성 셀의 어레이가 배치될 수 있다. 상기 위치에서, 액적의 표면 장력 특성은 전기습윤 필드에 의해 수정될 수 있다. 상기 전도성 셀은 이후 광전도층 상에 충돌하는 빛에 의해 일시적으로 스위치를 켤 수 있다. 이 접근법은 유용성이 전극 배열에 의해 어느 정도 제한되지만, 스위칭이 훨씬 쉽고 빠르다는 장점이 있다. 또한 액적을 이동시킬 수 있는 속도 및 실제 액적 경로를 변화시킬 수 있는 정도에 제한이 있다.

도 3에 도시된 것과 같은 예시적 장치는 25℃에서 점도가 1 센티스토크 이하인 플루오로카본오일에 유화되고, 제한되지 않은 상태에서의 직경이 100 μm 미만, 예를 들어 20 내지 80 μm 범위인 수성 미세액적(1)의 조작에 적합하다. 일부 실시예에서, 직경은 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 140, 160 또는 180 μm보다 클 수 있다. 일부 실시예에서, 직경은 200, 180, 160, 140, 120, 100, 80, 60, 50, 30, 30 또는 20 μm 미만일 수 있다.

상기 장치의 oEWOD 스택은 130 nm 두께의 전도성 인듐 주석 산화물(ITO)의 투명층(3)으로 코팅된 각 500 μm 두께의 상부(2a) 및 하부(2b) 유리 플레이트를 포함한다. 각각의 전도성 인듐 주석 산화물(ITO)층(3)은 하부 유리 플레이트(2b) 상의 ITO층이 접지된 상태에서 A/C 소스(4)에 연결된다. 하부 유리 플레이트(2b)는 800 nm 두께의 비정질 실리콘층(5)으로 코팅된다. 상부 유리 플레이트(2a) 및 비정질 실리콘(5)층은 고순도 알루미나 또는 하프니아층(6)의 표면이 소수성이 되도록 폴리(3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트)의 단일층(7)으로 차례로 코팅된 160nm 두께의 고순도 알루미나 또는 하프니아층(6)으로 각각 코팅된다.

상부 유리 플레이트(2a) 및 비정질 실리콘층(5)은 상기 미세액적이 상기 장치 공동 내로 도입될 때 어느 정도 압축되도록 스페이서(미도시)를 사용하여 8 μm 이격된다. LED 광원(8)에 의해 조명된 반사 픽셀화된 스크린의 이미지는 일반적으로 하부 유리 플레이트(2b)의 아래에 배치되고, 0.01Wcm2 수준의 가시광선(파장 660 또는 830 nm)이 각 다이오드(9)로부터 방출되어, 하부 유리 플레이트(2b)와 전도성 인듐 주석 산화물(ITO)층(3)을 통하여 다중 상향 화살표의 방향으로 전파하여 비정질 실리콘층(5)에 충돌하게 된다.

상기 다양한 충돌점에서, 상응하는 전기습윤 위치(11)에서 고순도 알루미나 또는 하프니아층(6) 층 상에 수정된 액체-고체 접촉각을 유도하는 광여기된 전하 영역(10)이 비정질 실리콘층(5) 상에 생성된다. 상기 수정된 특성은 미세액적(1)을 하나의 전기습윤 위치(11)로부터 다른 위치로 밀어내는 데 필요한 모세관력을 제공한다. LED 광원(8)은 사전-프로그램된 알고리즘에 의해 어느 순간에 어레이의 어떤 다이오드(9)가 조명될 지를 결정하는 마이크로 프로세서(12)에 의해 제어된다.

본 발명의 상기 방법을 실시하기에 적합한 미세유체 칩의 추가적인 특정 세부 사항은 본 명세서에 참조로 포함된 공개 특허 WO 2018/234445에서 확인할 수 있다.

본 발명의 장치는 또한 다음과 같은 부착성 세포 조건에 적합한 환경 제어의 수단을 제공한다: 제어된 온도, 상이한 유동 영역, 배양된 세포에 영양소를 연속적으로 공급하기 위한 캐리어 상의 제어 및 배양 세포를 둘러싸는 캐리어 상에서 국부적인 가스 농도의 제어.

예를 들어, 상기 부착성 세포 배양물은 저속 유동 영역에 위치되고, 성장을 촉진하는 영양소 및 화학 물질을 함유하고 상기 배양물에 공급하는 더 빠른 유동 영역으로 둘러싸일 수 있다.

도 4를 참조하면, 병합된 미세액적 내부의 단일 마이크로비드와 단일 부착성 세포가 도시되어 있다. 각 단계는 대략 0시간, 15분, 30분, 4시간 내지 22시간에 취하여 마이크로비드에 부착성 세포의 부착을 보여준다. 시간이 경과함에 따라, 단일 마이크로비드와 단일 부착성 세포가 서로 접촉하게 된다. 단일 부착성 세포는 도 4에 도시된 바와 같이 미세액적 내에서 마이크로비드에 부착된다. 도 4에 표시된 화살표는 부착성 세포의 증식을 나타낸다.

도 5를 참조하면, 다수의 마이크로비드 및 다수의 부착성 세포를 함유하는 병합된 미세액적이 도시되어 있다. 병합된 미세액적은 0시간, 15분, 30분, 4시간 및 22시간의 각 단계에서 모니터링하였다. 도 5는 마이크로비드를 덮는 다수의 부착성 세포 및 하나 이상의 마이크로비드에 대한 응집체를 보여준다. 일부 실시예에서, 구조, 크기 및/또는 형태와 같은 세포 형태는 마이크로비드와의 배양 기간 동안 변할 수 있다. 형태의 변화는 세포의 표현형 상태와 성장 과정을 나타낸다; 이는 세포 건강 및 생존능의 지표로 사용될 수 있다.

도 6을 참조하면, 다수의 부착성 세포를 갖는 단일 비드를 함유하는 병합된 미세액적이 도시되어 있다. 병합된 관심 미세액적은 0시간, 15분, 30분, 4시간 및 22시간의 각 단계에서 모니터링하였다. 도 6은 다수의 부착성 세포가 단일 마이크로비드에 부착될 수 있음을 보여준다. 경우에 따라서는, 구조, 크기 및/또는 형상과 같은 세포 형태는 마이크로비드와의 배양 기간 동안 변할 수 있다.

도 7의 A 및 도 7의 B는 세포가 마이크로비드와 접합된 후 세포 생존능 테스트를 보여주는, 각각 4시간 및 22시간의 미세액적의 이미지를 제공한다. 제공된 조건은 부착성 세포가 마이크로비드와 접합할 수 있도록 하고, 상기 세포는 4시간 동안 마이크로비드에서 배양되도록 하였다. 부착성 세포와 마이크로비드를 함유하는 미세액적은 이후 추출하여 도 7의 A에 도시된 바와 같이 조직 배양 처리된 플레이트 상에 분배하였다. 이어서, 상기 세포를 22시간 동안 마이크로비드 상에서 배양하도록 하였다. 22시간 후, 부착성 세포 및 마이크로비드를 함유하는 미세액적을 추출하여 도 7의 B에 도시된 바와 같이 조직 배양 처리된 플레이트에 분배하였다.

병합된 미세액적의 4시간째 이미지인 도 8의 A와 상기 미세액적의 22시간째 이미지인 도 8의 B에 도시된 결과는 단일 비드 또는 다수의 비드 상의 부착성 세포가 배양 기간 동안 생존 가능하고 증식할 수 있음을 보여준다.

복수의 세포 및 하나 이상의 마이크로비드를 포함하는 각 액적은 다양한 방식으로 특정 시료 분석의 요구에 따라 조작될 수 있다. 상기 조작은 미세액적이 상기 표면으로부터 탈습윤되거나 부분적으로 탈습윤되도록 미세액적에 대한 전기습윤 조건을 변경하는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "탈습윤(de-wet)"은 액적이 표면에서 떨어지도록 액적 및 칩 표면 간의 접촉각이 변화하는 것을 지칭한다.

배양된 세포 상에서 생물학적 및/또는 화학적 분석이 수행될 수 있으며, 이는 리포터 비드의 도입, FRET 리포터의 도입, 내인적으로 발현된 리포터의 이미징, 미시적인 세포 형태 측정, 배양된 세포의 용해, PCR, 등온 증폭 또는 형광 in-situ 혼성화와 같은 유전자 검출 분석 및 DNA 시퀀싱 준비를 포함할 수 있다. 또는 탈착된 세포는 추가의 분석을 위해 칩 외부로 유출될 수 있다.

본 발명의 다양한 추가 양태 및 실시예들은 본 개시내용을 감안하여 당업자에게 명백할 것이다.

본 명세서에서 사용된 "및/또는"는 두 특정 특징 또는 구성요소의 각각이 다른 하나와 함께 있거나 없는 특정 개시로 간주된다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B 마치 각각이 독립적으로 본 명세서에 제시된 것과 같은 특정 개시로서 간주된다.

문맥이 다르게 지시하지 않는 한, 위에 제시된 특징의 설명 및 정의는 본 발명의 임의의 특정 양태 또는 실시예에 한정되는 것이 아니라, 설명된 모든 양태 및 실시예에 동일하게 적용된다.

본 발명이 몇몇 실시예를 참조하여 예시적으로 기술되었지만, 당업자에게는 충분히 이해될 것이다. 개시된 실시예에 한정되는 것은 아니며, 첨부된 청구항에 정의된 바와 같이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 대안적인 실시예가 구성될 수 있다.

Claims (19)

1. 부착성 세포를 마이크로비드에 접합함으로써 미세액적 분석 시스템에서 부착성 세포를 취급하는 방법으로,
   복수의 제1 미세액적을 미세유체 공간에 로딩하는 단계, 여기에서 각각의 제1 미세액적은 마이크로비드와 제1 유체를 함유함;
   복수의 제2 미세액적을 미세유체 공간에 로딩하는 단계, 여기에서 각각의 제2 미세액적은 부착성 세포 및 제2 유체를 함유함;
   상기 복수의 제1 미세액적 및 상기 복수의 제2 미세액적을 병합하여 복수의 병합된 미세액적을 형성하며, 각각의 병합된 미세액적은 상기 제1 및 제2 유체, 적어도 하나의 마이크로비드 및 적어도 하나의 부착성 세포를 함유하는 단계; 및
   상기 각각의 병합된 미세액적에서 상기 제1 및 제2 유체를 이동시켜 적어도 하나의 부착성 세포가 적어도 하나의 마이크로비드에 부착되도록 상기 각각의 병합된 미세액적을 교반하는 단계;
   를 포함하는 방법.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   적어도 하나의 마이크로비드에 부착된 적어도 하나의 부착성 세포에 대한 선택, 분석, 배양 또는 회수 공정을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
   
3. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 미세유체 공간은 광학 매개 전기습윤 (oEWOD)을 통해 복수의 제1 및 제2 미세액적을 조작하도록 구성된 미세유체 칩의 일부인 방법.
   
4. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 마이크로비드는 세포 부착을 용이하게 하도록 구성된 폴리펩티드의 표면 기능화를 갖는 방법.
   
5. 청구항 4에 있어서,
   상기 펩티드 표면 기능화는 Gly-Arg-Gly-Asp-Ser (GRGDS), Arg-Gly-Asp (RGD) 또는 Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro (GRGDSP)의 서열 중 하나 이상을 포함하는 방법.
   
6. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 부착성 세포는 그 본래의 부착 상태에 있는 방법.
   
7. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
   병합 전에, 미세액적의 내용물 및 미세액적 당 비드 또는 세포의 수를 결정하기 위해, 적어도 복수의 제1 및 복수의 제2 미세액적의 서브세트를 검사하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
   
8. 청구항 7에 있어서,
   원하는 세포 수를 갖는 것을 제외한 하나 이상의 미세액적을 폐기하도록 구성된 분류 작업 단계를 추가로 포함하는 방법.
   
9. 청구항 7 또는 청구항 8에 있어서,
   원하는 비드 수를 갖는 것을 제외한 하나 이상의 미세액적을 폐기하기 위한 분류 작업 단계를 추가로 포함하는 방법.
   
10. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    소정의 임계값 미만의 비드 수를 갖는 미세액적의 선택을 식별하고 상기 선택된 미세액적 중 둘 이상을 병합하여 비드 수를 증가시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
    
11. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    소정의 임계값 수준의 비드 수를 갖는 미세액적의 선택을 식별하고 상기 선택된 미세액적을 둘 이상으로 분할하여 비드 수를 감소시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
    
12. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    복수의 제1 및/또는 복수의 제2 미세액적이 커플링 촉진제를 추가로 포함하는 방법.
    
13. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 유체 및/또는 제2 유체는 세포 성장 배지를 포함하고, 상기 방법은 상기 미세유체 공간에 캐리어 상을 도입하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 캐리어 상은 세포 성장 배지와 평형을 이루고, 상기 캐리어 상은 상기 병합된 미세액적으로부터 고갈된 세포 성장 매체를 대체하도록 구성되는 방법.
    
14. 청구항 13에 있어서,
    상기 캐리어 상은 적어도 하나의 마이크로비드로부터 적어도 하나의 부착성 세포를 방출하기 위한 방출제를 포함하는 방법.
    
15. 청구항 14에 있어서,
    상기 방출제는 트립신, EDTA, 프로테아제 또는 시트르산 중 하나 이상인 방법.
    
16. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 복수의 병합된 미세액적을 배양하고 상기 각각의 병합된 미세액적에서 상기 마이크로비드에 부착된 세포를 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
    
17. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 병합된 미세액적에서 온-칩 리포터 분석을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
    
18. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 병합된 미세액적을 용기에 분배하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
    
19. 청구항 18에 있어서,
    처리된 웰 플레이트의 표면 상에 상기 복수의 병합된 미세액적을 증착하는 단계를 추가로 포함하며, 여기에서 각각의 병합된 미세액적은 적어도 하나의 마이크로비드에 부착된 적어도 하나의 세포를 함유하는 방법.

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